metabolismo de nucleotidos

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 Angelo Parra Mardones - Tecnología Médica Metabolismo de Nucleótidos: Biosíntesis y Degradac ión Los nucleótidos participan como tales en multitud de funciones claves en el metabolismo celular y los polímeros de nucleótidos, los ácidos nucleicos, son los depositarios de la herencia celular. 1. Los nucleótidos son compuestos ricos en energía que dirigen los procesos metabólicos (fundamentalmente la biosíntesis) en todas las células. 2. También actúan como señales químicas, vínculos esenciales de los sistemas celulares, capaces de responder a estímulos extracelulares (hormonas , factores de crecimiento ). 3. Componentes estructurales de una serie de cofactores enzimáticos e intermediarios metabólicos. Los ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA) son los depositarios moleculares de la información genética: La estructura de cada proteína, y en último término de cada componente celular, es producto de la información programada en la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos. En el DNA celular se encuentra especificadas las secuencias de aminoácidos de todas sus proteínas y las secuencias de nucleótidos de todas las moléculas de RNA. - Un segmento de DNA que contiene la información necesaria para la síntesis de un producto biológico funcional (proteína o RNA) recibe el nombre de gen. - Una célula normal posee miles de genes y en consecuencia no resulta sorprendente que las moléculas de DNA tiendan a ser muy largas. La única función del DNA parece ser el almacenamiento de información biológica. - Varias clases de RNA celular: * RNA ribosómicos (rRNA): componentes de los ribosomas (síntesis de proteína) * RNA mensajeros (mRNA): ácidos nucleicos que transportan la información desde un gen (pocos genes) hasta el ribosoma (síntesis de proteínas) * RNA de transferencia (tRNA): moléculas adaptadoras que traducen con fidelidad la información contenida en el mRNA en secuencias especificas de aminoácidos * Otros RNAs: microRNAs Estructura general de nucleótidos Tres componentes básicos:  - Base nitrogenada - Una pentosa - Un fosfato Bases purínicas y pirimidínicas  Bases y pentosas: son compuestos heterocíclicos (en las pentosas se utiliza el signo prima (‘))   La base se une por el N1 en pirimidinas y N9 en purinas a través de un enlace N-glucosídico (H2O: OH de la pentosa y un H de la base)

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Metabolismo de Nucleótidos: Biosíntesis y Degradación

Los nucleótidos participan como tales en multitud de funciones claves en el metabolismo celular y los polímeros de nucleótid

los ácidos nucleicos, son los depositarios de la herencia celular.

1. Los nucleótidos son compuestos ricos en energía que dirigen los procesos metabólicos (fundamentalmente la biosínteen todas las células.2. También actúan como señales químicas, vínculos esenciales de los sistemas celulares, capaces de responder a estímuextracelulares (hormonas, factores de crecimiento).

3. Componentes estructurales de una serie de cofactores enzimáticos e intermediarios metabólicos.

Los ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA) son los depositarios moleculares dinformación genética: La estructura de cada proteína, y en último término de cada componente celular, es producto deinformación programada en la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos.

En el DNA celular se encuentra especificadas las secuencias de aminoácidos de todas sus proteínas y las secuencias

nucleótidos de todas las moléculas de RNA.

- Un segmento de DNA que contiene la información necesaria para la síntesis de un producto biológico funcional (proteínRNA) recibe el nombre de gen.- Una célula normal posee miles de genes y en consecuencia no resulta sorprendente que las moléculas de DNA tiendan a muy largas. La única función del DNA parece ser el almacenamiento de información biológica.- Varias clases de RNA celular:* RNA ribosómicos (rRNA): componentes de los ribosomas (síntesis de proteína)* RNA mensajeros (mRNA): ácidos nucleicos que transportan la información desde un gen (pocos genes) hasta el riboso(síntesis de proteínas)* RNA de transferencia (tRNA): moléculas adaptadoras que traducen con fidelidad la información contenida en el mRNAsecuencias especificas de aminoácidos* Otros RNAs: microRNAs

Estructura general de nucleótidos

Tres componentes básicos: - Base nitrogenada- Una pentosa- Un fosfato

Bases purínicas y pirimidínicas

  Bases y pentosas: son compuestos heterocíclicos (en las pentosas se utiliza el signo prima (‘))   La base se une por el N1 en pirimidinas y N9 en purinas a través de un enlace N-glucosídico (H2O: OH de la pento

un H de la base)

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Nucleósidos = Azúcar + Base (sin Fosfato) Nucleótidos = Azúcar + Base + Fosfato

Nomenclatura

Funciones de los nucleótidos  Nucleótidos como portadores de energía química (ATP y en menor medida GTP)  Nucleótidos como cofactores y coenzimas: incorporación de adenina (NAD+ y NADP+ son coenzimas que partici

en una amplia gama de reacciones enzimáticas de oxido-reducción: Mecanismo de reducción de los ribonucleótpor rNDP reductasa)

  Nucleótidos como segundos mensajeros y reguladores de otras funciones (AMPc)

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Síntesis de nucleótidos

Biosíntesis de novo de nucleótidos

Síntesis de ribonucleótidos de purina 

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Biosíntesis de novo de un anillo purínico: desde PRPP hasta IMP

PRPP: Fosfo-ribosil-1-pirofosfatoIMP: Inosina 5'-monofosfato (ácido inosinico; inosinato)

Puntos importantes

1. Síntesis de novo de bases purínicas ocurre directamente sobre la ribosa.2. La adición de un grupo amino en la primera reacción causa que el carbón anomérico rote desde la posición en PRPPposición 5-fosforibosilamina (PRA) 3. Los grupos aminos son donados por la glutamina a través de reacciones catalizadas por la enzima amidotransferasa.4. Los carbonos (únicos) son adicionados desde 10-formil-tetrahidrofolato en una reacción catalizada por la enz

transformilasa.5. Moléculas de glicina y fumarato se usan para construir la estructura del anillo.6. La vía completa es regulada alostéricamente por AMP, ADP, GMP, y GDP, todos los cuales inhiben PRPP-amidotransferala primera enzima en la vía.

Biosíntesis de novo de un anillo purínico: desde IMP hasta guanilato y adenilato (GMP y AMP)

EnzimasA1: Adenilsuccinato sintetasaA2: Adenil succinato ligasaG1: IMP deshidrogenasa

G2: XMP-glutamina amidotransferasa

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Síntesis de ribonucleótidos de pirimidinas

Biosíntesis de novo de pirimidinas: Aspartato hasta Citidina 5’-trifosfato (CTP)

Biosíntesis y metabolismo de los desoxirribonucleótidos-  La mayoría de las células contienes de 5 a 10 veces más RNA que DNA-  Los dNTP’s se utilizan casi exclusivamente para la biosíntesis de DNA-  El DNA es químicamente distinto del RNA por el azúcar y la identidad de una de las bases pirimidínicas-  La biosíntesis de desoxirribonucleótidos transcurre en dos procesos que ocurren a nivel del nucleótido:

o  La conversión de ribosa en desoxirribosa o  La conversión de Uracilo en Timina 

  Los ribonucleótidos son los precursores de los desoxirribonucleótidos

H H

OH OHOH 2' H

H HH H

H H

O O

O O

O O

O POCH O POCH

- -

2 2

O O

O O

O P O P

- -

- - -BaseNADPH

Ribonucléosido difosfato

reductasa

NADPBase

Deoxiribonucléosido

difosfato

Ribonucléosido

difosfato

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EJ: Adenosina difosfato (ADP) ----> 2’-desoxiadenosina difosfato (dADP)

  La ribonucleótido reductasa (rNDP) cataliza la conversión de todos los ribonucleótidos

  El DNA contiene Timina, mientras que el RNA contiene Uracilo, ¿por qué?-  La citosina de desamina espontáneamente y forma uracilo-  Las enzimas de reparación del DNA reconocen la “mutación” y reemplazan el uracilo por citosina-  Las enzimas no pueden distinguir entre un uracilo original y uno proveniente de citosina-  La naturaleza ha resuelto el problema sustituyendo, en el DNA, los uracilo por su forma metilada: timina

Catabolismo de nucleótidos

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Catabolismo de nucleótidos purínicos a ácido úrico

Producto de excreción en diferentes organismos:Acido úrico (primates, aves, reptiles, insectos), Alantoina (la mayoría de los mamíferos), Alantoato (peces con esqueletUrea (anfibios, peces cartilaginosos), Amonio (invertebrados marinos)

Vías metabólicas de nucleótidos y enfermedades

- La guanina y la hipoxantina se recuperan a través de la vía de recuperación de nucleótidos (Hipoxantina-guan

fosforribosil transferasa HGPRT)

Ácidos nucleicos y Replicación

  Rutas de información a través de procesos de replicación, transcripción y traducción  El DNA almacena la información genética (Watson y Crick 1953)

Estructura del DNA  Dos cadena helicoidalaes dextrógiras enrolladas en torno a un mismo eje  Esqueleto hidrofílico, desoxirribosas y fosfatos se hallan en el exterior de la hélice  Bases purínicas y pirimidínicas apiladas al interior de la hélice

  Cada base se aparea con una base de la otra cadena y se sitúan en el mismo plano  Los pares de bases se encuentran unidos por enlaces de hidrógeno  Las cadena son antiparalelas (enlace fosfodiéster 5’-3’) 

Estructura Primaria, Secundaria y Terciaria de los Ácidos Nucleicos

1. La estructura primaria corresponde a su estructura covalente y a la secuencia del nucleósido monofosf(frecuentemente como la secuencia de bases que ellas contienen).2. La estructura secundaria se refiere a la forma que los ácidos nucleicos asumen de acuerdo de su estructura primaB-DNA, A-DNA, y Z-DNA son todas formas de estructura secundaria. B-DNA corresponde a la forma predominante eambiente acuoso de la célula.

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3. La estructura terciaria se refiere al plegamiento de gran escala en un polímero linear, el cual es de mayor orrespecto del observado en la estructura secundaria. La estructura terciaria es la forma tri-dimensional del plegamiede la cadena completa.

  El DNA puede adoptar diferentes estructuras

  H-DNA. Estructura poco habitual que se encuentra en regiones de polipirimidina - polipurina dan origen aordenamiento en triple-hélice.

  Aparecen en regiones donde se inicia o regulan procesos importantes en el metabolismo del DNA (replicacrecombinación, transcripción).

Horquilla Cruciforme Triple Hélice

  Genes y regiones intergénicas: Genoma   Centrómero: punto de unión de las proteínas que fijan el cromosoma a los microtúbulos del huso mitó

(compuestos por número importante de secuencias repetitivas: DNA satélite).  Telómeros: secuencias que estabilizan el extremo de cromosomas eucarióticos lineales; ~ 100 pb de secuen

repetida (x e y entre 1-4)

Cromatina y Estructura Nuclear

  Cromosomas: cuerpos claramente definidos en el núcleo en periodo previo a la mitosis.  Cromatina: Se observa en células que no están en división, siendo amorfo, disperso y desordenado alrededor

núcleo.  Cromatina: fibras que contienen proteína y DNA (nucleína Miescher ) en masa similar y una pequeña cantidad de RN  DNA de la cromatina se encuentra asociado a proteínas básicas (Arg, Lis) llamadas histonas.  Las histonas empaquetan y ordenan el DNA en estructuras denominadas nucleosomas, que son las unida

fundamentales de la organización del DNA.

Reglas fundamentales de la replicación

  La replicación del DNA es semiconservativa   La replicación comienza en un punto de origen y, normalmente, transcurre en forma bidireccional

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  La síntesis de DNA ocurre en dirección 5’ → 3’ y es semidiscontinua 

Elongación de una cadena de DNA

  El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Sin embargo, las DNA polimerasas no inician la síntesis (polimerizan), por lo que se requiere de un cebador (oligonucleótido de RNA)

  Todas las DNA polimerasas requieren de un molde  Las DNA polimerasas también realizan correcciones en el DNA

Metabolismo del RNA

Las moléculas de RNA no solo son portadoras y expresan información genética sino también actúan como catalizadores.Con la excepción de los genomas de RNA de ciertos virus, todas las moléculas de RNA se forman a partir de informaccontenida en el DNA: transcripción.3 clases principales de RNA:

-  RNA mensajero (mRNA): secuencias que codifican para aminoácidos de uno o más polipéptidos codificados en un o conjunto de genes en un cromosoma

-  RNA de transferencia (tRNA): adaptador que lee la secuencia codificada en el mRNA y transfiere el aminoácadecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento durante la síntesis proteica.

-  RNA ribosómico (rRNA): se asocia con proteínas para formar la maquinaria de síntesis proteica, conjudenominado ribosoma.

Diferencias entre replicación y transcripción:

Replicación: se copia el cromosoma entero para dar origen al DNA hijo que es idéntico al DNA parental.Transcripción: Selectiva; se transcribe sólo el DNA de un gen(es) determinado(s), correspondiente a la información celnecesaria en un momento cualquiera.

Síntesis de RNA dependiente de DNA

  El RNA es sintetizado por RNA polimerasas dirigidas por DNA  Requiere: DNA templado, ribonucleótidos (ATP, GTP, UTP y CTP), además de Mg2+ (Zn2+)  No requiere cebador (primer), pero la transcripción se inicia solo en secuencias denominadas promotores  Formación de súper enrollamientos producto de la apertura de la hebra de DNA: acción de la Topoisomerasa   La velocidad de síntesis es -> 50 nucleótidos por segundo

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  La síntesis del RNA se inicia en promotores 

  La síntesis del RNA termina en región de poli-A 

Inhibición de la transcripción del DNA

  Actinomicina D: Intercalación del anillo peptídico cíclico en el surco menor. Secuencia sombreada se insertasecuencias ricas en G –C (bacterias y eucariontes).

  Acridina: Mecanismo similar por intercalación en el DNA.  Rifampicina: Se une específicamente a la subunidad beta de las RNA polimerasas bacterianas (inhibe el inicio dtranscripción).

  a-amanitina: Bloquea la síntesis de RNA inhibiendo a la Pol-II y Pol-III (a concentraciones elevadas).  Ama

 phalloides

Maduración del RNA

Los intrones transcritos en el RNA se eliminan por corte y empalme (splicing), existen 4 tipos:  Grupo I: genes nucleares, mitocondriales y cloroplastidiales que codifican rRNA.  Grupo II: transcritos primarios de mRNA de mitocondrias y cloroplastos.-  Grupos I y II no necesitan cofactores de alta energía como ATP (emplean transesterificación)  Grupo III: transcritos primarios de mRNA nuclear (grupo más numeroso).

  Grupo IV: transcritos primarios de tRNA. Requiere de ATP y de una endonucleasa.

Mecanismo de splicing en intrones del grupo I: requerimientoexógeno de nucleósido o nucleótido de Guanina: autocorte y empalme.

No requiere de un complejo proteico particular, se utiliza un nucleótidopara favorecer el splicing. La célula reconoce que hay intrones y quedebe eliminarlos, a través de la identificación de una secuencia consenso.Por ejemplo, en la zona de unión entre el 5’ exón y el 3’ intrón, hay una

secuencia (Uracilo y Adenina) reconocida como el sitio de comienzo deeliminar el intrón. En este caso es una Guanina que hace el ataque aesta unión. El hidroxilo de la guanosina ataca el enlace fosfodiéster

entre el Uracilo y la Adenina, se abre la cadena y la guanosina se une ala Adenina, el hidroxilo del Uracilo queda libre para hacer el ataquesobre la unión del exón 3’. Se elimina el intrón y se unen los exones.

Mecanismo de splicing en intrones del grupo II: adenilato dentrointrón: autocorte y empalme. Existe el mismo tipo de reacción que egrupo I. Se denomina autocorte porque no hay ningún tipo de prote

que este favoreciendo el splicing. Lo diferente en este caso es que eintrón hay una Adenina que es reconocida por una Guanina del extre3’ del mismo intrón y el tipo de reacción es exactamente la misma

antes. La guanosina, en vez de estar fuera del RNA, está dentro y founa estructura de lazo con el intrón. Ahora el hidroxilo del Uracilo extremo 5’ del exón queda libre y puede atacar a otro Uracilo, se libel lazo del intrón y se unen los dos exones. 

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Mecanismo de splicing en intrones del grupo III: ocurre un mecanismosimilar a la eliminación de intrones del grupo II (formación de lazo); sinembargo no experimentan autocorte y empalme. Ahora existen proteínas ymoléculas de RNA que favorecen el proceso de splicing, llamadosspliceosoma. El splicing requiere de la participación de complejos RNA yproteínas especializados que contienen moléculas de snRNA (small nuclear 

RNA o RNA nuclear pequeño).Intervienen 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 y U6) que forman complejos conproteínas denominados ribonucleoproteínas (snRNP), cuya función esreconocer las secuencias iniciales y finales del intrón, y a partir de la unión delas ribonucleoproteínas a la secuencias del intrón se va a empezar el mismoproceso que antes con el grupo I y II, formándose un lazo con el intrón queposteriormente es degradado. Utilizan secuencias altamente conservadas enel límite intrón - exón.

Spliceosoma: snRNP U1 + snRNP U2, U4, U5, U6

Proceso de maduración del RNA  Formación del transcrito primar

su modificación durante la maduración mRNA en una célula eucarionte.

  El casquete 5’ se añade antes de

se complete la síntesis del transcprimario.

  La poliadenilación ocuprincipalmente luego del splicing.

  Todos los procesos ocurren ennúcleo.

Adición del Casquete 5’ Protege el comienzo del RNAm, agregando un nucleótido modificado,la 7-Metil-guanosina, en el extremo 5’ del RNAm transcrito primariomediante un enlace 5'-fosfato → 5'-fosfato en lugar del habitual enlace3',5'-fosfodiéster. Es crítico para el reconocimiento y el accesoapropiado del ribosoma. 

Adición de cola poli(A) al transcrito primario de RNA de eucariontes La RNA polimerasa sintetiza más allá del segmento que contiene lainformación del sitio de corte (5’-AAUAAA).

a. Complejo entre endonucleasa y poliadenilato polimerasa se fijan a estasecuencia señal.b. El RNA es cortado de 11 a 30 nt por el lado 3’ de la señal AAUAAA. c. La poliadenilato polimerasa sintetiza una cola de 20 a 250nt empezandocon el sitio de corte.

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Maduración del RNA

  Maduración diferencial del RNA da origen a múltiples productos a partir de un gen: Poliadenilación y/o spli

alternativos

Los rRNA y tRNA también sufren un proceso de maduración. Durante la eliminación de intrones, se producen diferen

subunidades que van a formar la estructura final de proteínas y ribosomas, los que se sintetizan en el núcleo de célueucariontes, específicamente en el nucléolo (zona más densa, donde se forman los RNA prerribosómicos). En el caso decélulas procariontes; de un mismo transcrito primario puede haber formación de rRNA y tRNA, lo que se da sólo procariontes. Pero en ambos es similar, hay metilación del rRNA y ruptura de éste para eliminar los intrones.En el caso de los tRNA la maduración se da gracias a ribonucleasas. Cortan en el extremo 5’ y en el 3’, y se hace un agreg

de una secuencia CCA en el extremo 3’, sitio de unión del aminoácido y también lleva un splicing. A parte de los n ucleótque conocemos, el tRNA también está formado por nucleótidos modificados mediante metilación, desaminación, reducción

Ribozimas: Corresponden a intrones con auto splicing del grupo I y II, donde una secuencia de RNA elimina otra secuenciaRNA. No es una proteína, sino que un RNA que está funcionando como una enzima.

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Maduración del tRNA en bacterias y eucariontes

  La mayoría de las células tienen entre 40 – 50 tRNAs diferentes.

  El tRNA proviene de precursores más largos (corte 5’ y 3’). Dos o más tRNAs pueden estar codificados en el mistranscrito (maduración diferencial).

Corte por ribonucleasas (RNasa). Adición del trinucleótido CCA en el extremo 3’ de los tRNA (tRNA nucleotidiltransferasa

La enzima tRNA nucleotidiltransferasa cataliza la formación de los tres enlaces fosfodiéster al mismo tiempo, tiene múltisitios activos que fijan de manera separada cada uno de los nucleósidos precursores.RNasa P: complejo RNA-proteína (M1 RNA, 377 nt); RNA corta el transcrito y la proteína estabiliza el complejo.

Síntesis de RNA y DNA dependientes de RNA

  Retrovirus: Virus con genoma de RNA (hebra simple; ca. 10.000 nt)  Moléculas importantes para tecnología del DNA recombinante. Perspectiva evolutiva.  Transcriptasa inversa: copia la molécula de RNA a una hebra de DNA, complementaria al RNA vírico; degrada

cadena de RNA en el híbrido y la reemplaza por DNA.  Generalmente se produce integración en el genoma del huésped (estados durmientes o de latencia y activo

replicación).

Ampliación del dogma central de la biología molecular

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Síntesis de proteínas y código genético

¿En qué parte de la célula se sintetizan las proteínas? En el citosol.

¿Porqué luego de la síntesis de aminoácidos, estos quedan “activados”? Quedan en una forma activa para que despuéspuedan integrarse en la cadena peptídica que va a dar lugar a la proteína, formando un complejo con los tRNA.

¿De qué modo se traduce la información genética contenida en el lenguaje de 4 letras de los ácidos nucleicos al lenguaje deletras de las proteínas? Mediante codones formados por los nucleótidos del DNA, donde combinaremos tres de éstos paraformar un codón (triplete). Existen 64 posibles combinaciones que están ordenadas en el código genético, cada una de elladetermina qué aminoácido se agregará a la cadena polipeptídica.

Código genético de los aminoácidos de acuerdo a la secuencia de mRNA (5’ -> 3’).

  Note que todos los aminoácidos excepto Met y Trptienen más de un codón.

  Codón de inicio: AUG (pro y eucariontes), ademáscodifica Met en la cadena peptídica.

  Codón de término: UAA, UAG y UGA no codifican paraningún aa conocido y señalan el fin de la síntesis de una

cadena proteica.  Mutaciones sin sentido en E. coli : se encuentran como

resultado de mutaciones de un nucleótido quedeterminan una cadena terminada en formaprematura.

  Código genético degenerado: un aa puede serespecificado por más de un codón.

  Los RNA de transferencia reconocen codones mediaapareamiento antiparalelo de bases entre el codón del mRNA yanticodón del tRNA.

  El tRNA proviene de precursores más largos (corte 5’ y 3’). Do

más tRNAs pueden estar codificados en el mismo transcrito (maduracdiferencial).

  Corte por ribonucleasas.  Adición del trinucleótido CCA en el extremo 3’ de los tRNA (tR

nucleotidiltransferasa)  Síntesis de proteínas: tRNA

Fases principales de la síntesis de proteínas

1.- Activación de los aminoácidos: Cada uno de los 20 aa se une a un tRNA específico. Tiene lugar en el citosol (no enribosomas), requiere de ATP. Reacción catalizada por aminoacil-tRNA sintetasas (Mg2+) específica para cada aa y tRcorrespondiente(s).

2.- Inicio: Formación del complejo de iniciación (GTP y factores de inicio)* Fijación de los factores de inicio a la subunidad ribosómica menor.* El mRNA portador del código del polipéptido a sintetizar se fija a la menor de las dos subunidades ribosómicas principales* El aminoacil-tRNA iniciador se aparea con el codón de inicio AUG del mRNA.

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3.- Elongación: La cadena polipeptídica se alarga mediante las uniones covalentes de aa sucesivos, transportados al ribosoy posicionados correctamente por el apareamiento entre el tRNA y el mRNA. Hidrólisis de 2 moléculas de GTP.

4.- Término y liberación: Codón de término en el mRNA indica en qué momento está completa la cadena polipeptídDesprendimiento del polipéptido gracias a la ayuda de factores de liberación.

5.- Plegamiento y maduración. El polipéptido se pliega para adoptar su forma 3D adecuada. Modificaciones ptraduccionales.

Aminoacilación de un tRNA por aminoacil-tRNA sintetasas (activación de un aminoácido)

Dirección de la síntesis de proteínas

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Activación de un aminoácido

En el tRNA, en la secuencia CCA, específicamente en el hidroxilo terminal de la Adenina, se une el aminoácido a través dgrupo carboxilo (activándose). La enzima que promueve la unión entre el RNAt y el aminoácido es la Aminoacil-RNAt sintetexistiendo una por cada aminoácido

Iniciación

Una cadena polipeptídica tiene en sus extremos un grupo amino y un grupo carboxilo, el crecimiento de la cadena comiepor el extremo amino en dirección al carboxilo terminal. El primer aminoácido que incluyamos en la cadena polipeptídicaa ser el aminoácido N-terminal y el último será C-terminal. Esto es en forma general, porque luego en la maduración dproteína, muchos péptidos N-terminal generalmente se remueven, no conservando siempre los mismos aminoácidos queincorporaron de forma inicial.

Procariontes: En el ribosoma tenemos 2 subunidades, la 50S y la 30S, paraque se dé la iniciación de la síntesis se formará un complejo de iniciación.Existen 3 factores de iniciación: IF-1, IF-2, IF-3El IF-1 e IF-3 se unen la subunidad ribosómica menor, evitando que lasubunidad mayor se pegue a ésta subunidad, luego el RNAm se fija a éstamisma subunidad y determina la iniciación de la síntesis. En el RNAm hayuna secuencia que se denomina de Shine-DalgRNAo, la cual es reconocidapor el RNAr de la subunidad menor, formándose una unión entre el RNAm yel RNAr. Después de esta unión se busca el primer AUG y este es el que va areconocer la bacteria como el iniciador de la traducción.

El RNAr de la subunidad menor se va a hibridizar con el RNAm, luego quereconoce el primer AUG, codón iniciador, se debe unir el RNAt que ellevando formilmetionina, lo trae el IF-2 que está unido a GTP.Una vez que se unión el RNAt a través de su anticodón, al codón

iniciación, se hidroliza el GTP, liberando GDP + Pi y todos los factoresliberación. Recién ahí se puede formar el complejo entre la subunidad mey mayor.En la subunidad menor se reconocen 2 sitios, uno que se llama siti(aminoacilo) y el sitio P (peptidilo). Normalmente en el sitio P, se encuenla cadena naciente y se desprenden los RNAt descargados y en el sitiodonde se une el aminoacil-RNAt, va a venir un aminoácido que se va a unpéptido que se está formando. Sólo en el inicio tenemos un aminoácunido en el sitio peptidilo, que en este caso es la formilmetionina.

En el caso de los eucariontes todo es más complicado, tienen vaproteínas que favorecen la iniciación y el proceso que viene posteriorme

que es la elongación.

Elongación 

Ya tenemos formado el ribosoma con sus dos subunidades, la 30S y la 50S. Se dice que el ribosoma es 70S y que tiene un hla formilmetionina. Necesitamos 3 factores de elongación: EF-Tu, EF-Ts y EF-G

  EF-Tu: transporta el RNAt con el aminoácido correspondiente al sitio aminoacilo libre.  EF-Ts: regenera la unión a GTP del factor EF-Tu para que después podamos transportar otro aminoácido, es un cicl

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Una vez que ingresó el RNAt con el aminoácido que está en segundo lugar, elgrupo amino del nuevo aminoácido ataca el grupo carboxilo del aminoácidoque esta inicialmente en la cadena, produciéndose la unión peptídicatransitoria por la enzima peptidil transferasa, una ribozima (23S) que está enla subunidad mayor del ribosoma. Se produce una translocación corriéndoseel RNAm, provocando la correcta unión del péptido, quedando el RNAtdescargado en el sitio P y libre el sitio A.Para la translocación se requiere el factor EF-G, llamado también translocasa y GTP, los cuales producen el corrimiento de la hebra de RNAm

Término y liberación

Debemos tener un codón que nos indique un lugar en donde no se ningún aminoácido; hay 3 codones que indican el término de la síntesis. Pestos codones no hay un RNAt que se una al sitio A, uniéndinmediatamente tres factores de terminación o liberación a este sRF1: reconoce UAG y UAA; RF2: reconoce UGA y UAA; RF3: no se sabe reconoce.Éstos van a promover la hidrólisis del enlace peptidil-RNAt termintroducen agua en vez de otro aminoácido por la peptidil transferasa, lo va a producir la liberación del péptido y disociándose después el ribosoque se recicla para otra síntesis de proteínas.En los eucariontes existe un solo factor de terminación “eRF” que recon

todos los codones stop.

Maduración

Una proteína recién sintetizada se encuentra en forma inactiva porque tenemos proteínas para diferentes funcionsufriendo una serie de procesos de modificación post-traduccional. El polipéptido se pliega para adoptar su formaadecuada.

Regulación de la expresión génica

La expresión de un gen en forma constante, aparentemente no regulada, es conocida como expresión génica constitutivde housekeeping (ejemplo: enzimas que participan en las vías metabólicas centrales, proteínas chaperonas, etc).Los genes que aumentan su expresión dependiendo de los requerimientos celulares se conocen como genes inducibles

proceso que da lugar al incremento en la expresión se conoce como inducción (ejemplo: enzimas de reparación del DNArespuesta a altos niveles de daño)Por otro lado, el fenómeno que permite apagar la expresión de ciertos genes se conoce como represión.

Existen 3 tipos de proteínas que regulan la expresión génica:  Factores de especificidad: modifican la especificidad de la RNA polimerasa (factor s de la RNA polimerasa de E. col

  Represores: se unen a un sitio especifico del promotor (operador) y bloquean el acceso de la RNA polimerasa.  Activadores: se unen en la vecindad del promotor y aumentan la interacción de este con la RNA polimerasa.

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La RNA polimerasa se une al DNA e inicia la transcripción en sitios específicos del DNA denominados promotores:

Modelos típicos de regulación del inicio de la transcripción

Regulación Negativa: Tenemos una prote

unida al promotor que es represora, porbloquea la entrada de la RNA polimerasa.este caso, el represor puede ser eliminadtravés de un inductor por regulación alostércuando el inductor se une al represor, se inhla represión, porque éste cambia conformación y libera el promotor. Otro tiporepresión, es cuando el represor está unidmetabolito para poder estar unido al Dentonces, sólo en presencia de ese metaboel represor se unirá al DNA (metabolito accomo un co-represor) y bloquearán

transcripción.

Regulación Positiva: el activador se encueunido a una zona cercana al promotor, accomo tal cuando está unido sin el ligando. Sligando se une al activador, elimina la activade la expresión génica. En resumen, el activaen ausencia del metabolito funciona coactivador, de pronto este metabolito se un

activador e inhibe su unión al DNA, inhibiendo de alguna manera la acción del activador. También existe la posibilidad de

el activador no funcione en ausencia del metabolito, o sea, NO se une al DNA sin el metabolito.

Modelo clásico de un operón: Conjunto formado por el grupo de genes, el promotor y las secuencias adicionales implicaen la regulación de la transcripción génica (operador, donde se une el represor y la secuencia reconocida por el activador)

Operón LacLa bacteria usa como fuente de C la glucosa. Hay situaciones en que la glucosa no está presente en el medio, Entonces la

bacteria tiene otras alternativas. Por ejemplo, puede usar la lactosa; La bacteria degradará la lactosa para obtener glucosa,pero para poder hacerlo necesitara enzimas que le permitan degradar la lactosa. Si la bacteria no tiene glucosa en el mediosintetizará proteínas que metabolizan la lactosa.

  Galactósido permeasa: permite el transporte de lactosa desde el medio extracelular al interior de la célula.  β-Galactosidasa: degrada la lactosa en galactosa y glucosa.  Transacetilasa: cuando la b-galactosa no está completamente metabolizada, esta enzima forma un compuesto que

luego puede ser exportado de la célula.

También lo que está involucrado en la regulación de este “Operón Lac” es una proteína represora que va a reprimir la sínte

de estos genes estructurales.

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Nomenclatura

LAC Z: codifica β-galactosidasaLAC Y: codifica galactósido permeasaLAC A: codifica transacetilasa

También está el gen que codifica para la síntesis delrepresor, codificado con un promotor diferente.

Falta glucosa, hay lactosaMientras no haya lactosa en el medio, el represor estará unido al promotor y no se podrá sintetizar el RNAm. Si hay lactosael medio y no glucosa, la célula sintetizará las enzimas que degradan la lactosa, pero tenemos el represor que se une en lazona del promotor. Entonces en presencia de lactosa, un inductor se une al represor, cambiándole la conformación, así ya se puede unir a su sitio operador en la zona del promotor, activando la transcripción.

Hay glucosa y lactosaSe prevalece el uso de la glucosa frente a la lactosa, porque es el metabolito final; se debe inhibir la expresión de las tresenzimas aún cuando haya lactosa en el medio.Cuando hay de las dos, la alolactosa (análogo de la lactosa) se une al represor, activando la expresión; pero al haber glucosacélula debe reprimir la degradación de lactosa.

Normalmente la expresión génica del Operón Lac se da cuando también está unido un activador, es decir, cuando está elactivador y la lactosa se dan las dos condiciones para que se produzca la expresión génica:

  el activador se une al AMPc (niveles altos cuando la glucosa está baja),

  se unen en conjunto cerca del promotor del Operón Lac,  activan la síntesis de estos genes.

-  Al haber lactosa y altos niveles de AMPc, la lactosa elimina el represor y el AMPc activa la síntesis de los genes.-  Cuando hay alta glucosa, bajo AMPc, el activador no va a estar funcionando; aunque tengan lactosa, no va a haber

regulación génica.

Tecnología del DNA Recombinante o Ingeniería Genética

Clonar: Hacer copias idénticas (se refirió a clonamiento de células) se lleva a cabo en 5 procedimientos generales:

1.  Selección de molécula de DNA pequeña capaz de autorreplicación (plásmidos o DNA víricos: vectores de clonación2.  Método para trasladar desde el tubo de ensayo a la célula huésped (ofrece la maquinaria necesaria para

replicación).3.  Método para seleccionar o identificar aquellas células huésped que contienen el DNA recombinante.4.  Método para cortar el DNA en una localización precisa (endonucleasas de restricción: tijeras moleculares).5.  Método para unir covalentemente dos fragmentos de DNA (ligasas).

DNA recombinante: molécula de DNA compuesta con segmentos de DNA de una o más fuentes.

Plásmidos/vectores: Plásmidos son moléculas de DNA extra cromosómico circular o lineal, que se replican de manindependiente del DNA cromosómico y que están presentes generalmente en bacterias. Tienen la misma estructura típicadoble hélice del DNA cromosómico, pero no forman parte del DNA genómico. Se encuentran en casi todas las bactercodificando genes que confieren resistencia a metales y antibióticos.Se utilizan en ingeniería genética porque pueden ser manipulados fácilmente en el laboratorio. La presencia en el plásmidouno o más genes, que confieren resistencia a antibióticos a las bacterias, permite seleccionar clones recombinantes de esbacterias.Actualmente existen muchos tipos de plásmidos, la mayoría de ellos modificados. Todos estos plásmidos de clonacmodernos son vendidos por diferentes compañías biotecnológicas y su aplicación es de amplio espectro.

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Para ser funcional contienen:

A.- Origen de replicación (Ori) que permite copiar el vector en el interior dela bacteria transformada.

B.- Genes que confieran resistencia a antibióticos u a otra actividadenzimática, lo que permite la identificación de las bacterias que portan dichoplásmido.

C.- Secuencia de DNA con sitios de corte único para diferentes enzimas derestricción, denominada “Sitio de clonamiento múltiple” o MCS (del inglés“Multiple Cloning Site”).

Transformación de BacteriasLa transformación consiste en introducir una molécula de DNA exógena, en este caso un plásmido, al interior de la bactmediante diferentes técnicas.Genes proporcionados por el plásmido sirven como marcadores de selección de las bacterias transformadas. Los genes utilizados son los de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, tetraciclina, cloramfenicol y la kanamicina.

Enzimas de restricción

  También conocidas como endonucleasas  Cortan DNA a partir del reconocimiento de secuencias específicas.

El sitio de reconocimiento es una secuencia denominada palindrómica (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)Al cortar el DNA pueden generar dos tipos de extremos:1. cohesivos o pegajosos (sticky end)2. extremos parejos (blunt end)

Algunos usos  Confección de mapas de restricción de un plásmido.  Generación de fragmentos de DNA, los que introducidos en plásmidos apropiados permiten la generación

moléculas de DNA recombinante

DNA recombinante  Unión covalente de un fragmento de DNA a un plásmido genera una molécula de DNA recombinante.

  Generalmente el plásmido y fragmento de DNA (o producto de PCR) son digeridos con la misma enzimarestricción, generando extremos compatibles que se unen covalentemente utilizando la enzima DNA ligasa.

Análisis de DNA por electroforesis  Fragmentos de DNA pueden ser separados en base a su tamaño en geles de agarosa (matriz porosa).  Ácidos nucleicos migran en un campo eléctrico por tanto, son susceptibles de ser separados por electroforesis.  Ácidos nucleicos tienen grupos fosfatos que se cargan negativamente (-) en presencia del buffer de carga y corr

(pH 7.0).  Para visualizar las bandas de DNA hay que teñir el gel. Por ejemplo, con bromuro de etidio (BrEt), el cual se inter

en la doble hebra del DNA y emite luz cuando se le excita con luz ultravioleta (UV).

PCR

La reacción de PCR se basa en la repetición de un cicloformado por tres etapas:1ª Desnaturalización de la doble cadena de DNA porefecto del calor2ª Hibridación de los oligonucleótidos cebadores(primers) a la zona 3´ específica de cada una de las hebrasdel DNA3ª Síntesis-Extensión del primer por acción de la DNApolimerasa