Expresión del ag de superficie de

hepatitis B en Pichia pastoris

Vanesa Macías CañoMejora genética de microorganismos

Máster en biología molecular, celular y genética

ÍNDICE

• Pichia pastoris• Antígeno de superficie de la hepatitis B• Recuerdo histórico• Vacuna contra la hepatitis B• Introducción• Cepas y vectores• Transformación de Pichia pastoris• Resultados• Conclusiones• Bibliografía

Pichia pastorisAmpliamente utilizado para la expresión de proteínas utilizando técnicas de ADN recombinante se utiliza en bioquímica, genética… y en la industria biotecnológica

• Se utiliza como sistema de expresión para la producción de proteínas. Propiedades que la hacen adecuada:

– tiene una alta tasa de crecimiento – es capaz de crecer en un medio de bajo costo– puede crecer en movimiento, frascos o fermentador pequeñas y grandes producciones

• Tiene dos genes de la alcohol oxidasa, AOX1 y AOX2, que tienen un fuerte promotor inducible.

– El gen de la proteína deseada se introduce bajo el control del promotor AOX1, producción inducida por metanol (inhibida pe. por glucosa)

– En un vector de expresión, la proteína se produce como producto de fusión con el factor α de S. cerevisiae la proteína se secreta en el medio purificación de proteínas .

– En el mercado plásmidos: como el vector pPICZα

• El genoma de Pichia pastoris GS115 ha sido secuenciado por el Instituto de Biotecnología de Flandes y la Universidad de Gante y publicado en Nature Biotechnology

http://2010.igem.org/wiki/images/f/f3/Pichia_pastoris.jpg

Antígeno de superficie de la hepatitis B• La hepatitis B es una enfermedad hepática causada por

HBV • Afecta a 300 millones de personas y es responsable de

hasta 500.000 muertes/año. • Prevalencia: varía. Las tasas más altas: Ásia, China y el sur

de África.• La mayoría se recupera sin consecuencias. infección

menos de 6 meses hepatitis B aguda. • Cuando perdura más de 6 meses hepatitis B crónica 5%

del total depende de la edad y del estado inmunitario• Manifestaciones clínicas: variables desde portador latente. • El daño hepático variable y depende de la capacidad de

regeneración y del SI• Consecuencias a largo plazo cirrosis hepática y

carcinoma hepatocelular • Tratamiento: antivirales. • Se cuenta con una vacuna altamente efectiva y segura para

prevenir la infección.

Fotografía electrónica de partículas virales del virus B (fotografía del CDC,

Centers for Disease Control)

http://www.fundapoyarte.org/contenidos/virus3.bmp

Antígeno de superficie de la hepatitis B

HBs Ag. Antígeno de superficie del virus B: es el marcador serológico de infección por VHB. • Aparece en el suero de 1-10 semanas tras la exposición, antes del establecimiento de la

clínica o la elevación de las transaminasas (período de incubación). • En los pacientes que se curan de la infección habitualmente se negativiza en 4-6 meses. • Si se detecta más allá de 6 meses implica infección crónica.

http://www.fisterra.com/guias2/mhepatitis.asp

RECUERDO HISTÓRICO• Pichia Pastoris, es capaz de producir cantidades importantes

de proteína recombinada del orden de gramo por litro.

• P. Pastoris es una levadura metilótrofa. En ausencia de glucosa como fuente de carbono, ésta es capaz de utilizar el metanol.

• El promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) controla la expresión de alcohol oxidasa, (1ª etapa de la vía metabólica del metanol).

• Como la enzima posee una actividad específica débil, es producida en la levadura en grandes cantidades.

• Cuando las células son incubadas en presencia de grandes cantidades de metanol, la alcohol oxidasa constituye más del 30% de proteínas solubles.

• En ausencia de metanol, no se detecta la presencia de la alcohol oxidasa.

• OJO! Se necesita un tiempo muy largo (240h) para alcanzar la concentración máxima debido a la baja actividad metabólica de AOX1

Este tipo de construcciones crea primero la biomasa y segundo el antígeno en un medio con

metanol

VACUNA CONTRA LA HEPATITIS B el clonaje de HBsAG como vacuna:• El clonaje del gen codificador del antígeno mayor, HBsAg no

pudo hacerse directamente en E. coli.

• Este gen fue entonces ligado a un promotor de levadura: promotor alcohol deshidrogenasa y luego fué clonado en un vector de copias elevadas en la levadura.

• El gen HBsAg fue modificado para que la proteína se secrete.

• Las levaduras transformadas por el plásmido producen grandes cantidades de la proteína viral, alrededor de 1 al 2 % de las proteínas totales de la levadura.

• Al cultivar las levaduras en grandes fermentadores, se producen entre 50 a 100 mg de proteínas por litro de cultivo.

• Estas proteínas son fuertemente parecidas a la proteína viral natural; formando agregados de alrededor de 20 nanómetros de diámetro muy parecidos a los agregados inmunógenos encontrados en los pacientes afectados.

• La proteína producida en la levadura es actualmente comercializada y permite vacunar contra la infección producida por el HBV

INTRODUCCIÓN• Debido a la baja actividad metabólica bajo el promotor AOX1 en

Pichia pastoris, se estudia la posibilidad de reducir el tiempo de producción del HBsAg

• Limitación: que la proteína no sea tóxica para el huésped

• Se ha utilizado en S. cerevisae inestabilidad del plásmido (replicación autónoma) rendimiento global

• Sistema G3P-DH + Pichia expresión mayor • AOX1 reduce niveles de expresión de proteínas de membrana• Se produce la integración del plásmido inestabilidad

http://www.unl.pt/investigacao/investigacao/em-foco/pichiapastoris.gif

CEPAS Y VECTORES

GS115 (his4), pAO815, pGAPZ A y pGAPZ C fueron adquiridos de Invitrogen. Todos las clonaciones se llevaron a cabo en E. coli DH5.

(A) Vector de expresión inducible. En este vector, el gen HBsAg se coloca bajo el control del promotor inducible por metanol AOX1. El marcador his4 permite la selección de transformantes en placas de his-;  (B) Vector de expresión constitutiva. Gen HBsAg se coloca bajo el promotor G3P-DH. El marcador Zeocin permite la selección (C) Vector de expresión constitutiva + secreción de HBsAg. Este vector es similar al descrito en B, excepto que lleva el factor alfa secretor de S. Cerevisae en sentido descendiente de secuencia del promotor GAP.

P. Pastoris son los vectores de expresión para el gen HBsAg Éste se inserta en el sentido de la orientación, en sitios Eco RI de plásmidos que

luego se integrarán.

TRANSFORMACIÓN DE Pichia• Los plásmidos de expresión de HBsAg se digirieron con:

– Bgl II vector inducible • Introducción cassette del HBsAg y marcador his4 • + regiones homólogas en AOX1 de Pichia• La cepa de acogida GS115, que lleve un gen intacto AOX1 (Mut +), requiere histidina por auxotrofia de ésta (si se ha transformado

sera MutS)

– BSP HI vectores constitutiva• inserción del vector de GAP-HBsAg en la región del promotor GAP

• Se realizó mediante electroporación. • Selección de transformantes:

– cassette inducible por metanol (Mut+) en placas histidina - – con los plásmidos de expresión GAP Zeocin en placas YPDS

• Detección de transformantes:– PCR para la detección de la inserción del gen, amplificándose éste mediante cebadores específicos.– Los clones + se seleccionaron posteriormente mediante ELISA: diferentes ac según partícula o monómero

http://www.vph-viruspapilomahumano.com/wp-

content/uploads/2010/10/Pcr_machine.jpg

Zeocin se utilizará también para evaluar la capacidad de crecimiento en presencia de

concentraciones crecientes de éste antibiótico. Cuántas más copias tenga del gen más R tendrá

COMPARACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN INDUCIBLE Y CONSTITUTIVA DE HBsAg en Pichia Pastoris

EFECTO DEL Nº DE COPIAS SOBRE EL PROMOTOR G3P-DH

EN LA EXPRESIÓN DE HBsAg

EFECTO DEL Nº DE COPIAS SOBRE EL PROMOTOR G3P-DH

EN LA EXPRESIÓN DE HBsAg

AgHBs expresado en Pichia del promotor GAP se ensambla en partículas

Sería de interés investigar la inmunogenicidad de AgHBs expresado en Pichia utilizando el promotor G3P-DH.

La producción de HBsAg en cultivo continuo

Pichia secreta pocas partículas HBsAg

CONCLUSIONES• La expresión constitutiva de HBsAg en Pichia utilizando el

promotor GAP se ha demostrado por primera vez como una alternativa eficaz a la AOX1 promotor.

• El aumento de número de copias del gen puede aumentar la magnitud de la expresión constitutiva de HBsAg de manera significativa.

• El HBsAg se produce en forma de partículas con el sistema de expresión GAP. A diferencia del sistema metanol inducible mediante el promotor AOX1, la tasa de crecimiento no parece ser esencial para el ensamblaje de las partículas.

• El sistema de expresión constitutiva HBsAg es susceptible de cultivo continuo que permita, en teoría, la producción por tiempo indefinido.

• Pichia es capaz de secretar partículas de 20 nm HBsAg esta secreción no es un proceso eficiente se ha de idear un método de extracción más eficiente y reproducible

http://www.mbmp.ruhr-uni-bochum.de/eng/luebben/forschung/

RUEGOS Y PREGUNTAS

BIBLIOGRAFÍA• Daly R, Hearn MT (2005). "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering

and production". J. Mol. Recognit. 18 (2): 119–38. • www.invitrogen.com/site/us/en/home/• Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T (2009). "Expression in the yeast Pichia pastoris". Meth. Enzymol.

463: 169–89. Brondyk WH (2009). "Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein". Meth. Enzymol. 463: 131–47. Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, et al. (September 2006). "Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins". Science 313 (5792): 1441–3.

• De Schutter K., Lin Y.-C., Tiels P, et al. (2009). "Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris.". Nature Biotechnology 27 (6): 561–566.

• Alberta Clinical Practice Guidelines Program. Serological testing for suspected viral hepatitis: summary of the laboratory guidelines for serological testing for suspected viral hepatitis, 2006 . Edmonton: Alberta Medical Association; revisado 2006 [acceso 3/9/2010]. Disponible en: http://www.topalbertadoctors.org/informed_practice/cpgs/viral_hepatitis.htm

• Emerson SU, Purcell RH. Hepatitis E virus. Rev Med Virol. 2003 May-Jun;13(3):145-54 [PubMed]• Finnish Medical Society Duodecim. Viral hepatitis. En: EBM Guidelines. Evidence-Based Medicine [Internet]. Helsinki, Finland: Wiley

Interscience. John Wiley & Sons; 2008 • Gilson R, Brook MG. Hepatitis A, B, and C. Sex Transm Infect. 2006 Dec;82 Suppl 4:iv35-9 • Guidelines and Protocols Advisory Committee. Viral Hepatitis Testing [Internet]. Victoria, Canada: BC Ministry of Health; 2005

[acceso 3/9/2010]. Disponible en: http://www.bcguidelines.ca/gpac/pdf/vihep.pdf• Mast EE, Weinbaum CM, Fiore AE, Alter MJ, Bell BP, Finelli L et al., Rodewald LE, Advisory Committee on Immunization Practices

(ACIP) Centers for Disease Control and Prevention (CDC). A comprehensive immunization strategy to eliminate transmission of hepatitis B virus infection in the United States: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) Part II: immunization of adults. MMWR Recomm Rep. 2006 Dec 8;55 (RR-16):1-33 [PubMed] [Texto completo].