Renata Aparecida de Camargo Bittencourt

CULTURA DE CONDRCITOS PARA O USO TERAPUTICO: RECONSTITUIO DE CARTILAGEM

Orientador: Prof. Dr. Hamilton da Rosa Pereira (Departamento de Ortopedia) Co-orientadora: Profa. Dra. Elenice Deffune (Hemocentro).

Tese apresentada Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP ao Programa de psgraduao em Bases Gerais da Cirurgia, rea de concentrao: Agresso, Reparao, Regenerao e Transplante de Tecidos e de rgos, desenvolvida junto ao Departamento de Cirurgia e Ortopedia e Diviso Hemocentro, para a obteno do ttulo de doutor.

Botucatu Estado de So Paulo Brasil 2008

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FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO TCNICA DE AQUISIO E TRATAMENTO DA INFORMAO DIVISO TCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

Bibliotecria responsvel: Selma Maria de Jesus

Bittencourt, Renata Aparecida de Camargo. Cultura de condrcitos para o uso teraputico: reconstituio de cartilagem/ Renata Aparecida de Camargo Bittencourt. Botucatu : [s.n.], 2008.

Tese (doutorado) Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2008.Orientador: Hamilton da Rosa Pereira Co-orientador: Elenice Deffune Assunto CAPES: 40101186 1. Articulaes - Cirurgia - Estudos experimentais 2. Cartilagem Doenas 3. Ortopedia CDD 616.72 Palavras chave: Cartilagem articular: Cultura de condrcitos; Engenharia de tecidos; Hidrogel de alginato; Plasma rico em plaquetas; Regenerao

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Epgrafe

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Determinao, coragem e autoconfiana so fatores decisivos para o sucesso. No importa quais sejam os obstculos e as dificuldades. Se estamos possudos de uma inabalvel determinao, conseguiremos super-los. Dalai-Lama 1998

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Dedicatria Dedicatria

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A Deus Fora inexplicvel em nossas vidas, em todos momentos, sejam momentos de tristezas, fraquezas, felicidades e principalmente conquistas.

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minha me Edna e ao meu pai Elyseu (in memorian), por terem sido os precursores de toda esta histria construda em minha vida. Sem sombra de dvidas os pais so considerados o alicerce que permanecem por toda vida de um filho.

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A o meu esposo Altair: As pessoas no se precisam. Elas se completam, No por serem metades, Mas por serem pessoas inteiras, Dispostas a dividir objetivos comuns, Alegrias e vidas. Uma pessoa maravilhosa que esteve presente ao longo dos anos, sempre me apoiando e incentivando, sendo inteiramente paciente com a minha ausncia.

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Agradecimento Especial

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A todos animais includos nesta pesquisa !!!

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Agradecimentos

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Meus sinceros agradecimentos

Ao meu estimado orientador, Prof. Dr. Hamilton da Rosa Pereira, por ser um grande professor e orientador, mostraste-me a cada momento, compreenso, pacincia, comprometimento e dedicao. querida Profa. Dra. Elenice Deffune, que como ningum, exerce com maestria a funo de ensinar, tendo contribudo muito ao longo destes dez anos para o meu enriquecimento intelectual. Literalmente pode ser considerada uma pessoa que transforma, esclarece, compreende e vence todos desafios. o suave mistrio da sua vocao. Ao Prof. Dr. Srgio Lus Felisbino que me acompanhou desde o incio neste trabalho, sempre disposio para compartilhar o seu imenso conhecimento. Ao Hemocentro de Botucatu, local onde pude me especializar, descobrir o que realmente pesquisar e crescer profissionalmente. Ao meu irmo Francisco e minha cunhada Marlene, que so pessoas muito especiais a minha vida e que contriburam muito para o meu crescimento como pessoa. toda minha famlia, em especial minha av Tereza e Tia Eliana, que foram pessoas presentes em todos momentos da minha vida. minha sogra Laurinda e ao meu sogro Aparecido, que so pessoas de uma enorme bondade, sempre me apoiando a seguir em frente no meu futuro profissional. minhas cunhadas Lucinia, Lucilene e Lucimara, pessoas que tenho minha estima considerao, sempre ao meu lado indicando os rumos que deveria seguir para chegar at este momento. Nadir, uma grande pessoa, que torceu para o meu desenvolvimento profissional a cada momento. Equipe do Laboratrio de Engenharia Celular Tata, Andrei, Gabrielle, Rosana, Priscila, Valdir, Daniel, Vitria e at mesmo as pessoas que por ali permaneceram por um tempo como a Ana Paula e Marina, agradeo pela imensa colaborao de todos no desenvolvimento deste trabalho. Ao Ednelson e toda equipe do Laboratrio de Cirurgia Experimental, pela ateno, comprometimento e disponibilidade em todos momentos os quais precisei para poder finalizar este trabalho. minha querida amiga Mjorie, uma pessoa sincera, sempre alegre, persistente, lutadora e de uma bondade extrema. Pode-se dizer que uma pessoa iluminada por Deus. Agradeo imensamente por voc ter me ajudado, pois uma das alegrias da amizade saber em quem confiar. 12

s minhas amigas Tata e Lia, pessoas extremamente confiveis, otimistas, sinceras com esprito fraterno, sempre me ajudando em todos os momentos que precisei. minha querida amiga Prscila, pela sua dedicao, sinceridade e alegria que sempre transmitiu em nossa amizade. amiga Profa. Dra. Rosana Rossi Ferreira, que alm de amizade verdadeira constitui uma grande professora ao longo destes anos. Mara, secretaria do Dr. Hamilton, sempre atenciosa e dedicada, uma grande pessoa que me ajudou em todos momentos. Ao meu amigo Andrei, que me acompanhou desde o incio neste trabalho, sempre ao meu lado, me ajudando. s minhas eternas amigas Cristiane, Marcinha, Marina, pessoas que contriburam muito para que eu pudesse alcanar este objetivo em minha vida. Cleonice, uma pessoa que sempre esteve ao meu lado, ajudando em todos momentos, demonstrando ser minha amiga. Ao Departamento de Cirurgia e Ortopedia pela oportunidade concluso deste curso. Aos funcionrios da Seo de Ps-Graduao da FMB, pela pacincia e comprometimento. Bilbiotecria Meire, pela ateno, eficincia, simpatia e comprometimento. Rita de Cssia Alvarado, por sua dedicao, comprometimento e competncia. s amigas Rejane e Adriana, Laboratrio de Biologia Molecular Hemocentro de Botucatu, por compartilhar os seus conhecimentos.

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Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes instituies:

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico - CNPq

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Prefcio

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PREFCIO

A biomdica Renata optou por defender seu doutoramento no num formato convencional de Tese, e sim com demonstrao de sua trajetria cientfica. So seis trabalhos cientficos, alguns j publicados, que denotam o rduo caminho percorrido pela candidata, no tempo e no espao. Durante alguns anos ela transitou entre o in vitro e o in vivo. Sob a co-orientao de pesquisadores com perfis bastante diversos um clnico-laboratorial, outro cirrgico-experimental no foram poucas as vezes em que ela deve ter duvidado do sentido a seguir. O certo que, apesar desta aparente desvantagem, a candidata soube aproveitar os diferentes pontos de vista para construir sua prpria direo. Esta autonomia a credencia a tornar-se doutora. Seus trabalhos mostram cada passo de seu crescimento. Passam por tcnicas diferentes de captao de condrcitos: clulas mesenquimais e/ou lise de cartilagem diferenciada. Avanam por identificar e utilizar diferentes suportes: alginato e gel de plaquetas. E culminam com a aplicao in vivo (coelhos) do material que ela prpria cultivou. No se pode atribuir toda a responsabilidade a uma s pessoa quando o projeto do qual ela participa envolve numerosas frentes. Mas possvel afirmar a grande catalizadora do processo foi a biomdica Renata. Se no fosse o histrico que envolve o laboratrio de Biologia Celular, as lutas do Prof. Dr. Paulo Machado, da Profa. Dra. Elenice Deffune e tantos outros que contriburam, nada do que foi feito seria possvel.

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A multidisciplinaridade que ainda sobrevive no Campus de Botucatu permitiu a integrao entre Morfologia (Histologia), Bioestatstica, Ortopedia e Traumatologia (Dr. Ricardo), Laboratrio de Cirurgia Experimental, etc.. Por a andou a biomdica Renata. E, por fim, e no menos importante, posso testemunhar que o que permeou a produo de todos os trabalhos aqui apresentados foi o forte sentido tico humano e cientfico O que est dito foi o que se viu.

Prof. Dr. Hamilton da Rosa Pereira 2008

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Sumrio

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Resumo........................................................................................................................... I ...... Abstract............................................................................................................................ II ..... Artigo de Reviso: Regenerao da cartilagem articular uma viso geral................................................................................................................................. 01 Artigo I: Cultura de condrcitos em arcabouo tridimensional: hidrogel de alginato............................................................................................................................ 21 Artigo II: Caracterizao imunohistoqumica da cultura de condrcitos em pellet tridimensional................................................................................................................... 41 ..... Artigo III: Platelet lysate gel (PLG): New methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage Implants 54 Artigo IV: Tratamento de leses osteocondrais da cartilagem articular do joelho atravs da engenharia tecidual: transplante alognico de condrcitos embebidos em gel de plaquetas versus gel de alginato.......................................................................... 68 Artigo VI: Isolamento de clulas-tronco mesenquimais da medula ssea............................................................................................................................... 103

Artigos em Colaborao: Artigo VII: Avaliao de morte programada de clulas:comparao do ndice apopttico progressivo em cultura de condrcitos.......................................................... 106 Artigo VIII: Gel de plaquetas: nova tecnologia em arcabouos 3D para cultivo de cartilagem - engenharia de tecidos.................................................................................. 122

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ResumoA cartilagem articular um tecido avascular com nmeros limitados de condrcitos, com capacidade limitada de reparo aps uma leso aguda. As tcnicas disponveis atualmente para o tratamento de leses de cartilagem articular podem resultar em alvio dos sintomas, mas no na regenerao do tecido lesado. A gerao de um substituto biolgico que recomponha a cartilagem articular nativa requer clulas vivas que sejam capazes de sintetizar e manter a matriz cartilaginosa. A engenharia de tecidos constitui recentemente uma metodologia para reconstruo de novos rgos e tecidos que foram lesados e apresentam dificuldades na reparao. Um dos maiores avanos no campo da engenharia de tecidos e dentro da medicina ortopdica, tem sido, o recrutamento de tecido do prprio paciente, que so dissociados em clulas e cultivadas sobre suportes biolgicos ou sintticos, conhecidos como scaffolds, para posterior realizao de implante de condrcitos, com intuito de regenerar o tecido cartilaginoso lesado. Uma variedade de scaffolds como hidrogel e polmeros sintticos, tm sido investigadas para a expanso dos condrcitos in vitro para o reparo da cartilagem lesada. Tais matrizes incluem: arcabouos base de colgeno: gel de colgeno tipo I e II, esponjas de colgeno tipo II, cido poliltico e cido poligliclico, fibrina, xido de polietileno, fibrina, peptdeos, alginato e gel de plaquetas. No presente trabalho desenvolvemos diferentes metodologias de cultura de condrcitos utilizando scaffold sinttico hidrogel de alginato e biolgico gel de plaquetas obtido a partir do Plasma Rico em Plaquetas - PRP, alm da cultura de condrcitos em pellet tridimensional, objetivando encontrar a melhor metodologia para a realizao de implantes de condrcitos. Como modelo experimental escolhemos coelhos, tanto para coleta da cartilagem articular como para obteno do plasma sangneo e realizao dos implantes alognicos. Em relao cultura celular, obtivemos resultados satisfatrios e termos de viabilidade celular e produo de matriz pericelular da cartilagem, quando utilizamos hidrogel de alginato. Na cultura em gel de plaquetas, os resultados tambm foram satisfatrios no tocante da viabilidade celular e produo de matriz extracelular. A cultura em pellet tri-dimensional demonstrou ser eficiente para estudo da histognese dos condrcitos, constituindo-se de uma massa celular com pouca resistncia. Para a realizao dos implantes em leses osteocondrais efetuadas na cartilagem articular dos animais, utilizou-se como scaffold hidrogel de alginato contendo condrcitos (grupo tratado) ou no (grupo controle) e gel de plaquetas contendo condrcitos (grupo tratado) ou no (grupo controle), implantados respectivamente em joelhos esquerdos e direitos em grupos distintos de animais. Efetuou-se avaliao macroscpica e microscpica dos implantes em um prazo de 30, 60 e 90 dias ps-cirurgia, observando resultados de reparao satisfatrios nos implantes os quais usou-se gel de plaquetas.

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Abstract

Articular cartilage is an avascular tissue with limited numbers of chondrocytes, and limited recuperative capacity after a severe lesion. The techniques currently available for treatment of articular cartilage lesions can result in relief of symptoms, but not in regeneration of injured tissue. The generation of biological substitute that would recompose native articular cartilage requires live cells capable of synthesizing and maintaining cartilaginous matrix. The engineering of tissues has recently constituted a methodology for constructing new organs and tissues that had been injured and present recuperative difficulties. One of the greatest advances in the field of tissue engineering, and within orthopedic medicine, has been the recruitment of tissue from the patient him- or herself, that are dissociated in cells and cultured on biological or synthetic supports, known as scaffolds, for subsequent realization of implantation of chondrocytes, in order to regenerate injured cartilaginous tissue. A variety of scaffolds, such as hydrogel and synthetic polymers, have been investigated for expansion of chondrocytes in vitro to repair injured cartilage. Such matrices include: collagen-based scaffolds: gel of collagen types I and II, sponges of

collagen type II, polylactic acid and polyglycolic acid, fibrin, polyethylene oxide, peptides, alginate and gel of platelets. In the present work we developed different methodologies of chondrocyte culture utilizing the synthetic scaffold alginate hydrogel and biological gel of platelets obtained from Platelet-Rich Plasma - PRP, in addition to chondrocyte culture in a tri-dimensional pellet, aiming to find the best methodology for accomplishing chondrocyte implants. We chose rabbits for the experimental model, as much for collection of articular cartilage as for obtaining blood plasma and realization of allogenic implants. In relation to cell culture, we obtained satisfactory results in terms of cellular viability and production of pericellular matrix of cartilage, by using alginate hydrogel. In platelet gel culture, the results in relation to cell viability and extracellular matrix production were also satisfactory. The culture in tri-dimensional pellet was demonstrated efficient for the study of chondrocyte histogenesis, constituting a cellular mass with little resistance. For the accomplishment of implants in osteochondral lesions induced in articular cartilage of animals, the scaffold consisted of alginate hydrogel containing chondrocytes (treated group) or not (control group) and platelet gel containing chondrocytes (treated group) or not (control group), implanted, respectively, in left and right knees in distinct animal groups. Macroscopic and microscopic evaluations of implants were performed at 30, 60 and 90 days post-surgery, displaying satisfactory recuperative results in implants that used platelet gel.

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Regenerao da Cartilagem Articular Uma Viso Geral [Artigo de Reviso]

Status: a ser submetido a Peridico Nacional Brazilian Journal of Medical and Biological Research

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[Artigo de reviso]

REGENERAO DA CARTILAGEM ARTICULAR UMA VISO GERAL ARTICULAR CARTILAGE REGENERATION - AN OVERVIEW Renata Aparecida de Camargo Bittencourt1; Hamilton Rosa Pereira2; Srgio Lus Felisbino3 ; Elenice Deffune4 Doutoranda do Departamento de Cirurgia e Ortopedia Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 2Professor Assistente Doutor, Departamento de Cirurgia e Ortopedia - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 3 Professor Assistente Doutor, Departamento de Morfologia Instituto de Biocincias UNESP Botucatu./ 4Professora Assistente Doutora, Departamento de Urologia/ Hemocentro - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Endereo para correspondncia: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt, Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP, Hemocentro, Rubio Jnior s/n, Telefone: (14) 38116041, Fax: (14) 38116041, E-mail: rentcourt2000@yahoo.com.br Resumo A limitada capacidade de regenerao da cartilagem articular tem sido caracterizada como uma das maiores preocupaes na rea da ortopedia. Existem vrias metodologias sendo empregadas na tentativa de reparar leses focais da cartilagem articular. Tais metodologias incluem o tratamento cirrgico que vo desde mtodos clssicos de estimulao da medula ssea como desbridamento, perfuraes mltiplas, abrases, microfaturas, at mtodos biolgicos modernos como transplantes periosteais e pericondrais, implante de condrcitos autlogos cultivados e enxertos autlogos osteocondrais. Vrios mtodos biolgicos modernos1

encontram-se associados engenharia de tecidos, tambm conhecida como medicina regenerativa, consistindo na regenerao de rgos e tecidos vivos, atravs do recrutamento de tecidos do prprio paciente, que so dissociados em clulas e cultivadas sobre suportes biolgicos ou sintticos, conhecidos como scaffolds (suportes), para ento serem reinseridos no paciente. Vrios tipos de 23

suportes tm sido utilizados na cultura de condrcitos, dentre eles, hidrogel de alginato, quitosana, fibrina, colgeno, agarose, cido poligliclico, cido poliltico etc... No entanto, cada suporte apresenta propriedades especficas na produo de cartilagem in vitro. As pesquisas que englobam a engenharia tecidual esto amplamente avanadas, trazendo benefcios no que diz respeito ao uso de suportes para o estudo do desenvolvimento do tecido cartilaginoso e aplicao in vivo de tais suportes com o objetivo de regenerar a cartilagem articular.

Palavras chaves: regenerao, cartilagem articular, engenharia de tecidos.

1. Caractersticas do Tecido Cartilaginoso

O tecido cartilaginoso um tipo especializado de tecido conjuntivo de consistncia semi-rgida, avascular, contendo muita matriz extracelular

esparsamente povoada por clulas (condrcitos) (1,2). A matriz cartilaginosa composta por 48% a 62% de colgeno tipo II e 22 a 38% de proteoglicanos (1). Outros tipos de colgenos como V, VI, IX, X e XI, e outros colgenos secundrios fazem parte da composio da matriz cartilaginosa em menor concentrao (3). As glicosaminoglicanas presentes so condroitim-4sulfato, condroitim-6-sulfato, heparam-sulfato e cido hialurnico (4,5). A matriz cartilaginosa divide-se em matriz territorial (em torno das lacunas) e interterritorial. No caso da cartilagem hialina, a matriz territorial composta por grande quantidade de condroitim-sulfato e pouco colgeno, deixando-a basfila, ao passo que, a matriz interterritorial, mais rica em colgeno tipo II e pobre em proteoglicanas (4). Nas zonas intermedirias e profundas da cartilagem articular, a matriz pericelular separada da matriz territorial por uma cpsula fibrosa. Os condrcitos juntamente com a matriz pericelular e a cpsula que os envolvem formam unidades estruturais da cartilagem denominadas cndrons (6). A interao dos condrcitos com a matriz extracelular mantm o fentipo diferenciado dessas clulas (7). No tecido cartilaginoso adulto normal a homeostase da matriz balanceada de forma que no haja nem perda, nem ganho de tecido. Estes processos so controlados por uma variedade de fatores de crescimento como [(Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) e Transforming growth factor-beta (TGF-E)] que estimulam a sntese 24

de agrecana e citocinas como interleucina-1 (IL-1), a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (FNT-D) que estimulam a degradao da matriz (8-10).

2. Estrutura e Funo da Cartilagem Articular Normal:

A cartilagem hialina que reveste a superfcie das articulaes sinoviais pode medir no adulto de 2 a 4mm de espessura, os condrcitos apresentam-se em disposio zonal, a matriz composta de 68 a 85% de gua, o que confere elasticidade ao tecido cartilaginoso (3,11). Macroscopicamente, a cartilagem articular brilhante, lisa, branca e semi-rgida (12). Microscopicamente, a cartilagem articular divide-se em vrias zonas (Figura 1): - Zona superficial: contm clulas fusiformes com estrutura citoplasmtica semelhante ao fibroblasto. Tanto os condrcitos quanto as fibras de colgenos esto organizados paralelamente superfcie articular; Zona intermediria: os condrcitos so arredondados, apresentando

prolongamentos citoplasmticos, e se dispe em filas alongadas e irregulares. As fibras colgenas se organizam de modo perpendicular superfcie articular; - Zona mais profunda: os condrcitos tendem a hipertrofiar e degenerar. Quando observadas pela microscopia eletrnica, h um acmulo de glicognio e material lipdico no citoplasma. H o acmulo de cristais de hidroxiapatita, levando calcificao da matriz cartilaginosa (13). Durante o perodo de crescimento esta regio substituda por tecido sseo, enquanto que as clulas da zona intermediria dividem-se por mitose, permitindo o aumento da epfise ssea (14). As fibras de colgeno, na zona mais profunda, esto firmemente inseridas no osso subcondral, dando estabilidade cartilagem articular (15). As articulaes sinoviais tambm apresentam ligamentos intra e

extracapsulares, e como no caso da articulao do joelho contm meniscos intraarticulares, de natureza fibrocartilaginosa (14).

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Figura 1. Organizao da cartilagem articular. Fonte: Junqueira & Carneiro (2).

2.1. Degenerao da cartilagem articular

As patologias que envolvem leso da cartilagem articular tm freqentemente associadas o prognstico reservado, devido dificuldade de plena regenerao da cartilagem hialina e possvel evoluo para doena articular degenerativa, resultando em hipofuno da articulao e comprometimento e bem estar de um indivduo (16). Vellutini (17) deixa explcita em seu trabalho a importncia da diferenciao entre alteraes cartilaginosas decorrentes do envelhecimento e as de ordem

degenerativa. A cartilagem articular hialina humana de articulaes sinoviais apresenta alteraes progressivas com a idade. Com o envelhecimento h diminuio progressiva e importante do nmero de condrcitos da cartilagem articular, que passa de 24 x 106 clulas por grama de tecido cartilaginoso no feto para 0,4 x 106 no tecido adulto (17). Inmeras alteraes tambm ocorrem na matriz extracelular como diminuio do peso seco do colgeno e desequilbrio nas quantidades de proteoglicanas (17,18). 26

Egri e colaboradores (18) relataram em seu estudo que o tamanho dos condrcitos, o ndice de diviso celular e a taxa de utilizao de oxignio no so afetados pelo processo de envelhecimento, em contrapartida h uma diminuio na atividade sinttica dos condrcitos. A osteoartrite, doena articular degenerativa, artrose ou osteoartrose (OA) , como ainda designada, acomete grande parte da populao acima dos 45 anos. Entre as alteraes morfolgicas, a cartilagem articular perde sua natureza homognea e rompida e fragmentada, com fibrilao, fissuras e ulceraes (10). Quando se trata da histologia do tecido a OA est associada a alteraes do colgeno, de proteoglicanas, da sntese de condrcitos, da hidratao e das propriedades mecnicas da cartilagem. Apesar de no existirem evidncias de alterao do contedo de colgeno, o aumento importante da hidratao tecidual resulta provavelmente do enfraquecimento e ruptura da trama de fibrilas. Desequilbrios entre ativadores e inibidores enzimticos levam degradao da matriz cartilaginosa (17). As metaloproteinases tm grande participao na degradao excessiva dos componentes da matriz (5). Fernandez e colaboradores (19), citam em seu trabalho que a maioria das tentativas teraputicas desenvolvidas, algumas com resultados controversos e at insatisfatrios, objetiva intervir na patogenia, ou seja, agir no metabolismo dos condrcitos, atuar nas citocinas IL-1 e IL-6 e alguns fatores de crescimentos, inibir metaloproteinases, alm de estimular fibras colgenas, proteoglicanas e clulas da matriz, entre outros. As tcnicas de cultura e transplante de condrcitos avaliadas em seu artigo de reviso parecem serem promissoras para o tratamento de leses decorrentes da osteoartrite. Quanto s leses traumticas, estas podem ocorrer diretamente ou indiretamente em conseqncia de uma fratura intra-articular, impacto de alta intensidade ou seguidas de leses no ligamento, afetando a cartilagem articular (20).

2.2. Classificao dos Defeitos da Cartilagem

Outerbridge na dcada de 60 fez uma classificao dos defeitos articulares de acordo com a profundidade da leso (Figura 2); grau 0: normal, grau I: leso articular branda, grau II: leses so caracterizadas por fibrilao, fissuras menor que 1.5 cm

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de dimetro, grau III: leses com fissuras profundas at o osso subcondral; grau IV: leses so diferenciadas por expor o osso subcondral (3,21).

Superfcie articular Osso subcondral Grau I Grau II

Grau III

Grau IV

Figura 2 Classificao dos defeitos articulares. Fonte: Smith e colaboradores (22) - modificado por Bittencourt 2008.

2.3. Processo de Reparo da Cartilagem Articular

O tratamento cirrgico das leses condrais e osteocondrais que acometem articulaes que suportam carga, principalmente o joelho, ainda representa um desafio para a medicina ortopdica. A cicatrizao de uma leso restrita cartilagem hialina articular (defeito condral) no obedece inteiramente s trs fases naturais que so necrose, inflamao e reparao, justamente por causa da sua condio avascular, limitando a capacidade de cicatrizao. Quando se trata de um defeito osteocondral, muito vascularizado, todas as trs fases ocorrem naturalmente. (23). As leses focais da cartilagem articular requerem tratamento cirrgico que vo desde mtodos clssicos de estimulao abrases, da medula ssea at como

desbridamento,

perfuraes

mltiplas,

microfaturas,

mtodos

biolgicos modernos como transplantes periosteais e pericondrais, implante de 28

condrcitos autlogos cultivados (IAC), e enxertos autlogos osteocondrais (20, 21,23). Para a realizao do IAC, a cartilagem das margens da articulao do joelho colhida atravs de artroscopia (Figura 3). Posteriormente, os condrcitos so cultivados durante quatro semanas, e depois so transplantados na rea lesada. As clulas so sustentadas por uma membrana de peristeo retirada da parte superior da tbia. Esta membrana suturada sobre o defeito da cartilagem, antes da injeo dos condrcitos isolados (15,24).

Coleta cartilagem

Implante condrcitos sob peristeo

Figura 3 - Implante Autlogo de Condrcitos (IAC). Fonte: http://cartilagecenter.com/repairing.htm (25) modificado por Bittencourt 2008)

Brittberg e colaboradores (24) foram os pioneiros na realizao do implante de condrcitos autlogos em humanos, obtendo resultados satisfatrios no tratamento de pacientes com leses no cndilo femoral. No entanto o procedimento no foi considerado eficiente para o tratamento de condromalcia patelar. As explicaes mais provveis para o processo de reparao da cartilagem articular atravs do IAC so as seguintes (19): Os condrcitos transplantados repopulariam a rea da leso e sintetizariam matriz cartilaginosa; o peristeo selaria o defeito; O peristeo estimularia a replicao dos condrcitos cultivados e implantados; O peristeo e os condrcitos implantados estimulariam os condrcitos da cartilagem adjacente ou as clulas das camadas calcificadas mais profundas da cartilagem articular a entrarem na rea defeituosa, dividirem-se e reparar o defeito. 29

Recentemente tem-se usado no lugar do peristeo a cola de fibrina (21). Segundo os dados de WROBLE (26) cerca de 80% dos pacientes seguidos num perodo de 5 a 10 anos aps o IAC, tiveram bom ou excelente resultado. Complicaes referentes adeso ou a artrofibrose foram encontrados em 5% deles. Houve registro de falha no transplante em 2% dos pacientes. Outerbridge e colaboradores (27) foram os primeiros a relatarem a tcnica que envolve o enxerto autlogo osteocondral (EAO). Esta tcnica baseada na transferncia de fragmentos de cartilagem de reas do joelho onde no h desgaste e sobrecarga e implante em reas de leso. Entretanto, uma tcnica de uso limitado pelos ortopedistas devido baixa quantidade de doadores disponveis. Outra metodologia o enxerto alognico osteocondral, freqentemente as amostras so obtidas de cadvares podendo causar reaes imunolgicas (20).

Artroplastia Por Abraso

Perfures Na Leso

Coleta do material

Realizao do Enxerto

Enxerto preenchido

Figura 4 Enxerto Autlogo Osteocondral (EAO). Fonte: Smith e colaboradores (22) - modificado por Bittencourt 2008

Shah e colaboradores (21) citaram em seu trabalho de reviso um modelo de algortimo de tratamento de leses na cartilagem articular, de acordo com as tcnicas j existentes na medicina ortopdica (Figura 5). De acordo com os pesquisadores deve-se levar em considerao o tamanho da leso e as caractersticas dos pacientes como idade e nvel de atividade.

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Tamanho da Leso

< 4cm Perfil do Paciente

2

>4cm Perfil do Paciente

2

Baixa Demanda

Alta Demanda

Leses Superficiais

Alta Demanda

Estimulao Medula ssea

EAO

IAC

Enxerto Alognico Osteocondral ou IAC

Falhou

Falhou

EAO Ou IAC

IAC

Figura 5 Algortimo de tratamento de defeitos na cartilagem articular: Estimulao da Medula ssea, Enxerto Autlogo Osteocondral (EAO). Implante Autlogos de Condrcitos (IAC). Fonte: Shah e colaboradores (22) modificado por Bittencourt 2008.

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A tabela 1 representa as vantagens e desvantagens do uso de todos tratamentos em questo para o reparo da cartilagem articular.

Tabela 1 Vantagens e desvantagens dos tratamento que visam reparar leses na cartilagem articular. Fonte: Smith e colaboradores (22), modificada por Bittencourt, 2008.

Tratamento Microfratura

Vantagens x custo alto; x tcnica aplicvel.

Desvantagens x no produz cartilagem hialina confivel; x mobilidade restrita. x morbidade da rea doadora; x reabilitao a longo prazo; x leso na superfcie articular devido ao implante dos fragmentos levando aos processos de inflamao e restrio na mobilidade da articulao. x reaes imunolgicas e transmisso de doenas; x problemas na fixao e viabilidade celular; x reabilitao longa; x leso na superfcie articular devido ao implante dos fragmentos levando aos processos de inflamao e restrio na mobilidade da articulao. x atividades restritas durante um ano para permitir a integrao das clulas; x custo alto; x realizao de dois procedimentos cirrgicos.

Enxerto Osteocondral

Autlogo x alta taxa de sobrevida dos condrcitos na articulao; x caracterticas do tecido cartilaginoso hialino.

Enxerto Alognico x alta taxa de sobrevida Osteocondral dos condrcitos na articulao; x caracterticas do tecido cartilaginoso hialino.

Implante Autlogo Condrcitos

de x caracterstica de tecido cartilaginoso hialino de reparo; x implante de clulas autlogas; x um ano de tratamento.

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3. Engenharia de Tecidos

A tcnica, conhecida como Engenharia de Tecidos, consiste na regenerao de rgos e tecidos vivos, atravs do recrutamento de tecidos do prprio paciente, que so dissociados em clulas e cultivadas sobre suportes biolgicos ou sintticos, conhecidos como scaffolds (suportes, matrizes tridimensionais, arcabouos, estruturas, etc), para ento serem reinseridos no paciente. De uma forma geral, a preparao dos produtos da engenharia de tecidos segue as seguintes etapas (28): x Seleo e processamento do suporte; x Inoculao da populao celular sobre o suporte; x Crescimento do tecido prematuro; x Crescimento do tecido maturado em sistema fisiolgico (bioreator); x Re-implante cirrgico; x Assimilao do produto. O suporte dever ser biocomptivel de maneira que minimize o mximo de reaes imunolgicas, biodegradvel, onde os produtos de degradao no devam ser citotxicos, tumorignicos, nefrotxicos ou causar qualquer outro efeito txico ao organismo (29). Segundo Vert e colaboradores (30) dentro da engenharia de tecidos os termos biodegradao, bioabsoro e bioreabsoro apresentam definies distintas: Biodegradvel: um termo utilizado para polmeros e dispositivos slidos que devido degradao macromolecular sofrem disperso in vivo, mas sem a eliminao dos produtos e subprodutos pelo organismo; Bioreabsorvvel: so materiais polimricos e dispositivos slidos que mostram degradao atravs da diminuio de tamanho e que so reabsorvidos in vivo; ex: materiais que so eliminados por rotas metablicas do organismo. Bioabsorvvel: so materiais polimricos e dispositivos que podem se dissolver em fludos corpreos sem qualquer clivagem das cadeias macromoleculares ou diminuio de massa molecular.

A primeira etapa na engenharia de tecidos inicia-se com o desenvolvimento, seleo e processamento dos suportes para cultura de clulas, que podem ser 33

polmeros naturais (colgeno, agarose, alginato, fibrina, hialuronato, gelatina e glicosaminoglicana) suportes de polmeros sintticos degradveis [poli (D - hidroxi cidos)] (31-33). Existem inmeros suportes que podem ser utilizados na cultura de clulas para produo de tecidos in vitro, todos classificados de acordo com suas caractersticas qumicas, como polmeros base de protenas, polmeros base de carboidratos e polmeros artificiais (tabela 2). Pode-se tambm fazer combinaes entre suportes distintos, efetuando-se algumas alteraes qumicas para produo de matrizes especficas como exemplo o tri-copolmero utilizado na cultura de condrcitos contm trs componentes: gelatina, condroitim sulfatado e hialuranato (20,29). Outras caractersticas so de suma importncia para a escolha de um suporte adequado, como ilustrada na tabela 3.

Tabela 2 Suportes utilizados em engenharia tecidual. Fonte: Hunziker (20), modificada por Bittencourt 2008.

1. Polmeros a base de protenas Fibrina Colgeno Gelatina 2. Polmeros a base de carboidratos cido Poliltico cido Poligliclico Hialuronato Agarose Alginato Quitosana 3. Polmeros Artificiais Dcron (Tereftalato de polietileno) Teflon (politetrafluoroetileno) Fibras de Carbono Hidroxiapatita

34

Tabela 3 Propriedades dos suportes para utilizao em engenharia tecidual. Fonte: Hunziker (20), modificada por Bittencourt 2008.

Propriedades do suporte 1. Porosidade 2. Carreadora

Base Biolgica Migrao Celular Liberao sinalizadoras e transporte de substncias

3. Adeso 4. Biodegradabilidade 5. Estabilidade do volume

Fixao da clula Remodelamento fisiolgico Contorno da superfcie lisa, no caso de reparo da cartilagem articular

6. Biocompatibilidade

Bom contato com os compartimentos do tecido nativo

7. Ligao

Aumenta a integrao entre fibrilas de colgeno nos compartimentos do tecido de reparo e nativo

8. Elasticidade

De acordo com as propriedades do tecido

3.1. Suportes Utilizados na Cultura de Condrcitos

A cultura de condrcitos permite identificar condies sob as quais o reparo da cartilagem ocorre e descobrir meios especficos para a preveno de danos ou mesmo a interrupo de sua destruio e aumentar a celularidade para possvel implante (19). A cultura de condrcitos em um suporte tri-dimensional baseia-se em cultivar os condrcitos em uma matriz artificial, biodegradvel, que pode suportar o crescimento da cartilagem durante alguns meses, enquanto os condrcitos e a matriz se estabelecem, sem a alterao fenotpica. A matriz degrada gradualmente em 8 a 10 semanas aps o implante de cartilagem (15). Vrios sistemas de cultura so usados na expanso dos condrcitos: a denominada cultura de condrcitos em monocamadas, (34) cultura em sistema tridimensional em esponjas de colgeno, fibrina, gel de agarose, hidrogel de alginato, quitosana, etc... (20,29). A cultura de condrcitos em monocamadas, baseada na aderncia destas clulas numa placa de plstico tem algumas desvantagens, pois possvel manter o 35

fentipo condrocitrio por somente algumas semanas. O tecido formado neste tipo de cultura apresenta caractersticas de tecido fibroso ou mais propriamente fibrocartilagem (35). H mais de 20 anos, tm-se usado suportes ou esponjas de colgeno, compostos por fibrilas de colgeno (tipo I ou II). Tal suporte tem sido usado no reparo de leses osteocondrais de coelhos, obtendo-se resultados satisfatrios (20). O suporte de colgeno estimula a produo de colgeno na cultura de condrcitos, sendo que, o uso de colgeno tipo II tem apresentados melhores resultados que matriz contendo colgeno tipo I (36). J a cultura em gel de agarose um mtodo propcio para manuteno da sntese de colgenos tipo II e agrecanas contendo queratan-sulfato que so marcadores do fentipo dos condrcitos (34). No entanto apresenta pobre biodegradabilidade, devido falta de enzimas de degradao nos tecidos de mamferos (29). A quitosana um polissacardeo natural, estruturalmente similar as

gicosaminoglicanas, derivada de carapaas de crustceos, atxica e bioabsorvvel. Na cultura de condrcitos, tem-se demonstrado ser eficiente na manuteno da morfologia dos condrcitos, no entanto, no estimula a proliferao celular (37). Geralmente usada em associao com sulfato de condroitim (20). O gel de fibrina ou cola de fibrina formado atravs da interao entre fibrinognio e trombina (29). Sua formao ocorre no final da cascata de coagulao, onde a trombina converte o fibrinognio solvel em fibrina, formando uma trama fibrilar tridimensional, que pode servir como suporte para cultura de condrcitos e clulas mesenquimais. Apresenta vantagens de biocompatibilidade e biodegradao, principalmente por ser um componente prprio do organismo (38). O suporte de gel de fibrina tem sido empregado no somente para incorporao de condrcitos in vitro quanto in vivo, alm de ser um importante carreador de fatores de crescimento (29). Estudos experimentais utilizando fibrina exgena tm demonstrado a ocorrncia de reaes imunolgicos na aplicao de tal gel (20). O alginato um polissacardeo linear [n - cido gulurnico (G) cido manurnico (M)] arranjado em blocos (Figura 6), aninico isolado e purificado de algas marrons (Phaeophyta), em particular das seguintes espcies: Ascophyllum nodosum, Laminaria digitata e Fucus serratus (34,39,40).

36

Tal hidrogel apresenta a capacidade de gelatinizar-se de maneira reversvel, na presena de clcio ou outros ctions divalentes (34,39,40). Pode ser utilizado na concentrao de 1-20% (29), no entanto a concentrao ideal para prolifero dos condrcitos 1,5% (41). Os condrcitos suspensos em alginato no aderem matriz, facilitando a sua recuperao depois de cultivados, permitindo o estudo da expresso protica e gentica. Atravs deste mtodo, consegue-se manter a expresso do fentipo diferenciado, restaurar condrcitos no diferenciados e formar uma matriz extracelular similar encontrada na cartilagem articular (42). O hidrogel de alginato apresenta caracterstica biocompatvel, podendo ser utilizado na indstria de alimentos, cosmticos, produo de anticorpos monoclonais e produo de cartilagem (40). Haselmann e colaboradores (34), obtiveram excelentes resultados cultivando condrcitos retirados da cartilagem articular bovina em prolas de alginato num perodo de oito meses. Neste trabalho tanto o fentipo dos condrcitos quanto a sntese de colgenos e proteoglicanas foram mantidos identificando-se presena de duas populaes de condrcitos com diferenas morfolgicas dependendo da sua localizao nas prolas de alginato.

Figura 6 - Frmula estrutural do alginato consistindo de resduos do cido manurnico (M) e gulurnico (G) arranjado em blocos lineares. Fonte: http:// curatec.com.br (43).

37

O hialuronato um componente fisiolgico da matriz cartilaginosa, que pode ser usado para formao de suporte para o cultivo de condrcitos. Entretanto, o hialuronato na forma modificada pode comprometer sua biocompatibilidade e pode levar a condrlise. Deste modo, utiliza-se a forma no modificada do hialuronato (20,29). Filova e colaboradores (44), associaram colgeno tipo I, fibrina e hialuronato para produo de um suporte contendo os trs componentes, obtendo resultados satisfatrios no reparo da cartilagem quando utilizaram tal suporte contendo condrcitos autlogos implantados em defeitos osteocondrais do joelho. Os polmeros sintticos que foram mais investigados para serem utilizados como suportes para cultura de condrcitos tm sido poli (D - hidroxi cidos) que incluem o poli (cido ltico) (PLLA), poli (cido gliclico) (PGA) e poli (cido ltico-co-cido gliclico) (PLGA). Esses trs materiais, tm uma longa histria no uso de suturas cirrgicas degradveis e so aprovados para uso em humanos pela Food and Drug Administration (FDA) (29,45). O polmero mais usado na produo de cartilagem o PGA. No entanto existem alguns problemas relacionados a tais suportes: adeso da clula ao polmero, integrao deste ao tecido adjacente mnima e reaes que levam a formao de clulas sinciciais (29).

Concluso

-

A limitada capacidade de regenerao da cartilagem articular ainda continua sendo um grande problema dentro da medicina ortopdica;

-

Vrios mtodos que visam a regenerao da cartilagem articular tm sido descobertos e alguns tm demonstrado resultados satisfatrios no reparo de leses cartilaginosas;

-

As pesquisas que englobam a engenharia tecidual esto amplamente avanadas, trazendo benefcios no que diz respeito ao uso de suportes para o estudo do desenvolvimento do tecido cartilaginoso e aplicao in vivo de tais suportes com o objetivo de regenerar a cartilagem articular.

38

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J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2008 (in press).

41

45.

Sakata

MM,

Alberto-Rincon

MC,

Duek

EA.

Estudo

da

interao

polmero/cartilagem/osso utilizando poli (cido ltico-co-cido gliclico) e poli (pdioxanoma) em cndilo femural de coelhos. Polmeros 2004; 14: 176-180.

42

Cultura de Condrcitos em Arcabouo Tridimensional: Hidrogel de Alginato [Artigo I]

Status: submetido a Peridico Nacional Acta Ortopdica Brasileira

43

[ARTIGO I]

CULTURA DE CONDRCITOS EM ARCABOUO TRIDIMENSIONAL: HIDROGEL DE ALGINATO

CHONDROCYTE CULTURES IN TRI-DIMENSIONAL SCAFFOLD: ALGINATE HYDROGEL

Renata Aparecida de Camargo Bittencourt1 ; Hamilton Rosa Pereira2 ; Srgio Lus Felisbino3 ; Andrei Moroz Deffune6Doutoranda do Departamento de Cirurgia e Ortopedia Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 2Professor Assistente Doutor, Departamento de Cirurgia e Ortopedia - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 3Professor Assistente Doutor, Departamento de Morfologia Instituto de Biocincias UNESP Botucatu./ 4Alunos de Mestrado em Biotecnologia Mdica Hemocentro - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 5Professora Assistente Doutora, Departamento de Urologia/ Hemocentro - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de Botucatu, Laboratrio de Cultura Celular, Hemocentro - UNESP So Paulo - Brasil. Endereo para correspondncia: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt, Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP, Hemocentro, Rubio Jnior s/n, Telefone: (14) 38116041, Fax: (14) 38116041, E-mail: rentcourt2000@yahoo.com.br Agradecimentos: Ns agradecemos Ftima Regina Guimares, Maria Helena Spadot de Lima e Ednelson Henrique Bianchi pela excelente assistncia tcnica em todo desenvolvimento do trabalho.1

4

; Gabrielle Reinoldes Bizarria Guilherme4, Elenice

[Resumo] O hidrogel de alginato tem sido usado como arcabouo na cultura de condrcitos com a propriedade de manter o formato esfrico dessas clulas, o fentipo diferenciado e a expresso de protenas especficas do tecido cartilaginoso. O presente estudo teve como objetivo cultivar condrcitos retirados da articulao do joelho do coelho encapsulados em hidrogel de alginato e caracterizar a produo de matriz extracelular (ECM). A cartilagem articular foi removida do joelho do coelho, com trs a seis meses de idade, fragmentada em pedaos de 1mm e submetida a digesto enzimtica seqencial com tripsina (0,25%), hialuronidase (2mg/mL) e 44

colagenase tipo I (0,45%) a 37C. Aps a digesto enzimtica a suspenso de clulas foi filtrada em filtro de nylon e ressuspensas a uma densidade de 1x106 cls/mL em uma soluo de alginato de sdio a 1,5% (w/v). A suspenso de clulas em alginato no polimerizado foi colocada em uma seringa de 10 cc equipada com uma agulha de 21 g, e posteriormente foi dispensada da seringa por gotejamento dentro da soluo de gelatinizao (CaCl2 - 102 mM), permitindo a polimerizao do alginato. Os hidrogis foram cultivados em meio DMEM-F12 suplementado com cido ascrbico (50 g/mL) e 10% de SBF. A cultura foi mantida em estufa de 37 C em uma atmosfera mida a 5% de CO2 e 95% de ar durante quatro semanas. O meio de cultura foi trocado a cada 2 dias. A distribuio das clulas e a ECM foram acessadas atravs das seces histolgicas coradas com e azul de toluidina hematoxilina e eosina (HE). Observou-se a presena de vrias clulas durante a cultura celular formando grupos de clulas, assemelhando-se a grupos isgenos da cartilagem hialina. Houve um aumento no nmero e na viabilidade dos condrcitos durante as quatro semanas de cultura. Atravs das anlises histolgicas dos hidrogis de alginato corados com azul de toluidina e HE foi possvel observar a distribuio definida dos condrcitos no hidrogel e a formao de matriz territorial. Este estudo demonstrou a eficincia do hidrogel de alginato como arcabouo para ser usado na cultura de condrcitos. Tal arcabouo pode ser aplicvel no reparo de leses na cartilagem articular. Descritores: cartilagem articular, condrcitos, alginatos, hidrogel, regenerao, engenharia tissular.

45

[Abstract] Hydrogels such as alginate have been used for culture of anchorage-independent cells like chondrocytes and can keep chondrocytes in a spherical conformation, supporting differentiated phenotype and expression of cartilage-specific proteins. The aim of this study was acquire chondrocytes culture from rabbit knee articular cartilage encapsulated in alginate beads and to characterize the production of extracelular matrix (ECM). Articular cartilage was obtained from rabbit knee, aged three to six months. Cartilage removed from femoral condyles was diced into small fragments and the chondrocytes were isolated by sequential enzymatic digestion of the ECM with trypsina (0,25%), hyaluronidase (2mg/ml) type I collagenase (0,45%) at 37C. The resulting cell suspension was filtered through a nylon mesh, centrifuged, and the cells ressuspended at density 1x106 cells/mL of 1.5% (w/v) sodium alginate solution. Alginate hidrogels were made by dropping alginate-cell suspension through an injection needle (21g) into CaCl2 suspension (102mM). The beads were cultured in DMEM-F12 medium supplemented with ascorbic acid (50Pg/mL), and 10% SBF, kept in a humidified 5% CO2 incubator at 37C for four weeks. The ECM and cell distributions within alginate hidrogels were assessed from staining with toluidine blue and hematoxyline-eosin (H&E) in the histological sections. The presence of many cells was observed during the cellular culture forming cellular groups, resembling it to isogenous groups of hyaline cartillage. It had an increase in the number and the viability of the chondrocytes during the four weeks of culture. Through the staining of the histological sections of alginate hidrogels with toluidine blue and HE it was possible to observe the well definite distribution of the chondrocytes in the gel and the formation of territorial matrix. In this study, the alginate was shown to be an

46

efficacious scaffold to use in a chondrocytes culture. Such scaffold may be a good application for repairing articular cartilage defects. Key words: cartilage, articular, chondrocytes, alginates, hydrogel,

regeneration, tissue engineering.

Introduo

Uma

vez

danificada,

a

cartilagem

no

cicatriza

espontaneamente,

provavelmente devido baixa eficincia de reparo da rede de colgeno, j que a deficincia das proteoglicanas reversvel (1). Estima-se que cerca de um milho de pessoas por ano necessitam de tratamento relacionado a defeitos em cartilagens, principalmente as das articulaes do joelho (2). Estudos experimentais tm mostrado que h um declnio na atividade de crescimento da cartilagem com o aumento da idade. No entanto, a engenharia de tecidos oferece novas oportunidades para restaurao funcional e estrutural do tecido lesionado (3) Na literatura, relata-se que os condrcitos necessitam de um arcabouo em trs dimenses (3D) para crescerem e preservarem a morfologia e produo de componentes de matriz prprios de condrcitos quando em cultura celular (4). Caso contrrio, quando cultivados em monocamadas, as clulas tendem a aderir ao fundo do recipiente de cultura, e passam por um processo de desdiferenciao, onde adquirem caractersticas morfolgicas e passam a produzir componentes de matriz fibroblsticas como colgeno tipo I (5,6, 7

). Para se conseguir a produo de um

tecido cartilaginoso funcional, crucial evitar a desdiferenciao dos condrcitos durante o processo de engenharia de cartilagem (8).

47

A cultura de condrcitos em um arcabouo tridimensional baseia-se em cultivar tais clulas em uma matriz artificial, biodegradvel, que possa suportar o crescimento da cartilagem durante alguns meses, enquanto os condrcitos e a matriz se estabelecem. O princpio consiste em produzir clulas atravs da matriz para implant-las num defeito articular. A matriz degrada gradualmente em 8 a 10 semanas aps o implante de cartilagem (9). Recentemente, uma variedade de matrizes como hidrogel e polmeros sintticos, tm sido investigadas para a expanso dos condrcitos in vitro para o reparo da cartilagem lesada. Tais matrizes incluem: arcabouos base de colgeno: gel de colgeno tipo I e II, esponjas de colgeno tipo II, cido poliltico e cido poligliclico, fibrina, xido de polietileno, peptdeos e alginato (10, 11). A cultura de condrcitos em hidrogel de alginato constitui o mtodo mais indicado para o isolamento destas clulas (12). O alginato um polissacardeo linear (n - cido gulurnico cido manurnico), aninico, capaz de gelatinizar-se de maneira reversvel, na presena de clcio ou outros ctions divalentes (13, 14). A vantagem deste polissacardeo polimeralizado a sua constituio atxica, biocompatvel e injetvel em modelos animais. Os condrcitos suspendidos em alginato no aderem matriz, facilitando a sua recuperao depois de cultivados, permitindo o estudo da expresso protica e gentica. Atravs deste mtodo, consegue-se manter a expresso do fentipo diferenciado, restaurar condrcitos no diferenciados e formar uma matriz extracelular similar encontrada na cartilagem articular (12,15). O presente estudo teve como objetivo cultivar condrcitos encapsulados em hidrogel de alginato, caracterizar a produo de matriz extracelular (ECM) do tecido

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produzido in vitro para que possivelmente este hidrogel possa ser usado em implantes autlogos visando a regenerao da cartilagem articular lesada.

Materiais e Mtodos

Materiais

Os meios de cultura utilizados foram: DMEM:Hams F12 (Dulbecco`s modified Eagles medium) (1:1), meio Hams F12, soro bovino fetal (SBF), antibiticos: 10U/ml de penicilina G, 10Pg/ml de estreptomicina and 25Pg/ml de anfotericina B, tripsina 0,25%/EDTA, colagenase tipo I, todos obtidos da GIBCO Invitrogen Corporation. cido Algnico Sal Sdio de Baixa Viscosidade obtido de Macrocisti sp, hialuronidase, cido ascrbico todos da Sigma. Cloreto de clcio dihidratado (Fluka) e cloreto de sdio (LABSYNTH).

Animais: Foram utilizados neste estudo 10 coelhos da raa Botucatu com 3 a 6 meses de idade. Os animais foram pesados e em seguida anestesiados com pentobarbital sdico (30 mg/ Kg) administrado nas veias central ou marginal da orelha. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em Pesquisa em Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu segundo o protocolo nq 345.

Isolamento dos Condrcitos: A cartilagem articular foi removida do cndilo femoral, fragmentada em pedaos de r 1mm e submetida a digesto da matriz extracelular com as seguintes enzimas: tripsina (0,25%), hialuronidase (2mg/mL) por 45 minutos cada enzima e colagenase tipo I (0,45%) a 37C por 16 horas. 49

Cultura dos Condrcitos em Hidrogel de Alginato: Aps a digesto enzimtica a suspenso de clulas foi filtrada em filtro de nylon de 70 m, centrifugada, e as clulas foram ressuspendidas a uma densidade de 1x106 cls/mL em uma soluo de alginato de sdio a 1,5% (w/v). A suspenso de clulas em alginato no polimerizado foi colocada em uma seringa de 10 cc equipada com uma agulha de 21 g, e posteriormente foi dispensada da seringa por gotejamento dentro da soluo de gelatinizao (CaCl2 - 102 mM) com moderados movimentos magnticos, permitindo a polimerizao do alginato durante 10 minutos at formar os "hidrogis. A soluo de gelatinizao foi desprezada, e os "hidrogis" foram lavados 3 vezes em 5 vol. de NaCl a 0,15 M. Os hidrogis foram cultivados em meio DMEM-F12 suplementado com cido ascrbico (50 g/mL) e 10% de SBF. A cultura foi mantida em estufa de 37 C em uma atmosfera mida a 5% de CO2 e 95% de ar durante quatro semanas. O meio de cultura foi trocado a cada 2 dias.

Recuperao dos condrcitos aps cultura em hidrogel: a recuperao dos condrcitos do hidrogel para acessar a viabilidade celular foi realizada atravs da dissoluo do hidrogel em citrato de sdio (155mM), por 20 minutos em estufa de 37 C. Posteriormente foi realizada a centrifugao da amostra e diluio na soluo de azul de trpano.

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Contagem e Viabilidade Celular: A contagem de clulas e determinao da viabilidade celular foi realizada utilizando a cmara de Neubauer. O nmero de clulas vitais foi determinado pela tcnica de excluso de clulas no vitais coradas por soluo de azul de trpano, seguindo as recomendaes de Freshney, 2001 (12).

Anlises Morfolgicas: Anlises morfolgicas das clulas foram realizadas rotineiramente utilizando microscopia de fase em microscpio invertido (Axiovert 200 Carl Zeiss). As culturas celulares foram fotografadas semanalmente.

Caracterizao da Matriz Extracelular: Para avaliar a produo dos componentes da matriz extracelular, as amostras foram fixadas em formaldedo a 4%, passadas por solues crescentes de lcool (70%, 95% e 100%), includas em resina Historesina - Leica e posteriormente seccionadas no micrtomo da marca Leica. As seces obtidas foram coradas com azul de toluidina a 0,3%, pH 3.65 e Hematoxilina e Eosina (HE).

Resultados Isolamento dos condrcitos Houve dificuldades na padronizao da digesto enzimtica da cartilagem articular. Nos primeiros ensaios fazia-se a digesto sob agitao utilizando duas enzimas: tripsina e colagenase tipo I, conseguia-se uma baixa celularidade e viabilidade, mdia 60%. Aps tentativas de padronizao, conseguiu-se determinar o uso de trs enzimas para o processo de digesto: tripsina, hialuronidase e colagenase em concentraes e tempos distintos, usando o modelo esttico de digesto. Obteve-se uma viabilidade celular superior a 90% na maioria das amostras digeridas pelo ltimo protocolo. Em todas coletas conseguiu-se obter amostras de cartilagens pesando entre 170mg e 475 mg (Tabela 1). 51

Tabela 1. Valores de peso das bipsias do tecido cartilaginoso, nmero inicial de clulas e viabilidade inicial. Peso da Bipsia (mg) 221 300 391 475 402 326 473 170 234 288 Nmero Inicial de Clulas/mm3 1.600.000 1.780.000 975.000 1.948.000 2.840.000 3.725.000 2.765.000 460.000 590.000 1.186.000 Viabilidade Inicial 99% 94% 63% 97% 93% 92% 99% 96% 84% 94%

Cultura de Condrcitos Quando foram realizadas culturas em monocamadas os condrcitos aps 12 horas de cultura aderiram placa de Petri, formando colnias de clulas com morfologia fibroblastide, indicando a perda do seu fentipo arredondado, conforme demonstrada na Figura 1A e 1B. Os condrcitos desdiferenciados apresentam inicialmente longos filopdios. Aps uma semana de cultura observou-se a confluncia celular na placa de cultura com morfologia fibroblastide (Figura B). Obteve-se 40 hidrogis de alginato em uma mdia de 400 mg de cartilagem articular coletada. Cada hidrogel apresentava 3mm de dimetro Figura 2. Aps a

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polimerizao do hidrogel de alginato foi possvel observar no microscpio a distribuio homognea dos condrcitos em cada hidrogel (Figura 1C). Os condrcitos permaneceram com a morfologia esfrica semelhante cartilagem nativa (Figura 1C e 1D) quando comparados cultura em monocamada (Figura 1A e 1B), mantendo-se fixo no polmero. J nos primeiros dias de cultura a presena de aglomerados celulares nas prolas de alginato, demonstrou a intensa diviso celular, assemelhando-se aos grupos isgenos da cartilagem hialina em formao (Figura 1D). Ao acessar a viabilidade celular semanalmente das prolas de alginato com azul de trpano, pode-se confirmar o aumento da celularidade e a manuteno da viabilidade ao comparar com o nmero de clulas iniciais (Quadro 1). Na quarta semana de cultura observou-se por microscopia a alta celularidade em relao primeira semana e todas os hidrogis estavam intactos, alm da reteno do fentipo arredondado dos condrcitos.

53

1A

B

C

D

Figura 1. Fotomicrografia de contraste de fase. (A) Cultura de condrcitos em monocamada. Observar clulas alongadas e com muitos prolongamentos (seta) (Aumento 1.000x). (B) Cultura em monocamada, confluente aps 2 semanas em cultura, apresentando condrcitos com morfologia fibroblastide (seta) (Aumento 1.000x). (C) Cultura de condrcitos em hidrogel de alginato. A seta indica a delimitao do hidrogel de alginato de caracterstica translcida. No interior dos hidrogis de alginato, observar inmeras estruturas esfricas e arredondadas esbranquiadas que representam a alta celularidade no incio da cultura (Aumento 100x). (D) Observar o fentipo arredondado dos condrcitos (seta) no interior do hidrogel de alginato (Aumento 1.000x).

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Figura 2. (A) Vrias esferas de hidrogel de alginato aps gelatinizao (seta). (B) Uma esfera de hidrogel de alginato com ~3mm de dimetro (seta).

Quadro 1. Viabilidade dos condrcitos cultivados em hidrogel de alginato por 4 semanas102% 100% 98% 96% 94% 92% 90% 88% 86% 84% Ps-Digesto Sem. 1 Sem. 2 Seqncia1 Sem. 3 Sem. 4

Caracterizao da Matriz Extracelular A figura 3A apresenta uma viso ampla de todo hidrogel de alginato corado com azul de toluidina onde demonstra a alta celularidade e a distribuio de forma organizada dos condrcitos dentro do hidrogel. Nas seces histolgicas (Figura 3B e 3C) foi possvel observar uma colorao mais intensa nas reas da matriz pericelular e/ou territorial ao redor dos 55

condrcitos denominando-os de grupos de condrcitos (grupos isgenos). Na figura 3B esta bem evidente a formao da matriz pericelular com formao da lacuna ao redor dos condrcitos e a reteno do fentipo arredondado. A morfologia das lacunas similar ao do tecido cartilaginoso nativo. Na figura 3C observou-se um grupo de condrcitos com alta celularidade indicando a multiplicao dessas clulas no hidrogel, com produo de matriz pericelular e territorial, conforme corado com azul de toluidina. A matriz pericelular e territorial corada com azul de toluidina revelou a produo de proteoglicanas, componente principal desta regio. Conforme demonstrado na figura 3D, seces coradas com HE,

demonstraram no haver a produo da matriz interterritorial, e sim os condrcitos presos em suas lacunas produzindo matriz pericelular e territorial.

56

1A

B

C

D

Figura 3. Anlise histolgica da cultura de condrcitos em hidrogel de alginato. (A, B e C) colorao com azul de toluidina, (D) colorao com HE. (A) Corte histolgico do hidrogel de alginato inteiro, mostrando a distribuio uniforme dos condrcitos no hidrogel (Aumento 25x). (B) Evidncia da formao da matriz pericelular e interterritorial (seta) (Aumento 1.000x). (C) Grupos de condrcitos em diviso (Grupos isgenos) (Aumento 1.400x). (D) Ausncia de matriz territorial (seta) (Aumento 1.000x).

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Discusso A engenharia de tecidos representa um mtodo promissor para a construo de enxertos condrognicos autlogos dentro da cirurgia ortopdica reconstrutiva. A existncia de vrios matrizes e fatores de crescimento especficos proporciona a produo de tecido cartilaginoso in vitro e in vivo. Os condrcitos so clulas que necessitam de cultivo tri-dimensional, para a manuteno do seu fentipo original, pois em monocamadas estas clulas desdiferenciam, produzindo componentes da matriz como o colgeno tipo I caracterstico da fibrocartilagem e no da cartilagem hialina, portanto, sendo conseqncia de alterao da expresso gnica (3). Quando se trabalha com cartilagem articular, o interesse somente tecido cartilaginoso hialino, pois em um implante articular a produo de colgeno tipo I, indica fibrose, ou seja, a transformao do tecido hialino em fibroso. A matriz de alginato pode ser utilizada tanto em implantes como em estudos da condrognese, fato importante para o entendimento da fisiologia do tecido cartilaginoso (10). De acordo com MASUDA(17)

, a cultura de condrcitos em alginato, estabiliza

por at oito meses, o fentipo condroctico dessas clulas. No presente artigo demonstramos resultados de 4 semanas de cultura, mas em outros experimentos conseguimos cultivar condrcitos por at 4 meses sem a perda do fentipo desta clula. A concentrao do alginato influencia muito no metabolismo da clula e difuso dos componentes necessrios provenientes do meio de cultura. A melhor concentrao encontrada em todo experimento foi 1,5%, tendo sido usada 1,0%, 1,2%, 1,5% e 2,%. Outro fator importante que o preparo do alginato deve ser

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realizado no dia, pois em experimentos usando alginato preparado em dias anteriores demonstrou a perda da consistncia do gel e formao de grupo clulas alongadas, adquirindo fentipo fibroblastide. Um estudo realizado por DOMM et al., 2004 demonstrou em seus experimentos que o tipo de alginato pode influenciar na cultura de condrcitos, fato este tambm observado neste trabalho. O tecido cartilaginoso consiste de condrcitos distribudos de maneira esparsa envolvidos por matriz extracelular (ECM). Os condrcitos so responsveis pela manuteno da ECM e conseqentemente do tecido cartilaginoso. A ECM pode ser dividida em compartimentos pericelular, territorial e interterritorial, contendo colgeno tipo II e a proteoglicana agrecana (3). O hidrogel de alginato foi eficiente na manuteno do fentipo dos condrcitos, na proliferao celular, na produo de matriz pericelular e territorial, no entanto, foi considerado ineficiente do ponto de vista de produo de matriz interterritorial. Muitos pesquisadores tm usado o hidrogel de alginato como arcabouo de sustentao dos condrcitos para implante em articulaes lesadas em modelos animais. A vantagem desse hidrogel a sua propriedade atxica e a sua utilizao de maneira injetvel. Tal arcabouo pode ser injetado juntamente com os condrcitos in situ, permitindo a sua gelatinizao com cloreto de clcio no local da leso (3,15). O alginato degradado por vias enzimticas no prprio tecido em duas subunidades monomricas: cido gulurnico e cido manurnico. Neste estudo foi possvel obter dados in vitro do hidrogel de alginato. Para aplicao clnica do hidrogel de alginato, ser necessria a realizao de implantes em reas pr-lesionadas nas articulaes do joelho, usando como modelo animal coelhos, para confirmao da sua eficincia na produo de tecido cartilaginoso hialino in vivo, o que de fato constitui a prxima fase deste estudo.

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Concluso A cultura de condrcitos em hidrogel de alginato demonstrou alta celularidade e um aumento na produo de matriz pericelular e territorial quando comparada a interterritorial. O hidrogel de alginato constituiu um eficiente arcabouo de sustentao e cultura de condrcitos, mantendo seu fentipo arredondado, assemelhando-se a cartilagem nativa, sendo um importante arcabouo para uso em implante articular.

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Referncias Bibliogrficas 1. Lafeber FP, van Roy H, Wilbrink, B, Huber-Bruning O, Bijlsma JW. Human osteoarthritic cartilage is synthetically more active but in culture less vital than normal cartilage. J Rheumatol. 1992; 19:123-9. 2. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science. 1993; 260: 920-926. 3. Goessler UR, Hrmann K, Riedel F. Tissue engineering with chondrocytes and function of the extracellular matrix (Review). Intern J Mol Med. 2004;13: 505-513. 4. Yang IH, Kim, Su-Hyang, Kim, YH, Sun, HJ, Kim SJ, Lee JW. Comparison of phenotypic characterization between alginate bead and pellet culture systems as chondrogenic differentiation models for human mesenchymal stem cells. Yonsei Med. J. 2004; 45: 891-900. 5. Benya P, Shaffer, J.. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the

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immunohistochemical and ultrastructural analysis in comparison with cartilage explants. J. Anat. 2004; 205: 229-237. 9. Bentley G, Minas T. Reviso clnica: tratar a leso articular em jovens. Br. Med. J., London, v. 10, 2001. [cited 22 may 2003]. Available from: URL: http//www.bmj-pt.com 10. Fragonas E, Valente M, Pozzi-Mucelli M, Toffanin R, Rizzo R. Silvestri F,et al. Articular cartilage repair in rabbits by using suspensions of allogenic chondrocytes in alginate. Biomaterials. 2000; 21:795-801. 11. Kisiday J, Jin M, Kurz B, Hung H, Semino C, Zhang S, et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 2002; 99: 9996-10001. 12. Freshney RI. Specialized cells. In: Culture of animal cells: a manual of basic technique. 4th. ed. New York: Wiley-Liss, chap. 22, 2000; 367-370. 13. Huselmann HJ, Fernandes RJ, Mok SS, Schimid TM, Block JA, Aydelotte MB, et al. Phenotypic stability of bovine articular chondrocytes after long-term culture in alginate beads. J. Cell Sci. 1994; 107: 17-27. 14. Mulder L. Cell adhesion on alginate scaffolds for tissue engineering of aortic valve a review. Faculty Biomedical Engineering, Eindhoven University Technology. 2002; 22-34. 15. Park K, Huang J, Azar F, Jin Ri L, Min Byoung-Hyun, Han DK, et al. Scaffold free, engineered porcine cartilage construct for cartilage defect repair in vitro and in vivo study. Artif. Organs. 2006; 30: 586-596. 16. Freshney RI. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd. Ed. New York: Wiley-Liss; 2001. 62

17. Masuda K, Sah RL, Hejna MJ, Thonar EJ. A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate-recovered-chondrocyte (ARC) method. J. Orthop. Res. 2003; 21: 139148. 18. Domm C, Schnke M, Steinhagen J, Freitag S. Kurz B. Influence of various alginate brands on the redifferentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in alginate bead culture under high an low oxygen tension. Tissue Eng. 2004; 10: 1796-1805.

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Caracterizao Imunohistoqumica da Cultura de Condrcitos em Pellet Tridimensional [Artigo II]

Status: a ser submetido a Peridico Nacional Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento

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[Artigo II] CARACTERIZAO IMUNOHISTOQUMICA DA CULTURA DE CONDRCITOS EM PELLET TRIDIMENSIONAL IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF CHONDROCYTE THREEDIMENSIONAL PELLET CULTURE SYSTEM Renata Aparecida de Camargo Bittencourt1; Hamilton Rosa Pereira2; Srgio Lus Felisbino3; Andrei Moroz 4; Elenice Deffune51

Doutoranda do Departamento de Cirurgia e Ortopedia Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 2Professor Assistente Doutor, Departamento de Cirurgia e Ortopedia - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 3 Professor Assistente Doutor, Departamento de Morfologia Instituto de Biocincias UNESP Botucatu./ 4Aluno de Mestrado em Biotecnologia Mdica - Hemocentro - Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP/ 5 Professora Assistente Doutora, Departamento de Urologia/ Hemocentro Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de Botucatu, Laboratrio de Cultura Celular, Hemocentro - UNESP So Paulo - Brasil. Endereo para correspondncia: Renata Aparecida de Camargo Bittencourt, Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP, Hemocentro, Rubio Jnior s/n, Telefone: (14) 38116041, Fax: (14) 38116041, E-mail: rentcourt2000@yahoo.com.br Agradecimentos: Ns agradecemos Ftima Regina Guimares, Maria Helena Spadot de Lima e Ednelson Henrique Bianchi pela excelente assistncia tcnica em todo desenvolvimento do trabalho. Resumo: Neste presente trabalho desenvolvemos um sistema de cultura de condrcitos em pellet, onde os condrcitos ficam condensados similarmente ao processo de condrognese embrionria, e avaliamos a sntese dos componentes da matriz cartilaginosa atravs dos mtodos clssicos de histologia e imunohistoqumica. Condrcitos foram isolados da cartilagem articular de coelhos e cultivados em pellet (2x10 cls por pellet) por 21 dias. Aps 21 dias de cultura, o pellet apresentava um formato discide e volume maior quando comparado ao volume inicial. O fentipo condroctico permaneceu estvel durante o perodo da cultura, pois demonstrou atravs da anlise imunohistoqumica produo de colgeno tipo II e condroitim655

sulfato, alm de morfologia arredondada. Conclumos que, a cartilagem hialina sintetizada pela cultura em pellet, sem o uso de scaffolds, apresentam fentipo similar a cartilagem nativa quanto a morfologia celular e matriz extracelular, sendo importante seu uso no estudo do processo de desenvolvimento do tecido cartilaginoso. Palavras chaves: imunohistoqumica, cultura de condrcitos, pellet, cartilagem articular.

Abstract In the present work we developed a system of chondrocyte culture in pellet, where chondrocytes were condensed similarly to the process of embryonic chondrogenesis, and we evaluated the synthesis of cartilaginous matrix components by classic methods of histology and immunohistochemistry. Chondrocytes were isolated from articular cartilage of rabbits and cultivated in a pellet (2x10 cells per pellet) for 21 days. After 21 days of culture, the pellet presented a discoid form and greater volume when compared to the initial volume. The chondrocytic phenotype remained stable throughout the culture period, as immunohistochemical analysis demonstrated production of collagen type II and chondroitin sulfate, besides rounded morphology. We conclude that hyaline cartilage synthesized by culture in pellet, without the use of scaffolds, presents a phenotype similar to native cartilage in its cellular morphology and extracellular matrix, and its use is important in the study of the development process of cartilaginous tissue. Key words: immunohistochemistry, chondrocyte culture, pellet, articular cartilage.5

Introduo A cartilagem articular um tecido avascular com nmeros limitados de condrcitos, com capacidade limitada de reparo aps uma leso aguda (Kaps et al., 2002, Akeda et al., 2006). H um aumento crescente de doenas degenerativas que acometem a cartilagem, e a freqncia de leses articulares, principalmente em atletas, levando um grande interesse mdico em obter-se um tratamento eficaz da reparao da cartilagem. (Mandelbaum et al.,1998) A engenharia de tecidos uma possvel soluo, pois pode-se expandir os condrcitos de um paciente, e em seguida realizar um transplante autlogo na rea lesada da articulao. Esta possibilidade de isolar clulas do prprio paciente e posteriormente implant-las, 66

para o reparo tecidual, pode resolver um dos maiores problemas a rejeio imunolgica de tecidos e rgos (Carvalho, 2001). Na literatura, relata-se que os condrcitos necessitam de um arcabouo em trs dimenses (3D) para crescerem e preservarem a morfologia e produo de componentes de matriz prprios de condrcitos quando em cultura celular. Caso contrrio, se cultivados em monocamadas, as clulas tendem a aderir ao fundo do recipiente, e passam por um processo de desdiferenciao, onde adquirem caractersticas morfolgicas e passam sintetizar colgeno tipo I, componente da matriz do tecido fibroso (Benya & Shaffer, 1982, Zhang et al., 2004). Assim, perde-se a funcionalidade do tecido. Recentemente, inmeros arcabouos so empregados na cultura de condrcitos: arcabouos base de colgeno: gel de colgeno tipo I e II, esponjas de colgeno tipo II, cido poliltico e cido poligliclico, fibrina, xido de polietileno, peptdeos e alginato (Kisiday et al., 2002). O sistema de cultivo celular em pellets outra maneira de cultivo em 3D que aumenta expresso de glicosaminoglicanas (GAGs) e colgeno II (Capito & Spector, 2006) sem precisar utilizar uma arcabouo artificial, o que diminui os riscos de possveis complicaes por respostas imunes e inflamatrias (Zhang et al., 2004). A condensao dos condrcitos pelo mtodo de centrifugao daria condies ao processo de formao de tecido cartilaginoso in vitro juntamente com o uso de fatores de crescimento especficos como Fator de Crescimento

Transformante-Beta (TGFE), importante no processo de condrognese (Nakayama et al., 2003, Zhang et al., 2004, Capito & Spector, 2006), evitando o processo de desdiferenciao-rediferenciao, mantendo o fentipo da cartilagem hialina (Zhang et al., 2004). Outras vantagens da cultura de condrcitos em pellet so: a utilizao de uma menor densidade celular pr-cultura, simplicidade da tcnica e obteno de tecido cartilaginoso de boa qualidade (Park et al., 2006). O trabalho proposto teve como objetivo cultivar condrcitos em pellet tridimensional e avaliar a produo de matriz cartilaginosa atravs da anlise imunohistoqumica.

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Materiais e Mtodos

Materiais Os materiais utilizados para a realizao das culturas celulares foram: meio de cultura DMEM:Hams F12 (Dulbecco`s modified Eagles medium) (1:1), meio

Hams F12, soro bovino fetal (FBS), antibiticos: 10U/ml de penicilina G, 10ug/ml de estreptomicina and 25Pg/ml de anfotericina B, piruvato de sdio, tripsina 0,25%/EDTA, colagenase tipo I, todos obtidos da GIBCO Invitrogen Corporation, filtros de nylon de 70 m (BD), cido ascrbico e hialuronidase (Sigma), Fator de Crescimento Transformante-E3 (TGFE3) (Sigma), insulina bovina (IOLIN).

Anticorpos usados na anlise em imunohistoqumica (IH): Anticorpos primrios: IgG policlonal (cabra) anti-colgeno tipo I e II, anticorpo secundrio IgG policlonal bovino anti-cabra complexado a HRP, todos da Santa Cruz . Anticorpo primrio monoclonal (camundongo) anti-condroitim sulfato e anticorpo secundrio IgG policlonal bovino anti-camundongo complexado a HRP, albumina de soro bovino (BSA), diaminobenzidina (DAB) e perxido de hidrognio todos da Sigma.

Animais: Foram utilizados neste estudo 5 coelhos da raa Botucatu com 3 a 6 meses de idade. Os animais foram pesados e em seguida anestesiados com pentobarbital sdico (30 mg/ Kg) administrado nas veias central ou marginal da orelha. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em Pesquisa em Animais da Faculdade de Medicina de Botucatu segundo o protocolo nq 345.

Isolamento dos Condrcitos: A cartilagem articular foi removida do cndilo femoral, fragmentada em pedaos de r 1mm e submetida a digesto da matriz extracelular com as seguintes enzimas: tripsina (0,25%), hialuronidase (2mg/mL) por 30 minutos cada enzima e colagenase tipo I (0,45%) a 37C por 16 horas.

Cultura dos condrcitos em pellet tridimensional: Aps a digesto enzimtica a suspenso de clulas foi filtrada em filtro de nylon de 70 m, centrifugada por cinco minutos a 1000 rpm a 4oC por duas vezes, e ressuspensas a uma concentrao final de 2x10 clulas por pellet, em tubos cnicos de polipropileno de 15 mL. O meio de cultura usado foi DMEM-F12 suplementado com cido ascrbico (50 g/mL), 685

TGFE3 (10 ng/mL), 1% de soro bovino fetal, penicilina G (10 U/ml), estreptomicina (10 g/ml) e anfotericina B (25 g/ml), insulina bovina (100 ng/mL) e piruvato de sdio (100 g/mL). Os pellets foram cultivados durante 21 dias em estufa de 37 C em uma atmosfera mida a 5% de CO2 e 95% de ar. As tampas dos tubos ficaram semi-abertas para permitir trocas gasosas. O meio de cultura foi trocado a cada dois dias.

Caracterizao da Matriz Cartilaginosa pelo Mtodo de Imunohistoqumica (IH): Os pellets foram fixados em formaldedo a 10%, includos em parafina e seccionados em micrtomo. Os corantes utilizados foram hematoxilina-eosina (HE), azul de alcian e picrossrius. Para anlise em IH, realizou-se a marcao da matriz extracelular utilizando-se os seguintes anticorpos: anti-colgeno tipo I, anti-colgeno tipo II e anti-condroitim sulfato. Primeiramente as seces foram incubadas com 3% de perxido de hidrognio em metanol para bloquear as peroxidases endgenas. Depois seces individuais foram incubadas com anticorpo primrio (anticorpo IgG policlonal (cabra) anti-colgeno tipo I ou anti-colgeno tipo II), em BSA 1%, e posteriormente anticorpo secundrio (anticorpo IgG policlonal bovino anti-cabra complexado a HRP). A reao foi revelada com diaminobenzidina, e as seces foram coradas com HE. Para a marcao da glicosaminoglicana (GAG) presente na matriz extracelular especfica da cartilagem utilizou-se anticorpo anti-condroitim sulfato marcando primeiramente o anticorpo primrio (anticorpo monoclonal (camundongo) anticondroitim sulfato) e o anticorpo secundrio (anticorpo IgG policlonal bovino anticamundongo complexado a HRP).

Resultados e Discusso

Cultura de Condrcitos em pellet tridimensional Obteve-se cinco pellets em uma mdia de 300 mg de cartilagem articular coletada. A centrifugao a 4qC permitiu uma melhor condensao das clulas, pois em experimentos anteriores os quais utilizou-se a centrifugao a temperatura 69

ambiente, houve uma desagregao celular durante a troca do meio de cultura, desfazendo-se os pellets, por isso optamos por 4qC. Observou-se o crescimento do pellet a cada troca do meio de cultura comparando com o volume inicial, e aps 21 dias a aparncia era hialina, slida com morfologia discide. A engenharia de tecidos representa um mtodo promissor para a construo de enxertos condrognicos autlogos dentro da cirurgia ortopdica reconstrutiva. A existncia de vrios matrizes e fatores de crescimento especficos proporciona a produo de tecido cartilaginoso in vitro e in vivo. Os condrcitos so clulas que necessitam de cultivo tri-dimensional, para a manuteno do seu fentipo original, pois em monocamadas estas clulas desdiferenciam, produzindo componentes da matriz como o colgeno tipo I caracterstico da fibrocartilagem e no da cartilagem hialina. Quando se trabalha com cartilagem articular, o interesse somente tecido cartilaginoso hialino, pois em um implante articular a produo de colgeno tipo I, indica fibrose, ou seja, a transformao do tecido hialino em fibroso. Os membros da superfamlia TGFE desenvolvem uma funo importante na formao da cartilagem durante o perodo embrionrio podendo tambm estimular o reparo da cartilagem in vivo (Ma PX & Langer, 1999). O TGFE uma molcula da matriz extracelular muito abundante na cartilagem articular (Goessler et al., 2004). Quando os condrcitos foram cultivados em pellet, com 10% SBF com ou sem TGFE3, no houve crescimento do pellet. O aumento do pellet s foi possvel aps padronizar o uso de fator de crescimento TGFE3 com SBF a 1%. Provavelmente a concentrao de SBF 1%, permite uma melhor ao do TGFE3. Segundo Zhang et al., 2004, a cultura em pellet imita o processo de embriognese da cartilagem, onde vrias clulas esto em ntimo contato como s clulas mesenquimais no embrio, oferecendo uma melhor interao entre as clulas e clula-matriz. Em seu estudo foi possvel cultivar no sistema em pellet condrcitos obtidos do esterno de embries de galinhas, mantendo o fentipo dos condrcitos e a expresso dos componentes da matriz durante todo o perodo de cultura. No trabalho de Ballock & Reddi, 1994, condrcitos obtidos da epfise de ratos foram cultivados em pellet com fatores de crescimentos especficos, insulina e o hormnio tiroxina, possibilitou o aumento da sntese de colgeno X, a organizao 70

dos condrcitos em um padro colunar, assemelhando-se a cartilagem de crescimento in vivo.

A

B

C

D

Figura 1 Seco histolgica do pellet aps 21 dias de cultura demonstrada pela colorao com hematoxilina e eosina (A e B), azul de alcian (C) e picrossrius (D). Pellet com alta celularidade contendo clulas com morfologia arredondadas especfico do fentipo condroctico (A e B, aumento 40x e 100x respectivamente). Matriz pericelular corada em azul (seta) evidenciando a presena de GAGs ao redor dos condrcitos no corados (C, aumento 100x). Evidencia de focos fibrosos corados em vermelho (seta), correspondendo ao colgeno na matriz interterritorial, e marcao discreta da matriz pericelular (D, aumento 100x).

Caracterizao Imunohistoqumica (IH) da Matriz Extracelular

A seco histolgica do pellet celular corada com HE demonstrou alta celularidade, morfologia arredondada das clulas, caracterstica especfica dos condrcitos (Figura 1A e 1B), semelhante ao trabalho de Capito e Spector, 2006. No se observou a separao das clulas em grupos isgenos observado no trabalho de Capito e Spector, 2006, onde foram observadas as clulas em lacunas. 71

Neste trabalho, os autores testaram diferentes fatores de crescimento, como TGFE1, Fator de Crescimento Derivado das Plaquetas (PDGF). Sabe-se que os TGFEs participam como fatores cruciais no estmulo de produo de GAGs e colgeno tipo II por condrcitos da cartilagem articular (Grimaud et al, 2002; Quiao et al, 2005 ), regulando o reparo de leses de cartilagem por produo de matriz extracelular (Grimaud et al, 2002). A seco histolgica corada com o azul de alcian nos evidencia as GAGs marcadas em azul concentrando-se na regio pericelular, e as regies no coradas (Figura 1C) correspondem aos condrcitos. A seco corada em picrossrius (Figura 1D) tambm evidencia a matriz, embora seja um corante diferencial para colgeno. Nela visualizamos focos fibrosos corados em vermelho, aos quais correspondem ao colg