Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Qumica Qumica Analtica Instrumental II

Tcnicas Cromatogrficas

Diciembre de 2007

Introduccin a los mtodos de separacin

Captulo 1. Introduccin a los mtodos de separacin1.1 Introduccin a la cromatografaEn 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna a diferentes velocidades. Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el experimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de ellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica. Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil: Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un slido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien un lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquidolquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquidolquido. Captulo 1 1

Introduccin a los mtodos de separacinCromatografa de gases. En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte (cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica manera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separacin. De acuerdo con el mecanismo de retencin, la cromatografa se puede clasificar en los siguientes tipos: adsorcin (normal, de fase reversa) particin lquido-lquido intercambio inico permeacin sobre gel de afinidad

Las reas de aplicacin son muy diversas y abarcan prcticamente todas las actividades en las que interviene la qumica, por ejemplo: se emplea en: El anlisis de drogas y frmacos en fluidos biolgicos como la saliva, la sangre, la orina; Seguir la transformacin de las sustancias responsables de la transmisin neurolgica; Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente; Descifrar la composicin de los combustibles fsiles; Realizar el control de calidad de los productos qumicos y farmacuticos manufacturados; en fin, la lista de ejemplos es interminable.

1.2 Cromatografa en papelLa cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la disolucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. La separacin se realiza en funcin de la afinidad de los solutos con las dos fases, las ms solubles en agua se quedarn cerca del punto donde se aplic la muestra, y las menos solubles en agua y ms solubles en el disolvente llegarn ms lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos fsicos o qumicos

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Introduccin a los mtodos de separacinLa cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevar a cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancia. Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de cromatografa, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de separacin de zonas y sectores.

Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas manchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una lmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). =

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En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que ir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentes que se pretenden separar.

1.3 Cromatografa en capa finaLa cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para Captulo 1 3

Introduccin a los mtodos de separacinaplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos. Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente. En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes

No utilizar compuestos muy voltiles. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

(reproducibilidad). La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

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Introduccin a los mtodos de separacinGeneralmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.

1.4 Cromatografa de permeacin en gelLa cromatografa de permeacin en gel, tambin conocida como cromatografa de exclusin es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatogrfica empacada de tal manera que las partculas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaos de poros o de redes de poros con el fin de que las molculas de soluto sean retenidas o excluidas basndose en su forma y tamao y no en el peso molecular. Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de cama de vaco de la fase mvil. Por el contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porque tiene ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca los poros que tienen accesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan pasar. Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estn los polmeros macromoleculares semirgidos, los entrecruzados, las slices rgidas las de poro controlado. Los materiales semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso ya que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen un tamao usual de 5m, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con sistemas no acosos. Captulo 1 5

Introduccin a los mtodos de separacinOtro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una polimerizacin por suspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes orgnicos polares. Disolventes. La cromatografa de exclusin requiere un solo disolvente durante el anlisis en el cual se pueda disolver la muestra. El nico inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la relacin de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad de la fase mvil se pueden dar, una distorsin en los picos cromatogrficos y cambios anmalos en los tiempos de retencin.

1.5 Cromatografa de exclusin de ionesUna variante de la cromatografa de permeacin en gel o cromatografa de exclusin, es cuando se realiza para la exclusin de iones. Mediante esta modificacin, se tienen separaciones que dependen de factores como tamao de partcula de la resina, forma inica e incluso distribucin de ismeros. Esto permite separar especies que de otra forma eluiran al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, cidos minerales diluidos. Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de muestras fisiolgicas en donde la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, puede ser hecho fcilmente mediante el uso de una columna de exclusin aninica. El uso de las columnas de exclusin aninica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separacin de oligosacridos usando agua como eluyente a una temperatura de 90C, aplicando tambin la separacin por exclusin estrica.

1.6 Cromatografa de intercambio inicoLa cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazados permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retencin ms comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo cargado de la fase estacionaria. En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catinicas. Los ms comunes son los sulfnicos, los cuales son fuertemente cidos y tiene las propiedades de los Captulo 1 6

Introduccin a los mtodos de separacincidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el intercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son fuertemente bsicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos funcionales estn totalmente disociados. As, sus propiedades de intercambio son independientes del pH de la fase mvil. La cromatografa de intercambio inico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor, sobre una cuenta de vidrio con dimetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de slice en el que se impregna o enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja: 0.01- 0.1 meq/g. El intercambiador puede tambin estar enlazado a macropartculas de slice por medio de reacciones de sililacin o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso. El proceso primario en la cromatografa de intercambio inico involucra la adsorcin/desorcin de materiales inicos cargados en la fase mvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solucin que contiene iones K+, existe un equilibrio: resina, H + K+ resina, K+ + H+

Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los iones solvatados. La fase de resina presenta preferencia por: 1. El ion de carga mayor. 2. El ion con menor radio solvatado. 3. El ion que tenga mayor polarizabilidad. Aplicaciones de intercambio catinico: Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajos en sodio, y en muestras de orina. Aplicaciones de intercambio aninico: Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico y clorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro. Captulo 1 7

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1.7 Cromatografa de fluidos supercrticosLa temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir en la fase lquida independientemente de la presin. La presin crtica es la presin de vapor de una sustancia a su temperatura crtica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico. Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre las caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en estado lquido. Comparacin de las propiedades de los fluidos supercrticos con las de gases y lquidos. (Los datos slo indican el grado de magnitud).

GAS Densidad (g/cm3) Coeficiente de difusin (cm2/s) Viscosidad (g cm-1 s-1) (0,6-2)*10-3 (1-4) * 10-1 (1-3)* 10-4

FLUIDO SUPERCRTICO 0,2- 0,5 10-3 10-4 (1-3) * 10-4

LQUIDO 0,6- 2 (0,2 2)* 10-5 (0,2- 3)* 10-2

Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases, lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importante de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbono supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segunda propiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser fcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que son baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la atmsfera sin efectos ambientales dainos. La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la cromatografa de gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada una de ellas. Esta tcnica es una de los tres tipos importantes de cromatografa en columna, sta permite la separacin y determinacin de compuestos que no son manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos no voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable y (2) los

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Introduccin a los mtodos de separacincompuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas o electroqumicas empleadas en cromatografa de lquidos. Los equipos instrumentales para la cromatografa de fluidos supercrticos son bastante parecidos en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y adems proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase mvil; (2) un restrictor o un dispositivo de contrapresin, que se utiliza para mantener la presin en la columna en el nivel deseado y para convertir el eluyente, de fluido supercrtico en un gas, y arrastrarlo al detector. Las variaciones de presin en cromatografa de fluidos supercrticos tienen un efecto muy marcado sobre el factor retencin o de capacidad, k. Este efecto es una consecuencia del incremento de la densidad de la fase mvil a medida que aumenta la presin. Tal incremento de la densidad origina un aumento de la capacidad disolvente de la fase mvil, lo cual acorta los tiempos de elucin. La mayora de los perfiles de presin utilizados en cromatografa de fluidos supercrticos son: presin constante (isobrica) para un perodo de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asinttico de la presin hasta alcanzar el valor de la presin final. Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque las primeras son las ms empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de slice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas tienen una longitud de 10 a 20 m y un dimetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la pelcula vara entre 0.05 1 micrmetro. Fases mviles. La fase mvil ms utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de molculas orgnicas no polares. Adems, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no txica, fcilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases mviles cromatogrficas. La temperatura crtica del CO2 ES 31 C y su presin crtica 72,9 atmsferas, lo cual permite jugar con una banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operacin de un equipo de HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, xido nitroso, diclorodifluorometano, ter dietlico, amonaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases mviles de cromatografa de fluidos supercrticos. Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la cromatografa de gases, detectores de ionizacin de llama. Este detector es de respuesta universal a compuestos orgnicos, de elevada sensibilidad. Los espectrmetros de masas tambin se pueden Captulo 1 9

Introduccin a los mtodos de separacinadaptar como detectores ms fcilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de absorcin en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisin de fluorescencia, termoinico y fotomtrico de llama. La cromatografa de fluidos supercrticos se ha aplicado a la separacin de un amplio conjunto de sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, frmacos, alimentos, pesticidas y herbicidas, tensoactivos, polmeros, aditivos de polmeros, combustibles fsiles y explosivos y propelentes.

1.8 Cromatografa de afinidadLa cromatografa de afinidad separa las protenas (analitos) en funcin de su especificidad de fijacin de ligandos. Los ligandos de afinidad son molculas polimricas que sirven de soporte porque estn unidas covalentemente sobre la columna cromatogrfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para as, retener y adsorber especficamente a las protenas, la fase estacionaria es slida. Estos ligandos se clasifican segn su naturaleza qumica o su selectividad para la retencin de analitos, esta ltima se clasifica en ligandos especficos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las protenas no especficas se han lavado a travs de la columna, se eluye la protena ligada con solucin que contiene ligando libre. Despus se introduce una nueva fase mvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteracin de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la fuerza inica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las caractersticas de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la protena para continuar con la regeneracin de la columna cromatogrfica. La cromatografa de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retencin de protenas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presin, columnas cortas y un campo restringido para la separacin. Esquema de cromatografa de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de protenas que se aaden a la columna, la cual contiene un ligando especfico ligado al polmero, para la protena de inters. En el segundo matraz se encuentra una solucin de ligando, el cual se aade a una probeta para que eluya a la protena de inters. La bureta de en medio indica que las protenas deseadas se lavan a travs de la columna. Los puntos rojos representan la protena de inters, los negros, el ligando y las bolas beige unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polmero. Captulo 1 10

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1.9 Cromatografa de lquidos de alta resolucinLa cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de inters en la industria. Algunos ejemplos son: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y gran variedad de sustancias inorgnicas. La fase mvil es un lquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.

1.10 ElectroforesisLos orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separar mezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso al que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquier especie cargada o alrededor de una doble capa elctrica. El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de especies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en funcin de sus cargas y su movilidad inica en ese medio. Cuanto ms elevado sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos de estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente y acumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable. Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc. Captulo 1 11

Introduccin a los mtodos de separacinElectroforesis capilar La seccin transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drstica al realizar la electroforesis en el interior de un tubo capilar de dimetro interno menor a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m. Es efectivo llevar de sta forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin es tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sin calentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado mtodos para llevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas. Adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografa en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y despus de la separacin, cada uno de los analitos est en volmenes inferiores al nanolitro. Con volmenes de lquido tan pequeos, muy pocos mtodos de deteccin se pueden usar eficazmente. Fig. 1. Diagrama de las partes bsicas de un instrumento de electroforesis capilar con deteccin espectroscpica. La muestra penetra por la parte de la izquierda introduciendo el final del capilar en la disolucin de la muestra y cargndolo, bien hidrodinmicamente, bien electrocinticamente. Toda la unidad de la ilustracin funciona a temperatura constante. El capilar est enrollado alrededor de un soporte. Durante el anlisis los niveles de las dos disoluciones tampn deben ser iguales como se indica con la lnea punteada) para evitar el flujo de masa debido a una diferencia de presin.

1.11 Bibliografa Braithwaite, A. Mtodos cromatogrficos, 4 ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Pginas 216217, 271-272. Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jess Hernndez Mndez, Qumica Analtica Cualitativa, Ed. Thompson, Espaa, 2003 pp 321-322. Garrido, A., Fundamentos de qumica biolgica. Interamericana Mc Graw-Hill. Espaa. 1991. Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Anlisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, Espaa 2004, pp 730-739. Lehninger, Albert. L. Principios de Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega. Barcelona, 1995, pp 137 12

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Introduccin a los mtodos de separacin McCABE / SMITH /HARRIOTT. Operaciones Unitarias en Ingeniera Qumica 1991. Cuarta Edicin en Espaol. Editorial McGraw Hill S.A. Espaa PERRY, ROBERT H. Manual del Ingeniero Qumico 1992. Sexta Edicin. Tercera Edicin en Espaol. Editorial McGraw Hill. Mxico Skoog A. Douglas. Principios de anlisis instrumental, 5 ed., Saunders Collage Publishing, Espana, 2001, pgs.: 785- 791 y 831- 836. Willard Hobart, Mtodos instrumentales de anlisis. 7. Ed., Compaa de publicaciones Wadsworth, California, 1988, Pginas 644-650. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht m http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel

http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml

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Parmetros cromatogrficos

Captulo 2 Parmetros cromatogrficos2.1 GlosarioAnchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un separador de banda. Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale de cromatografico o de una columna electrofortica. Coeficiente de difusin: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s. Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases, para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD). Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un mtodo para un interferente dado en comparacin con su sensibilidad para el analito (KA,I). Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy activos en la fase estacionaria. Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligando se disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD). Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor numrico de K depende de la fuerza inica del medio. Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria. Cromatografa gaseosa: tcnica cromatogrfico en la que la fase mvil es un gas. Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen. Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se suele expresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en que la distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianza dividida entre la longitud de la columna del empacado.

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Parmetros cromatogrficosEnsanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza desde el punto de inyeccin al detector. Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k). Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad de la columna para uno de ellos (). Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entre el analito y el interferente. Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posicin fija. Fase mvil: fase extractarte que se desplaza a travs del sistema. Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir su eficiencia. Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una columna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto entre las fases mvil y estacionaria Relacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacin con una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D). Resolucin: separacin entre dos bandas cromatogrficas (R). Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un mtodo que se mide ante el cociente de selectividad del mismo. Tiempo de retencin: es el tiempo entre la inyeccin en una columna cromatogrfica y la llegada a un pico de analito al detector. Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.

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Parmetros cromatogrficosUn parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso, una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodos facilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y la resolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.

2.2 Constantes de DistribucinAl encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un fenmeno de distribucin, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases. De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La constante asociada es la llamada constante de distribucin, que se define para un soluto A como: = 1 2

donde [A]1 y [A]2 son la concentracin de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, en cromatografa la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase mvil y el soluto A es el analito de inters. Esta constante es especfica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase mvil.

2.3 Factores de influencia en la retencinLa retencin que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la mvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas segn su coeficiente de distribucin. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribucin distintos, la retencin ser diferente para cada uno. En la cromatografa de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de retencin del pico de aire. En la cromatografa de lquidos, cualquier compuesto no retenido puede usarse como muestra para medir el to. El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retencin ajustado o corregido, tR. t'R = tR to

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Parmetros cromatogrficosUna medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (o factor de retencin), k = 0

FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.

Los valores de k no tienen un significado simple en un gradiente de elucin o en temperatura programada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k pueden ser determinados a partir del tiempo de retencin, tR. En los modos de retencin de cromatografa se tiene: k > 0, que significa que no hay bandas eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es til expresar el tiempo de retencin o el volumen en trminos del factor de capacidad, k. tR = to (1+ k) VR = Vm (1 + k) La retencin del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan afectar a la misma. El fenmeno de adsorcin depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea sta se fomentar la desorcin, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del anlisis.

2.4 Retencin y Equilibrio en CromatografaEl soluto se encuentra en un equilibrio de distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retencin del mismo. Una separacin cromatogrfica tpica se muestra en la figura 2. La separacin est fuertemente afectada por la proximidad de bandas adyacentes en el cromatograma. Captulo 2 17

Parmetros cromatogrficosUna importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separacin, , donde dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: = k2 / k1 El factor de separacin, , es usualmente identificado con la selectividad del sistema cromatogrfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retencin para dos compuestos especficos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significara que no hay separacin, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retencin muy largos se traducen en tiempo desperdiciado durante la operacin experimental. Los valores de depende de los dos solutos y de 1) La composicin qumica de la fase estacionaria. 2) La composicin qumica de la fase mvil (excepto en cromatografa de gases). 3) La temperatura. En cromatografa de fluidos supercrticos, la presin tambin puede afectar a al cambiar la densidad de la fase mvil.

FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos .

2.5 Eficiencia de separacin de una columnaLas columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El Captulo 2 18

Parmetros cromatogrficosvalor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X: = 2 X

donde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos la anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico. El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por: = donde L es la longitud de la columna. Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es , obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, la ecuacin anterior se convierte en = 16 2 W2 = 2

Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar: = 16 2

La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, con lo cual se puede utilizar = 5.545 1/22

Tambin puede hacerse en funcin de la altura y rea del pico = 2 2

Es importante que tanto , W W1/2 se expresen en las mismas unidades ya que N es adimensional. Captulo 2 19

Parmetros cromatogrficosPara que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados y columnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la fase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener el mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiado tiempo en anlisis.

2.6 Procesos de ensanchamiento de bandaEl nmero de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la banda cromatogrfica. Cuando inyectamos un pequeo volumen de analito en una columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura de pico aumenta con la raz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Segn la ecuacin de Van Deemter = + +

A representa el trmino de caminos mltiples. Esto es porque las molculas no siguen nicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la fase estacionaria y afecta segn el tamao y forma de la partcula. B representa la difusin axial, la cual depende de la movilidad de las molculas en las fases. El soluto se difunde desde la zona central que es la ms concentrada hacia las regiones ms diluidas. En esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el trmino A. Para encontrar la velocidad ptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funcin de v. Por ltimo, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario ste trmino porque en realidad los fenmenos que ocurren estn fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase mvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las molculas de analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.

2.7 ResolucinLa separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se define como

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Parmetros cromatogrficos = 2 1 1 ( + 2 ) 2 1

Aqu, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retencin (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2 son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separacin de dos bandas adyacentes como una funcin de sus valores de Rs y su tamao relativo. Se observa que la separacin mejora sistemticamente a mayores valores de Rs, y la separacin es generalmente mejor para dos bandas de igual tamao (y el mismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirn normalmente para la separacin de las bandas desiguales.

Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.

La resolucin depende de la retencin y selectividad de manera proporcional. A mayor selectividad y retencin k, mayor resolucin. Para tener una buena separacin se recomienda utilizar k > 2, y generalmente se trabaja con 1. Para el anlisis cuantitativo es deseable (pero no siempre prctico) alcanzar la resolucin de al menos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separacin a la lnea base de bandas de tamao similar. La separacin de la lnea base hace que los sistemas de datos midan el tamao de cada banda apropiadamente y esto significa una cuantificacin fiable. Una resolucin pobre puede deberse a que el mtodo utilizado no es apropiado, pues no discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporcin a la columna cromatogrfica. Captulo 2 21

Parmetros cromatogrficos

2.8 Cuantificacin en cromatografaPara llevar a cabo un anlisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables, tanto para la construccin de la curva de calibracin como para el tratamiento del analito mismo. Primero es necesario llevar a cabo un anlisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones ptimas. Para evaluar esto, se calculan los parmetros cromatogrficos de cada ensayo que sirven como referencia. De sta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones posibles, acercndose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo ms exactos que sta tcnica nos permite. Si no se obtiene una buena resolucin, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de muestre, sino puede probarse utilizando una fase mvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo, y analizar la naturaleza qumica de las distintas fases as como solutos, para probar con otra fase sea estacionaria o mvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operacin mejor, y que una vez encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse. Para realizar la curva de calibracin puede usarse el mtodo de estndar externo o interno, siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operacin.

2.9 ResumenLa cromatografa es una tcnica de separacin que se basa en la diferencia de distribucin que existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y mvil. As, cada soluto tendr un tiempo de retencin distinto y podrn analizarse por separado. Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientas que ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo. Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como el factor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nos indicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacin entre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nos indicar la eficiencia del sistema. Una vez evaluados los parmetros cromatogrficos, se podr determinar si el cromatograma obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condicin para optimizarlo. Captulo 2 22

Parmetros cromatogrficos

2.10 BibliografaHeftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edicin, EUA, 1992, pp. 2-14 Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM, Mxico 2002 http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr14/skoog/26d.html

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Captulo 3 Cromatografa en fase lquida a columna abierta3.1 Procedimientos de empaquetamientoEn cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende a travs de la columna. La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un tubo capilar o la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas partculas slidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.

Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.

Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil. Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial, inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan, entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de intercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a un tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico que Captulo 3 Pgina 24

Cromatografa en fase lquida a columna abiertael tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms uniforme posible. El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: 1. Colocacin de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y dimetro apropiados). 2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.

2.2 Aplicacin de la muestraUna vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicacin de la disolucin de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, sta se queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco y, empujado por la disolucin que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el disolvente utilizado para la elusin es el mismo que la disolucin problema, los platos tericos comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase mvil en equilibrio con ellos y las concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona slo es aparente en sus extremos por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene ms espesor de un plato terico.

2.3 Procedimientos de elucinLa diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de los disolventes de acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie eluotrpica. La fuerza eluyente es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valor cero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna.

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Cromatografa en fase lquida a columna abiertaLa cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colas de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto originando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (como el agua), que pueda haber en el eluyente.

2.4 Elucin isocrtica y gradienteLa elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente contino.

Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.

2.5 Cromatografa de absorcin y de particin de columnaEstas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que la retencin del analito en la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito, con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de particin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.6 Cromatografa de adsorcinLa absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie interfacial, formndose una pelcula del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea slido o lquido, aunque este proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas o qumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es solo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica enlaces con el adsorbente. As pues, en la cromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se eliminen. Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de adsorbente, que es la fase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria slida, formando una cama de partculas que se dividen de modo que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largo del slido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorcin. El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si vemos la ilustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la fase slida, los huecos en ella son los sitios de absorcin, donde el analito interacciona con la fase estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de magnesio.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Aplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende deltipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para la separacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestos con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada para separar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambin se ha usado para obtener protenas biliares.

2.7 Cromatografa de particin de columnaEsta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra o cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente afn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase mvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito, donde este se disuelve.

Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa Captulo 3 Pgina 28

Cromatografa en fase lquida a columna abiertade solvente adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la capa de solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta sobre una columna, por ello se le llaman particin de columna.

La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de particin, KD: =

Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.

Aplicaciones.inmiscibles.

Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos

2.8 Cromatografa en gel.La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga durante una migracin osmtica a travs de geles. La filtracin en gel es el mtodo de separacin que consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas. En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica cuyos poros se llenan con el solvente que se usar en la fase mvil. El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel (V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen del lquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm). El volumen de elusin (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: Ve V0 K d Vi Kd es el coeficiente de distribucin volumtrica: K d (Ve V 0) / Vi Kd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gel que es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:

En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta:

K d A B log MLa separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de la red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmeros

entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente suave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el vidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel Captulo 3 Pgina 30

Cromatografa en fase lquida a columna abierta

Aplicaciones. Desalinizacin: Largas molculas de origen biolgico son separadas de especiesionizables o inorgnicas. Un ejemplo en la separacin de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. La cromatografa en gel se utiliza para separar protenas, pptidos, cidos nuclicos, polisacridos, enzimas, hormonas y los qumicos en polmeros, para determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polmeros.

2.9 Cromatografa de intercambio inico.El intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solucin y un slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin. Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional de cadenas polmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin de que se mantenga la electroneutralidad. Una resina tpica se prepara por polimerizacin de estireno y divinilbenceno. Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir fcilmente, tienen el protn disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones positivos. Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina intercambia aniones. Los cambiadores aninicos se preparan con aminas, obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un medio bsico. Las propiedades ms importantes que determinan el funcionamiento de una resina: o o o o Tamao de las partculas velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna. Naturaleza de los grupos funcionales tipo de los iones intercambiables. Fuerza de los grupos funcionales coeficiente de distribucin. Nmero de grupos funcionales capacidad de la resina.

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Cromatografa en fase lquida a columna abiertaA partir de la sustitucin de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de accin de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribucin KD:

KD

K [ HR] [H ]

Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar un intercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:

Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejos de carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos, se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.

Aplicaciones.

Eliminacin de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasndola a

travs de un cambiador de cationes, y despus a travs de un cambiador de aniones. Separacin de aminocidos. La naturaleza anftera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o eliminar la carga neta, de modo que un cido determinado se puede intercambiar en una resina aninica, en una resina catinica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solucin.

2.10 Cromatografa covalenteEs un sistema especial de cromatografa, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolcula a separar, las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.11 Conformacin de la cromatografa covalentea) Ligandos: Se trata de biomolculas que se encuentran en una base slida, siendo estas las responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2 maneras: Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos. b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carcter suficientemente hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica, en especial para trabajar a alta presin, estos soportes generalmente geles orgnicos derivados de los polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.

2.12 Fundamento de la cromatografa de afinidadUn volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en la columna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin especfica entre este ligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la elusin de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en el acoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase mvil que desactiva el acoplamiento por alteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos de esta manera se eluye el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil siendo una etapa rpida.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.13 Cromatografa FlashEs un mtodo cromatogrfico, el cual nos permite separar de una manera rpida, fiable y econmica; principalmente utilizada para la separacin y purificacin de protenas. La Cromatografa Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuracin de las columnas (variables por el usuario), una bomba peristltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiacin ultravioleta para detectar las biomolculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de elusin, las vlvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyeccin de la muestra, la seleccin de la columna o corriente de inversin, y un controlador con una funcin de integracin computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el anlisis.

Aplicaciones.

En farmacia la cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) se utiliza para la

depuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).

2.14 ResumenLas columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de dos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b) Verificacin de compactacin (no espacios vacos). El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolvente empleado para el proceso.

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Cromatografa en fase lquida a columna abiertaLa elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos de elusiones: Elusin por gradiente (cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente) y elusin isocrtica (un solo disolvente). Cromatografa de adsorcin: esta tcnica aprovecha el fenmeno de la absorcin de sustancias en una superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a travs de su superficie. Cromatografa de particin de columna: sta tcnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente qumicamente similar al analito, en el que este queda disuelto y retenido cuando pasa la fase mvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases, en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna. Cromatografa en gel: consiste en la filtracin en gel que consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas. El flujo de la fase mvil del sistema provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el mismo. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. Cromatografa de intercambio inico: el intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga. Cromatografa covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separacin de anticuerpos y enzimas. Cromatografa Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una tcnica muy utilizada en el rea de bioqumica ya que nos permite separar biomolculas y protenas.

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Cromatografa en fase lquida a columna abierta

2.15 BibliografaBERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma edicin, Madrid 1991. HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001. SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001. ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003. SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - New York, 1975. PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981. BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994. http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm

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Cromatografa de gases

Captulo 4 Cromatografa de gasesEsta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar los componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado notablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos) de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido y sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidades muy pequeas de muestra. En cromatografa de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de un fase mvil de un gas inerte a diferencia de los otros tipo de cromatografa, la fase mvil no interaccionan con la molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna.Existen dos tipos de cromatografa de gases:la cromatografa Gas-Slido (GCS) y la cromatografa gas liquido (GLC).La cromatografa gas liquido tiene gran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente como cromatografa de gases (GC). En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionaria como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin del analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte.

4.1 InstrumentacinLos componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran a continuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utiliza cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la presencia de las molculas de analito.

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Cromatografa de gases

Gas portador. Entre los gases portadores

deben ser qumicamente inertes, se encuentran el

helio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de presin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente mediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo de regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo.

Sistema de inyeccin de muestra.

La eficacia de la columna requiere que la muestra

sea de un tamao adecuado y que sea introducida como un de vapor, la inyeccin lenta de la muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .El mtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o de goma de silicona en una cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente esta unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.

Configuracin de la columna y del horno para la columna. En cromatografa degases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la mayor parte de las cromatografa de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la actualidad esta situacin est cambiando rpidamente y parece probable que en un futuro prximo, Captulo 4 38

Cromatografa de gasesexcepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas abiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m de longitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de regularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del grado de separacin requerida.

Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientescaractersticas. 1.- adecuada sensibilidad 2.- buena estabilidad y reproducibilidad 3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud 4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400C 5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal 6.-alta fiabilidad y manejo sencillo 7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o ms tipos de soluto 8.-no destructivo de la muestra.

Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna yque se denomina resolucin de la columna y se define: = 2 2 1 1 + 2

Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuacin queda: = 2 2 1

Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos como para que baste medir slo uno.

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Cromatografa de gasesComo lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa de los solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contiene casi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para el mismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto aumentando el nmero de platos tericos.

Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares osemicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separacin cromatogrfica Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con un dimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000 (platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. La columna est rellena de un material slido (soporte), finamente dividido y homogneo; recubierto, por una capa de 0,05-1 m de espesor, de fase estacionaria lquida. Est configurada en forma helicoidal, con un dimetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado

Fase estacionaria. Eleccin de la fase estacionaria de una columna cromatogrfica ha de reuniruna serie de requisitos como: Baja volatilidad, su punto de ebullicin debe de ser por lo menos 100 C superior a la temperatura mxima de operacin de la columna. Estabilidad trmica. Captulo 4 40o

Cromatografa de gases Inercia qumica. Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estar dentro de los intervalos aconsejados. La separacin en cromatografa gas-lquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto del analito entre la fase mvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una caracterstica muy importante de la fase estacionaria es la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen ms en las fases lquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones. Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las compuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, los alcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y son de baja polaridad los hidrocarburos saturados. Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la fase estacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la fase lquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la presin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullicin) por encima de esta temperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido, suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna. En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero de tomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de punto de ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad de puntos de ebullicin. Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en las columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase lquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase mvil y fase estacionaria. Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m /g); una superficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de las partculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa. Captulo 4 412 o

Cromatografa de gasesLos soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; de vidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos de algas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos. Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen una superficie especfica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO (90%),2 2

tratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb W de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares. Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel, tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no se puede utilizar con compuestos polares. Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en las columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado picos cromatogrficos distorsionados. Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicas polares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el2 3 2

o

H del silanol formando ClH.

Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT,de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto. Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno. Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin Captulo 4 42

Cromatografa de gasesapenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de 2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas. Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones. En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililacin con DMCS. La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la slice empleada.

4.2 Cromatografa gas-slidoEn la cromatografa gas-slido se produce la retencin de los analitos en una fase estacionaria slida como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas-slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de adsorcion), de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas-slido se basa en la adsorcion de sustancias gaseosas sobre superficies slidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografa gas-liquido. En consecuencia la cromatografa gas-slido es til para la separacin de especies que no se retienen en columnas de gas-liquido, tales como los componentes del aire, sulfuro de hidrogeno, disulfuro de carbono, xidos de nitrgeno, monxido de carbono, dixido de carbono y gases nobles. Captulo 4 43

Cromatografa de gasesLa cromatografa gas-slido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas abiertas. En estas ltimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa del adsorbente; estas columnas a veces se denominan columnas abiertas de pared porosa, o columnas PLOT. Se encuentras dos tipos de adsorbente: los tamices moleculares y los polmeros porosos.

4.3 Tamices moleculares.Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamao de poro depende del tipo de catin presente. Los preparados comerciales de esos materiales estn disponibles en tamaos de partcula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican segn el dimetro mximo de las molculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices moleculares comerciales ser encuentran con tamaos de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las molculas ms pequeas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partculas donde tiene lugar la adsorcion, para estas molculas el rea de la superficie disponible es enorme cuando se compara con el rea disponible para las molculas ms grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para separar las molculas pequeas de las grandes. Por ejemplo, un relleno de 5 amstrongs y 183 cm de largo, a temperatura ambiente, separar fcilmente una mezcla de helio, oxigeno, nitrgeno, metano y monxido de carbono en ese orden. En la primer figura de la siguiente hoja se muestra un tpico cromatograma obtenido con tamices moleculares. En esta aplicacin se utilizan dos columnas de relleno: una es una columna de gas-liquido ordinaria y la otra es una columna de tamices moleculares. La primera retiene solamente el dixido de carbono y deja pasar los restantes gases a una velocidad que corresponde a la velocidad del portador. Cuando el dixido de carbono eluye de la primera columna, un conmutador desva el flujo de la segunda columna para evitar la adsorcion permanente del dixido de carbono en los tamices moleculares. Una vez que la seal de dixido de carbono ha vuelto a cero el flujo se reconduce a traves de la segunda columna, y de este modo se produce la separacin y elusin del resto de los componentes de la muestra.

4.4 Polmeros porosos:Las bolitas de los polmeros porosos de tamao uniforme se fabrican a partir de estireno polimerizado con divinilbenceno. El tamao de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por el grado de polimerizacin. Los polmeros porosos han encontrado una gran aplicacin en la separacin de especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, xidos de nitrgeno, agua, dixido de carbono, metanol y cloruro de vinilo. Captulo 4 44

Cromatografa de gasesEn la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicacin caracterstica de una columna abierta revestida con un polmero poroso (columna PLOT).

4.4 Aplicaciones.Se sabe que los cidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de cidos grasos trans aumenta el riesgo de enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupacin por los cidos grasos trans requiere de mtodos precisos y convenientes para el anlisis de productos comerciales. Los mtodos analticos disponibles actualmente incluyen: cromatografa de gases,

espectroscopia de infrarrojo, y cromatografa de gases de capa fina (AgNO3- TLC- GC, por sus siglas en ingls). Dentro de estos mtodos la cromatografa de gases se ha usado preferencialmente dado su conveniencia y su sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno son las fases estacionarias comnmente usadas en el anlisis de cidos grasos trans en correspondencia a la necesidad por una alta resolucin entre los picos de los metil- esteres de los cidos grasos (FAME). Existen varios mtodos analticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los mtodos del AOAC (Asociacin Oficial de Qumicos Agricultores) y AOCS (Asociacin Americana de Qumicos y Aceites) (por sus siglas en ingls). A pesar de que el mtodo de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un tiempo de anlisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificacin de los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos econmicos debidos a el uso de un estndar caro. Por lo tanto debe buscarse un mtodo ms conveniente de GC, particularmente para el propsito de control de calidad.

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Cromatografa de gasesMtodo 1 Columna Fase estacionaria Longitud Dimetro interno Grosor de pelcula Temperatura Inj/Det Gas acarreador Split Volumen inyectado Tiempo de corrida3

Mtodo 2

Mtodo 3 SP-2560

1

TC- 70

TM

(GL- Science)

TM

(Supelco Inc.)

bis cianopropilsiloxano polisilfenileno 30m 0.25mm 0.25m 190C 250C/260C 1 ml/min Helio 100:1 1l 18min 40 min 60m

bis cianopropil polisiloxano 100m 0.25mm 0.20m 180C2

250C/250C 1 ml/min Helio 100:1 1l 74min

Tabla 1. Ejemplo del trabajo hecho por determinacin de cidos grasos trans

Shirasawa y colaboradores para encontrar un mejor mtodo de

1) Prueba control: AOCS celh-05 2) 180C (60 min)- (10C/min)- 220C (10 min) 3) 1% del aceite en hexano. Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupo de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bien identificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemtico entre la poblacin joven y a pesar de que las