mbky ders3
TRANSCRIPT
-
8/8/2019 MBKY ders3
1/19
MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I
DERS 3DERS 3
Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik
BlmBlm
20052005--20062006
-
8/8/2019 MBKY ders3
2/19
NKLEK ASTLERN SAFLIKNKLEK ASTLERN SAFLIK
KONTROLKONTROL
Bu amala kullanlan iki temel yntem:Bu amala kullanlan iki temel yntem:
1)1) SpektralSpektral yntemyntem2)2) ElektroforetikElektroforetik yntemyntem
kullanlrkullanlr
zole edilen DNA ve RNAnn saflk kontrol ve miktarnnzole edilen DNA ve RNAnn saflk kontrol ve miktarnn
belirlenmesi dahabelirlenmesi dahasonra yaplacak almalar iin gereklidirsonra yaplacak almalar iin gereklidir !!!!!!
-
8/8/2019 MBKY ders3
3/19
Spektral YntemSpektral YntemDNA ve RNA miktarnn ve saflnnDNA ve RNA miktarnn ve saflnn
belirlenmesi iin kullanlrbelirlenmesi iin kullanlr
Nkleotidlerin bazlar UV 260 nmdeNkleotidlerin bazlar UV 260 nmdemaksimum dzeyde absorbe etmemaksimum dzeyde absorbe etmezelliinden yaralanarak lm yaplrzelliinden yaralanarak lm yaplr
-
8/8/2019 MBKY ders3
4/19
Spektral YntemSpektral YntemAA260260 = 260nmdeki absorbsiyon deeri= 260nmdeki absorbsiyon deeri
miktar belirlemede kullanlrmiktar belirlemede kullanlr
ift zincirli DNA iin 1 Aift zincirli DNA iin 1 A260260 = 50= 50QQg/mlg/ml
Tek zincirli DNA/RNA iin 1 ATek zincirli DNA/RNA iin 1 A260260 == 4040QQg/mlg/ml
-
8/8/2019 MBKY ders3
5/19
Spektral YntemSpektral Yntem
ift iplikli DNA (Qg/ml)=A260 x sulandrm oran x 50
Tek iplikli DNA ya da RNA (Qg/ml)=A260 x sulandrm oran x 40
Miktar belirlemek iin
-
8/8/2019 MBKY ders3
6/19
Spektral YntemSpektral YntemSaflk belirlemek iin;Saflk belirlemek iin;A260/A280 oranndan
yararlanlr
Proteinler UV 280nmde maksimum absorbeederler
A260/A280=1.95 (saf DNA iin), E.coli iinA260/A280=2 (saf RNA iin)
Fenol, protein gibi safszlklar varlnda deerlerder
-
8/8/2019 MBKY ders3
7/19
Spektral YntemSpektral Yntemspektrofotometrespektrofotometre
-
8/8/2019 MBKY ders3
8/19
Elektroforetik YntemElektroforetik YntemAvantajlarAvantajlar
BasitBasit
HzlHzl
GlGl
Nkleik asit fragmentlerininNkleik asit fragmentleriningsterilebilmesigsterilebilmesi
-
8/8/2019 MBKY ders3
9/19
Elektroforetik YntemElektroforetik YntemElektroforezElektroforez znm haldeki yklznm haldeki ykl
molekllerin elektriksel bir alandamolekllerin elektriksel bir alanda
kitlelerine bal oranda hareket etmelerikitlelerine bal oranda hareket etmeleri(g) ve buna bal olarak birbirlerinden(g) ve buna bal olarak birbirlerindenayrlmalardrayrlmalardr
+_
-
8/8/2019 MBKY ders3
10/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi
Elektrik akm varlnda jele uygulanmElektrik akm varlnda jele uygulanmnegatif yklnegatif ykl DNADNA ntral pHda anodantral pHda anodadoru hareket ederdoru hareket eder
-
8/8/2019 MBKY ders3
11/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Nkleik asitleri ayrmada sklkla kullanlrNkleik asitleri ayrmada sklkla kullanlr Nkleik asitler bir destek materyalineNkleik asitler bir destek materyaline
(matriks) uygulanrlar(matriks) uygulanrlarMatriks materyalleriMatriks materyalleri
AgarozAgaroz PoliakrilamidPoliakrilamid
NiastaNiastaAgarozAgaroz--poliakrilamidpoliakrilamid
-
8/8/2019 MBKY ders3
12/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Kullanlan matriks tipine greKullanlan matriks tipine gre
Agaroz jel elektroforeziAgaroz jel elektroforezi -- Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) --
Matriks konumuna greMatriks konumuna gre Yatay elekroforezYatay elekroforez
Dikey elektroforezDikey elektroforez
DNA
protein
proteinDNA
-
8/8/2019 MBKY ders3
13/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi Jele uygulanm nkleik asitler UV kJele uygulanm nkleik asitler UV k
altnda fluoresan veren boya etidyumaltnda fluoresan veren boya etidyum
bromid (EB)varlnda gzle grlebilirbromid (EB)varlnda gzle grlebilir((bantbant)) parlak bantlar halinde ayrlrlarparlak bantlar halinde ayrlrlar
EBkanserojenEBkanserojen!!!!!!
UV gze zararlUV gze zararl!!!!!!
-
8/8/2019 MBKY ders3
14/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi11--10 ng kadar az miktardaki DNAnn10 ng kadar az miktardaki DNAnnjeldekijeldekiYerini belirlemekYerini belirlemek
Jelden kesip almakJelden kesip almak
mmkndrmmkndr
-
8/8/2019 MBKY ders3
15/19
Jel ElektroforeziJel Elektroforezi1)1) Matriks materyali tarak yerletirilmi olanMatriks materyali tarak yerletirilmi olan
elektroforezelektroforez kasetkasetine dklrine dklr2)2) Matriks donduktan sonraMatriks donduktan sonra taraktarak karlrkarlr
3)3) rneklerin ykleneceirneklerin yklenecei kuyukuyucuklar oluurcuklar oluur4)4) rnek ykleme ii kaset iinde elektroforezrnek ykleme ii kaset iinde elektroforez
tamponu bulunantamponu bulunan tanktankta yaplrta yaplr5)5) EB genellikle jel hazrlanrken eklenirEB genellikle jel hazrlanrken eklenir6)6) Sistemin kapa kapatlrSistemin kapa kapatlr
7)7) ElektrodElektrodlar yerletirilirlar yerletirilir8)8) G kaynaG kaynandan istenen gte akm geirilirndan istenen gte akm geirilir
-
8/8/2019 MBKY ders3
16/19
-
8/8/2019 MBKY ders3
17/19
Jel ElektroforeziJel ElektroforeziAGAROZ JELLERAGAROZ JELLER
HazrlamasHazrlamas kolaykolay Genellikle yatayGenellikle yatay
znrl dkznrl dk
Ayrma alan fazlaAyrma alan fazla 200b200b 50.000 b50.000 b
POLAKRLAMD JELLERPOLAKRLAMD JELLER
Hazrlamas zorHazrlamas zor Genellikle dikeyGenellikle dikey
znrl yksekznrl yksek
1blik fark1blik farkAyrma alan darAyrma alan dar
55--500 b500 b
-
8/8/2019 MBKY ders3
18/19
Agarozun DNA ayrm etkinliiAgarozun DNA ayrm etkinliiAgaroz miktarAgaroz miktar
(% w/v)(% w/v)
Linear DNAnn etkin birLinear DNAnn etkin birbiimde ayrlabileceibiimde ayrlabilecei
boyutboyut
(kb)(kb)0,30,3
0,60,6
0,70,7
0,90,91,21,2
1,51,5
2,02,0
55--6060
11--2020
0,80,8--1010
0,50,5--770,40,4--66
0,20,2--33
0,10,1--22
-
8/8/2019 MBKY ders3
19/19
Poliakrilamid jellerin DNAPoliakrilamid jellerin DNA
ayrma etkinlikleriayrma etkinlikleriAkrilamid
(% [w/v])aEtkin Ayrma
Alan (bp)
Ksilen
Siyanol
FFb
Bromofenol
mavisib
3,5 1000-2000 460 100
5,0 80-500 260 65
8,0 60-400 160 45
12,0 40-200 70 20
15,0 25-150 60 15
20,0 6-100 45 12
a) N,N' metilenbisakrilamid akrilamidin 1/30u kadar
b) Boya ile birlikte g eden ift iplikli DNA molekllerinin baz ifti says