AIX-MARSEILLE UNIVERSITÉ

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

THÈSE DE DOCTORAT

Présentée et soutenue publiquement le 15 juillet 2013 par

Maxime ASSOUS

En vue de l’obtention du grade de :

Docteur d’Aix-Marseille Université Spécialité NEUROSCIENCES

MODELE PROGRESSIF DE LA MALADIE DE PARKINSON APRES DYSFONCTIONNEMENT AIGU DES TRANSPORTEURS DU GLUTAMATE DANS LA

SUBSTANCE NOIRE CHEZ LE RAT. Composition du jury :

Président Pr. André NIEOULLON IBDML, Aix-Marseille Université

Rapporteurs Dr. Erwan BEZARD IMN, Université Victor Segalen Dr. Patrick-Pierre MICHEL ICM, Université Pierre et Marie Curie

Examinateurs Dr. Emmanuel BROUILLET MIRCen, CEA Pr. Philippe DAMIER Hôpital Laennec, CHU Nantes

Co-directeurs de thèse Dr. Lydia KERKERIAN-LE GOFF IBDML, Aix-Marseille Université Dr. Philippe KACHIDIAN IBDML, Aix Marseille Université

AVANT PROPOS

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury qui m’ont fait l’honneur d’évaluer mon

travail et du temps qu’ils y ont accordé. Je remercie le Dr. Erwan Berzard et le Dr. Patrick-

Pierre Michel d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail ainsi que le Dr. Emmanuel

Brouillet et le Pr. Philippe Damier d’avoir examiné ce manuscrit. Je remercie également le

Pr. André Nieoullon de présider ce jury.

Je voudrais adresser un immense merci à toute l’équipe. Vous êtes pour moi plus que des

collègues de travail mais presque une deuxième famille. Dès mon premier passage il y a

maintenant 7 ans j’ai tout de suite senti une ambiance et une convivialité incroyable. On ne

peut espérer de meilleures conditions pour effectuer une thèse. J’ai tellement appris grâce à

vous tous je vous en suis infiniment reconnaissant.

Philippe, c’est en grande partie grâce à toi que j’ai réalisé ce parcours. Je me rappelle de nos

discussions alors que je n’étais qu’en deuxième année de licence venant te voir pour des

conseils d’orientation, ta proposition de venir faire un stage et de découvrir la recherche

dans cette équipe m’a totalement convaincu. Je te remercie également pour ton aide tout au

long de cette thèse, les sessions montage de coupe jusqu’à 1h du mat et les discussions

scientifiques toujours très intéressantes. Je te remercie également de la confiance que tu as

eue en moi, et de l’autonomie que j’ai eu lors de ma thèse. Je te remercie aussi pour le goût

que tu m’as donné de l’enseignement, grâce à ton support j’ai également passé 3 supers

années de monitorat. Enfin, je voulais te remercier pour ton éternelle bonne humeur et le fait

que tu ais toujours veillé à ce que tout se passe bien pour moi notamment au début de cette

thèse. Pour tout ça et pleins d’autres choses encore, je te remercie !

Lydia, je ne sais pas non plus par où commencer, je suis tellement reconnaissant envers tout

ce que tu as pu faire pour moi. Tout le temps que tu m’as accordé dans les préparations des

oraux, rédactionsssss d’articles, et plus récemment de ce manuscrit ! Tu as toujours été d’un

incroyable soutien pendant toute la durée de ma thèse et même avant pendant le master aussi

bien sur le plan moral, que scientifique. J’ai énormément appris grâce à toi, à tous nos

échanges et discussions. Tout le monde peut rêver avoir une chef d’équipe comme toi, et je

n’aurai pu avoir une meilleure formation qu’en partageant ton bureau pendant ces 4 années.

Je voudrais également remercier Paolo, tout d’abord pour avoir accepté de faire les manips

patch de boitedekwak pedeque black substance ! J’ai passé de supers aprems dans ta pièce à

écouter ta musique bizarre et également beaucoup appris ! Je voulais également te remercier

pour ton aide énorme dans toutes les relectures, écritures et critiques de mes travaux ! Enfin

merci encore pour tous les repas/jeux étranges que nous avons faits chez toi, je suis devenu

grâce à ton apprentissage chef second en pâtes carbo et maître en harri coché ! A part les

cheveux, ne changes rien t’es au top !

Un énorme merci également à Pascal ! Mon troisième responsable de thèse ! Merci pour

toute l’influence que tu as eu sur ce travail, toutes les discussions que nous avons eu avec

Philippe pour tenter d’interpréter mes résultats parfois ininterprétables ! Merci pour toute

l’aide que tu m’as apportée en hybridation in situ et pleins d’autres choses… Merci aussi

pout tous ces fous rires à l’heure du repas et pour les sorties en bateau inoubliables lors des

chasses au trésor ! Je n’oublie pas qu’on a un titre à défendre !

Christophe Melon Pastek Tequespax, merci pour tout ! Tu m’as appris toi aussi tellement de

choses entre la stéréotaxie, le comportement, la dialyse, l’HPLC…. et pleins de blagues pas

top et des groupes de musique parfois douteux ! Il ne manque pas grand-chose pour que je

t’appelle Master Melone moi aussi ! Merci aussi pour ta bonne humeur (sauf quand tu râles),

ta gentillesse (sauf quand tu l’es pas), et ta générosité d’auvergnat ! Je me souviendrai de ces

quelques apéros parfois très nocturnes et des concerts que nous avons passé ensemble !

(Passes le bonjour à maman pastek et aux mini pasteks de ma part !)

Annie je voulais également te remercier fortement, tu as été d’une aide énorme notamment

sur la fin de ma thèse sur les manips d’immuno parfois assez compliquées, les expériences de

neurogenèse et pour mon financement de fin de thèse avec protis valor ! Tu es partie à peine

plutôt que moi, ce que ça va faire vide sans nous !! En tout cas, profites bien de ta retraite tu

l’as tellement méritée !

Corinne je voulais également te remercier notamment pour toutes les discussions et échanges

que nous avons eu pendant ma thèse (souvent pendant les pauses clopes !). Merci aussi pour

les soirées et les petits bars à vins que tu m’as fait découvrir (c’est dur à dire de la part d’un

marseillais à une bordelaise)! Je te remercie d’avance également de passer ton été à

m’apprendre l’électrophy (je n’ai pas oublié).

Merci aussi à Florence, pour ton accent, ta bonne humeur quotidienne et pour ton caractère.

C’est vraiment une occupation fantastique de t’embêter, va falloir qu’on s’y remette un peu

avec Pascal ! Merci d’être toujours disponible pour tout le monde dès qu’on a besoin d’un

renseignement ou quoi que ce soit ! Je te souhaite plein de chance pour la suite avec ta belle

petite famille.

Mister Maurice ! Merci également à toi pour ta bonne humeur bretonne, ta gentillesse et tout

ton savoir sur les ganglions de la base ! Ce fut un plaisir de partager avec toi ce colloque à

Paris et les quelques bières que nous avons bues (hors congrès biensur !). J’attends avec

impatience ma formation en électrophy in vivo !

Je remercie également Sylviane pour les échanges que nous avons eus notamment sur

l’enseignement, le métier de maître de conférences et également les mojitos barcelonais !

Merci à toi Katia pour ta gentillesse, ta bonne humeur constante, et l’aide que tu nous

apporte à tous !

Je voudrais également remercier Laurence pour l’aide que tu m’as apportée durant le début

de ma thèse et notamment pour la réalisation des dosages biochimiques.

Ce passage dans ce labo restera inoubliable grâce aux maintenant « anciens » du Labo, de

véritables amis. Merci à Delphine, Loréline et j’inclus Romain dans la bande pour tout votre

soutien au labo (bravo pour m’avoir supporté et même partagé le bureau !) et surtout merci

pour tous ces bons moments passés ensemble entre les repas, les week ends skis ou à

L’Ayguades. Merci à Loréline et Romain de m’avoir offert un magnifique cadeau, celui d’être

parrain d’une incroyablement belle petite Sasha ! Merci également à Khaled, je te souhaite

pleins de bonnes choses pour ton nouveau post-doc !

Je remercie également tous mes amis, qui sont là depuis un nombre d’années qu’on ne

compte même plus. Merci à Nono, Kino, Toc, Olive, Ro, Loule, Geo, Chou, Ziz… Malgré

toutes les années et les occupations de chacun on reste toujours aussi proche, et c’est

toujours aussi agréable de vous voir tous !

Un merci particulier va à Louise, je te remercie pour tout ce que tu fais pour moi (surtout en

ce moment !), de ton soutien permanent et des moments superbes que je passe en ta présence

et pour tous les moments qui restent à venir…

Je remercie énormément ma famille, Mattias et Chloé vous êtes des frère et sœur au top,

toujours là lorsque l’on a besoin de vous et pour me faire décompresser quand j’en avais

besoin !

Un immense merci va à mes parents, merci pour votre soutien pendant ces longues années

d’études, merci de m’avoir toujours conforté dans mes choix et de vous occuper de nous à la

perfection. Vous avez toujours veillé à ce qu’on puisse faire ce qu’on avait envie et fait en

sorte que l’on y arrive du mieux possible. C’est essentiellement grâce à vous que je suis

arrivé là où j’en suis. Je remercie également tout le reste de la famille, marseillaise, belge

notamment mon petit filleul Simon qui grandit à une vitesse incroyable !

LISTE DES

ABREVIATIONS

3-MT 3-méthoxytyramine

6-OHDA 6-hydroxydopamine

AAV Virus adéno-associé

AHP After hyperpolarisation

AMPA alpha-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate

AMPc Adénosine mono-phophate cyclique

AMPD 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol

ANOVA Analyse de variance

APV acide (2R)-amino-5-phosphonovalerique

ASCT1/2 Alanine/Serine/Cysteine/Threonine Transporter

ATD Domaine N-terminal

CTD Domaine C-terminal

ATP adenosine triphosphate

ATV aire tegmentale ventrale

BDNF Brain-derived neurotrophic factor

BO bulbe olfactif

BrDU bromodéoxyuridine

CBP CREB binding protein

CL Corps de Lewy

COMT Catechol-O-methyl transferase

COX Cyclo-oxygénase

CREB C-AMP Response Element-binding protein

DA dopamine

DAB 3,3'-Diaminobenzidine

DAT transporteur de la dopamine

DO densité optique

DOPAC 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid

EAAC1 Excitatory amino-acid carrier 1

EAATs transporteurs d’acides aminés excitateurs

EDTA acide ethylenediaminetetraacetique

EGF Facteur de croissance épidermique

En1/2 Engrailed 1/2

EP entopédonculaire

EPSP potential postsynaptique excitateur

ERK Extracellular signal-regulated kinases

FMT faisceau médian du télencéphale

FOXO Forkhead box O

FRET Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

GABA Acide γ-aminobutyrique

GAD Glutamic Acid Decarboxylase

GB ganglions de la base

GCL glutamylcysteine ligase

GLAST glutamate aspartate transporter

GLT-1 glial glutamate transporter 1

GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor

GFAP Glial fibrillary acidic protein

GFP green fluorescent protein

GP globus pallidus

GPe globus pallidus externe

GPi globus pallidus interne

GPNA Glutamyl-P-Nitroanilide

GPx glutathion peroxydase

GSH glutathion total ou forme réduite

GSSG forme oxydée du glutathion

GST glutathion S-transférase

GTRAP protéine associée aux transporteurs du glutamate

HEPES acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique

HIS hybridation in situ

HPLC Chromatographie liquide à haute performance

HSP90 heat shock protein 90

HVA acide homovanillique

Iba-1 ionized calcium binding adaptor molecule 1

IL-1 interleukine 1

ILBD incidental Lewy Body Disease.

iNOS NO Synthase inductible

jpi jours post-injection

KO knockout

LBP protéine de liaison au lipopolysaccharide

LCR liquide céphalorachidien

L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine

LPS lipopolysaccharide

LRRK2 Leucine-rich repeat kinase 2

MAO monoamine oxydase

MAP1-LC3A Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A

mGluRs récepteurs métabotropiques du glutamate

Mn-SOD superoxide dismutase à manganèse

MP maladie de Parkinson

MPDP+ 1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridinium

MPO myeloperoxydase

MPP+ 1-methyl-4-phenylpyridinium

MPPP 1-Methyl-4-phenyl-4-propionoxypiperidine

MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

NAC N-acétylcystéine

NL Neurites de Lewy

NMDA acide N-méthyl-D-aspartique

NST noyau subthalamique

Nurr1 Nuclear receptor related 1

PB tampon phosphate

PDC L-trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylate

PFA paraformaldéhyde

PHH3 Phosphohistone-H3

PINK1 PTEN induced putative kinase 1

Pitx3 Pituitary homeobox 3

PK protein kinase

PPN noyau pedonculopontin

PSA-NCAM Poly-Sialated Neural Cell Adhesion Molecule

RCPG récepteur couple aux protein G

RMS Flux de migration rostral

RNS espèces réactives pour le nitrogène

ROS espèces réactives pour l’oxygène

SEM Standard Error of Mean

Sesn2 Sestrin-2

SLA sclérose latérale amyotrphique

SLC solute carrier family

SN substance noire

SNc substance noire pars compacta

SNC système nerveux central

SNE système nerveux entérique

SNr substance noire pars reticulata

SOD superoxide dismutase

Srxn1 Sulfiredoxin-1

SSC Standard Saline Citrate

SUP système ubiquitine protéasome

TBARs Thiobarbituric acid reactive substances

Tfam facteur de transcription mitochondrial A

TGF facteur de croissance transformant

TH tyrosine hydroxylase

TLR-4 Toll like receptor 4

TNF tumor necrosis factor

TORC transducer of regulated CREB activity

TRP transient receptor potential

TTX Tétrodotoxine

Txnip Thioredoxin interacting protein

UCH-L1 Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1

VDAC Voltage-dependent anion channel

VGLUT transporteurs vésiculaires du glutamate

VL noyau ventrolatéral du thalamus

VM noyau ventromédian du thalamus

VMAT transporteur vésiculaire des monoamines

VSOAC volume-sensitive organic osmolyte-anion channel

WPRE Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element

ZSG zone sous-granulaire

ZSV zone sous-ventriculaire

γ-GT gamma glutamyl transpeptidase

SOMMAIRE

INTRODUCTION...............................................................................................................

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES..............................................................................

I. LES GANGLIONS DE LA BASE................................................................................

II. LES NEURONES DOPAMINERGIQUES…………………………………………. 2.1. La synapse dopaminergique…………………...………………….………………..

2.1.1. Biosynthèse, stockage et libération de dopamine………………………… 2.1.2. Les récepteurs à la dopamine………………………………………………. 2.1.3. Inactivation de la dopamine………………………………………………….

2.2. Connectivité des neurones dopaminergiques........................................................... 2.2.1. Les afférences des neurones dopaminergiques………………………………

2.2.1.1. Les afférences GABAergiques………………………………….. 2.2.1.1.1. En provenance du striatum................................................ 2.2.1.1.2. En provenance du globus pallidus.................................... 2.2.1.1.3. En provenance de la SNr………………………………...

2.2.1.2. Les afférences cholinergiques et glutamatergiques…………….. 2.2.1.2.1. En provenance du noyau pedonculopontin…………….. 2.2.1.2.2. En provenance du noyau latéro dorsal tegmental……….

2.2.1.3. Les autres afférences glutamatergiques......................................... 2.2.1.3.1. En provenance du cortex.................................................. 2.2.1.3.2. En provenance du noyau subthalamique...........................

2.2.2. Les efférences des neurones dopaminergiques................................................ 2.2.2.1. Vers le striatum............................................................................ 2.2.2.2. Vers le GP, l’EP, le NST………………………………………. 2.2.2.3. Vers la SN.................................................................................... 2.2.2.4. Vers le cortex...............................................................................

2.3. Propriétés électrophysiologiques des neurones dopaminergiques........................... 2.3.1. Propriétés électrophysiologiques de base........................................................ 2.3.2. Activité de décharge in vivo………………………………………………… 2.3.3. Activité de décharge in vitro………………………………………………………

2.3.3.1. Canaux sous-tendant les propriétés pacemaker…………………

III. LA MALADIE DE PARKINSON........................................................................... 3.1. Généralités…………………………………………………………………………. 3.2. Caractéristiques neuropathologiques de la maladie de Parkinson………………….

3.2.1. Pertes neuronales centrales………………………………………………….. 3.2.1.1. Atteinte des neurones dopaminergiques mésencéphaliques.......... 3.2.1.2. Atteintes centrales non-dopaminergiques.....................................

3.2.2. Corps de Lewy……………………………………………………………… 3.2.3. Pertes neuronales dans le système nerveux périphérique……………………

3.3. Pathophysiologie des troubles moteurs parkinsoniens : modifications fonctionnelles dans les ganglions de la base……………………….

3.4. Pathogenèse de la maladie de Parkinson………………………………………….

1

9

11

14 15 15 19 21 24 24 24 24 24 25 26 26 27 27 27 28 29 29 29 30 31 31 32 32 33 34

37 37 39 39 39 42 42 43 45 47

3.4.1. Stress oxydatif................................................................................................. 3.4.1.1. Facteurs pouvant contribuer à la genèse du stress oxydatif…….. 3.4.1.2. Etat des défenses anti-oxydantes : réduction des taux de

glutathion………………………………………………………. 3.4.1.3. Le glutathion : synthèse, métabolisme et rôles…………………. 3.4.1.4. Déplétion en glutathion et maladie de Parkinson……………….

3.4.2. Dysfonctionnement mitochondrial.................................................................. 3.4.3. Dysfonctionnement du système ubiquitine/protéasome.................................. 3.4.4. Neuroinflammation.......................................................................................... 3.4.5. Excitotoxicité...................................................................................................

3.4.5.1. Mécanismes.................................................................................... 3.4.5.2. Implications pathologiques............................................................

3.5. Neurogenèse et maladie de Parkinson.......................................................................

IV. MODELES ANIMAUX DE LA MALADIE DE PARKINSON…………………….. 4.1. Modèles pharmacologiques et neurotoxiques...........................................................

4.1.1. Reserpine......................................................................................................... 4.1.2. Haloperidol...................................................................................................... 4.1.3. 6-OHDA.......................................................................................................... 4.1.4. MPTP............................................................................................................... 4.1.5. Rotenone.......................................................................................................... 4.1.6. Paraquat........................................................................................................... 4.1.7. Lipopolysaccharide..........................................................................................

4.2. Modèles génétiques................................................................................................... 4.2.1. Modèles utilisant la transgenèse......................................................................

4.2.1.1. Modèles α-synucléine.................................................................... 4.2.1.2. Modèles parkine, PINK1, DJ-1...................................................... 4.2.1.3. Modèles LRRK2............................................................................

4.2.2. Modèles utilisant des vecteurs viraux.............................................................. 4.2.2.1. Surexpression de l’α-synucléine par virus adéno-associé………. 4.2.2.2. Surexpression de LRRK2..............................................................

4.2.3. Autres modèles génétiques..............................................................................

V. LA TRANSMISSION GLUTAMATERGIQUE........................................................... 5.1. Synthèse du glutamate……………………………………………………………… 5.2. Libération du glutamate.............................................................................................

5.2.1. Libération vésiculaire...................................................................................... 5.2.2. Libération par inversion du transport.............................................................. 5.2.3. Autres modes de liberation..............................................................................

5.3. Les récepteurs du glutamate....................................................................................... 5.3.1. Généralités....................................................................................................... 5.3.2. Les récepteurs NMDA.....................................................................................

5.3.2.1. Structure......................................................................................... 5.3.2.2. Localisation....................................................................................

48 50 52 53 54 57 60 63 67 67 69 71

75 76 76 77 77 81 86 87 89 93 93 93 94 95 96 96 98 98

100 102 103 103 104 105 106 106 109 110 111

5.3.2.3. Caractéristiques fonctionnelles...................................................... 5.3.2.4. Localisation synaptique vs. extrasynaptique et survie ou

mort neuronale…………………………………………………

VI. TRANSPORT A HAUTE AFFINITE DU GLUTAMATE DANS LE SNC………. 6.1. La famille des transporteurs du glutamate…………………………………………. 6.2. Mécanismes du transport du glutamate...................................................................... 6.3. Activité de canal ionique des transporteurs du glutamate…………………………. 6.4. Structure des transporteurs du glutamate................................................................... 6.5. Expression des transporteurs du glutamate................................................................

6.5.1. Expression de GLT1/EAAT2.......................................................................... 6.5.2. Expression de GLAST/EAAT1...................................................................... 6.5.3. Expression de EAAC1/EAAT3...................................................................... 6.5.4. Expression de EAAT4..................................................................................... 6.5.5. Expression de EAAT5.....................................................................................

6.6. Régulation des transporteurs du glutamate................................................................ 6.7. Rôles des transporteurs du glutamate........................................................................

6.7.1. Rôle dans la transmission glutamatergique..................................................... 6.7.2. Rôle métabolique.............................................................................................

6.8. Transporteurs du glutamate et atteintes neurologiques…………………………….

MATERIELS ET METHODES..........................................................................

I. LES ANIMAUX............................................................................................................... 1.1. Les rats....................................................................................................................... 1.2. Les souris...................................................................................................................

II. CHIRURGIE STEREOTAXIQUE ET TRAITEMENTS PHARMACOLOGIQUES................................................................................................ 2.1. Injection intranigrale unilatérale de PDC et des antagonistes des récepteurs

NMDA…………………………………………………………………………… 2.2. Implantation des guides de microdialyse…………………………………………... 2.3. Traitement à la N-acétylcystéine................................................................................ 2.4. Injection intrapéritonéale de BrDU........................................................................

III. TESTS COMPORTEMENTAUX.................................................................................. 3.1. Le test du cylindre...................................................................................................... 3.2. Le test de l’open-field................................................................................................

IV. APPROCHES BIOCHIMIQUES.................................................................................... 4.1. La microdialyse intracérébrale chez l’animal éveillé………………………………

4.1.1. Principe........................................................................................................... 4.1.2. Procédure expérimentale et dispositif...........................................................

4.1.2.1. Sondes utilisées et rendement....................................................... 4.1.2.2. Liquide de perfusion..................................................................... 4.1.2.3. Recueil des échantillons................................................................

113 115

121 122 123 124 125 127 127 128 129 131 131 132 134 135 137 139

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145 145 145

146 146 147 148 148

149 149 150

151 151 151 152 152 153 153

4.2. Mesure des taux extracellulaires de dopamine……………………………………... 4.3. Dosage du glutathion et enzymes associées………………………………………...

V. APPROCHES MORPHOLOGIQUES........................................................................... 5.1. Préparation des tissus.................................................................................................

5.1.1. Tissus perfusés................................................................................................. 5.1.2. Tissus non perfusés..........................................................................................

5.2. Marquage au bleu de toluidine................................................................................... 5.3. Marquages immunocytochimiques............................................................................

5.3.1. Protocoles expérimentaux................................................................................ 5.3.2. Quantification de la perte des neurones TH-positifs de la SNc…………….. 5.3.3. Quantification du marquage DAT................................................................... 5.3.4. Quantification du marquage NR2B-P.............................................................. 5.3.5. Quantification du marquage Iba-1 et GFAP………………………………… 5.3.6. Quantification des cellules BrDU- et PHH3-positives………………………

5.4. Protocoles d’hybridation in situ radioactive.............................................................. 5.4.1. Marquage radioactif des sondes oligonucléotidiques......................................

5.4.1.1. Etape de préhybridation................................................................. 5.4.1.2. Etape d’hybridation....................................................................... 5.4.1.3. Etape de posthybridation............................................................... 5.4.1.4. Révélation du signal....................................................................... 5.4.1.5. Analyse à l’échelle cellulaire.........................................................

5.4.2. Hybridation in situ fluorescente de la GAD67……………………………… 5.4.2.1. Etape de préhybridation................................................................ 5.4.2.2. Etape d’hybridation...................................................................... 5.4.2.3. Etape de posthybridation..............................................................

VI. ANALYSE STATISTIQUE.............................................................................................

VII. APPROCHE ELECTROPHYSIOLOGIQUE...............................................................

RESULTATS........................................................................................................

I. SPECIFICITE DE L’ATTEINTE................................................................................... 1.1. Effet du PDC in vivo sur la viabilité des neurones dopaminergiques et

GABAergiques de la SN…………………………………………………………… 1.2. Réponses électrophysiologiques des neurones dopaminergiques et non-

dopaminergiques de la SN à l’application de PDC in vitro………………………...

II. MECANISMES DE LA MORT CELLULAIRE.......................................................... 2.1. Déplétion en GSH et stress oxydatif……………………………………………….. 2.2. Excitotoxicité............................................................................................................ 2.3. Autophagie.................................................................................................................

III. CARACTERISTIQUES NEUROPATHOLOGIQUES DU PROCESSUS DEGENERATIF INDUIT PAR LE PDC……………………………………………..

154 155

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173 173 175

177 177 178 181

182

3.1. Cinétique de la perte neuronale dans la SN………………………………………... 3.2. Cinétiques des réactivités gliales dans la SN………………………………………. 3.3. Conséquences de la perte dopaminergique au niveau de la cible striatale…………

3.3.1. Analyse morphologique……………………………………………………... 3.3.2. Libération de dopamine par microdialyse…………………………………...

3.4. Changements adaptatifs dans les neurones dopaminergiques épargnés…………… 3.5. Impacts sur la neurogenèse adulte............................................................................ 3.6. Conséquences fonctionnelles au plan moteur...........................................................

IV. TRANSPOSABILITE A UNE AUTRE ESPECE : LA SOURIS ……………………

DISCUSSION ET PERSPECTIVES………………………………………….

I. ATTEINTE SPECIFIQUE DES NEURONES DOPAMINERGIQUES……………

II. MECANISMES IMPLIQUES DANS LA PERTE DOPAMINERGIQUE………… 2.1. Mécanismes impliqués à court terme……………………………………………….

2.1.1. Excitotoxicité………………………………………………………………... 2.1.2. Stress oxydatif………………………………………………………………. 2.1.3. Autophagie…………………………………………………………………. 2.1.4. La neuroinflammation………………………………………………………. 2.1.5. Interactions potentielles entre ces différents mécanismes…………………... 2.1.6. Pourquoi le PDC affecte-t-il spécifiquement les neurones DA ?...................

2.2. Mécanismes impliqués à long terme..……………………………………………… 2.2.1. Implication de l’excitotoxicité ?..................................................................... 2.2.2. Implication du stress oxydatif ?...................................................................... 2.2.3. Réactivités gliales……………………………………………………………

III. L’INJECTION DE PDC RECAPITULE LES CARACTERISTIQUES PATHOGENIQUES ET NEUROPATHOLOGIQUES MAJEURES DE LA MALADIE DE PARKINSON………………………………………………………… 3.1. Aspects cellulaires………………………………………………………………….. 3.2. Atteinte de la voie nigrostriée et processus compensatoires………………………..

3.2.1. Progression de l’atteinte neuronale dans la substance noire………………… 3.2.2. Perte de l’innervation dopaminergique striatale…………………………….. 3.2.3. Processus compensatoires…………………………………………………… 3.2.4. Altérations de la neurogenèse……………………………………………….. 3.2.5. Atteintes motrices……………………………………………………………

3.3. Le PDC : un nouveau modèle d’étude de la mmaladie de Parkinson ?....................

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………..

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198 198 198 200 201 202 202 205 207 208 210 211

214 214 219 219 221 222 224 226 227

233

1

INTRODUCTION

2

3

Mon travail de thèse a eu pour objectif de déterminer si un dysfonctionnement des

transporteurs des acides aminés excitateurs (EAATs) pourrait constituer un lien entre

différents mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson (MP) et

engendrer un processus dégénératif progressif caractéristique de cette pathologie.

La MP constitue la deuxième maladie neurodégénérative après la maladie d’Alzheimer en

terme de prévalence, affectant environ 6 millions de personnes dans le monde (Van Den

Eeden et al., 2003; de Lau and Breteler, 2006). Seulement 10 à 15% des cas de MP sont des

formes familiales pour lesquelles, à ce jour, environ 16 loci (PARK1 à PARK16) et 11 gènes

ont pu être identifiés (Singleton et al., 2013). Ainsi, la très grande majorité des cas de MP

(~80-90%) est sporadique, avec une étiologie encore mal connue (de Lau and Breteler, 2006).

La caractéristique neuropathologique majeure de la MP est la perte massive des neurones

dopaminergiques (DA) de la substance noire pars compacta (SNc), accompagnée dans les

neurones DA survivants d’inclusions protéiques intracellulaires appelées corps de Lewy (CL),

dont les composants principaux sont l’α-synucléine et l’ubiquitine (Kuzuhara et al., 1988;

Spillantini et al., 1997; Dauer and Przedborski, 2003). La perte en neurones DA est évolutive

avec un décours lent et progressif. Lorsqu’elle est inférieure à 50-60%, les patients sont

asymptomatiques. Au-delà de ce seuil, on voit apparaître progressivement la triade de

symptômes moteurs caractéristiques de la pathologie parkinsonienne : akinésie/bradykinésie,

rigidité et tremblement au repos. L’atteinte et les symptômes, initialement unilatéraux, se

bilatéralisent avec l’avancée de la pathologie.

Il est admis que la perte des neurones DA se ferait par mort cellulaire programmée. En plus de

l’apoptose, des processus autophagiques pourraient également intervenir (Anglade et al.,

1997; Levy et al., 2009; Alvarez-Erviti et al., 2010). L’étude de la fonction des gènes

impliqués dans les formes familiales de MP et de l'action des toxines pouvant conduire à un

syndrome parkinsonien ont conduit à l’élaboration de plusieurs hypothèses, non exclusives,

concernant les mécanismes qui pourraient engendrer cette mort neuronale. Ceux-ci incluent

déplétion en glutathion (GSH), stress oxydant, dysfonctionnements mitochondriaux ou du

système ubiquitine/protéasome, phénomènes d'excitotoxicité ou encore neuro-inflammatoires

(Olanow, 2007). La chronologie de l’intervention de ces processus dans le décours de la

dégénérescence reste mal connue. L’hypothèse actuelle est qu’ils puissent s’enchainer pour

créer un cercle vicieux entretenant le processus dégénératif.

4

Une des caractéristiques précoces de la MP est une déplétion en GSH, l’antioxydant majeur

du système nerveux central (SNC), spécifiquement au niveau de la SNc (Sian et al., 1994a).

La déplétion en GSH pourrait ainsi être un mécanisme pathogénique primaire, responsable du

stress oxydant et de la perte subséquente des neurones DA, en lien avec les autres mécanismes

pathogéniques. Des données expérimentales vont dans le sens de cette hypothèse : en effet, la

réduction de la synthèse de GSH in vivo affecte l’activité du complexe I de la chaine

respiratoire mitochondriale, et conduit à une perte progressive et préférentielle des neurones

DA de la substance noire (SN) et à des phénomènes d’agrégation protéiques (Chinta et al.,

2007; Garrido et al., 2011). Les mécanismes responsables de la déplétion en GSH ne sont

toujours pas totalement élucidés (Sian et al., 1994b; Schulz et al., 2000). Elle ne serait pas due

à un défaut de synthèse du GSH puisque l’activité de la -glutamylcystéine ligase (GCL),

l’enzyme de synthèse, est reportée inchangée. La déplétion n’est pas non plus causée par une

augmentation de son utilisation pour détoxifier des molécules oxydantes : en effet, les

niveaux de la forme oxydée (GSSG), ainsi que des enzymes qui utilisent le GSH pour la

détoxification (glutathion péroxydase - GPx - et glutathion S-transférase - GST -) ne sont pas

augmentées. La seule enzyme du métabolisme du GSH montrant une augmentation de son

activité est la -glutamyl-transpeptidase ( -GT), qui est l’enzyme responsable du recyclage du

GSH. Une interprétation possible est que la réduction des taux de GSH serait liée à un défaut

de disponibilité en substrats pour sa synthèse et que l’augmentation de -GT viserait à

compenser ce déficit.

Les EAATs jouent non seulement un rôle essentiel dans l’élimination du glutamate de la fente

synaptique et la prévention de l’excitotoxicité, mais aussi pour fournir les précurseurs de la

synthèse du GSH. Ils sont en effet capables de lier et de transporter le glutamate et la

cystine/cystéine, qui sont des substrats pour la synthèse de GSH. Ce rôle métabolique des

EAATs serait particulièrement important pour le transporteur neuronal EAAC1 (Hayes et al.,

2005). Diverses études, dont celles du laboratoire, ont contribué à montrer qu’un

dysfonctionnement des EAATs peut provoquer une déplétion en GSH et conduire à une mort

astrocytaire et de certaines populations neuronales, dont les neurones DA de la SNc (Re et al.,

2003; Aoyama et al., 2006; Re et al., 2006; Nafia et al., 2008). En particulier, le KO

d’EAAC1 conduit à une déplétion en GSH et à une perte des neurones DA de la SNc, cette

dernière pouvant être empêchée par un traitement à la N-Acétylcystéine (NAC), un

antioxydant puissant (Berman et al., 2011). Par ailleurs, il est probable que la réduction des

défenses anti-oxydantes pourrait, de plus, vulnérabiliser les neurones à l’élévation des taux

5

extracellulaires de glutamate résultant du dysfonctionnement des EAATs, et favoriser ainsi les

processus excitotoxiques (Nafia et al., 2008).

Diverses études étayent l’hypothèse de l’implication de ce phénomène d’excitotoxicité dans la

perte des neurones DA dans la MP, au travers notamment d’une suractivation des récepteurs

du glutamate de type NMDA (Rodriguez et al., 1998; Blandini, 2010). En effet, dans les

modèles expérimentaux de la MP utilisant le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine

(MPTP), les antagonistes des récepteurs NMDA ont une action protectrice (Turski et al.,

1991; Brouillet and Beal, 1993). Les neurones DA expriment des récepteurs NMDA

fonctionnels, majoritairement constitués de sous-unités NR2D et NR2B (Standaert et al.,

1994; Counihan et al., 1998; Lin and Lipski, 2001; Jones and Gibb, 2005; Brothwell et al.,

2008). Des données de la littérature suggèrent que ces sous-unités seraient particulièrement

impliquées dans les processus excitotoxiques médiés par les récepteurs NMDA (Brickley et

al., 2003; Mony et al., 2009; Baron et al., 2010). L’excitotoxicité n’est toutefois généralement

pas considérée comme un mécanisme primaire d’atteinte des neurones DA, mais plutôt

comme un mécanisme secondaire, entretenant le processus dégénératif.

Si un dysfonctionnement des EAATs a été impliqué dans les pertes cellulaires observées dans

diverses atteintes neurodégénératives, aussi bien aiguës, comme l’ischémie cérébrale, que

chroniques, comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) (Danbolt, 2001; Maragakis and

Rothstein, 2004), le rôle de ces transporteurs dans la MP n’est pas encore clairement établi.

Cependant, plusieurs éléments suggèrent qu’un tel dysfonctionnement pourrait effectivement

avoir lieu et être responsable des pertes DA :

- Les neurones DA de la SNc expriment fortement le transporteur neuronal du

glutamate EAAT3/EAAC1 (Shashidharan et al., 1997; Plaitakis and Shashidharan,

2000).

- L’hyperactivité du noyau subthalamique (NST), source de l’innervation

glutamatergique majeure des neurones DA, serait un événement précoce dans le

décours de la MP (Obeso et al., 2004 ; Oueslati et al., 2005 ; Janssen et al., 2012). Or

la stimulation intense et répétée par des fibres glutamatergiques hyperactives est une

condition favorisant le fonctionnement inversé des transporteurs du glutamate (Grewer

et al., 2008). De plus, supportant cette idée du rôle de l’hyperactivité du NST, les

stratégies visant à inactiver ce noyau ont un effet neuroprotecteur dans les modèles

animaux (Wallace et al., 2007; Harnack et al., 2008; Spieles-Engemann et al., 2010).

6

- Plusieurs mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP peuvent également

affecter le fonctionnement des EAAT :

o Un dysfonctionnement mitochondrial peut provoquer une déplétion en ATP, ce

qui entraînerait une altération du fonctionnement de la pompe Na+/K+ ATPase,

dont l’activité est importante pour maintenir les gradients ioniques qui sont

nécessaires pour le bon fonctionnement des EAATs (Grewer et al., 2008).

o Une réaction neuroinflammatoire peut également affecter le fonctionnement et

l’expression des EAATs (Tilleux and Hermans, 2007).

o Un stress oxydant pourrait entraîner l’oxydation des EAATs qui provoquerait

une diminution de l’activité de transport (Trotti et al., 1998).

Ainsi, des acteurs majeurs de la pathogenèse de la MP pourraient affecter le fonctionnement

des EAATs et, en retour, ceux-ci seraient capables d’entretenir le processus dégénératif via

stress oxydant et excitotoxicité.

Mon travail de thèse s’inscrit dans ce cadre conceptuel et dans la poursuite des travaux du

doctorat d’Imane Nafia au laboratoire, visant à caractériser la vulnérabilité des neurones DA

au dysfonctionnement des transporteurs des EAATs induit pharmacologiquement par un

inhibiteur substrat des EAATs, le L-trans-pyrrolidine-2,4-dicarboxylate (PDC). Sa capture

conduit à un efflux de glutamate par hétéroéchange (Volterra et al., 1996; Koch et al., 1999),

mimant le fonctionnement inversé pathologique des EAATs, comme décrit notamment dans

l’ischémie cérébrale (Danbolt, 2001). Imane Nafia a montré qu’un traitement par le PDC in

vitro (dans un modèle de culture primaire de mésencéphale embryonnaire) induit une mort

préférentielle des neurones DA (Nafia et al., 2008). Le stress oxydant abaisse le seuil de

vulnérabilité à l’excitotoxicité de ces neurones, alors que les neurones non-DA ne sont

vulnérables qu’aux processus excitotoxiques, et les astrocytes uniquement au stress oxydant

(Nafia et al., 2008). Les données préliminaires obtenues in vivo chez le rat indiquent que

l’injection aiguë de PDC dans la SNc conduit, à court terme (4 jours), à une perte dose-

dépendante des neurones DA, accompagnée de la présence d’agrégats intracytoplasmiques

positifs à l’α-synucléine. De façon remarquable, cet effet est obtenu à des doses ne produisant

pas de dommages dans d’autres structures cérébrales (Massieu et al., 1995; Montiel et al.,

2005).

7

Mon objectif a été d’analyser les caractéristiques et les conséquences fonctionnelles de la

neurodégénérescence induite, chez le rat, par l’injection aiguë de PDC in vivo dans la SN,

selon les points suivants :

- Spécificité de réponse au PDC des neurones DA versus GABA de la SN en termes

d’activité électrophysiologique et de mort neuronale.

- Mécanismes associés à la mort cellulaire (métabolisme du GSH, stress oxydant,

excitotoxicité, neuroinflammation, autophagie) par des analyses biochimiques,

immunocytochimiques et des études de neuroprotection.

- Evolution ou non du processus dégénératif : pertes neuronales et mécanismes

adaptatifs dans la SN et au niveau du striatum (cible majeure des terminaisons DA),

libération de dopamine striatale, réactivité gliale dans la SN (étude cinétique allant de

4 à 120 jours post-injection et utilisant des méthodes morphologiques quantitatives et

de microdialyse).

- Expression des troubles moteurs (activité locomotrice et déficit de type akinétique

évalué dans le test du cylindre).

Mon travail de thèse a permis de confirmer le lien fonctionnel entre transport du glutamate et

divers mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP. Au-delà de la mise en évidence de

ce lien, mon travail a par ailleurs permis de produire un modèle original de la maladie chez le

rongeur mimant ses principales caractéristiques.

8

9

RAPPELS

BIBLIOGRAPHIQUES

10

11

I. Les ganglions de la base

Les ganglions de la base (GB) sont un ensemble de structures sous corticales intervenant dans

le contrôle du mouvement. Ces noyaux sont interconnectés et s’inscrivent dans une boucle

cortico-sous-cortico-thalamo-corticale (Figure 1) (Albin et al., 1989; DeLong, 1990). Le

système des GB regroupe essentiellement quatre noyaux : le striatum, le globus pallidus (GP),

le noyau subthalamique (NST) et la substance noire pars reticulata (SNr). Chez les primates,

le striatum est subdivisé par les fibres de la capsule interne en noyau caudé et putamen. Le GP

est subdivisé, par la lame médullaire interne, en GP externe (GPe) et interne (GPi), alors que

chez les rongeurs ces structures correspondent respectivement au GP "tout court" et au noyau

entopédonculaire (EP). La SN est subdivisée en deux parties : la SNc, formée par les neurones

à dopamine (DA), et la SNr, formée par les neurones utilisant l'acide -aminobutyrique

(GABA) comme neurotransmetteur. A l’exception du NST qui utilise le glutamate comme

neurotransmetteur, les structures des GB sont toutes GABAergiques et exercent donc une

influence inhibitrice sur leurs cibles.

Figure 1. Schéma classique des ganglions de la base.

12

Le striatum est considéré comme la principale structure d’entrée du réseau des GB puisqu’il

est la cible majeure des afférences corticales. Il reçoit des projections glutamatergiques

massives en provenance de l’ensemble des aires corticales, ainsi que des projections

glutamatergiques issues du thalamus, notamment du complexe centre-

median/parafasciculaire. Il est également la cible principale des projections DAergiques

issues de la substance noire pars compacta (SNc). Les structures dites "de sortie" des GB sont

l’EP/GPi et la SNr : elles exercent une influence inhibitrice sur les noyaux moteurs du

thalamus, le noyau ventrolatéral (VL) et ventromédian (VM) et, via ce relais thalamique

glutamatergique, sur les aires corticales motrices, prémotrices et préfrontales (Obeso et al.,

2000).

Le modèle classique des GB a permis une meilleure compréhension du fonctionnement

normal et pathologique du réseau ainsi que le développement de stratégies thérapeutique

pharmacologique et chirurgical ciblant ces structures (Albin et al., 1989; DeLong, 1990).

Dans ce modèle, le striatum contrôle les structures de sortie par deux voies aux influences

opposées: l’une striato-nigrale dite "directe", l’autre impliquant deux relais, le GP/GPe et le

NST, dite "indirecte". Les neurones de projection du striatum composant la voie directe

expriment le récepteur à la DA D1 et co-expriment le GABA avec deux neuropeptides : la

substance P et la dynorphine. Cette voie aurait un rôle désinhibiteur sur la voie thalamo-

corticale et ainsi facilitatrice du mouvement. Les neurones de projection du striatum

composant la voie indirecte expriment le récepteur à la DA D2 et co-expriment le GABA

avec d’autres neuropeptides : les enképhalines. Etant donné la nature GABA du GP/GPe et

celle glutamatergique du NST, l’activation de la voie indirecte conduit à une action inverse de

celle de la voie directe, renforçant l’influence inhibitrice des structures de sortie sur la voie

thalamo-corticale. Cette voie indirecte est ainsi considérée comme inhibitrice de l’exécution

du mouvement. L’équilibre entre l’activité des deux voies permettrait le contrôle fin du

mouvement et le déséquilibre, pathologique, conduirait à des désordres du mouvement. A

noter également l'existence d'une voie dite hyperdirecte représentée par les projections du

cortex sur le NST, lequel projette sur les structures de sortie.

Les neurones DA de la SNc projettent majoritairement vers le striatum dorsal, ainsi que le

NST et le GP (Lindvall and Bjorklund, 1979; Cossette et al., 1999). Ces neurones reçoivent

des afférences GABAergiques en provenance du striatum et du GP (Ribak et al., 1980; Smith

and Bolam, 1989) et des neurones de projection de la SNr (Tepper et al., 1995). Ils reçoivent

également des afférences excitatrices glutamatergiques en provenance du cortex préfrontal, du

13

NST, du noyau pédonculopontin (PPN) ainsi que des aires hypothalamiques préoptiques

rostrales (Naito and Kita, 1994; Reese et al., 1995; Smith et al., 1996; Bezard and Gross,

1998). Ainsi, les neurones DA de la SNc sont au coeur du réseau des GB et possèdent un rôle

physiologique (et physiopathologique) très important.

14

II. Les neurones dopaminergiques

Les neurones DA constituent des groupes cellulaires anatomiquement et fonctionnellement

hétérogènes, localisés au niveau du mésencéphale, du diencéphale et du bulbe olfactif

(Albanese et al., 1986). L’ensemble de ces groupes forme un réseau dont le rôle est de

contrôler harmonieusement l’intervention des systèmes intégrateurs qui traitent plusieurs

modalités sensorielles dans les processus cognitifs, attentionnels, émotionnels, de motivation,

d’initiation et d’adaptation comportementale. Le groupe le plus proéminent réside dans la

partie ventrale du mésencéphale, laquelle comporte environ 90% du nombre total des

neurones DA du cerveau, constituant la source majeure de DA dans le SNC des mammifères

(Chinta and Andersen, 2005). Le système DA du mésencéphale est lui-même subdivisé en

plusieurs sous-systèmes ayant pour origine la région rétro-rubrale, la SNc et l’aire tegmentale

ventrale (ATV), dénommées respectivement A8, A9, A10 (Dahlstrom and Fuxe, 1964). Le

système le plus décrit reste la voie nigro-striée. C’est une voie ventrolatérale qui prend

naissance au niveau de la SNc, où les axones partent préférentiellement vers le striatum et les

dendrites vers la SNr. Elle joue un rôle important dans le contrôle des mouvements

volontaires, mis en évidence par exemple lorsque cette voie dégénère dans la maladie de

Parkinson (MP) (Obeso et al., 2000). De plus, les systèmes DA mésolimbique et mésocortical

sont des voies plus médianes impliquées dans les processus cognitifs, attentionnels et

émotionnels. Le système mésolimbique part de l’ATV et projette dans le système limbique

sur les tubercules olfactifs, la région septale, les complexes amygdaliens et le noyau

accumbens, correspondant à la partie ventrale du striatum, tandis que le système mésocortical

part de l’ATV et projette sur les cortex cingulaire, enthorinal et préfrontal. Ces deux systèmes

sont collectivement dénommés système méso-cortico-limbique (Wise, 2004).

La SNc est elle même subdivisée en plusieurs sous-régions, principalement déterminées au vu

de leur vulnérabilité différentielle dans la MP. Ainsi, quatre sous-régions principales peuvent

être identifiées au niveau de la SNc humaine :

- La SNc ventrale (correpondant aux nigrosomes 1 et 2)

- La SNc dorsale (ou nigrosomes 4, 5 et la matrice)

- La SNc pars medialis (ou groupe medio-ventral)

- La SNc pars lateralis (ou aussi nigrosome 3)

15

Chez l’homme, le tiers ventral correspondant aux cellules localisées très ventralement chez le

rat possède une densité cellulaire plus faible que le tiers dorsal (McRitchie et al., 1996;

Damier et al., 1999b). Cette région projette préférentiellement vers les striosomes du putamen

(striatum dorsal sensorimoteur) (Gerfen et al., 1987). Le tiers dorsal projette vers la plupart

des structures corticales mais surtout le cortex moteur et préfrontal (Gaspar et al., 1992) ainsi

que vers le noyau caudé et la matrice du putamen (Haber et al., 2000). La pars medialis

innerve plusieurs régions limbiques du cerveau comme le noyau accumbens du striatum et les

cortex limbiques (Haber et al., 2000), alors que la pars lateralis projette vers les colliculi

inférieur et supérieur ainsi que vers le noyau caudé et le putamen (Tokuno et al., 1993;

Harting et al., 2001; Double et al., 2010). Les neurones du tiers dorsal sont innervés

principalement par des afférences du striatum dorsal venant du noyau caudé, alors que le tiers

ventral reçoit des projections du noyau caudé et du putamen (Haber et al., 2000). Les

neurones de la pars medialis reçoivent des afférences du noyau accumbens et la pars lateralis

d’une région du striatum intervenant dans le traitement des informations corticales visuelles et

oculomotrices (Harting et al., 2001).

2.1 La synapse dopaminergique

2.1.1 Biosynthèse, stockage et liberation de la dopamine

La DA est synthétisée tout le long des neurones DA, des varicosités dendritiques aux

terminaisons axonales. Quantitativement, la synthèse de la DA est toutefois plus importante

dans les boutons synaptiques. La première étape de la synthèse de la DA (Figure 2) est la

capture de ses précurseurs : la phénylalanine ou plus directement la tyrosine. Cette capture est

opérée par des systèmes qui, en utilisant l’énergie cellulaire, peuvent concentrer ces deux

acides aminés contre leur gradient de concentration dans les neurones DA. La phénylalanine

peut alors être convertie en tyrosine, mais la capture de tyrosine permet de shunter cette étape.

La tyrosine arrive dans le cerveau par un système de transport d’acides aminés à basse

affinité, puis passe du milieu extracellulaire à l’intérieur des neurones DA via des

transporteurs d’acides aminés à haute et à basse affinité. Une fois dans le neurone, la tyrosine

est convertie en dihydroxyphénylalanine (DOPA) via l’action de la tyrosine hydroxylase

(TH) ; cette étape est considérée comme étant l’étape limitante de la synthèse de la DA. La

16

TH est présente dans le cytosol et a pour co-facteur la tétrahydrobioptérine, laquelle apporte

l’hydrogène au groupement hydroxyl. Ainsi se trouve formée la L-3,4-

dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) et, après avoir cédé deux atomes d’hydrogène, la

tétrahydrobioptérine se trouve à l’état de dihydroptéridine. La tétrahydrobioptérine sera

régénérée sous sa forme tétrahydrogénée par l’enzyme dihydroptérine réductase, qui

emprunte les hydrogènes de la réaction au NADH2.

Dans les conditions physiologiques, la TH fonctionne au maximum de ses capacités

catalytiques pour qu’à chaque instant tous les sites actifs soient occupés par le substrat. La

quantité disponible de substrat est nettement supérieure à la capacité catalytique de l’enzyme,

qui est donc un facteur limitant. L’inhibition de l’enzyme se traduit par une moindre

formation de L-DOPA. En revanche, la concentration en co-facteur est inférieure aux

capacités catalytiques de la TH. Dès lors, la conversion de la tyrosine en L-DOPA connaît

deux facteurs limitants : l’insuffisance en molécules enzymatiques de la TH, relativement aux

quantités plus élevés de la tyrosine, et l’insuffisance de la quantité de co-facteur. En outre,

l’activité de la TH est la cible de divers éléments régulateurs, notamment elle est modifiée par

la DA présente dans le cytosol. Des travaux suggèrent également que la capacité de stockage

de la DA par les vésicules synaptiques contrôle également l’activité de la TH ; une capacité de

stockage réduite déterminerait donc une moindre activité de l’enzyme. De plus, l’entrée des

ions calcium consécutive à la dépolarisation des terminaisons DA modulerait la

phosphorylation de la TH qui régule l’activité de l’enzyme (El Mestikawy et al., 1983;

Dunkley et al., 2004).

La L-DOPA cytosolique est ensuite convertie en DA par l’action de la DOPA décarboxylase.

Cette dernière est une enzyme peu spécifique opérant sur divers acides aminés aromatiques

comme le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine.

Au total, par l’intervention conjuguée i) des systèmes de capture des précurseurs, ii) de la TH

et iii) de la DOPA décarboxylase, la DA est ainsi formée dans le cytosol des neurones

catécholaminergiques et de manière plus abondante dans les neurones DA.

17

Figure 2. Etapes de la biosynthèse de la DA.

La DA ainsi formée va, au moins en partie, être transportée par des transporteurs vésiculaires

de monoamines (VMAT) pour être concentrée dans des vésicules de stockage. Le transport

vésiculaire requiert de l’ATP et fait donc intervenir une ATPase dépendante du magnésium.

Les vésicules de stockage sont situées au niveau des terminaisons DA, où les concentrations

en neurotransmetteurs peuvent atteindre 100 mM, soit 10 fois plus élevées que les

concentrations cytosoliques. La DA est également présente au niveau des dendrites où elle

peut à la fois être stockée dans les vésicules de stockage classiques et dans le réticulum

endoplasmique lisse. Une fois stockée, la DA est à l’abri de l’effet inactivateur des

monoamines oxydases (MAO).

Phénylalanine

Phénylalanine

Hydroxylase

18

Les VMAT sont des protéines membranaires responsables du stockage dans les vésicules

synaptiques, via un gradient électrochimique protonique, des catécholamines, de la sérotonine

et de la tyramine mais également des neurotoxines comme le MPP+ (Zheng et al., 2006).

Deux isoformes de ces VMAT sensibles à la réserpine ont été identifiées puis clonées :

VMAT1, exprimée de manière prédominante dans les cellules endocrines telles les cellules

entéro-chromaffines du tractus intestinal, et VMAT2, presque exclusivement neuronal,

exprimé dans les neurones monoaminergiques incluant les neurones DA, les neurones post-

ganglionnaires sympathiques, ainsi que certaines populations de cellules endocrines. Dans le

SNC, VMATβ est le seul transporteur responsable de l’accumulation de la DA dans les

vésicules synaptiques et de sa libération subséquente par exocytose (Zheng et al., 2006).

La DA est libérée dans la fente synaptique par exocytose calcium-dépendante et peut interagir

avec ses récepteurs. La stimulation de ces récepteurs est brève car deux mécanismes

concourent à soustraire rapidement cette amine de la fente synaptique : son inactivation

enzymatique et sa recapture par la terminaison DA (Figure 3). La libération de DA au niveau

mésencéphalique est au moins en partie non-synaptique et, par ailleurs, les récepteurs DA

ainsi que les transporteurs de la DA (DAT) dans cette région sont plutôt localisés en

extrasynaptique. Ainsi, la transmission DA somatodendritique est une transmission plutôt

volumique dont l’efficacité est régulée en termes de diffusion et de recapture par les

caractéristiques du microenvironnement local (Geffen et al., 1976; Nieoullon et al., 1977b;

Yung et al., 1995; Nirenberg et al., 1996; Jaffe et al., 1998; Rice, 2000).

19

Figure 3. Représentation schématique de la synapse dopaminergique.

2.1.2 Les récepteurs à la dopamine

Les récepteurs DA sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il en existe deux

grandes catégories :

- Les récepteurs DA de type D1 (D1 et D5) qui sont couplés à la protéine Gαs. La liaison

d’un agoniste provoque l’activation de l’adénylate cyclase et la formation d’AMPc. La

20

cascade de réactions qui s’en suit aboutit à un effet excitateur sur le neurone (Gerfen

and Surmeier, 2011). - Les récepteurs DA de type D2 (D2, D3, D4) sont couplés aux protéines Gαi/o. La liaison

de l’agoniste entraîne une inhibition de l’adénylate cyclase. La cascade de réactions qui

s’en suit aboutit à une diminution de l’excitabilité du neurone (Gerfen and Surmeier,

2011).Les récepteurs DA post-synaptiques sont abondants dans le striatum, avec une localisation des

D1 principalement sur les neurones striato-nigraux et des D2 sur les neurones striato-

pallidaux. Les récepteurs D2 sont aussi exprimés par des populations d'interneurones

striataux, notamment les interneurones cholinergiques lesquels expriment également les

récepteurs D5 (Yan et al., 1997; Yan and Surmeier, 1997). Des récepteurs post-synaptiques de

type D1 (D5) sont également mis en évidence dans les neurones du NST (Svenningsson and

Le, 2002; Baufreton et al., 2003), du GPi et de la SNr (Kliem et al., 2010) alors que

l'expression post-synaptique des D2 a été décrite comme minimale dans le GPe, GPi et SNr

(Hadipour-Niktarash et al., 2012). Les neurones du NST exprimeraient des récepteurs post-

synaptiques de type D2 et D3 (mais pas D4), qui seraient responsables de l'activation des

neuronesdu NST par les agonistes DA de type D2 (Flores et al., 1999; Ramanathan et al.,

2008).

La DA pourrait également stimuler des récepteurs localisés sur les cellules gliales (Henn et

al., 1977). En effet, il a été montré que des cellules astrogliales, localisées dans une structure

recevant des afférences DA, comme le striatum, répondent à la DA par une augmentation de

leur concentration en AMPc, alors que rien de tel n’est observé dans des astrocytes du tronc

cérébral (Hansson et al., 1984), suggérant une spécialisation de ces cellules selon que les

structures qui les hébergent possèdent ou non des afférences DA.

Des récepteurs DA présynaptiques sont localisés sur des terminaisons neuronales non DA, et

la DA qui les stimule est libérée soit par des varicosités dendritiques dans la région du corps

cellulaire, soit par les terminaisons DA. De tels hétérorécepteurs présynaptiques ont été

caractérisés dans la SN sur des terminaisons GABAergiques striatales. Ils sont couplés

positivement à l’adénylate cyclase et leur stimulation par la DA libérée par les varicosités

dendritiques induit une libération accrue de GABA (Aceves et al., 1995). Des récepteurs

présynaptiques à la DA ont également été mis en évidence au niveau du striatum sur les

terminaisons des neurones glutamatergiques corticostriés. La stimulation de ces récepteurs

21

facilite la libération de glutamate qui, lui-même module la libération de DA (Godukhin et al.,

1984; Bamford et al., 2004a; Bamford et al., 2004b).

D’autres récepteurs sont localisés présynaptiquement sur une grande majorité de neurones DA

eux-même au niveau des somas, des dendrites et des terminaisons. Ces autorécepteurs sont

activés par la DA libérée par les terminaisons et par les dendrites, et représentent l’un des

principaux mécanismes de régulation des neurones DA. Par exemple, la stimulation des

autorécepteurs localisés sur le compartiment somato-dendritique réduit le niveau de décharge

des neurones DA, alors que la stimulation des autorécepteurs présents sur les terminaisons

axonales conduit en une inhibition de la synthèse et/ou de la libération de DA. La majorité des

neurones DA de la SNc et de l’ATV possède des autorécepteurs sur ces deux compartiments

modulant ainsi la synthèse et la libération de neurotransmetteurs ainsi que le rythme de

décharge du neurone. De manière générale, ces autorécepteurs sont de type D2 et sont

beaucoup plus sensibles aux effets de la DA et de certains agonistes DA que les récepteurs

post-synaptiques (Skirboll et al., 1979).

2.1.3 Inactivation de la DA

L’action de la DA dans la fente synaptique est principalement terminée par sa capture et son

catabolisme (Figure 4) par les MAO et les catéchol-O-méthyl transférases (COMT).

La capture de la DA est accomplie via un transporteur membranaire à haute affinité capable

de transporter la DA dans les deux directions en fonction du gradient de concentration

existant. Le DAT s’associe à l’amine à la face externe de la membrane, puis le complexe

transporteur-amine subit une translocation dans l’épaisseur de la membrane et, à la face

interne de celle-ci, la DA se détache du DAT. Ce transport est un processus endergonique

nécessitant ainsi une consommation d’ATP cellulaire. 90% de la DA libérée dans la fente

synaptique est reprise par la terminaison DA pour être soit métabolisée par les MAO, soit

recyclée et stockée dans les vésicules en vue d’une utilisation ultérieure. Ainsi le DAT recycle

le neurotransmetteur et permet de concentrer la DA de 100 à 1000 fois au niveau

intracellulaire. Il a également un rôle important qui est de terminer la transmission synaptique.

22

La DA recaptée par le DAT peut ainsi être métabolisée par les MAO. Il en existe deux

formes : la MAO-A, présente dans les neurones DA, et la MAO-B astrocytaire (Nicotra et al.,

2004). Ces enzymes transforment la DA en acétaldéhyde qui sera rapidement convertie en

acide dihydrophénylacétique (DOPAC) par une aldéhyde déshydrogénase.

La DA peut également être le substrat d’une autre d’inactivation via la COMT, une

ectoenzyme située à proximité des récepteurs post-synaptiques, dont le rôle est toutefois

modeste comparé à l’efficacité du système de recapture. La COMT transforme la DA en 3-

méthoxytyramine (3-MT), dont le taux est relié à la concentration de DA dans la fente

synaptique et constitue donc un index de l’intensité de libération synaptique de l’amine. La

COMT n’a pas une spécificité étroite pour un substrat puisqu’elle agit aussi bien sur la DA, la

noradrénaline et le DOPAC.

Le produit final du catabolisme de la DA est l’acide homovanilique (HVA) quelque soit la

première enzyme (COMT ou MAO) qui intervienne. En effet, ces deux enzymes interviennent

dans le catabolisme de la DA en HVA mais d'une manière différente. Lorsque le catabolisme

commence dans la terminaison par l’action d’une MAO, il y a formation de DOPAC qui,

diffusant à l’extérieur du neurone, sera transformé en HVA par la COMT. A l’inverse, le

catabolisme de la DA présente dans la fente synaptique conduit tout d’abord à la formation de

3-MT par la COMT, qui sera ensuite convertie en HVA par une MAO. L’élévation du taux de

DOPAC ou d’HVA atteste d’une augmentation de la vitesse de renouvellement de la DA mais

ne renseigne pas du taux de libération synaptique, qui sera plutôt représenté par le taux de 3-

MT.

Figure 4 . Catabolisme de la DA.

23

Le métabolisme de la DA est connu pour produire des ROS et peut rendre compte, au moins

en partie, de la vulnérabilité sélective des neurones DA dans la MP. Des produits

cytotoxiques derivés de la DA, tels que les quinones, peuvent être formés pendant la

biosynthèse du neurotransmetteur (Choi et al., 2003). Le stockage de la DA dans les vésicules

synaptiques la protège de l’oxydation par un faible pH. L’auto-oxydation de la DA conduit à

la formation de DA quinone et du radical superoxyde par une réaction catalysée par des

métaux, de l’oxygène ou des enzymes comme la tyrosinase ou la xanthine oxydase. Le radical

superoxyde peut ensuite être soit métabolisé en peroxyde d’hydrogène soit interagir avec le

monoxyde d’azote pour générer le radical péroxynitrite hautement réactif. La DA quinone est

transformée en aminochrome (ou encore dopaminochrome), qui peut soit être polymérisée

pour conduire à la formation de neuromélanine, soit conjuguée au GSH et réduite via l’action

des quinones réductases (Graumann et al., 2002). L’aminochrome peut être métabolisée en O-

hydroquinone, laquelle peut être transformée par la COMT en produits inactifs excrétés dans

l’urine. Elle peut également être métabolisée par la NADPH cytochrome p450 réductase en

O-semiquinone. L’auto-oxydation de l’O-hydroquinone (neuroprotectrice) en O-semiquinone

(neurotoxique) est normalement prévenue par les enzymes anti-oxydantes SOD et catalase.

La neuromélanine est généralement considérée comme résultant de l’oxydation de la DA

(Zecca et al., 2006) bien que tous les neurones DA de la SNc ne soient pas pigmentés. Elle se

présente en granule dans le cytoplasme des neurones DA et constitue un chélateur puissant de

métaux lourds, en particulier du fer (Ben-Shachar et al., 1991; Double et al., 2003), ce qui lui

suggère un rôle neuroprotecteur (Zecca et al., 2006). En fait, plusieurs études suggèrent que la

neuromélanine pourrait avoir un rôle à la fois neuroprotecteur ou neurotoxique en fonction de

l’environnement cellulaire et notamment de la concentration en fer (Offen et al., 1997; Kienzl

et al., 1999). Ainsi, la neuromélanine pourrait être impliquée dans l’étiologie de la MP, mais

cette implication serait dépendante des contenus en fer des neurones DA. Egalement, la

neuromélanine est capable de lier une variété de substances potentiellement toxiques comme

le 1-méthyl-4-phényl pyridinium (MPP+) et les pesticides, suggérant sa contribution dans les

pertes en neurones DA induites dans ces modèles de la MP (Zecca et al., 2006).

24

2.2. Connectivité des neurones dopaminergiques

2.2.1. Les afférences des neurones dopaminergiques

2.2.1.1. Les afférences GABAergiques

2.2.1.1.1. En provenance du striatum

Les neurones de projection du striatum composant la voie directe projettent sur la SNc en plus

de la SNr (Grofova and Rinvik, 1970; Grofova, 1975; Bolam and Smith, 1990). Les

projections striatales vers les neurons DA de la SNc (Figure 5) co-expriment, avec le GABA,

la substance P et la dynorphine. Les terminaisons immunopositives pour la substance P

forment des synapses symétriques majoritairement sur les dendrites des neurones DA et

seulement un faible nombre contacte le corps cellulaire (Bolam and Smith, 1990).

In vivo, la stimulation du striatum conduit à une inhibition monosynaptique au niveau de la

SNc (Collingridge and Davies, 1981; Grace and Bunney, 1985), ce qui est en accord avec

l'existence d'une projection GABAergique directe sur la SNc (Bolam and Smith, 1990).

Cependant, lorsque la stimulation striatale est faible, les neurones GABAergiques de la SNr

semblent inhibés préférentiellement. Dans ce cas, les neurones DA sont déshinibés et

augmentent leur rythme de décharge (Grace and Bunney, 1979; Grace and Bunney, 1985).

2.2.1.1.2. En provenance du globus pallidus

Le GP (ou GPe) envoie des projections GABAergiques inhibitrices vers le NST ainsi que vers

la SNr et la SNc (Figure 5), innervant ainsi directement les neurones nigraux DA et

GABAergiques (Grofova, 1975; Smith and Bolam, 1989; Smith and Bolam, 1990; Smith et

al., 1990). Les terminaisons du GP forment des synapses symétriques GABAergiques

contactant à la fois les somas ainsi que les dendrites proximales des neurones de la SNc

(Smith and Bolam, 1990).

25

Le GP exerce ainsi une inhibition tonique sur les neurones DA de la SNc et GABAergiques

de la SNr. In vivo, la stimulation électrique du GP conduit à une inhibition de la décharge des

neurones DA en accord avec des projections directes du GP vers la SNc (Paladini et al.,

1999). Cependant, une augmentation du niveau de décharge du GP par application d’un

antagoniste des récepteurs GABAA augmente de façon paradoxale le nombre de neurones DA

déchargeant avec un pattern en burst (Celada et al., 1999) qui conduit en une augmentation de

DA striatale (Lee et al., 2004). Cet effet ressemblerait à l’excitation des neurones DA après

une faible stimulation du striatum et passerait également par la SNr. La stimulation chimique

du GP conduit à une libération asynchrone de GABA dans la SN alors que la stimulation

électrique induit une libération synchronisée. Là encore, étant donné que les neurones

GABAergiques sont plus sensibles à l’inhibition que les neurones DA, la libération

asynchrone est suffisante pour inhiber les neurones de la SNr mais pas ceux de la SNc,

induisant ainsi une désinhibition des neurones DA de la SNc. Par contre, la libération de

GABA massive, synchronisée, provoquée par la stimulation électrique inhibe directement les

deux populations neuronales de la SN (Paladini et al., 1999; Celada et al., 1999; Lee et al.,

2004; Tepper and Lee, 2007).

2.2.1.1.3. En provenance de la SNr

La SNr est responsable de la plus forte innervation GABAergique des neurones DA de la

SNc. En plus de l’innervation du thalamus et du colliculus supérieur, les neurones de la SNr

envoient également des collatérales d’axones qui s’étendent à la fois dans la SNc et la SNr et

sont responsables de l’inhibition des neurones DA et GABAergiques de la SN (MacNeil et

al., 1978; Grace and Bunney, 1979; Deniau et al., 1982; Deniau and Chevalier, 1992; Hajos

and Greenfield, 1994; Tepper et al., 1995; Tepper and Lee, 2007). Ces collatérales présentent

souvent des varicosités qui sont de larges boutons formant des synapses symétriques avec le

soma et les dendrites proximales (Deniau et al., 1982; Kemel et al., 1988; Mailly et al., 2003;

Tepper and Lee, 2007).

L’interaction importante entre les neurones GABAergiques de la SNr et les neurones DA de

la SNc fut suggérée par des études montrant une relation inverse entre l’activité spontanée de

certains neurones DA et GABAergiques dans des enregistrements extracellulaires in vivo

(Grace and Bunney, 1979). La source de l’inhibition des neurones DA par les neurones

26

GABAergiques de la SNr viendrait des collatérales d’axones des neurones de projections de

la SNr (Deniau et al., 1982). Les neurones de projection de la SNr déchargent de manière

spontanée à haute fréquence à la fois in vivo (~20 à 40 Hz) et in vitro (~10 à 40 Hz) (Deniau

et al., 1978; Nakanishi et al., 1987b; Lee and Tepper, 2009) et constituent donc une source

d’inhibition tonique ou de désinhibition (lorsque ceux-ci sont inhibés) des neurones DA. Une

telle desinhibition des neurones DA par inhibition des neurones GABA de la SN soutendrait

notamment les effets renforçant de différentes drogues d'abus agissant comme agonistes

GABAA, tels que l'éthanol ou les benzodiazepines (Ross et al., 1982; Mereu et al., 1984;

Mereu and Gessa, 1985; Tepper and Lee, 2007).

2.2.1.2. Les afférences cholinergiques et glutamatergiques

2.2.1.2.1. En provenance du pédonculopontin

Les neurones DA de la SNc et de l’ATV reçoivent une innervation directe en provenance du

PPN (Jackson and Crossman, 1983) constituée des projections glutamatergiques et

cholinergiques (Woolf and Butcher, 1986; Charara et al., 1996). Ces projections seraient plus

importantes sur la SNc que sur l'ATV (Watabe-Uchida et al., 2012) et seraient en partie

bilatérales (Parent et al., 1999).

Le PPN constitue la source majeure d’afférences cholinergiques sur les neurones DA de la

SNc. Les synapses cholinergiques sont observées à la fois sur le corps cellulaire et les

dendrites des neurones DA et GABAergiques de la SN (Beninato and Spencer, 1988;

Martinez-Murillo et al., 1989; Bolam et al., 1991). L'influence excitatrice exercée par les

projections cholinergiques a été mise en évidence par l'observation d'une réduction du taux de

décharge des neurones DA après infusion d’acétylcholinestérase (Greenfield et al., 1981).

A noter que 35% des boutons synaptiques marqués de façon antérograde depuis le PPN

innervent la SNc, ce qui est plus important que la proportion des terminaisons

glutamatergiques en provenance du NST. De plus, les boutons synaptiques en provenance du

PPN semblent former des synapses sur des dendrites de diamètres plus larges que les boutons

synaptiques en provenance du NST (Damlama, 1994; Lee and Tepper, 2009) suggérant que le

PPN représente une source importante (voire la plus importante) d’excitation des neurones

27

DA de la SNc. En accord avec cette idée, la stimulation électrique du PPN in vitro ou in vivo

provoque des réponses excitatrices dans les neurones DA de la SNc qui peuvent être bloquées

par des antagonistes glutamatergiques et cholinergiques (Scarnati et al., 1986; Futami et al.,

1995) ; cette stimulation in vivo peut de plus commander l’apparition d’une activité en bursts,

suggérant un effet monosynaptique (Lokwan et al., 1999). A noter qu’au niveau de l’ATV,

une activité en burst est également déclanchée par les afférences du PPN mais uniquement

pour les neurones qui présentent déjà une activité de décharge ; cettte afférence ne pourrait

pas recruter des neurones inactifs ou augmenter la fréquence de décharge des neurones DA de

l’ATV (Floresco et al., 2003).

2.2.1.2.2. En provenance du noyau latéro dorsal tegmental

Les neurones DA mésencéphaliques reçoivent une innervation cholinergique, glutamatergique

et GABAergique en provenance du noyau latérodorsal tegmental situé en position caudale du

PPN (Mena-Segovia et al., 2008). Cette innervation est ipsilatérale et concerne

préférentiellement l’ATV par rapport à la SNc. Les projections vers la SNc sont moins denses

que celles en provenance du PPN.

2.2.1.3. Les autres afférences glutamatergiques

2.2.1.3.1. En provenance du cortex

Les neurones DA de la SNc reçoivent des afférences excitatrices glutamatergiques en

provenance des aires corticales primaires et secondaires (M1 et M2) ainsi que du cortex

somatosensoriel (S1) (Figure 5, Watabe-Uchida et al., 2012). Les neurones DA de l’ATV

reçoivent moins d'afférences corticales que les neurones DA de la SNc ; ces afférences

proviennent de zones corticales différentes dont les plus importantes sont issues du cortex

orbitofrontal latéral et du cortex préfrontal.

28

2.2.1.3.2. En provenance du noyau subthalamique

Les neurones DA de la SNc reçoivent également de nombreuses afférences en provenance du

NST (Figure 5) (Hammond et al., 1978; Chang et al., 1984; Kita and Kitai, 1987; Watabe-

Uchida et al., 2012). Il est de plus intéressant de noter que les neurones glutamatergiques du

NST projettent préférentiellement vers la SNc alors que les projections vers l’ATV sont

relativement faibles (Watabe-Uchida et al., 2012).

Les neurones du NST déchargent de manière spontanée aussi bien in vivo qu’in vitro (~ 6 à 30

Hz) (Nakanishi et al., 1987a; Bergman et al., 1994; Beurrier et al., 1999) fournissant ainsi une

afférence excitatrice toniquement active pour les neurons DA de la SNc. Ces afférences

glutamatergiques, en particulier via l’activation des récepteurs NMDA, sont responsables de

l’activité en burst observée in vivo et in vitro (Charlety et al., 1991; Overton and Clark, 1992;

Johnson et al., 1992). La lésion ou l’inhibition pharmacologique du NST diminue cette

activité en burst des neurones DA de la SNc (Smith and Grace, 1992), ce qui pourrait être lié

à la diminution de la stimulation des récepteurs NMDA.

Figure 5. Afférences des neurones DA de la substance noire (rouge) et de l’aire tegmentale ventrale (bleu) (Issu de : Watabe-Uchida et al., 2012)

29

2.2.2. Les efferences des neurones dopaminergiques

2.2.2.1. Vers le striatum

La cible majeure des neurones DA de la SNc est le striatum, constituant la voie nigro-striée

(Figure 6). Ces projections présentent une organisation topographique (Smith and Kieval,

2000; Bjorklund and Dunnett, 2007). Chez le primate, le striatum sensori-moteur reçoit des

afférences provenant majoritairement du tiers ventral de la SNc. Le striatum limbique est

innervé préférentiellement par les neurones de l’ATV et les neurones de la partie dorsale de la

SNc. Le striatum associatif reçoit des afférences en provenance de la partie ventrale de la

SNc. A noter que, chez le rat, les neurones du tiers dorsal de la SNc projettent

majoritairement vers le striatum dorsal. Les fibres DA nigrostriées sont minces, variqueuses

et parcourent de longues distances. Une caractéristique des afférences DA au niveau du

striatum est leur convergence avec les afférences corticales, supportant un rôle important de la

DA dans la régulation des informations corticales.

La DA provoque un effet opposé sur les deux voies de sortie striatale :

- Excitatrice sur les neurones de la voie directe qui expriment en majorité le récepteur

D1 ;

- Inhibitrice sur les neurones de la voie indirecte qui expriment en majorité le récepteur

D2.

2.2.2.2. Vers le GP, l’EP et le STN

Même si les neurones DA projettent en majorité vers le striatum, le GP, le GPi et le NST

reçoivent également des afférences de ces neurones (Figure 6) (Smith and Kieval, 2000;

Bjorklund and Dunnett, 2007; Rommelfanger and Wichmann, 2010). En effet, les deux

segments du pallidum (surtout le GPi) ainsi que le NST présentent des varicosités TH-

positives formant des synapses symétriques. De plus, des expériences de traçages

anatomiques (antérogrades et rétrogrades) montrent des connexions anatomiques directes

entre la SNc/ATV et le GP (Lindvall and Bjorklund, 1979; Parent and Smith, 1987; Smith and

Bolam, 1989) ou le NST (Hassani et al., 1997; Francois et al., 2000). Ces projections ne

seraient pas uniquement des collatérales de neurones DA projetant vers le striatum, mais

30

seraient issues de neurones projetant directement vers ces structures et réalisant peu de

collatérales vers le striatum.

En complément de ces données anatomiques, des données fonctionnelles montrent que la DA

module l’activité neuronale et l’expression de c-fos dans les neurones pallidaux et du STN

(Pan and Walters, 1988; Ruskin and Marshall, 1995). De plus, l’infusion bilatérale

d’antagonistes D1 ou Dβ dans le GP induit une akinésie (Hauber and Lutz, 1999).

A noter que la voie nigro-pallidale est relativement préservée dans les modèles animaux de la

MP et pourrait jouer un rôle dans la récupération fonctionnelle observée après administration

de GDNF (glial derived neurotrophic factor) dans des modèles de MP chez le singe.

2.2.2.3. Vers la SN

Les neurones DA de la SN ont la particularité de pouvoir synthétiser, stocker et libérer la DA

au niveau dendritique dans la SN. La libération de DA dans la SN serait plutôt dendritique

qu’axonale (Leviel et al., 1979a), issue de neurones localisés dans le tiers ventral de la SNc

dont l’arborisation s’étend dans de large portions de la SNr, et pourrait être induite par la

stimulation des afférences glutamatergiques (notamment du NST) de la SNc (Mintz et al.,

1986; Rosales et al., 1994). L’effet physiologique de la DA libérée est exercé par une

transmission volumique et une action sur des sites extrasynaptiques plutôt que par

transmission synaptique classique. Il n’existe en effet que très peu de synapses

dendrodendritiques dans la SNc et ces synapses sont quasiment absentes de la SNr. Il a été

montré que cette libération dendritique est responsable d’une régulation de l’activité des

neurones DA ainsi que des afférences GABA striatonigrales et des neurones GABA de

projection de la SNr (Bustos et al., 2004).

L’effet de la DA sur les neurones DA serait inhibiteur et passerait par des autorécepteurs

(Groves et al., 1975; Falkenburger et al., 2001). Sur la SNr (Ruffieux and Schultz, 1980;

Waszczak and Walters, 1986), l’application de DA ou de l’agoniste Dβ quinpirole provoque

une diminution de la réponse des neurones GABAergiques au GABA (Martin and Waszczak,

1996). Au travers des récepteurs D1, la DA augmente la réponse au GABA des neurones de la

SNr probablement au travers des récepteurs D1 localisés sur les afférences striato-nigrales

(Martin and Waszczak, 1994; Radnikow and Misgeld, 1998).

31

2.2.2.4. Vers le cortex

Bien qu’issue en majorité de l’ATV, l’innervation DA corticale fait intervenir toutes les

populations mésencéphaliques (A8, A9, A10). Chez le rongeur, cette innervation concerne

surtout le cortex frontal, cingulaire et enthorinal, alors que chez le primate, elle couvre

l’entièreté du cortex (Bjorklund and Dunnett, 2007).

Figure 6. Efférences des neurones DA de la

substance noire compacte et de l’aire tegmentale ventratrale.

2.3. Propriétés electrophysiologiques des neurones DA

Au début des années 70, plusieurs études ont montré par des enregistrements

électrophysiologiques in vivo que les neurones DA de la SNc et de l’AVT se distinguent des

neurones non-DA de la SN de par leurs propriétés electrophysiologiques et

pharmacologiques.

32

2.3.1. Propriétés electrophysiologiques de base

Les neurones DA possèdent une résistance d’entrée modérée (1κ-45 MΩ in vivo et 80-320

MΩ in vitro) (Grace and Bunney, 1983; Grace and Onn, 1989). Néanmoins, les membranes

des neurones DA sont caractérisées par une rectification forte à des potentiels hyperpolarisés.

Cette rectification possède deux composantes (Grace and Bunney, 2000) :

- Une instantanée montrant une activation maximale à un potentiel membranaire de -63

mV

- Une dépendante du temps, montrant une activation maximale à un potentiel

membranaire de -78 mV.

De plus, une hyperpolarisation brève de la membrane provoque une forte repolarisation

voltage-dépendante des neurones DA qui ressemblerait au courant potassique IA, mais cette

conductance n’est pas affectée par le bloqueur potassique le 4-aminopyridine.

Les études in vitro ont également mis en évidence des propriétés pacemaker dépendantes du

Ca2+ dont nous rappelerons plus loin les substrats moléculaires.

2.3.2. Activité de décharge in vivo

En comparaison avec les neurones non-DA, les neurones DA ont un potentiel d’action plus

large, une vitesse de conduction lente et un rythme de décharge plus faible. La raison exacte

expliquant la largeur du potentiel d’action des neurones DA n’est toujours pas évidente : cela

pourrait être relié à la distance assez longue pouvant exister entre l’endroit où est généré le

potentiel d’action et le soma enregistré. En effet, l’axone, dans les neurones DA, naît d’une

dendrite et non directement du soma. Ainsi, lorsque le potentiel d’action est généré, celui-ci

se propage d’abord dans la dendrite ayant donné naissance à l’axone avant d’arriver au soma

(Hausser et al., 1995). In vivo, certains neurones DA de la SNc montrent un pattern de

décharge en bursts qui les différencie des neurones non-DA voisins qui ont un pattern regulièr

(Aghajanian and Bunney, 1973; Shi, 2009) ; ce pattern en burst est plus visible chez les

animaux anesthésiés à l’hydrate de chloral que chez des animaux non anesthésiés. Les

analyses spectrales suggèrent toutefois que cette activité en bursts pourrait en fait

correspondre à une activité lente oscillatoire, où la fréquence des oscillations correspondrait à

la fréquence d’apparition des burst et l’amplitude des oscillations au nombre de spikes et à la

33

fréquence des spikes à l’intérieur du burst. Les neurones DA de la SNc sont moins sujet à

cette activité lente oscillatoire que les neurones DA de l’ATV où les oscillations sont

cohérentes avec l’activité oscillatoire du cortex préfrontal (Shi et al., 2004; Shi, 2005; Gao et

al., 2007; Zhang et al., 2008).

2.3.3. Activité de décharge in vitro

L’enregistrement des neurones DA in vitro (Figure 7) montre certaines propriétés similaires

aux enregistrements in vivo, comme un potentiel d’action large, un rythme de décharge plutôt

lent, une réponse inhibitrice aux agonistes DA suggérant la présence d’autorécepteurs

(Sanghera et al., 1984). Cependant, les neurones DA enregistrés en déchargent de manière

hautement régulière, de type pacemaker, et ne présentent pas de décharge en bursts (Sanghera

et al., 1984). Plusieurs études ont tenté de reproduire l’activité irrégulière en bursts sur

tranches, en activant ou en inactivant de façon tonique certains récepteurs ou canaux.

Notamment, le bloquage des canaux SK par l’apamine induit une activité de décharge

irrégulière et parfois une activité en bursts (Shepard and Bunney, 1988). Une activation

prolongée des récepteurs NMDA, surtout en présence d’apamine, induit également une

activité rythmique en bursts (Johnson et al., 1992). Dans tous les cas, les bursts induits in

vitro ne présentent pas les mêmes caractéristiques qu’in vivo (fréquence de bursts plus basse

et nombre de potentiels d’action par burst plus élevé). Ces différences suggèrent que la

décharge en burst et les oscillations lentes observée in vivo sont causées par une activité

phasique ou oscillatoire d’afférences à la SNc (Gao et al., 2007). Il a récemment été montré

que les neurones DA in vitro sont capables de générer des bursts similaires à ceux observés in

vivo lorsqu’ils sont stimulés de façon transitoire à haute fréquence par des afférences

glutamatergiques ou par une application brève de glutamate sur les dendrites des neurones

DA (Blythe et al., 2007).

34

Figure 7. Caractéristiques électrophysiologiques des neurones dopaminergiques. (A) Caractéristiques in

vitro. (Aa) immunomarquage tyrosine hydroxylase d’un neurone enregistré (rempli avec la biocytine ; barre

d’échelle : 10 µM) ; (Ab) illustration du courant Ih pendant des créneaux hyperpolarisants ; (Ac) Illustration de

la décharge régulière, lente avec un potentiel d’action assez large (Ad) barre d’échelle 1ms, 10mV (Issu de :

(Wanat et al., 2008)). (B) Traces représentant l’activité électrophysiologique spontanée en bursts d’un neurone DA in vivo (Issu de : (Brischoux et al., 2009)).

2.3.3.1. Canaux sous-tendant les propriétés pacemaker

Certains neurones DA sont capables de décharger spontanément, même en l’absence d’inputs

synaptiques, suggérant la présence de mécanismes pacemaker dans ces cellules. Plusieurs

canaux ioniques sous-tendent cette activité pacemaker dans les neurones DA, notamment les

canaux Na+, Ca2+, K+ ainsi que les canaux cationiques non-sélectifs. Le rôle de ces canaux

varie en fonction de l’âge de l’animal et de la région, SNc vs. ATV.

Rôle des canaux Na+

La contribution des canaux Na+ à l’activité pacemaker des neurones DA a été suggérée pour

la première fois après l’observation que la TTX ne bloque pas seulement les potentiels

d’actions rapides mais diminue également la phase de dépolarisation lente précédent le

potentiel d’action (Grace and Onn, 1989; Kang and Kitai, 1993). Cependant, la majeure partie

A

B

35

du potentiel pacemaker, un potentiel oscillatoire lent, persiste en présence de TTX (Fujimura

and Matsuda, 1989; Harris et al., 1989) suggérant l’implication de conductances à la fois

sodiques et calciques dans la dépolarisation spontanée interspike (Puopolo et al., 2007). Une

étude récente suggère que les canaux Na+ soit essentiels pour les propriétés pacemaker des

neurones DA de l’ATV et les « jeunes » neurones DA de la SNc, mais ne seraient plus requis

dans les neurones DA de la SNc « adultes » (Chan et al., 2007).

Rôle des canaux Ca2+

Il semblerait que les neurones DA expriment tous les types de canaux calciques (types L, P/Q,

N et T) sauf les canaux de type R. Les canaux de type L et P/Q interviendraient dans la phase

de dépolarisation du potentiel pacemaker alors que les canaux de type T seraient impliqués

dans les phases de dépolarisation ainsi que de repolarisation du potentiel (Shi, 2009).

Rôles des autres canaux

Un certain nombre d’autres canaux semblent également jouer un rôle dans l’activité

pacemaker des neurones DA comme les canaux IH, IA, SK et TRP (transient receptor

potential).

Les canaux IH sont des canaux cationniques non-sélectifs à rectification entrante. En réponse

à des créneaux de courant hyperpolarisant, les neurones DA présentent une rectification

entrante voltage-dépendante, qui est lente et bloquée par le césium. Comme les canaux Na+,

les canaux IH seraient essentiels à l’activité pacemaker des neurones DA de l’ATV et des

neurones DA de la SNc « jeunes », mais seraient moins importants dans les neurones

« adultes » (Chan et al., 2007).

Les canaux IA sont des canaux potassiques voltage-dépendants, activés lorsque la cellule est

dépolarisée à partir de potentiels hyperpolarisés. L’activation de ces canaux ralentit la phase

de dépolarisation et provoque un retard dans la décharge de potentiels d’action (Kita et al.,

1986; Grace and Onn, 1989). Ainsi, les canaux IA jouent un rôle inhibiteur sur l’activité

pacemaker des neurones DA et leur blocage augmente le rythme de décharge de ces neurones

(Nedergaard, 1999; Liss et al., 2001).

Les canaux SK, activés par l’influx calcique entrant lors de l’activité pacemaker, sont des

canaux potassiques dépendants du calcium. Ils sont en partie responsables de la phase

d’hyperpolarisation consécutive au potentiel d’action (AHP) (Shepard and Bunney, 1988).

Ainsi, l’apamine, un bloqueur de ces canaux, prolonge la phase de dépolarisation et augmente

le nombre de potentiels d’actions émis durant chaque phase (Ping and Shepard, 1996; Wilson

and Callaway, 2000). Les neurones DA expriment en majorité le sous-type SK3 ; à noter que

36

les neurones DA de l’ATV expriment 4 fois moins SKγ que les neurones DA de la SNc. Au

niveau électrophysiologique, les neurones DA de l’ATV possèdent également des courants

AHP 4 fois plus petits (Wolfart et al., 2001). Les neurones GABA de la SN expriment plutôt

SK2 mais pas SK3 (Yanovsky et al., 2005).

Les canaux TRP sont des canaux présentant une perméabilité non spécifique pour les

cations. Il en existe six superfamilles. Des bloqueurs non sélectifs ainsi que des bloqueurs de

la famille TRPC (classique) inhibent l’activité pacemaker des neurones DA de la SNc (Kim et

al., 2007).

37

III. La maladie de Parkinson

3.1. Généralités

Figure 8. Première page de l’ouvrage de James Parkinson donnant la première description de la MP

La MP a été décrite pour la première fois par James Parkinson en 1817 (Parkinson, 1817)

dans son ouvrage intitulé « An essay on the Shaking Palsy » (Figure 8). Cette maladie

constitue la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue après la maladie

d’Alzheimer, affectant approximativement 6 millions de personnes dans le monde (Van Den

Eeden et al., 2003; de Lau and Breteler, 2006). En France, on estime (au 31 décembre 2009)

que le nombre de patients parkinsoniens est compris entre 150 000 et 175 000, ce qui conduit

à une estimation de la prévalence de la maladie de Parkinson comprise entre 2,3 et 2,7 pour 1

000. Les premiers symptômes n’apparaissent en général qu’aux alentours de 60 ans, même

s’il faut toutefois noter que 5-10% des patients sont âgés de moins de 40 ans (Tanner and

Goldman, 1996; Langston, 1998). La MP est une atteinte neurologique lente et progressive

avec une durée moyenne de 15 ans entre le diagnostic et le décès du patient (Elbaz et al.,

2003). Les symptômes de la MP commencent insidieusement, empirent graduellement et

peuvent démarrer plusieurs années avant le diagnostic clinique (Hawkes, 2008). Les

symptômes moteurs dominent le tableau clinique ; les signes cardinaux sont les suivants

(Pallone, 2007) :

- Le tremblement de repos : il est le premier symptôme visible chez 70% des patients

parkinsoniens. Ce tremblement, qui est souvent le symptôme le plus difficilement

38

contrôlable par la médication, est défini par une fréquence de quatre à six cycles par

seconde avec une amplitude variable selon les activités et le stress.

- L’akinésie : elle se caractérise par un défaut d’initiation et d’exécution des mouvements

volontaires. Tous les types de mouvements ne sont pas concernés au même degré. Ainsi,

on notera en particulier les mouvements réclamant de la précision et les mouvements semi-

automatiques, comme la marche (perte du balancement des bras pendant la marche) ou

l'écriture (micrographie). L’akinésie s’accompagne le plus souvent d’une bradykinésie, qui

correspond à un ralentissement de l’exécution des mouvements. La bradykinésie altère

énormément la qualité de vie des patients, entrainant une augmentation du temps

nécessaire pour effectuer des taches usuelles, comme s’habiller ou manger.

- La rigidité musculaire ou hypertonie rigide : elle implique une augmentation de la

résistance lors de mouvements passifs des membres.

- L’instabilité posturale : elle est la conséquence principale de l’hypertonie, qui fragilise

l’équilibre, la station verticale ainsi que le développement dynamique de la marche et

entraîne des chutes chez les patients parkinsoniens (Fahn, 2003; Dauer and Przedborski,

2003).

En outre, les patients parkinsoniens développent fréquemment une posture voutée et peuvent

perdre les réflexes posturaux normaux, pouvant engendrer des chutes et nécessitant parfois

l’utilisation d’un fauteuil roulant. Au moins deux de ces troubles caractéristiques doivent être

présents pour diagnostiquer la MP, l'un des deux devant être le tremblement de semi-repos ou

la bradykinésie. De façon intéressante, tous les signes cardinaux de la pathologie apparaissent

d’abord de façon asymétrique, en impliquant un seul côté du corps, et s’expriment ensuite de

façon bilatérale avec l’évolution de la maladie. En plus des symptômes moteurs

caractéristiques, la plupart des patients présentent également des symptômes non moteurs

(Fahn, 2003; Ferrer et al., 2012; Maass and Reichmann, 2013). Ceux-ci sont très diversifiés ;

ils incluent par exemple une bradyphrenia (ralentissement des fonctions mentales), diminution

de la motivation, apathie, démence, fatigue, dépression, anxiété, troubles olfactifs, désordres

du sommeil, constipation, désordres de la vessie ainsi que d’autres fonctions autonomes

(sexuel, gastro-intestinal), des symptômes sensoriels comme la douleur, engourdissement, des

picotements... La démence est associée à l’âge et est présente chez plus de 70% des patients.

Le taux de mortalité est environ 1,5 fois plus élevé que pour des individus sains au même

âge. La mort des patients atteints de la MP est en général due à une autre maladie

39

concomitante ou aux effets de la diminution de mobilité, pneumonie par aspiration ou une

augmentation des chutes entraînant des blessures ou des fractures.

La grande majorité (80-90%) des cas de MP sont sporadiques. Une des grandes avancées des

10 dernières années fut la découverte de plusieurs gènes dont la mutation est impliquée dans

des formes familiales de MP (Corti et al., 2011). Mais ces mutations génétiques n’expliquent

pas la vaste majorité des cas de MP sporadiques et comptent pour seulement 10-20% des cas

de MP. Même si des formes rares de MP relativement « pures » ont été associées à la

mutation d’un seul gène (par exemple le gène de la parkine), à l’action d’une seule toxine

environnementale (par exemple 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyrridine, MPTP) ou

d’un seul agent infectieux (par exemple encephalitislethargica), les théories actuelles sur la

pathogénèse de la MP idiopathique sont plutôt en faveur d’une combinaison entre

susceptibilité génétique et facteur de risque environnemental (Chand P and Litvan, 2009).

Les facteurs putatifs environnementaux et démographiques prédisposant à la MP idiopathique

incluent l’âge, le sexe, les taux d’oestrogènes, la race, l’ethnie, l’exposition aux pesticides, un

traumatisme crânien, alors que la consommation de tabac, d’alcool ou de café serait associée à

une réduction du risque de développer cette pathologie. De tous les facteurs étudiés, l’âge est

le plus hautement lié à la MP : l’incidence de la MP augmente progressivement avec l’âge.

Des facteurs environnementaux de nature inconnue et la combinaison de facteurs génétiques

et environnementaux sont suggérés comme jouant un rôle dans l’étiologie de la MP

sporadique. Néanmoins, les déterminants moléculaires spécifiques impliqués dans la forme

idiopathique de la MP restent toujours inconnus (Chand P and Litvan, 2009).

3.2. Caractéristiques neuropathologiques

3.2.1. Pertes neuronales centrales

3.2.1.1. Atteintes des neurones dopaminergiques

mésencéphaliques

L’étude anatomo-pathologique conduite sur des coupes de cerveaux de patients parkinsoniens

en 1919 par Tretiakoff décrit une dépigmentation bilatérale au niveau du locus niger

(substance noire ; SN).

40

Figure 9. Dépigmentation de la substance noire dans la maladie de Parkinson. Coupes mésencéphaliques

issues d’un patient parkinsonien (à gauche) et d’un individu sain (à droite).

L’identité DA de ces neurones sera déterminée plus tard par de nombreuses études. Cette

perte irréversible et progressive des neurones DA situés dans la SNc constitue la

caractéristique neuopathologique majeure de la MP (Figure 9), même si l’on sait maintenant

que d’autres noyaux sont également touchés.

La pigmentation de la SNc est due à la neuromélanine cytoplasmique neuronale qui

s’accumule avec l’âge. La perte de pigmentation est observée pour tous les patients

parkinsoniens. Elle correspond à une perte neuronale et augmente proportionnellement à la

sévérité et la durée de la maladie. Il semblerait que les neurones les plus pigmentés en

neuromélanine soient ceux qui dégénèrent préférentiellement. Ils exprimeraient des niveaux

plus faibles du transporteur vésiculaire des monoamines VMAT2 ainsi que de plus faibles

taux d’accumulation vésiculaire de DA et une expression réduite de calbindine.

La perte neuronale dans la MP concerne 50 à 90% des neurones DA de la SNc et se traduit

par des diminutions de 60 à 80% des concentrations en DA au niveau de la cible principale de

ces neurones : le striatum (Bernheimer et al., 1973; Agid et al., 1993; Vingerhoets et al.,

1994). Le déficit en DA est prépondérant dans la région dorsolatérale du putamen qui

correspond à la portion motrice du striatum (Kish et al., 1988; Graybiel et al., 1990).

L’apparition des symptômes moteurs classiques est reliée à cette perte massive en neurones

DA et aux changements qui en résultent au sein des GB (Rodriguez-Oroz et al., 2009).

La perte neuronale dans la SNc n’est pas uniforme. Elle affecterait d’abord et plus

massivement le tiers ventral (70-90% de perte) et s’étendrait plus tardivement au tiers dorsal

(25-70% de perte) (Gibb and Lees, 1991; Fearnley and Lees, 1991; Halliday et al., 1996;

Damier et al., 1999b). Dans les stades avancés de MP la perte en neurones dans la région

ventrale peut être quasi-totale. Il existe également des différences de pertes au niveau de la

41

SNc selon l’axe rostro-caudal. En effet, il semble que la dégénérescence des neurones DA

suive une progression spatio-temporelle précise, commençant par les nigrosomes et affectant

seulement ultérieurement la matrice selon l’une des directions de progression dans les trois

dimensions listées ci dessous (Damier et al., 1999b) : postérieur vers antérieur ; latéral vers

médian ; ventral vers dorsal (Figure 10).

Figure 10. Evolution spatiotemporelle des pertes neuronales DA dans la SN (Issu de : Damier et al., 1999).

Les lignes correspondent à des patients à différents stades d’évolution de la MP en années et les colonnes aux régions rorto-caudales de la SN. Le code couleur du bleu au rouge indique le degré croissant de perte cellulaire.

42

Les autres groupes de neurones DA mésencéphaliques présents à proximité de la SNc (A8 ou

aire rétro-rubrale et A10 ou ATV) sont beaucoup moins atteints que ceux de la SNc. Les

pertes neuronales dans l’AVT sont entre γ5 et 55% (Uhl et al., 1985) et sont observées

notamment chez les patients présentant des démences (Rinne et al., 1989).

3.2.1.2. Atteintes centrales non dopaminergiques

Il est désormais clairement établi que les atteintes dans la MP ne se limitent pas aux neurones

DA mésencéphaliques et concernent à différents degrés d'autres noyaux et systèmes de

neurotransmission (Jellinger, 1991; Braak and Braak, 2000). Les atteintes incluent les

systèmes noradrenergiques du locus coeruleus (Gesi et al., 2000), dont la dégénérescence peut

être quasi-totale dans des cas de MP tardifs, sérotoninergiques du raphé (Halliday et al.,

1990), cholinergiques du noyau basal de Meynert (Nakano and Hirano, 1984; Jellinger,

1991), peptidergiques (noyau dorsal moteur du vague) (Halliday et al., 1990) ou

glutamatergiques avec des pertes neuronales importantes dans le complexe thalamique centre-

median parafasciculaire (Henderson et al., 2000).

3.2.2. Corps de Lewy

La perte neuronale qui caractérise la MP est associée à la présence d’inclusions positives pour

l’α-synucléine dans les corps cellulaires (corps de Lewy ; CL) et les neurites (NL) de

neurones spécifiques du tronc cérébral (Spillantini et al., 1997; Dickson et al., 2009). Sous

microscope optique, les CL dans le tronc cérébral de patients parkinsoniens apparaissent

comme des inclusions intracytoplasmiques circulaires de 5 à 25 µm de diamètre, présentant

un cœur éosinophile dense entourés par une couronne d’aspect plus clair (Figure 11). Au

niveau ultrastructural, les CL sont composés d’un cœur dense constitué de matériels

filamenteux et granulaire qui sont entourés par des filaments orientés radialement de 10 à 20

nm de diamètre (Roy and Wolman, 1969; Goedert et al., 1998; Spillantini et al., 1998). Les

études en microscopie électronique ont montré que ces CL sont composés de filaments

d’α­synucléine de β00 à 600 nm de longueur et 5 à 10 nm de large. Ces filaments ont une

structure cross- comme les autres aggrégats amyloïdes où les feuillets sont empilés

perpendiculairement à l'axe de la fibre (Spillantini et al., 1998; Serpell et al., 2000).

43

L’hyperphosphorylation de la sérine 1βλ représente la principale modification post-

traductionnelle de l’α­synucléine lorsqu’elle est présente en filaments (Fujiwara et al., 2002;

Anderson et al., 2006). Ces filaments d’α­synucléine sont ensuite ubiquitinylés une fois

assemblés (Goedert, 2001).

Figure 11. Corps de Lewy mis en évidence dans la

substance noire d’un patient parkinsonien. (Issu du site du

laboratoire de Tom Warner).

Même si l’α­synucléine est le constituant majeur des CL et NL, un grand nombre d’autres

protéines entrent également dans leurs composition (Xia et al., 2008) :

- Des protéines chaperonnes (HSP 90, spectrin, plectin,…)

- Des protéines intervenant lors d’un stress oxydant (carbonyl reductase, peroxiredoxin

5,…)

- Des kinases (MEK1, PKC 1,…)

- Des protéines intervenant dans l’ubiquitinylation (ubiquitine, E3 ubiquitine ligase

KPC1…)

- Des protéines intervenant dans l’adressage (adaptator-related protein complex 2,

calcium-dependent secretion activator, clathrin heavy chain 1…)

3.2.3. Pertes neuronales dans le système nerveux périphérique

Le système nerveux périphérique regroupe le système sensoriel, moteur et autonome. Les

systèmes sensoriel et moteur ne montrent aucun signe pathologique (pas de CL) ni de

dégénérescence dans la MP. Par contre, des signes pathologiques sont observés dans le

système nerveux autonome.

44

Le système nerveux autonome peut être subdivisé en système nerveux sympathique,

parasympathique et des populations de neurones intrinsèques situés dans les parois des

organes qui sont chargés de réguler localement le fonctionnement de leurs cibles. La plus

grande composante de ces neurones intrinsèques est le système nerveux entérique (SNE) qui

se trouve dans le tractus gastro-intestinal. Les neurones du SNE sont subdivisés en deux

plexus : le plexus myentérique ou d’Auerbach et le plexus sous-muqueux ou de Meissner. Les

neurones du SNE possèdent des phénotypes très variés : il existe des neurones cholinergiques,

sérotoninergiques, noradrenergiques et DA (Anlauf et al., 2003).

Dès la caractérisation originale de la MP, il a été décrit des constipations sévères pour

plusieurs patients (Parkinson, 1817). Si d'anciennes études ne montraient pas de modification

du nombre de neurones TH+ dans les plexus myentériques et sous-muqueux chez les patients

parkinsoniens en comparaison avec des individus sains, il est maintenant largement décrit

qu’une perte des neurones DA du plexus myentérique des patients parkinsoniens est

responsable de ces constipatons (Li et al., 2011). Ainsi, une étude a montré une perte de plus

de 90% des neurones DA pour 9 des 11 patients parkinsoniens, associée à une perte majeure

des neurites DA dans le tissu entérique, ainsi qu'à une réduction de 70% des niveaux de DA

(Singaram et al., 1995). La première identification de CL chez des patients atteints de la MP

fut dans des neurones de l’œsophage et du colon ; ces patients présentaient également une

dysphagie (Qualman et al., 1984). D’autres études ont confirmé la présence de CL dans le

tractus gastrointestinal de patients parkinsoniens (Kupsky et al., 1987; Wakabayashi et al.,

1988). Les CL ont été observés dans les neurones DA (Lebouvier et al., 2010) mais leur

présence dans des neurones non-catécholaminergiques (Wakabayashi et al., 1990), comme

par exemple les neurones sérotoninergiques qui sont très représentés dans les intestins, n'a pas

été établie.

Les parties sympathiques et parasympathiques du SNA sont également affectées dans la MP.

Chez des patients parkinsoniens à des stades tardifs il y a quelques fois apparition

d’hypotension orthostatique. Ceci a été attribué à une chute de l’innervation cardiaque

noradrénergique (Goldstein et al., 2002; Cersosimo and Benarroch, 2012).

45

3.3. Pathophysiologie des troubles moteurs parkinsoniens :

modifications fonctionnelles dans les ganglions de la base

Dans la MP, la perte massive des neurones DA de la SNc induit une déplétion striatale en DA

qui a deux conséquences opposées sur les deux populations de neurones striataux : une levée

de l’influence activatrice via les récepteurs D1, induisant une hypoactivation des neurones de

la voie directe, et une levée de l’influence inhibitrice via les récepteurs Dβ, induisant une

hyperactivation des neurones de la voie indirecte. L’hypoactivation des neurones de la voie

directe entraîne une désinhibition des neurones des structures de sortie et donc l’inhibition de

la voie thalamo-corticale. L’hyperactivation des neurones striataux de la voie indirecte inhibe

le GP/GPe et donc désinhibe le NST, qui à la fois induit une hyperactivation des structures de

sortie, renforçant ainsi l’inhibition de la voie thalamo-corticale. La perte en DA entrainerait

donc un déséquilibre entre les deux voies : une hypo-activité de la voie directe, facilitatrice du

mouvement, et une hyperactivité de la voie indirecte, inhibitrice du mouvement (Figure 12).

Ce déséquilibre entre les deux voies serait à l’origine du ralentissement moteur caractéristique

de la MP (DeLong, 1990; Wichmann and DeLong, 2003).

Figure 12. Représentation shématique du fonctionnement physiopathologique des ganglions de la base.

46

Le schéma classique des GB restreint l’innervation DA au seul striatum. En réalité, toutes les

structures des GB sont soumises à une influence DA directe. Ainsi, deux grandes voies

d’innervation DA peuvent être considérées :

- La première, formée de neurones DA de la SNc de type I, est la voie nigro-striée. Elle

innerve majoritairement le striatum et très faiblement les autres structures des GB

grâce à un maigre contingent de collatérales formant des synapses « en passant »,

notamment dans le GP (Lindvall and Bjorklund, 1979; Kelland, Sr. and Walters,

1992).

- La deuxième voie est formée de neurones DA de la SNc de type II, qui innervent le

GP, l’EP et le NST, et émettent très peu de collatérales vers le striatum (Brown et al.,

1979; Meibach and Katzman, 1979; Gauthier et al., 1999). L’existence d’une

innervation DA du NST a été également confirmée chez le primate humain (Augood

et al., 2000) et non humain (Francois et al., 2000).

De ce fait, la perte en DA dans des régions extrastriatales participerait au dysfonctionnement

des GB dans la MP. Ainsi, la déplétion en DA dans le NST pourrait contribuer à la décharge

pathologique en bouffées de ce noyau, caractéristique de la MP (Baufreton et al., 2005).

D’autre part, des approches métaboliques et neurochimiques n’ont pas retrouvée

l’hypoactivité présumée du GP qui serait à l’origine de l’hyperactivité du NST. Ces résultats

ont conduit à reconsiderer les schémas du fonctionnement physiopathologique des GB, en

réévaluant le concept de voie indirecte et en considérant le rôle d'autres afférences longtemps

négligées, comme les projections glutamatergiques du complexe thalamique centre-

médian/parafasciculaire qui innervent toutes les structures des GB. Dans ces schémas, le NST

n'est pas considéré comme un simple relai de la voie trans-striatale indirecte, mais comme une

structure d'entrée des GB, et son activation pathologique dans la MP est attribuée à d'autres

afférences que celles issues du GP, dont les afférences thalamiques ou celles issues du PPN

(Chesselet and Delfs, 1996; Levy et al., 1997; Hirsch et al., 2000).

47

3.4 Pathogenèse de la MP

La MP, comme beaucoup de maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer

ou la sclérose latérale amyotrophique, est surtout sporadique, c'est-à-dire qu'elle apparait dans

la grande majorité des cas sans liens génétiques apparents. Cependant, certains cas sont

héréditaires, et dans ces cas le phénotype parkinsonien peut se transmettre de façon récessive

ou dominante (Dauer and Przedborski, 2003). Dans les deux cas, héréditaire et sporadique, les

symptômes moteurs sont presque identiques, ce qui suggère des mécanismes sous-jacents

communs. Il est de plus en plus évident que la dégénérescence qui a lieu dans la MP est due à

des mécanismes inhérents aux neurones qui dégénèrent, mais également à l’environnement

cellulaire de ces neurones. En effet, les neurones DA ne sont pas isolés : ils sont entourés de

nombreux neurones non-DA et de cellules gliales qui peuvent contribuer aux mécanismes de

dégénérescence (Hirsch et al., 2012a).

L’étude des mécanismes d’action des toxines pouvant conduire à des troubles parkinsoniens

et celle de la fonction de certains gènes impliqués dans des formes familiales de la MP ont

conduit à l’élaboration d'hypothèses non exclusives concernant les mécanismes de mort des

neurones DA dans la MP. La vision actuelle inclut stress soxydant, dysfonctionnement

mitochondrial et agrégations protéiques (dysfonctionnement du système

ubiquitine/protéasome) comme mécanismes pathogéniques primaires, ainsi que

neuroinflammation et excitotoxicité comme mécanismes secondaires, l'ensemble constituant

un cercle vicieux entretenant le processus dégénératif où la mort cellulaire impliquerait des

processus apoptotiques (Figure 13).

Figure 13 . Mécanismes

hypothétiques impliqués dans la mort

neuronale dans la maladie de

Parkinson (Issu de Olanow, 2007).

48

3.4.1. Stress oxydatif

Les ROS et les espèces réactives pour le nitrogène (RNS) sont générées lors du métabolisme

normal. Cependant, un stress oxydant se met en place lors d’une augmentation de la

production ou une diminution de la décontamination des ROS ou des RNS, comme l’anion

superoxide (O2•-), le monoxyde d’azote (NO) et surtout le radical hydroxyl (•OH). Les

mécanismes de défense de la cellule peuvent alors être dépassés, conduisant à des

perturbations fonctionnelles et, finalement, à la mort de la cellule.

L’hypothèse selon laquelle le stress oxydant jouerait un rôle clef dans la pathogénèse de MP a

été proposée et débattue depuis longtemps (Calne, 1992; Fahn and Cohen, 1992; Jenner,

2003; Berg et al., 2004). Il est maintenant clair qu’il s’agit d’un élément majeur dans le

processus de dégénérescence de la MP. Il n’est cependant pas encore établi si le stress

oxydant constitue un évènement primaire ou une conséquence d’autres facteurs

pathogéniques. Les études chez des patients atteints d’ILBD (incidental Lewy bodies disease ;

CL trouvés chez des individus apparemment sains), qui représenterait une forme de phase

précoce et présymptomatique de la MP, n’ont montré aucun signe de stress oxydant hormis

une réduction en GSH (Jenner, 2003), ce qui indiquerait que le stress oxydant n’est pas

présent dans les phases précoces de la maladie. Cependant ces études ont porté sur très peu

d’homogénats tissulaires de patients et aucune étude plus détaillée sur les neurones DA n’a

été réalisée ; ceci ne permet donc pas de tirer de conclusions définitives. D’autre part, il a été

démontré que des modifications oxydatives constitueraient une étape critique de la formation

d'inclusions d’α-synucléine (Souza et al., 2000; Giasson et al., 2000; Schildknecht et al.,

2013). Ainsi, la production excessive de ROS et/ou l’altération des mécanismes cellulaires de

défense antioxydante pourrait être un évènement de première importance aussi bien dans

l’initiation que dans la progression de la MP (Krishnan et al., 2003).

Il y a plusieurs indices de la présence de stress oxydant ainsi que de ses conséquences

délétères dans la SN de patients parkinsoniens :

- La péroxydation lipidique des membranes : Lors d’un stress oxydant, les acides gras

des lipides polaires réagissent avec l’oxygène. Cette réaction est catalisée par des

métaux comme le fer ou par la NADPH cytochrome P-450 reductase et conduit in

49

fineà un niveau réduit d’acides gras polyinsaturés. De telles réductions sont mesurées

dans les SN des patients parkinsoniens (Dexter et al., 1989; Pratico, 2001).

- L’oxydation des protéines : Les ROS peuvent directement oxyder des acides aminés,

ce qui altère la fonction de certaines protéines ainsi que l’activité de certaines enzymes

(Stadtman, 2001). De plus, des changements conformationnels ajoutés à une

peroxydation lipidique (Marnett, 2000) peuvent conduire à l’aggégation de protéines

non-dégradables, une hypothèse qui est appuyée par la détection d’aggrégats

protéiques qui sont dûs au stress oxydant (Munch et al., 1999) et qui sont détectables

dans les CL avant même que les signes cliniques ne soient présents (Munch et al.,

2000). Une augmentation de la carbonylation des protéines est également observée

chez les patients atteints de la MP mais pas pour l'ILBD, ce qui suggère que

l’altération oxydative des protéines apparait plus tardivement dans le processus

pathologique de la MP (Alam et al., 1997a).

- Des altérations de l’ADN causées par les ROS ont été observées dans la SN et le

striatum de patients atteints de la MP (Alam et al., 1997b; Poon et al., 2004)

- D’autres marqueurs d’un stress oxydant : Par l’utilisation d’anticorps spécifiques,

la3-nitrotyrosine résultant de l’interaction de résidus tyrosine avec l’ion peroxynitrite

(ONOO-) a été détectée dans les CL et ce marquage a été attribué à une nitration de

l’α-synucléine (Giasson et al., 2000). De plus, les niveaux de glutathion (GSH) réduit

sont diminués dans la SN des patients parkinsoniens (Sofic et al., 1992) et l’activité

des enzymes responsables du catabolisme des phospholipides est diminuée, ce qui

indique une diminution des capacités de réparation des dommages du stress oxydant

(Ross et al., 1998). D’un autre côté, il a également été décrit des up-régulations des

enzymes anti-oxydantes comme la superoxyde dismutase dépendante du manganèse et

la glutathion peroxydase non-dépendante du sélénium (Marttila et al., 1988; Yoshida

et al., 1994; Power et al., 2002).

De façon importante, il faut tenir compte du fait que les neurones DA ne constituent que 1-2%

des cellules de la SN. Ainsi, les changements observés au niveau des paramètres du stress

oxydant dans des homogénats de SN ne peuvent pas être uniquement attribués aux neurones

DA (Jenner, 2003). Ces changements doivent également se produire dans les autres types

cellulaires et principalement dans les cellules gliales, ce qui implique un concept de déficit

métabolique global dans la SN des patients parkinsoniens. De plus, il existe également des

marqueurs périphériques du stress oxydant pouvant indiquer un désordre systémique relié au

50

stress oxydant présent dans le cerveau. Ces marqueurs périphériques incluent, notamment, un

dysfonctionnement de l’activité de la SOD, des réductions de la recapture du glutamate, des

augmentations de la peroxydation lipidique dans les érythrocytes, le sérum et le plasma des

patients atteints de la MP ainsi que des dommages de l’ADN dans les lymphocytes de patients

parkinsoniens non-traités (Bostantjopoulou et al., 1997; Serra et al., 2001; Ferrarese et al.,

2001b; Migliore et al., 2002).

3.4.1.1. Facteurs pouvant contribuer à la genèse du stress

oxydatif

Plusieurs facteurs ont été montrés comme pouvant être responsable du stress oxydant dans la

MP :

- La DA, dont le métabolisme dans les neurones provoque l’apparition de ROS et

pourrait de ce fait contribuer au moins en partie à la vulnérabilité préférentielle des

neurones DA. Durant son processus de synthèse, la DA peut conduire à la formation

de produits toxiques comme les quinones (Choi et al., 2003). Ensuite, son auto-

oxydation conduit à la formation de quinones et d’O2•- (Lotharius and Brundin, 2002)

et son métabolisme enzymatique conduit à la formation d’H2O2 qui est ensuite

converti en •OH par la réaction de Fenton (Gotz et al., 1994; Maruyama and Naoi,

2002). De plus, la DA et plusieurs de ses métabolites peuvent inhiber le complexe I de

la chaine respiratoire mitochondriale et générer ainsi un stress oxydant (Chinta and

Andersen, 2008).

- Les métaux de transition comme le fer, le cuivre ou le manganèse, peuvent être

potentiellement dangereux via un transfert d’électrons permettant l’auto-oxydation de

la DA, la conversion de l’H2O2 en •HO, ou la décomposition de peroxydes lipidiques

en peroxyles réactifs et en radicaux alkoxyl. Les données actuelles concernent surtout

la contribution du fer dans le stress oxydant observé dans la MP. Le contenu en fer des

structures des GB et de la SN est, même en condition physiologique, plus élevé que

dans la plupart des autres structures cérébrales (HALLGREN and SOURANDER,

1958). Ceci est important car le fer est un co-facteur de la synthèse de la DA par la

tyrosine hydroxylase. Le contenu en fer de la SN est 35% plus élevé chez les patients

51

parkinsoniens, avec une élévation du rapport Fe(III)/Fe(II) de 2:1 à 1:2 (Sofic et al.,

1988; Riederer et al., 1988; Riederer et al., 1989; Dexter et al., 1993; Gerlach et al.,

1994). Des niveaux augmentés de Fe(II) facilitent la conversion de l’H2O2 en •OH par

la réaction de Fenton et ainsi provoquentune augmentation supplémentaire des ROS

(Berg et al., 2001). De plus, en catalysant des réactions oxydatives, le fer augmente la

conversion de l’α-synucléine de sa conformation dépliée ou en α-hélices en une

conformation repliée en feuillets , sa forme principale dans les CL (Hashimoto et al.,

1998; Munch et al., 2000; Golts et al., 2002). Le moment dans le décours de la

pathologie où l’accumulation de fer a lieu n’est pas encore déterminé. Des données

venant d’études par ultrason transcrâniennes montrent une accumulation de fer assez

précoce dans le processus pathologique : cette accumulation serait ainsi plutôt une

cause primaire de la pathologie (Becker et al., 1995; Berg et al., 1999; Berg et al.,

2002). De plus, une association a été établie entre des variations dans les séquences de

certains gènes codant pour des protéines intervenant dans le métabolisme du fer dans

le cerveau et la MP (Borie et al., 2002; Hochstrasser et al., 2004).

- La neuromélanine est un très bon chélateur d’ions métalliques, en particulier du fer

(Ben-Shachar et al., 1991), et a été suggéré comme étant neuroprotecteur (Gerlach et

al., 1994). Cependant, il semblerait que la quantité de fer détermine le rôle de la

neuromélanine : si les taux de fer sont normaux, le fer est séquestré ; si les niveaux de

fer sont élevés, la neuromélanine favorise la formation de ROS et augmente la

libération de fer dans le cytoplasme (Zareba et al., 1995; Zecca et al., 1996). De plus,

la neuromélanine peut fixer différentes substances au rôle potentiellement toxique

comme le MPP+ ou des pesticides, ce qui suggère un rôle de la neuromélanine dans la

toxicité de ces substances (D'Amato et al., 1986; Gerlach et al., 1994).

- Le monoxyde d’azote, dans la MP, a une production qui est augmentée par les cellules

gliales activées (Hunot et al., 1999). En tant que radical libre, le NO favorise le stress

oxydant en réagissant avec des protéines et des lipides (Iravani et al., 2002).

Egalement, en présence d’ion superoxyde, des intermédiaires hautement réactifs sont

produits comme le peroxynitrite, conduisant à des altérations de l’ADN et à la

peroxydation lipidique (Liu et al., 2002b). Le NO participe aussi à la libération du fer

à partir de la ferritine (Reif and Simmons, 1990) et peut interagir directement avec la

chaine respiratoire mitochondriale (Antunes et al., 2002).

52

- Les neurones DA de la SNc seraient d’autant plus sensibles au stress oxydant que la

SNc est une structure pauvre en astrocytes (Damier et al., 1993). Par ailleurs, les

travaux du groupe de Surmeier ont montré que l’activité pacemaker des neurones DA

de la SNc est due à la présence de canaux calciques de type L Cav 1.3. associée à une

conductance calcique plus forte en comparaison avec les neurones DA de l’ATV

(Chan et al., 2007), à l’origine d’une augmentation de production de ROS par la

mitochondrie (Guzman et al., 2010).

3.4.1.2. Etat des défenses anti-oxydantes : réduction des

taux de glutathion

La cellule possède elle-même des mécanismes de défense contre le stress oxydant. Ces

mécanismes font intervenir soit des réactions enzymatiques catalysées par la SOD, la

glutathion peroxydase, ou encore la catalase, soit en liant les métabolites toxiques avec des

molécules comme les vitamines anti-oxydantes C et E, le glutathion, la cystéine ou le

coenzyme Q. Cependant, aucun changement dans le niveau des vitamines anti-oxydantes n’a

été rapporté chez les patients atteints de la MP (Riederer et al., 1989). De même pour la

catalase et la glutathion peroxydase, pour lesquelles soit aucun changement soit seulement

une légère diminution de leurs activités a été reporté (Ambani et al., 1975; Kish et al., 1985;

Sian et al., 1994b). Cependant, une augmentation de la glutathion peroxydase non-dépendante

du sélénium a été observée dans les astrocytes de patientsparkinsoniens (Power et al., 2002)

ainsi qu’une augmentation spécifique de la SOD dans la SNc (Marttila et al., 1988; Yoshida et

al., 1994). Toutefois, cette augmentation n’est pas accompagnée par une augmentation de

l’activité des enzymes de détoxification qui interviennent en aval. En effet, de l’H2O2 est

produit dans le processus de détoxification par la SOD, et un déficit en catalase et en GSH

conduit en une production encore augmentée d’H2O2 (Foley and Riederer, 1999). Enfin, les

taux de GSH ne sont pas augmentés mais au contraire réduits comme on va le voir en détails,

ce qui contribue à rendre les neurones plus vulnérables aux toxines (Jenner and Olanow,

1996).

53

3.4.1.3. Le glutathion : synthèse, métabolisme et rôles

Le GSH est un tripeptide synthétisé à partir de 3 acides aminés : le glutamate, la cystéine et la

glycine ( -glutamylcysteinylglycine). La synthèse du GSH (Figure 14) se fait en deux étapes

dépendantes de l’ATP. La première, qui conduit à la formation de -glutamylcystéine, est

l’étape limitante : en effet le facteur limitant de la synthèse de GSH est l’approvisionnement

en cystéine. Cette étape est également influencée par le GSH, qui régule négativement

l’enzyme qui catalyse cette réaction, la glutamate-cystéine ligase (GCL). La deuxième étape

constitue l’addition de la glycine par la glutathion synthase pour former le GSH (Griffith,

1999; Zeevalk et al., 2008). Cette synthèse peut être réalisée par les neurones et les cellules

gliales, mais les astrocytes jouent un rôle important dans l’approvisionnement des précurseurs

du GSH aux neurones car ils possèdent l’ecto-enzyme -glutamyl transpeptidase ( -GT), qui

dégrade le GSH en ses précurseurs qui peuvent être fournis aux neurones pour une nouvelle

synthèse.

Le GSH est un composant majeur des défenses anti-oxydantes cellulaires (Sofic et al., 1992;

Sian et al., 1994a; Dickinson and Forman, 2002), protégeant les cellules contre des toxines

exogènes et endogènes comme les ROS et les RNS (Figure 14 et Figure 15). Ainsi le GSH

s’oppose aux effets toxiques des ROS, incluant oxydation des protéines, peroxydation

lipidique, agrégation de protéines ou encore dysfonctionnement mitochondrial. Ces espèces

réactives sont eliminées via réduction non enzymatique par le GSH, alors que l’élimination

des peroxydes d’hydrogènes (H2O2) nécessite la glutathion peroxydase (Griffith, 1999;

Dringen, 2000; Dickinson and Forman, 2002; Zeevalk et al., 2008). Ces deux réactions

conduisent à la formation de glutathion disulfide (glutathion oxydé, GSSG) qui peut être

réduit en retour par la glutathion réductase qui utilise comme coenzyme le NADPH

(Dickinson and Forman, 2002). Dans des conditions normales, 90% du GSH est sous forme

réduite et seulement 10% sous forme oxydée. La glutathion-S-transférase (GST) est une

enzyme qui permet la conjugaison du GSH avec des composés électrophiles et leur excrétion

à l’extérieur de la cellule ; ce mécanisme représente également un mécanisme de défense des

cellules pour lutter contre les toxines (Griffith, 1999; Dringen, 2000; Dickinson and Forman,

2002; Zeevalk et al., 2008). Lorsque l’état d’oxydoréduction d’une cellule est altéré, il y a une

augmentation de l’utilisation du GSH ; le GSSG produit peut à nouveau être réduit en GSH

mais, s’il y a un excès de formation et d’exportation de composés électrophiles avec le GSH,

ceci peut conduire à une déplétion en GSH. Cette déplétion peut être estompée par une

54

augmentation réactionnelle de la synthèse de GSH (Griffith, 1999; Dickinson and Forman,

2002).

Figure 14. Synthèse et métabolisme du GSH dans le système nerveux central (D’après (Martin and

Teismann, 2009).

3.4.1.4. Déplétion en glutathion dans la MP

Un des changements biochimiques le plus précoce observé dans la MP est une déplétion en

GSH réduit au niveau de la SN. Cette diminution des niveaux de GSH est également présente

dans l’ILBD (Jenner, 1994; Sian et al., 1994a), suggérant un rôle causal de la déplétion

nigrale en GSH dans la pathogénèse de la MP. Cette déplétion en GSH serait reliée à la

plupart des mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP, comme l’inhibition du

complexe I de la chaine respiratoire mitochondriale et la perturbation du système ubiquitine-

protéasome (Bharath et al., 2002), et peut affecter les processus neuro-inflammatoires

observés dans la pathologie. La déplétion en GSH conduit également à la libération d’acide

55

arachidonique, ce qui peut causer des dommages cellulaires à travers son métabolisme par la

lipooxygenase (Mytilineou et al., 2002).

Figure 15. Représentation schématique des processus impliquant les propriétés anti-oxydantes du GSH en

lien avec l’atteinte des neurones DA dans la maladie de Parkinson (Issu de : Bharath et al., 2002).

La déplétion en GSH observée dans la MP peut résulter d’un défaut dans sa synthèse et/ou

d’un défaut de recyclage. Dans le cas d'un défaut de synthèse, alors l’activité de l’enzyme

limitante dans la synthèse de GSH serait affectée. Même si une diminution de l’activité de la

GCL a été décrite avec l’âge dans le cerveau (Zhu et al., 2006), aucun changement de

l’activité de cette enzyme n’est rapporté chez les patients parkinsoniens (Sian et al., 1994b),

alors que la diminution des taux de GSH devrait conduire à une augmentation de l’activité de

la GCL étant donné l’effet rétroactif négatif du GSH sur la GCL (Griffith, 1999). L'absence

d'augmentation de l'activité de GCL au niveau de la SN dans la MP peut être due à une

diminution de l’approvisionnement en cystéine, qui est le substrat limitant de la synthèse du

GSH (Zeevalk et al., 2008). En effet, avec l’âge les niveaux circulants de cystéine diminuent

(Droge and Schipper, 2007) et l’incidence de la MP augmente (Dauer and Przedborski, 2003),

et cette diminution peut contribuer à la déplétion en GSH mesurée dans la MP. Par ailleurs,

une principale voie d’entrée de la cystéine à l’intérieur des neurones est sa capture par le

56

transporteur des acides aminés excitateurs (EAATs) neuronal (EAAC1). De façon

intéressante, le MPTP ou le MPP+ conduit à une altération de ces transporteurs (Aoyama et

al., 2008; Meredith et al., 2009) et, sur des tranches de mésencéphale, à une réduction de la

capture de la cystéine après traitement au MPP+ (Aoyama et al., 2008). A noter que

l'altération du fonctionnement des EAATs conduit à une déplétion en GSH dans différents

types cellulaires, incluant astrocytes et neurones DA, entrainant leur mort par stress oxydant

(Re et al., 2003; Re et al., 2006; Nafia et al., 2008). La délétion de EAAC1 induit une

déplétion en GSH neuronal et un processus neurodégénératif age-dépendant (Aoyama et al.,

2006), affectant notamment les neurones DA (Berman et al., 2011). La déplétion en GSH

dans la MP est associée à l’élévation de l’activité et des taux de gamma-glutamyl transférase

( -GT), enzyme contribuant au catabolisme extracellulaire du GSH (Sian et al., 1994b). La -

GT hydrolyse le GSH en cystéinyl-glycine qui est clivée par des dipeptidases membranaires

en cystéine et glycine, fournissant ainsi la cysteine pour une synthèse de novo de GSH par la

GCL ; elle peut aussi transférer la fraction -glutamyl du GSH à la cystéine extracellulaire

pour former de la -glutamylcystine qui peut aussi être captée par les neurones, être réduite en

-glutamylcystéine et utilisée pour la synthèse de GSH par la GCL. La cystéine intracellulaire

pourrait aussi avoir un effet délétère: elle peut réagir avec les quinones dopaminergiques

formées durant l'oxydation de la DA et les métabolites de ces conjugués pourraient inhiber le

complexe I mitochondrial. Il a été montré sur des lignées cellulaires dérivées de neurones DA

mésencéphaliques que l'élévation de l'activité -GT consécutive à la déplétion en GSH

représenterait un mécanisme adaptatif compensatoire pour tenter de maintenir les taux de

GSH et non un processus délétère impliqué dans l'inhibition du complexe I mitochondrial

(Sian et al., 1994b; Chinta et al., 2006).

La déplétion en GSH peut également résulter d’une augmentation de la libération des

conjugués de GSSG et GSH avec des composés électrolytes, mais l’activité de la GST étant

inchangée, la conjugaison enzymatique ne serait donc pas amplifiée (Sian et al., 1994b). Par

ailleurs, la déplétion en GSH causée par le MPP+ n’est pas associée à une augmentation de

libération de GSH (Drechsel et al., 2007).

La déplétion en GSH peut également provenir d’une augmentation de l’oxydation non-

enzymatique de GSH en GSSG. Cependant, les taux de GSSG dans la SN de patients

parkinsoniens sont inchangés en post mortem (Sian et al., 1994a). La GSH réductase,

l’enzyme responsable de la réduction du GSSG en GSH, est importante pour le maintien des

taux de GSH (Dickinson and Forman, 2002). De façon intéressante, son activité est

57

augmentée chez les patients parkinsoniens (Ilic et al., 1999). Cette augmentation de l’activité

de la GSH réductase dans la MP montre là encore que les cellules de la SN essaient de

maintenir leurs niveaux de GSH.

Il a également été montré in vivo, dans des modèles rongeurs, que la « down-regulation » de

la synthèse de GSH (par une approche d’ARN interférence utilisant des vecteurs viraux)

conduit à une perte des neurones DA de la SNc, alors que d’autres populations neuronales

(striatales par exemple) sont moins vulnérables. De façon intéressante, cette étude montre que

la surexpression de la GCL conduit également à des pertes DA, suggérant que la survie des

neurones DA dépend d’une régulation fine des niveaux de GSH (Garrido et al., 2011). Dans

une autre étude utilisant des souris génétiquement modifiées, la down-regulation de la GCL

sélectivement dans les neurones DA de la SNc induit un dysfonctionnement du complexe I de

la chaine respiratoire mitochondriale et une perte des neurones DA de la SNc (Chinta et al.,

2007). Ces deux études montrent que, in vivo, la déplétion en GSH dans les neurones DA de

la SNc est suffisante pour induire leur dégénérescence. Ainsi la déplétion en GSH pourrait

être un facteur causal, à l’origine des pertes des neurones DA observées dans la MP.

3.4.2. Dysfonctionnement mitochondrial

Les mitochondries sont des organelles dont les fonctions principales sont de fournir de

l’énergie aux cellules au travers de la formation d’ATP, de réguler localement les niveaux de

calcium ainsi que la création de ROS. La formation d’ATP se fait grâce aux mouvements

d’électrons à travers les complexes (I à V) de la chaine respiratoire mitochondriale. Durant la

synthèse d’ATP, de l’oxygène est consommé et quelques électrons s’échappent et peuvent

réagir localement avec de l’oxygène, ce qui conduit à la production d’ion superoxide.

Les mitochondries sont des organelles très dynamiques, elles transitent à travers le

cytoplasme et peuvent fusionner ou se fissionner. La mobilité des mitochondries est

importante pour les neurones pour fournir de l’énergie et tamponner le calcium au niveau des

synapses (Guo et al., 2005; Verstreken et al., 2005). Lorsque les mitochondries sont

endommagées, elles doivent être éliminées par un processus similaire à l’autophagie appelé

mitophagie.

58

De nombreuses évidences sont en faveur d'une implication des mitochondries dans la perte

des neurones DA de la SNc dans la MP. Le MPTP et la roténone, deux inhibiteurs du

complexe I de la chaine respiratoire mitochondriale, reproduisent la perte des neurones DA

caractérisant la maladie (Figures 16 et 17) (Beal, 2001). Egalement, les mitochondries des

patients atteints de la MP ont des altérations dans l’activité du complexe I dans plusieurs

régions dont la SN, les muscles squelettiques et les plaquettes (Mizuno et al., 1989; Schapira

et al., 1989; Bindoff et al., 1991; Krige et al., 1992). Une augmentation des ROS est

également observée dans la MP et leur synthèse a lieu principalement dans les mitochondries

(Andreyev et al., 2005). Cette augmentation de stress oxydant peut endommager le complexe

I de la chaine respiratoire mitochondriale en diminuant son efficacité, générant un cercle

vicieux.

Figure 16. Mécanismes d’actions des neurotoxines sur les mitochondries

(Issu de : (Keane et al., 2011)).

D’autre part, de nombreux gènes impliqués dans les formes familiales de la MP interviennent

dans la fonction mitochondriale (Figure 17).

59

Figure 17. Des facteurs

génétiques et environnementaux

impliqués dans la MP peuvent

induire un dysfonctionnement

mitochondrial et la mort

neuronale

Formes autosomiques récessives de la MP et mitochondries. Les gènes les mieux

caractérisés impliqués dans les formes autosomiques récessives de la MP sont la parkine,

PINK1 (PTEN-induced novel kinase 1) et DJ-1, le premier identifié étant la parkine (Figure

17). La protéine pour laquelle il code est une E3-ubiquitine ligase, qui participe donc à

l’ubiquitinylation de protéines favorisant leur élimination par le système ubiquitine-

protéasome (SUP). La parkine joue également un rôle dans le maintien de l’homéostasie

mitochondriale en participant à l’adressage des mitochondries endommagées vers un

processus de mitophagie (Tanaka, 2010). La fonction de la parkine ne se résume pas à son

activité ubiquitine ligase. Ainsi, il a été montré que la parkine agirait comme un répresseur de

la transcription de p53, pouvant soutendre ses propriétés anti-apoptotiques (Alves da Costa

and Checler, 2012). Les souris KO pour la parkine présentent des déficits moteurs légers et

progressifs et des caractéristiques de la phase précoce de la MP, comme une réduction de la

libération de DA, des détériorations mitochondriales et une augmentation du stress oxydant.

Le second gène identifié impliqué également dans des formes autosomiques récessives de la

MP est le gène DJ-1 : la protéine fait partie de la famille des molécules chaperonnes

ThiJ/Pfpl, et est exprimée un peu partout dans le corps et, au niveau subcellulaire, dans le

cytosol, la matrice mitochondriale et l’espace intermembranaire (Zhang et al., 2005). In vivo,

DJ-1 a un rôle protecteur contre le stress oxydant dans les mitochondries (Andres-Mateos et

al., 2007). Des interactions fonctionnelles ont été décrites entre DJ-1 et parkine dont les

mécanismes n'ont pas encore été totalement élucidés. Il a notamment été montré que la

parkine controle l'expression de DJ-1 au travers de p53 (Duplan et al., 2013).

60

Le dernier gène identifié comme pouvant être responsable de formes autosomiques récessives

de la MP est PINK1. La protéine PINK1 est une serine/thréonine protéine kinase, qui est

localisée dans l’espace intermembranaire et les membranes mitochondriales (Silvestri et al.,

2005). PINK1 semble réguler la dynamique calcique mitochondriale (Gandhi et al., 2009).

Formes autosomiques dominantes de la MP et mitochondries. Le gène codant l’α-

synucléine (Figure 17) a été le premier identifié comme cause génétique de MP

(Polymeropoulos et al., 1997). Récemment il a été suggéré que l’α-synucléine contiendrait

une séquence d’adressage à la mitochondrie en N-terminal qui facilite son importation et son

interaction avec la membrane interne de la mitochondrie (Devi and Anandatheerthavarada,

2010). L’accumulation à l’intérieur des mitochondries d’α-synucléine sauvage ou portant la

mutation A5γT conduit à une diminution de l’activité du complexe I mitochondrial et une

augmentation des ROS (Devi and Anandatheerthavarada, 2010; Chinta et al., 2010). En plus

d’inhiber la fonction mitochondriale, l’α-synucléine inhibe également l’autophagie, ce qui

peut de façon indirecte changer le turnover des mitochondries (Winslow et al., 2010).

LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2) est une grande protéine comportant plusieurs domaines

fonctionnels, avec des activités de kinase et GTPase, qui est principalement localisée dans le

cytoplasme. Certaines études ont montré néanmoins qu’une fraction de la protéine est

présente dans la membrane externe mitochondriale (West et al., 2005; Biskup et al., 2006). De

façon plus précise, la surexpression de LRRK2 sauvage conduit à une diminution de la

toxicité des peroxydes, et l’expression de LRRKβ humaine protège de la toxicité de la

roténone et du paraquat chez Caenorhabditis elegans (Liou et al., 2008; Saha et al., 2009). De

plus, un rapport récent montre que les patients parkinsoniens porteurs de la mutation G2019S

présentent des mitochondries avec un potentiel membranaire plus bas, des niveaux d’ATP

intracellulaires réduits ainsi que des altérations morphologiques (Mortiboys et al., 2010).

3.4.3. Dysfonctionnement du système

ubiquitine/protéasome

Dans les cellules eucaryotes, les protéines anormales ou endommagées sont normalement

éliminées par le SUP (Figure 18). Dans ce cas, ces protéines sont coiffées d’une chaine de

molécules d’ubiquitine représentant un signal pour leur dégradation par le protéasome. Ce

61

processus dépendant de l’ATP requiert l’action séquentielle de trois enzymes, nommées

respectivement E1, Eβ et Eγ, qui conduisent à l’addition covalente de molécules d’ubiquitine

sur des protéines substrats spécifiques. Dans cette voie interviennent également des enzymes

de désubiquitinylation (ubiquitine hydrolases) qui permettent de recycler des monomères

d’ubiquitine indispensables à l’adressage de protéines cellulaires vers la dégradation par le

protéasome (Moore et al., 2005). Un stress protéolytique peut être engendré par un

dysfonctionnement du SUP ou lorsque le nombre de protéines mal repliées ou endommagées

est trop important. Il peut en résulter une accumulation et une agrégation de ces protéines

anormales pouvant engendrer des dommages dans de nombreuses fonctions cellulaires et

finalement conduire à l’apoptose.

Figure 18. Le système ubiquitine protéasome (SUP) (Issu de : Moore et al., 2005).

62

Un grand nombre d’études proposent l'implication d’un stress protéolytique dans les formes

sporadiques et familiales de la MP (Olanow, 2007). Des mutations dans les gènes de l’α-

synucléine, la parkine et UCH-L1 ont été associées à des formes familiales de MP et ces

mutations peuvent aisément être reliées à un stress protéolytique. L’α-synucléine, une

protéine qui n’est normalement pas repliée, est sujette à de mauvais repliements et à

l’agrégation. Cette tendance est d’autant plus élevée que la protéine est mutée ou présente en

excès. L’agrégation de l’α-synucléine peut endommager le protéasome en altérant

l’élimination des autres protéines. Des formes mutantes de l’α-synucléine ou encore la

duplication ou la triplication du gène sauvage ont été décrites dans des formes familiales de

MP (Polymeropoulos et al., 1997; Singleton et al., 2003; Chartier-Harlin et al., 2004). Ceci est

possiblement lié au fait que la quantité d’α-synucléine sauvage ou mutante produite dans ces

cas est trop élevée et dépasse la capacité d’élimination du protéasome. En effet, dans les

modèles expérimentaux, la surproduction d’α-synucléine conduit à des pertes neuronales avec

formation d’agrégats (Feany and Bender, 2000; Lee et al., 2001) et une caractéristique

neuropathologique majeure de la MP est la présence d’agrégats positifs pour l’α-synucléine

(Spillantini et al., 1997). Des mutations au sein du gène de la parkine sont associées à des

formes de MP autosomiques récessives précoces (Kitada et al., 1998). La protéine parkine est

une ubiquitine E3-ligase dont le rôle est d’ubiquitinyler les protéines en vue d’une

dégradation par le SUP, contribuant ainsi à l’élimination de protéines mal repliées ou

néfastes. Des mutations dans le gène de la parkine pourraient empêcher l’ubiquitinylation et

l’élimination de protéines substrats de la parkine entraînant leur accumulation et la mort

cellulaire. En effet, des taux excessifs de proteines substrats de la parkine sont retrouvées sous

forme non-ubiquitinylées dans les cerveaux de patients parkinsoniens présentant cette

mutation (Murakami et al., 2004). La parkine est notamment essentielle pour

l’ubiquitinylation de protéines situées dans la membrane externe mitochondriale comme la

mitofusine ou VDAC1, ce qui représente une étape importante avant l’élimination des

mitochondries par mitophagie (Karbowski and Youle, 2011). Des mutations dans le gène

UCH-L1 ont été observées dans des cas de MP (Leroy et al., 1998). UCH-L1 clive

l’ubiquitine attachée à la protéine, permettant ainsi son entrée dans le protéasome. Des

mutations au niveau du gène UCH-L1 pourraient empêcher la dégradation de protéines

anormales en empêchant leur entrée dans le protéasome. Cette mutation peut également

conduire à une réduction des molécules d’ubiquitine disponibles nécessaires pour

l’élimination des protéines.

63

Des altérations du protéasome ont également été observées dans les formes sporadiques de la

MP. Dans la SNc de patients atteints de la MP, les taux de la sous-unité alpha du complexe

20S du protéasome, ainsi que les taux du complexe régulateur PA28, sont diminués. Il n’y a

pas d’« uprégulation » compensatrice du complexe régulateur 19S et on assiste également à

une diminution de l’activité enzymatique au sein du protéasome (McNaught et al., 2003). De

plus, dans des modèles expérimentaux en culture, des inhibiteurs du protéasome conduisent à

une dégénérescence préférentielle des neurones DA couplée à la présence d’inclusions

(Rideout et al., 2001; McNaught et al., 2002).

Si le concept de contribution d'un stress protéolytique à la mort cellulaire dans la MP est

particulièrement attractif et argumenté, la question reste posée de savoir si le

dysfonctionnement du protéasome est secondaire au stress oxydant et dysfonctionnement

mitochondrial ou représente un phénomène primaire (Olanow, 2007).

3.4.4. Neuroinflammation

Plusieurs sources de données suggèrent une implication de processus neuroinflammatoires

dans le développement de la MP. Les premières données proviennent d’études post-mortem

où la présence de cellules microgliales activées a été observée dans le SN de patients atteints

de la MP (McGeer et al., 1988). Une autre caractéristique neuropathologique bien établie est

la présence d’une réactivité astrocytaire dans la SN de patients parkinsoniens (Damier et al.,

1993). A noter que, chez les individus sains, la densité astrocytaire est faible dans la SN,

région la plus affectée dans la MP, alors qu’elle est plus élevée dans l’ATV et dans le groupe

A8, régions moins affectées. Ainsi la pauvreté de l’environnement astrocytaire pourrait être

un facteur de vulnérabilité pour les neurones DA de la SNc, les astrocytes étant importants

pour détoxifier les radicaux libres de l’oxygène par la GSH peroxidase (Damier et al., 1993).

Le rôle des astrocytes dans la MP n’est pas encore clarifié, car ils pourraient avoir un rôle

protecteur ou au contraire participer au processus dégénératif.

Les cellules microgliales (Figure 19), correspondant aux macrophages cérébraux impliqués

dans l’immunité innée, présentent une densité remarquablement élevée dans la SN en

comparaison avec d’autres régions cérébrales (Kim et al., 2000). Cette observation, associée

avec la découverte que les neurones de la SN sont particulièrement vulnérables à la présence

64

de microglie activée, suggèrent que la réactivité microgliale pourrait jouer un rôle important

dans la MP (Kim et al., 2000). De plus, la perte en neurones DA dans la SN de patients

parkinsoniens est associée à une importante réactivité microgliale (McGeer et al., 1988). De

façon intéressante, au niveau microscopique, la réactivité microgliale est la plus importante

dans les régions les plus affectées par le processus dégénératif (Teismann et al., 2003). La

réaction microgliale comprend la prolifération et l’activation de ces cellules associée à des

modifications morphologiques ; les cellules microgliales quiescentes possèdent de longs

prolongements et leur activation provoque une rétractation des prolongements et un

grossissement du corps cellulaire (Figure 19).

Figure 19. Réactivité microgliale. (A) Photographies illustrant des cellules microgliales non-activées, ramifiées

(à gauche) et activées (à droite). Le marquage vert de ces cellules est du à l’expression de la GFP. (B) Schéma

représentant les différentes phases d’activation des cellules microgliales (Illustrations issues du site internet du

laboratoire de Michael Dailey).

Les lymphocytes pourraient également participer à la réaction inflammatoire présente dans le

cerveau des patients atteints de la MP. La présence de lymphocytes T cytotoxiques (CD8+)

est augmentée dans la SN de patients (McGeer et al., 1988). De façon générale, les densités en

lymphocytes T CD4+ et CD8+ est augmentée dans les cerveaux de patients parkinsoniens

B

65

(Brochard et al., 2009). Dans cette étude, les auteurs rapportent que ces cellules sont en

contact étroit avec les vaisseaux sanguins (suggérant une infiltration à partir de la circulation

sanguine) et sont localisées à proximité des neurones DA mélanisés (suggérant une interaction

entre les lymphocytes et les neurones DA). Ils ont de plus montré la contribution de

l'infiltration de lymphocytes CD4+ dans le cerveau à la neurodégénérescence dans un modèle

de MP chez la souris injectée avec le MPTP.

La présence de processus neuroinflammatoires est également démontrée au niveau

moléculaire. Les concentrations de TNFα, β-microglobuline, facteur de croissance

épidermique (EGF), facteur de croissance transformant α (TGFα), TGF β, ainsi que les

interleukines 1 , 6 et β sont augmentées dans le striatum de patients parkinsoniens (Mogi et

al., 1994a; Mogi et al., 1994b; Mogi et al., 1995a; Mogi et al., 1995b; Mogi et al., 1996). Le

TNFα, l’interleukine 1 et l’interferon sont également détectés dans la SN de patients

atteints de la MP (Hunot et al., 1999). De plus, les neurones DA expriment les récepteurs de

ces cytokines, suggérant qu'ils sont sensibles à ces molécules. Par exemple, les neurones DA

expriment le récepteur 1 au TNFα et son expression est augmentée dans la MP (Mogi et al.,

2000a). Ces cytokines peuvent exercer un effet toxique direct sur les neurones DA en agissant

sur leurs récepteurs et en activant des seconds messagers, ou indirect via l’induction de

l’expression de la nitric oxide synthase inductible (iNOS) ou de la cyclooxygénase 2 (COX2)

et la production de ROS et/ou de RNS. En accord avec cette dernière hypothèse, une

augmentation de l’activité de la iNOS est observée dans la SN de patients parkinsoniens

(Hunot et al., 1996). D’autres enzymes impliquées dans les processus neuroinflammatoires

médiés par un stress oxydant sont également augmentées chez les patients atteints de la MP,

comme la NADPH oxidase, la COX2 et la myeloperoxidase (MPO) (Knott et al., 2000; Wu et

al., 2003; Choi et al., 2005).

Une étude récente rapporte que le risque de développer la MP est plus faible pour les

personnes ayant pris de l’ibuprofène (Gao et al., 2011). De plus, les auteurs rapportent un

effet dose/réponse entre la quantité d’ibuprofène pris par semaine et le risque de développer la

MP. Cet effet n’est pas retrouvé avec d’autres anti-inflammatoires non-stéroïdiens comme

l’aspirine ou avec le paracétamol, ce qui suggère un mécanisme spécifique de l’ibuprofène.

Ceci souligne l’intérêt de se pencher sur les différences entre les mécanismes d’action de ces

molécules et notamment l’activation du récepteur activé par les proliférateurs de peroxisomes

de type gamma (PPAR , qui regule le metabolisme du glucose et des acides gras), qui est

induite par l’ibuprofène (Lehmann et al., 1997) mais pas par l’aspirine ni le paracétamol. Une

66

vaste recherche de gènes conférant une susceptibilité à la MP a révélé plusieurs associations

entre le polymorphisme de certains gènes autres que ceux impliqués "classiquement" dans la

MP et le risque de développer cette pathologie. Ces gènes incluent le TNF-α, IL-1 , TNFR1,

IL-1RN (un antagoniste du récepteur d’IL-1), le récepteur monocytaire CD14, IFN- (Hirsch

and Hunot, 2009), et plus récemment le gène HLA-DRB5 (Hamza et al., 2010; Nalls et al.,

2011).

Les systèmes immunitaires inné et adaptatif et des processus inflammatoires ont été ainsi

impliqués dans la pathophysiologie de la MP. Leur rôle ne serait probablement pas primaire

dans la maladie. Leur contribution pourrait être déclenchée de façon secondaire par les

altérations cellulaires ou les pertes neuronales observées dans la MP, et participer à la

progression du processus dégénératif (Hirsch et al., 2012b). Ainsi, les récepteurs des

glucocorticoides sont importants pour limiter la réactivité microgliale et la dérégulation de

leur activité dans la MP pourrait conduire à une inflammation soutenue entretenant la

neurodégénérescence. Par ailleurs, la perte en neurones DA s’accompagne de la détection de

la neuromélanine en dehors des neurones, souvent englobée dans les cellules microgliales, et

la neuromélanine a été décrite comme un activateur puissant des cellules microgliales

stimulant la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires (Zecca et al., 2008).

Figure 20. Schéma illustrant les

dommages oxydatifs causés par une

réaction neuroinflammatoire pouvant

aboutir à la perte des neurones DA

dans la MP (Issu de Hirsch and Hunot,

2009).

Initialement, les processus neuroinflammatoires n’étaient perçus que comme une simple

conséquence du processus neurodégénératif. En conclusion, il est maintenant clair que la

67

neuroinflammation (Figure 20) est impliqué dans la perte neuronale, même si elle

n’interviendrait pas en tant qu’élément déclencheur de la pathologie.

3.4.5. Excitotoxicité

3.4.5.1. Mécanismes

Le glutamate, principal neurotransmetteur excitateur du SNC, est neurotoxique à fortes

concentrations. L’excitotoxicité est définie comme un processus de mort cellulaire résultant

de l'activation excessive des récepteurs ionotropiques du glutamate. Cette forme de toxicité

est surtout attribuéeaux changements de concentrations intracellulaires en Ca2+ liée à

l'activation des récepteurs glutamatergiques de type NMDA qui sont les plus perméables aux

ions Ca2+ (Figure 21). La surcharge intracellulaire en Ca2+ peut causer une mort par nécrose

ou apoptose. La mort par nécrose est principalement causée par une stimulation intense des

récepteurs NMDA, conduisant à l’activation d’enzymes impliquées dans le catabolisme de

protéines, de phospholipides ou encore d’acides nucléiques. A l’inverse, une suractivation

légère chronique des récepteurs NMDA peut déclencher des processus apoptotiques. Ces

processus interviendraient lorsque l’augmentation intracellulaire en Ca2+ dépasse les capacités

de tampon des mitochondries (Nicholls, 2008; Blandini, 2010).

Figure 21. Schéma illustrant les différents processus intracellulaires pouvant être déclenchés par des augmentations en calcium intracellulaire dans des neurones dans les conditions d’excitotoxicité (Issu de Doble, 1999).

68

La toxicité induite par l’activation des récepteurs NMDA peut impliquer un stress oxydant dû

à la rupture de l’équilibre entre la production de ROS ou de RNS et la capacité que possède de

la cellule de s’en débarrasser. Dans ce cas là également, les mitochondries jouent un rôle

central : un stress oxydatif provoque une formation supplémentaire de ROS par la

mitochondrie et la libération de facteurs pro-apoptotiques. L’influx de Ca2+ provoqué par la

stimulation excessive des récepteurs NMDA induit une activation de la NOS neuronale qui

synthétise le NO, et celui-ci peut se lier avec l’anion superoxide O2- produit lors de la

respiration mitochondriale. L’association de ces deux composés conduit à la formation de

peroxynitrite (ONOO-) qui est un radical libre hautement réactif pouvant conduire à la

fragmentation de l’ADN, le blocage de la phosphorylation protéique par nitration des résidus

tyrosine (Nakamura and Lipton, 2009).

Un autre mécanisme causé par l’augmentation de Ca2+ intracellulaire est dû à l'action directe

de ce cation sur les mitochondries. L’excès de Ca2+ pourra être stocké et s’accumuler dans les

mitochondries, ce qui peut conduire à des changements de potentiel de membrane

mitochondrial, un défaut de synthèse d’ATP et la formation de ROS (Figure 22).

Figure 22. Conséquences bioénergétiques de l’activation chronique des récepteurs NMDA. (a) L’activation des récepteurs NMDA provoque une entrée de Na+ et Ca2+ dans la cellule, (b) et (c) les Na+/K+ ATPase et

Ca2+ ATPase sont activées pour maintenir les gradients de concentrations. (d) Activation de l’ATP synthase pour compenser les besoins en ATP (e) accumulation de Ca2+ (f) inhibition partielle du complexe 1 par la

roténone, (g) augmentation de la fuite des protons (h) dommage oxydatif après déplétion en glutathion (i)

augmentation des taux de ROS (Issu de : Nicholls, 2008).

69

3.4.5.2. Implications pathologiques

La stimulation excessive des récepteurs du glutamate (soit par augmentation de la libération

ou par diminution de la recapture) est suggérée jouer un rôle dans plusieurs troubles

neurologiques, notamment dans les accidents vasculaires cérébraux ou les traumatismes

crâniens. Cette forme d’excitotoxicité directe est également supposée jouer un rôle dans

plusieurs atteintes neurodégénératives, même si l’efficacité du système de recapture du

glutamate rend le cerveau particulièrement résistant à la toxicité du glutamate. Néanmoins,

dans des cas d’hypoxie/ischémie, l’association entre l’augmentation de glutamate

extracellulaire et la diminution de l’efficacité du système de recapture fait de l’excitotoxicité

un acteur majeur des pertes neuronales.

L'intervention de processus excitotoxiques dans la MP a également été suggérée. Le

glutamateest présent à de nombreuses synapses clés dans le réseau des GB. Nous avons vu

qu'il est le neurotransmetteur des systèmes afférents d'origine corticale, thalamique et du PPN

ainsi que des projections du NST vers ses structures cibles. Une activation anormale de ces

systèmes a été associée à la déplétion en DA dans la MP, avec à la fois un rôle dans la

pathophysiologie et une implication présumée, au travers de processus excitotoxiques, dans le

processus dégénératif. Ainsi, les neurones DA de la SNc reçoivent des afférences

glutamatergiques, notamment en provenance du NST, structure qui présente une activité

pathologique en bouffées en condition parkinsonienne. Cette hyperactivité du NST

consécutive à la dégénérescence des neurones DA pourrait provoquer une augmentation

conséquente des taux de glutamate extracellulaire au niveau de la SNc et ainsi produire une

hyperactivation des neurones DA résiduels (Blandini, 2010). Un cercle vicieux pourrait ainsi

avoir lieu où la perte des neurones DA pourrait engendrer l’hyperactivité du NST qui en

retour pourrait aggraver les pertes DA par excitotoxicité (Rodriguez et al., 1998) et par stress

oxidant lié à la surproduction de DA.

Plusieurs mécanismes pourraient conduire à une réduction du seuil d'excitotoxicité dans la

MP. Par exemple, il est connu que déficit bioénergétique et excitotoxicité sont reliés. Comme

précisé plus haut, une réduction d’environ γ0-40% de l’activité du complexe I de la chaine

respiratoire mitochondriale est observée dans la SN des patients parkinsoniens (Schapira et

al., 1990). La fonction mitochondriale est essentielle pour le maintien des niveaux d’ATP

intracellulaire et le maintien de la polarité membranaire est consommateur d’énergie ; de ce

70

fait, un dysfonctionnement mitochondrial peut, en réduisant l’activité de la Na+/K+ ATPase,

induire une dépolarisation neuronale, ce qui diminue le seuil d’activation des récepteurs

NMDA. Dans ces conditions, le blocage du récepteur NMDA exercé par le Mg2+ est

compromis et même des niveaux non toxiques de glutamate extracellulaires peuvent le

devenir en induisant des influx calciques plus importants au travers de ce récepteur (Novelli et

al., 1988; Erecinska and Dagani, 1990).

Ceci constituerait l’excitotoxicité indirecte, où il est postulé que n’importe quel processus

altérant la capacité du neurone à maintenir son potentiel de membrane augmente sa

vulnérabilité à l’excitotoxicité (Albin and Greenamyre, 1992; Beal et al., 1993). Ce concept

d’excitotoxicité indirecte est soutenu par de nombreuses évidences expérimentales. Par

exemple, l’inhibition de la respiration mitochondriale in vivo et in vitro provoque des pertes

neuronales liées à l’excitotoxicité pouvant être prévenues par des antagonistes NMDA

(Greene and Greenamyre, 1996). Il a également été montré que l'excitotoxicité et/ou le stress

oxydant peut altérer la fission/fusion mitochondriale, et qu'en retour un déséquilibre

fission/fusion mitochondriale induit en retour une augmentation de l'expression des récepteurs

NMDA et un stress oxydant (Nguyen et al., 2011).

Ainsi, comme décrit pour les processus inflammatoires, des processus excitotoxiques

pourraient contribuer à un cercle vicieux impliquant dysfonctionnement mitochondrial et

stress oxydant et entretenir le processus dégénératif dans la MP.

Cette hypothèse est notamment supportée par des travaux montrant une augmentation de

l’activité glutamatergique associée à des processus excitotoxiques dans la SNc de souris

traitées au MPTP (Meredith et al., 2009). D'autres travaux réalisés sur le modèle roténone ont

montré que son effet délétère sur la voie nigro-striée ne passe pas uniquement par la

production de ROS, mais la rotenone est également capable de potentialiser les réponses des

neurones de la SNc au glutamate, même à faible concentrations, augmentant ainsi la

vulnérabilité des neurones DA à l’excitotoxicité (Wu and Johnson, 2009). Le paraquat

également est capable d’augmenter la toxicité du glutamate en stimulant sa libération

neuronale (Shimizu et al., 2003a).

71

3.5. Neurogenèse et maladie de Parkinson

De manière intéressante, l’étude de la neurogenèse adulte dans le cadre de la MP prend son

sens si l’on tient compte des symptômes non moteurs de cette pathologie. En effet, ces

symptômes incluent des troubles olfactifs qui pourraient être en relation avec des

modifications de neurogenèse adulte dans cette structure. De la même manière, on pourrait

associer une modification de la neurogenèse hippocampique aux altérations de la mémoire

spatiale et aux symptômes dépressifs observés chez ces patients.

La neurogenèse adulte

Le cerveau adulte possède la capacité de générer de nouveaux neurones dans des régions

restreintes et de les intégrer dans des circuits déjà existants. Cette neurogenèse adulte est

modulée par de très nombreux facteurs et diminue fortement au cours de l’âge. Il a été

largement démontré que toutes les lignées cellulaires du SNC, dont les neurones, peuvent être

générées dans deux zones distinctes du cerveau antérieur : la zone sous ventriculaire (ZSV) en

bordure du striatum, et la zone sous-granulaire (ZSG) du gyrus denté de la formation

hippocampique.

La ZSV

La ZSV possède une organisation cytoanatomique et fonctionnelle unique (Doetsch et al.,

1997) (Figure 23). Les cellules qui la composent sont regroupées dans un

microenvironnement appellé « niche neurogénique » constituée de quatre types cellulaires en

contact étroit: les cellules A, B, C et E. Les cellules épendymaires (cellule E) font l’interface

avec le ventricule. Parmi les astrocytes exprimant la GFAP, un contingent constituerait les

cellules souches neurales (cellules B) qui ont le potentiel de se renouveler lentement et de

donner naissance à des astrocytes, des oligodendrocytes ou des neurones (Doetsch et al.,

1999). Ces cellules multipotentes engendrent des cellules progénitrices neurales, appelées

cellules C, qui prolifèrent rapidement et sont reconnaissables par l’expression du récepteur de

l’EGF (EGFR). La division asymétrique de ces cellules donne naissance à des neuroblastes

exprimant PSA-NCAM (ou cellules A) qui migrent à travers le flux de migration rostral

(RMS) vers le bulbe olfactif (BO).

72

Figure 23. Organisation

cytoanatomique d’une niche au niveau de la zone sous-

ventriculaire (Issue de :

(Riquelme et al., 2008)).

Les neurones naissant dans la ZSV rejoignent une chaine de cellules en migration qui forme

le RMS. Ces cellules vont jusqu’au bulbe olfactif par migration tangentielle, puis se

répartissent dans le bulbe par migration radiale (Figure 24). A ce stade, les neuroblastes se

différencient principalement en neurones granulaires exprimant le GABA et quelque uns en

neurones périglomérulaires exprimant GABA et TH (Doetsch and Scharff, 2001).

Figure 24. Photographie illustrant le flux de migration rostral des cellules naissant au niveau de la zone

sous-ventriculaire et rejoignant le bulbe olfactif.

La zone sous-granulaire La ZSG est localisée à l’interface de la couche granulaire et du hilus, dans le gyrus denté de la

formation hippocampique. A l’inverse de la longue migration des neurones ayant pour

destination le bulbe olfactif, les neuroblastes qui naissent dans la ZSG du gyrus denté migrent

dans la couche granulaire adjacente pour devenir des neurones granulaires et intégrer la

circuiterie de l’hippocampe en projettant sur les cellules pyramidales de CAγ. Comme dans la

RMS

OB

CB

NC

73

ZSV, les progéniteurs (cellules D) ont une origine astrocytaire (cellule B). Ces progéniteurs se

différencient en cellules granulaires (cellule G) de type glutamatergique (Figure 25).

Figure 25. Organisation

cytoanatomique d’une niche au niveau de la zone sous-granulaire de

l’hippocampe (Issue de : (Riquelme

et al., 2008)).

Altérations de la neurogenèse dans la maladie de Parkinson

Des études par immununohistochimie et microscopie confocale et électronique ont montrées

que les progéniteurs neuraux (cellules C) de la ZSV adulte sont englobés dans un riche réseau

de terminaisons DA formant des structures ressemblant à des synapses (Hoglinger et al.,

2004). De plus, des études après traçage antérograde ont démontrées que ces fibres DA

présentes dans la ZSV étaient originaires au moins en partie en provenance de la SNc

(Freundlieb et al., 2006). Ces données posent la question du rôle de la DA sur la neurogenèse

adulte dans la ZSV. Pour répondre à cette question des études ont été réalisées sur des

neurosphères enrichies en cellules C. Sur ces cultures l’expression des récepteurs de type D1

« like » et D2 « like » a été vérifiée par immunohistochimie et par PCR. La bromocriptine et

l’apomorphine, des agonistes Dβ, augmentent de façon significative la prolifération cellulaire

(Hoglinger et al., 2004). In vivo, chez le rongeur, la lésion de la voie nigro-striée avec le

MPTP ou la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) réduit la prolifération cellulaire dans la ZSV de

30 à 45% (Hoglinger et al., 2004; Baker et al., 2004; Winner et al., 2006). Des analyses plus

détaillées ont montrées que cette diminution est entièrement due à la baisse de prolifération

des cellules C (Hoglinger et al., 2004). De plus, le traitement systémique par des agonistes

DA de rats normaux ou déplétés en DA augmente la prolifération des précurseurs dans la

ZSV (Hoglinger et al., 2004; Van Kampen et al., 2004). La L-DOPA également stimule la

prolifération cellulaire dans la ZSV de rats déplétés en DA (Hoglinger et al., 2004).

74

Concernant les modèles génétiques de MP, il est à noter qu'une réduction de la proliferation et

survie neuronale dans les 2 zones neurogeniques a été décrite dans un modèle de mutation

LRRK2 chez la souris (Winner B, Neurobiol Dis 2011). Par contre, une étude ciblant la

neurogenèse dans le complexe ZSV-BO sur un modèle murin exprimant la forme mutante

A30P de l'alpha-synucléine ne montre pas de modification de prolifération dans la ZSV mais

une réduction du nombre de neurones nouvellement générés dans le bulbe olfactif, attibuée à

une réduction de survie neuronale (Marxreiter et al., 2009).

Des fibres DA sont également observées dans la ZSG de souris à proximité de cellules

précurseur (Hoglinger et al., 2004); et la prolifération de ces cellules est également diminuée

after injection de MPTP. Les données sur ce sujet sont cependant insuffisantes pour conclure

sur un rôle de la DA dans la régulation de la prolifération cellulaire dans la ZSG adulte.

De plus, le nombre de précurseur qui prolifère dans la ZSV est également diminué dans le

modèle MPTP chez le primate, ainsi que chez les patients atteints de la MP (Hoglinger et al.,

2004). Ceci indique que la DA semble stimuler la prolifération des précurseurs dans la ZSV.

Néanmoins, des données récentes semblent contredire cette interprétation et des études

supplémentaires sont nécessaires pour affirmer que la DA contrôle également la neurogenèse

adulte chez l’homme.

La MP est diagnostiquée en général lorsque les symptômes moteurs apparaissent, mais la

présence de symptômes non-moteurs précède, en général, l’apparition des symptômes

moteurs caractéristiques. Ces symptômes ne répondent pas à la thérapie classique visant à

restaurer les taux de DA, suggérant qu’ils ne résultent pas directement de la perte des

neurones de la voie nigro-striée mais d’un dysfonctionnement plus complexe. Même si la

fonction de la neurogenèse adulte est encore débattue, l’inhibition expérimentale de la

neurogenèse adulte dans la ZSV et dans la ZSG altère l’olfaction (Enwere et al., 2004), la

mémoire spatiale (Nilsson et al., 1999) et peut être associée à des symptômes de types

dépressifs (Santarelli et al., 2003) chez l’animal.

75

IV. Modèles animaux de la MP

Il existe plusieurs modèles de la MP capables de reproduire une ou plusieurs caractéristiques

phénotypiques ou biochimiques de la pathogénèse, mais en général ils ne reflètent pas

l'ensembledes caractéristiques essentielles de la pathologie. L’identification de nouvelles

cibles thérapeutiques, moléculaires ou anatomiques, est donc entravée par le manque de

modèles expérimentaux qui se rapprochent véritablement de la pathologie, donc étant

capables de reproduire sa progressivité et ses différents états. Cette limitation est

particulièrement importante pour la recherche de stratégies de neuroprotection ou "disease-

modifying" permettant de stopper ralentir la progression de la maladie.

La définition de la MP idiopathique inclut un phénotype moteur caractéristique (rigidité,

tremblements de repos, bradikynesia, et instabilité posturale), une perte substantielle et

progressive des neurones DA de la SNc associée à la présence d’agrégats protéiques

intracytoplasmiques. Le spectre de la MP est variable et peut inclure des systèmes et des

symptômes non moteurs (dysfonctionnement du système olfactif et cognitif, troubles du

sommeil, constipation, dépression). Ces altérations peuvent précéder ou accompagner les

symptômes moteurs dans la phase précoce de la MP.

L’existence de modèles animaux avec un fort pouvoir prédictif est un prérequis indispensable

pour la recherche translationnelle. Plus un modèle est proche de la pathologie, plus la valeur

prédictive pour un essai clinique est haute. Jusqu’à présent, aucun traitement potentiel

neuroprotecteur n’a été officiellement approuvé. Une des raisons pour expliquer cela est

l’absence de modèles animaux de la MP suffisamment relevants pour la recherche

translationnelle préclinique. Pour tester de nouvelles stratégies neuroprotectrices dans le cadre

de la MP un modèle doit remplir plusieurs exigences :

- Les lésions DA doivent être reproductibles.

- Les lésions DA doivent être stables sans récupération spontanée.

- Le modèle doit posséder une fenêtre temporelle pour l’application du traitement

potentiellement neuroprotecteur. Un agent neuroprotecteur ayant idéalement pour rôle

de protéger d’une neurodégénérescence, il nécessite la présence de cellules

survivantes.

76

- Les lésions DA doivent être associées à des phénomènes morphologiques et

fonctionnels de plasticité neuropathologique proches de la pathologie humaine au

niveau des réseaux neuronaux impliqués dans la MP

- Les animaux doivent présenter une symptomatologie (symptomes moteurs et non-

moteurs) proche de celle observée chez les patients.

Les modèles existants de la MP peuvent être séparés en deux grandes catégories :

« les modèles toxines », basés sur l’injection locale ou systémique de toxines permettant une

ablation plus ou moins sélective des neurones DA de la SNc, et « les modèles génétiques »,

qui sont réalisés en créant des mutations sur des gènes connus pour être impliqués dans les

formes familiales de la MP.

Sans être exhaustif, ce chapitre décrira un ensemble de modèles pharmacologiques et

génétiques, essentiellement développés chez le rongeur.

4.1. Modèles pharmacologiques et neurotoxiques

4.1.1. Reserpine

L’un des plus anciens modèles de la MP est le modèle pharmacologique reserpine (4-5 mg/kg,

sous-cutané). La réserpine est un inhibiteur du transporteur vésiculaire des monoamines

VMAT2 et ainsi empêche le stockage de la DA dans les terminaisons présynaptiques, ce qui

entraîne une déplétion DA dans le striatum. La réserpine induit une perte de DA de 85% dans

la SNc et une déplétion de λ5% dans le striatum dans les βh suivant l’injection (Heeringa and

Abercrombie, 1995). Au niveau comportemental, la réserpine induit une akinésie et une

rigidité des membres postérieurs. Les symptômes moteurs persistent chez les rats traités à la

réserpine jusqu'à environ β4h après l’injection, ce qui correspond à la durée de la déplétion

striatale en DA. Le modèle reserpine chez le lapin a permis de mettre en évidence le rôle

crucial de la DA dans la pathogénèse de la MP. Son utilisation chez la souris a permis de

démontrer l’efficacité thérapeutique de la L-DOPA (Carlsson et al., 1957; Steg, 1964). Malgré

cet immense succès, le modèle reserpine possède de grandes limitations. La reserpine n’induit

pas seulement une déplétion en DA mais de toutes les monoamines, dont la noradrénaline et

77

la sérotonine, et cela de manière transitoire. Une autre limitation est que cette déplétion aigue

et transitoire ne mime pas la progressivité de la déplétion DA présente dans la MP. De plus, le

modèle reserpine ne reflète pas les caractéristiques neuropathologiques de la MP dues à la

dégénérescence des neurones DA de la SNc.

4.1.2. Haloperidol

Le deuxième modèle pharmacologique de la MP est le traitement de rats à l’halopéridol (0,5-

5mg/kg, intra-péritonéal), un neuroleptique antagoniste des récepteurs de la DA de type D2 et

dans une moindre mesure des récepteurs de type D1. Le blocage de la transmission DA

striatale se manifeste au niveau comportemental par une rigidité musculaire et une catalepsie

dans les 60 minutes suivant l’injection d’halopéridol. De la même manière que le modèle

réserpine, l’injection d’halopéridol ne reproduit pas les caractéristiques neuropatholigiques

majeures de la MP, son utilisation est donc limitée. Néanmoins il est utilisé pour évaluer

l’efficacité potentielle de traitements symptomatiques.

4.1.3. 6-hydroxydopamine

Quelques années après la publication du modèle reserpine, la dégénérescence de la voie nigro-

striée a été reconnue comme un facteur primaire de la MP. Dans ce contexte, les premiers

modèles neurotoxiques ayant pour but de reproduire cette dégénérescence nigro-striée ont été

établis. Une neurotoxine capable de reproduire cette dégénérescence était un analogue de la

DA, la 6-OHDA (Ungerstedt, 1968; Ungerstedt et al., 1974). La 6-OHDA est capturée par les

terminaisons synaptiques via les DAT et conduit à la mort des neurones par une combinaison

de stress oxydant et de dysfonctionnement de la chaine respiratoire mitochondriale (Figure

26). Une fois à l’intérieur de la cellule, la 6-OHDA s’oxyde pour i) former des ROS comme

l’H2O2 (Mazzio et al., 2004), ii) réduire les niveaux striataux d’enzymes impliquées dans les

défenses antioxydantes (SOD et contenu total en GSH) (Perumal et al., 1992; Kunikowska

and Jenner, 2001), iii) élever les niveaux de fer dans la SN (Oestreicher et al., 1994) et iv)

interagir directement avec les complexes I et IV de la chaine respiratoire mitochondriale, ce

78

qui conduit à une inhibition de la respiration mitochondriale et davantage de stress oxydant

(Glinka et al., 1997).

Figure 26. Mécanismes neurotoxiques de la

6-OHDA (Issue de : (Simola et al., 2007)).

Les effets cellulaires induits par la 6-OHDA semblent reproduire certains mécanismes qui

seraient impliqués dans la MP (Jenner, 1989). Comme dans la MP, l’injection de 6-OHDA est

suivie d’une activation microgliale dans la SN et le striatum avec la présence de marqueurs

inflammatoires comme le TNFα (Boka et al., 1994; Mogi et al., 2000b; Nagatsu and Sawada,

2005). Le seul lien pathogénique entre la 6-OHDA et la MP est la présence de 6-OHDA dans

le striatum et dans les urines de certains patients traités à la L-DOPA (Curtius et al., 1974;

Andrew et al., 1993). Le lien direct entre la 6-OHDA et la pathogénèse de la MP - ou l’idée

que la 6-OHDA pourrait être responsable d’une augmentation du stress oxydant, et ainsi

accélérer la dégénérescence des neurones DA restants chez les patients traités à la L-DOPA

reste encore très largement discuté (Muller et al., 2004; Fahn, 2005). Le modèle 6-OHDA

présente d’autres caractéristiques neuropathologiques similaires à la MP : en effet, comme

dans la MP, l’injection de 6-OHDA conduit à une diminution des taux de DA striatal et de

TH. De plus, on observe également une augmentation du rythme de décharge du NST

(Hassani et al., 1996; Hutchison et al., 1998; Benazzouz et al., 2002; Breit et al., 2006), ce qui

conduit également à une augmentation des niveaux de glutamate et du rythme de décharge des

neurones dans les structures de sortie des GB (You et al., 1996; Biggs et al., 1997; Breit et al.,

2006). La 6-OHDA ne traverse pas de façon efficace la barrière hémato-encéphalique. Elle

doit donc être injectée localement par stéréotaxie en intracérébral, soit au niveau de la SN ou

79

dans le faisceau médian du télencéphale (FMT) qui contient les afférences DA et

sérotoninergiques allant vers le cerveau antérieur (modèles antérogrades), soit ou au niveau

du striatum (modèle rétrograde) (Javoy et al., 1976). La 6-OHDA est une molécule qui agit

spécifiquement sur les DAT et n’affecte donc pas les autres neurotransmetteurs. De ce fait, ce

modèle ne reproduit pas entièrement les caractéristiques neuropathologiques de la pathologie,

i.e. les pertes non DA.

Faisant varier la position et l’étendue de la lésion, la 6-OHDA permet de représenter

différentes phases de la MP. Après l’injection de 6-OHDA dans la SN ou le FMT, le profil

des pertes DA est très rapide et donc loin de la progression lente observée dans la MP. La

mort cellulaire commence dans les 1βh suivant l’injection de 6-OHDA, est maximale autour

de 6 jours après l’injection et reste stable au moins 4 semaines après l’injection les

24h(Ungerstedt, 1968; Jeon et al., 1995; Zuch et al., 2000). L’injection de 6-OHDA n’induit

pas la formation de CL ou d’inclusions positives pour l’α-synucléine, et les neurones DA ne

présentent pas de profil apoptotique ; il est donc loin d’être évident que le mécanisme par

lequel la 6-OHDA tue les neurones DA partage des caractéristiques clés avec la pathogenèse

MP. Le pattern de perte DA est « semblable » à celui observé dans la pathologie où la perte de

cellules DA de la SNc (A9) est beaucoup plus étendue que la perte de cellules DA dans

l’ATV (A10) (German et al., 1989). Par exemple, l’injection de κµg de 6-OHDA dans la SNc

cause une perte de 90% des cellules DA de la SNc et seulement 40% des cellules de l’ATV

(Winter et al., 2007). Selon la dose de 6-OHDA et le site d'injection dans la SNc, la perte en

neurones DA peut être totale ou partielle. Dans de tels modèles de lésion extensive, mimant

les stades tardifs de la MP, les animaux sont rarement lésés bilatéralement, car cela nécessite

une attention particulière envers les animaux (Cenci et al., 2002) lesquels meurent en général

assez précocement à cause de l’apparition d’aphagie et d’adipsie (Ungerstedt, 1971). Les

lésions extensives sont donc réalisées essentiellement de façon unilatérale. De plus, les

lésions unilatérales sont associées à un ensemble de symptômes moteurs asymétriques qui

peuvent être facilement analysés, dont des rotations spontanées et induites par l’injection de

de L-DOPA, d’agonistes DA (apomorphine) ou de drogues induisant le relargage de DA

(amphétamine), d’autant plus importantes que le degré de la lésion nigro-striée est élevé

(Ungerstedt and Arbuthnott, 1970; Hefti et al., 1980; Carman et al., 1991; Przedborski et al.,

1995). Les rats présentant une lésion « totale » après injection de 6-OHDA présentent

également une akinésie de la patte antérieure controlatérale à l’injection qui peut être mesurée

facilement grâce à plusieurs tests moteurs comme le stepping test ou le test du cylindre. Les

80

déficits moteurs mesurés dans ces tests sont stables pour au moins 30 jours. Un avantage de

ces modèles est la possibilité d’évaluer les propriétés anti-parkinsoniennes de traitements

(Jiang et al., 1993) et le bénéfice de thérapies cellulaire ou génique pour réparer la voie nigro-

striée (Bjorklund et al., 2002). Ainsi, par exemple, les déficits induits par ces lésionssont

réversés par injection de L-DOPA (Olsson et al., 1995; Lundblad et al., 2002; Marin et al.,

2007) et par stimulation haute fréquence du noyau subthalamique (Gubellini et al., 2006), ce

qui soutient la validité de son utilisation pour mesurer les déficits moteurs « parkinsoniens »

et encourage de continuer l’évaluation de nouveaux traitements symptomatiques. Cependant,

ces traitements symptomatiques sont donnés aux patients dès leur diagnostic, et le modèle de

lésion totale 6-OHDA reflète plutôt les stades tardifs de la pathologie, ce qui peut être

également matière à débats. Le décours rapide de perte cellulaire au niveau de la SNc ne

permet donc pas d’utiliser ce modèle pour des études de neuroprotection, mais en revanche il

est très approprié pour pour évaluer l’efficacité de traitements symptomatiques.

Certaines études utilisent néanmoins des lésions partielles soit en diminuant la dose de 6-

OHDA au niveau de la SNc ou du FMT (6 µg) (Paille et al., 2007), soit en l'injectant au

niveau du striatum (Amalric et al., 1995). La diminution de la dose de 6-OHDA au niveau de

la SNc ou du MFB conduit à des pertes plus variables d’environ 70% et les déficits

comportementaux ont été reportées comme étant moins fiables (Hefti et al., 1980; Costa et al.,

2001). A noter toutefois que des lésions intranigrales focalisées à la SNc latérale ont permis

de produire une dénervation DA striatale préférentielle des régions dorsolatérales motrices du

striatum, mimant le pattron observé dans les stades précoces de la MP et de mettre en

évidence l'existence de mécanismes compensatoires DA dans les régions épargnées

(Dentresangle et al., 2001). Dans une étude récente, des lésions focalisées au sein de l'ATV et

de la SNc médiane n'induisant pas de déficit moteur ont été réalisées et ont montré que

l'atteinte partielle de la SNc médiane et non de l'ATV serait responsable de troubles

motivationnels et affectifs associés à la MP (Drui et al., 2013).

L’injection striatale est généralement utilisée pour induire des lésions DA partielles. Ce

protocole d’injection entraine une dégénérescence plus lente, rétrograde, des neurones de la

SNc qui dure de 1 à 3 semaines (Sauer and Oertel, 1994; Przedborski et al., 1995). Une

altération des terminaisons DA est observée dès le jour de l’injection et la perte des corps

cellulaires dans la SNc est faible à une semaine, mais atteint un maximum 2-3 semaines après

l’injection (Sauer and Oertel, 1994; Przedborski et al., 1995; Blandini et al., 2007). Là encore,

le pattern ressemble à la pathologie, avec une perte plus importante au niveau de la SNc que

81

de l’ATV (β0% de plus) (Przedborski et al., 1995). Néanmoins, les pertes DA varient

beaucoup en fonction du laboratoire : l’injection entre 20 et 28 µg de 6-OHDA produit entre

20 et 85% de pertes cellulaires dans la SNc et une réduction des taux de DA ou des

terminaisons dans le striatum entre 60 et λ0% à deux semaines après l’injection (Sauer and

Oertel, 1994; Przedborski et al., 1995; Kirik et al., 1998; Blandini et al., 2007). De plus, une

récupération spontanée via un sprouting des fibres DA ainsi qu’une récupération de la TH

dans le striatum a été observée 4 à 6 mois après la lésion (Blanchard et al., 1995; Stanic et al.,

2003). Ces modèles partiels peuvent être réalisés de façon bilatérale et permettent une analyse

fine des déficits moteurs dans les phases symptomatiques précoces de la MP.

4.1.4. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

Le MPTP a été identifié comme toxine DA suite à l'observation de l'expression rapide de

symptômes cliniques très comparables à la MP chez de jeunes consommateurs d'un

narcotique, le 1-methyl-4-phenyl-4-propion-oxypiperidine (MPPP), contaminé lors de sa

synthèse par du MPTP (Langston et al., 1983; Langston et al., 1999; Przedborski and Vila,

2003). Après injection systémique le MPTP, qui est un composé très lipophile, traverse la

barrière hémato-encéphalique et est métabolisé par la MAO-B (principalement dans les

astrocytes) en 1-methyl-4-phenyl-2,3,dihydropyridinium (MPDP+), avant son oxydation

spontanée en son métabolite actif, le 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) (Chiba et al.,

1984). Le MPP+ est capturé de façon sélective par le DAT ainsi que par les transporteurs de

la noradrénaline et de la sérotonine (Javitch et al., 1985; Mayer et al., 1986). Une fois à

l’intérieur des neurones, le MPP+ peut suivre au moins γ voies (Figure 27) : i) il se lie à

VMAT2 et est transporté à l’intérieur des vésicules synaptiques (Liu et al., 1λλβ). Cette

séquestration de la toxine à l’intérieur des vésicules synaptiques semble avoir pour rôle de

protéger les cellules de la dégénérescence (Liu et al., 1992; Takahashi et al., 1997). Il

semblerait que le ratio de l’expression de DAT/VMATβ soit un index de la vulnérabilité des

neurones dans la MP et dans le modèle MPTP. En effet, les terminaisons DA situées dans le

putamen, qui sont préférentiellement affectées dans le modèle MPTP et dans la MP,

présentent un ratio DAT/VMAT2 plus élevé que dans le noyau caudé qui est moins affecté

(Miller et al., 1999). ii) Le MPP+ peut également rester dans le cytosol pour induire la

production de ROS qui pourrait contribuer à sa toxicité (Javitch et al., 1985). Enfin, iii) il peut

82

aussi se concentrer à l’intérieur des mitochondries, son site d’action privilégié (Figure 28).

Dans ce cas, le MPP+ altère la phosphorylation oxydative mitochondriale en inhibant le

complexe I de la chaine de transport d’électrons (Nicklas et al., 1985; Mizuno et al., 1987).

Cette inhibition entraine une diminution des taux tissulaires d’ATP spécifiquement dans le

striatum et dans le mésencéphale (Chan et al., 1991; Fabre et al., 1999) ainsi qu’une

production augmentée de ROS (Rossetti et al., 1988; Hasegawa et al., 1990; Hasegawa et al.,

1997).

Figure 27. Métabolisme du MPTP et sites d'action intracellulaire (Issus de : (Dauer and Przedborski, 2003)).

Des résultats provenant d’études in vivo montrent l’importance des ROS dans le processus

dégénératif induit par le MPTP. Par exemple, les souris transgéniques pour la superoxide

dismutase-1 (SOD1), une enzyme clef responsable de l’élimination des ROS, sont résistantes

à l’effet toxique du MPTP sur les neurones DA (Przedborski et al., 1992) et d’autres études

prêtent également un rôle critique pour les espèces réactives, notamment le NO, comme des

effecteurs critiques de la toxicité du MPTP (Przedborski and Vila, 2003). La déplétion en

ATP et la production de ROS semblent se passer peu de temps après l’injection de MPTP,

avant même que la perte neuronale ne soit observée (Jackson-Lewis et al., 1995). De ce fait,

ces évènements précoces ne seraient pas impliqués directement dans la mort neuronale mais

déclencheraient plutôt des voies moléculaires en aval qui, elles, seraient impliquées dans la

perte des neurones DA (Mandir et al., 1999; Saporito et al., 2000; Vila et al., 2001). Jusqu’à

83

présent il n’y a pas d’observations convaincantes montrant des CL dans les modèles MPTP

(Forno et al., 1993).

Le MPTP est en général administré en systémique (sous-cutané, intra-péritonéal,

intraveineux, intramusculaire). La susceptibilité au MPTP varie en fonction de l’espèce et , au

sein de l’espèce, en fonction de la souche d’animaux. Les rats sont relativement résistants à la

toxicité du MPTP ; pour les souris, la sensibilité varie en fonction de la souche. De ce fait, le

MPTP est utilisé majoritairement sur des souches spécifiques comme la C57BL/6. Le MPTP

a beaucoup été utilisé pour explorer les mécanismes de dégénérescence des neurones DA.

Cependant, les souris traitées au MPTP ne développent pas de symptômes moteurs persistants

et progressifs (Przedborski et al., 2001). L’administration de MPTP aux primates non-

humains a été énormément utilisée pour analyser les conséquences physiologiques et

comportementales de la dégénérescence des neurones DA de la SNc, ainsi que pour tester de

nouvelles stratégies thérapeutiques (nouvelles molécules, thérapies géniques, greffes

cellulaires). En effet, le modèle singe MPTP constitue le modèle de référence pour

l’évaluation de nouvelles thérapies potentielles avant le passage en essais clinique sur les

humains.

La dose et le protocole d’injection du MPTP influencent énormément le décours temporel et

le profil de dégénérescence. Le modèle le plus utilisé chez la souris est un protocole

d’intoxication aigüe comprenant soit une soit plusieurs injections (en général 4) dans la même

journée (toutes les deux heures) (Jackson-Lewis and Przedborski, 2007). Dans ce modèle on

n’observe pas d’apoptose (Jackson-Lewis et al., 1995). Selon les doses utilisées on obtient

une déplétion DA plus ou moins totale (en général 75-95% après 4 x 20 mg/kg/inj). Le

modèle MPTP subaigu chez la souris (30 mg/kg/jour pendant 7 jours) conduit à une perte

striatale en DA d’environ 60-75%, due à la mort cellulaire par apoptose qui s’en suit (Tatton

and Kish, 1997). De plus, avec une dose journalière de MPTP de 30 mg/kg, on assiste à une

perte plus graduelle de la DA striatale en comparaison avec le modèle d’intoxication au

MPTP aigüe (Heikkila et al., 1984). Cette perte de DA striatale demeure jusqu’à 1 mois après

la dernière injection (Ricaurte et al., 1986). Dans le modèle MPTP chronique, les souris

reçoivent en général une dizaine de doses de MPTP (25 mg/kg) combiné avec un adjuvant, le

probenicide (250 mg/kg), utilisé pour inhiber l’élimination rapide et l’excrétion du MPTP du

cerveau et des reins. Les dix doses sont administrées sur une durée de 5 semaines (1 injection

tous les 3,5 jours) (Petroske et al., 2001). Dans cette étude, les auteurs montrent que ce

protocole d’injection chronique de MPTP et de probenicide conduit à une perte importante de

84

DA dans le striatum jusqu’à 6 mois après la dernière injection, associée à une perte

significative de la recapture de DA ainsi que du nombre de cellule dans la SNc. Ceci est

également associé à la présence de déficits mesurés dans le test du rotarod. De plus, dans ce

modèle, il existe une accumulation d’α-synucléine et d’ubiquitine dans la SN.

Dans le modèle aigu et subaigu, le MPTP produit une diminution dans les niveaux de DA

striatale et ses métabolites (Heikkila et al., 1984; Hallman et al., 1985; Ricaurte et al., 1986).

Cependant, lorsque les temps de survie sont allongés, l’effet neurotoxique du MPTP est

réversible (Heikkila et al., 1984; Hallman et al., 1985; Ricaurte et al., 1986). La perte de

neurones DA dans la SNc a été démontrée dans quelques études mais pas dans d’autres

(Heikkila et al., 1984; Seniuk et al., 1990; Bezard et al., 1997). Au niveau morphologique, le

modèle subaigu induit une mort des neurones DA par apoptose (Tatton and Kish, 1997), mais

pas le modèle aigu (Jackson-Lewis et al., 1995). Même s’il existe des pertes de DA dans le

striatum, les animaux traités de façon aigüe et subaigüe ne présentent pas de troubles moteurs

(Heikkila et al., 1989; Gerlach and Riederer, 1996). Ainsi les méthodes classiques pour

induire une toxicité rapide avec le MPTP ne sont pas si relevantes vis à vis de la nature lente

et progressive de la pathologie humaine.

Le modèle MPTP/probenicide chronique à faible dose (15 mg/kg) conduit à une déplétion DA

d’environ 60%, 6 mois après le traitement (Lau et al., 1990). La réduction du contenu en DA

et de sa recapture dans le striatum sont beaucoup plus fortes que la perte en cellules TH+ dans

la SN. Ceci a également été décrit dans le modèle aigu (Ara et al., 1998) et subaigu (Seniuk et

al., 1990) ainsi que pour les patients parkinsoniens. Il est postulé que la perte en DA striatale

causée par le MPTP résulte de l’inactivation de la TH par un processus de nitration, sans

affecter le niveau de la protéine et le nombre de cellules (Ara et al., 1998). Dans le modèle

chronique MPTP/probenicid, il existe une récupération de la TH au niveau striatal et nigral

(Petroske et al., 2001) mais les effets moteurs demeurent à long terme. Cette augmentation en

TH est attribuée à un sprouting des fibres restantes (Song and Haber, 2000), à l’apparition de

nouveaux neurones TH+ dans le striatum déplété en DA (Betarbet et al., 1997; Meredith et

al., 1999), ou représenterait un mécanisme compensatoire après une réduction des niveaux de

DA, comme suggéré par des études réalisées post-mortem sur des cerveaux de patients

atteints de la MP (Grima et al., 1987).

Etant donné que le MPTP possède un effet aigu ayant une toxicocinétique rapide, les modèles

sub-aigu et chronique ne sont en fait qu’un enchainement de dommages aigüs (Jackson-Lewis

85

and Przedborski, 2007). Le seul réel modèle chronique est celui où le MPTP est distribué par

pompe osmotique (Fornai et al., 2005). Dans ce modèle, la toxicité aigüe du MPTP est

moindre, car les pics de concentrations du MPTP sont plus faibles. Ce modèle conduit à des

pertes en neurones DA et noradrenergiques, des déficits comportementaux et à la formation

d’inclusions, dans les neurones de la SNc et noradrenergiques du locus coeruleus,

immunoreactives pour l’α-synucléine et l’ubiquitine. De plus, l’injection de MPTP chronique

par micropompe conduit à une inhibition durable du système ubiquitine protéasome et une

activation durable de la recapture du glucose. De façon intéressante, chez les KO pour l’α-

synucléine l’infusion chronique de MPTP induit toujours une activation métabolique, mais les

effets comportementaux ainsi que les pertes neuronales sont pratiquement abolis. De plus,

chez ces souris, l’inhibition du SUP et la présence d’inclusions sont réduites.

Un autre modèle d’intoxication au MPTP est l’administration aigüe ou continue de MPTP par

voie intranasale. Les rats traités avec une injection intranasale unique de MPTP à faibles

concentrations (0.1 mg/nostril, ~0.7 mg/kg) présentent une diminution de l’expression de la

TH dans le bulble olfactif et dans la SNc. Ceci conduit à une diminution de la concentration

en DA dans le bulbe olfactif, le cortex préfrontal et dans le striatum mais pas dans

l’hippocampe. Ces rats montrent des troubles progressifs dans les fonctions olfactives,

cognitives et motrices comme démontrés respectivement par les tests de discrimination

olfactive, le Morris water maze et le test de l’open field. Ces résultats reproduisent des

caractéristiques similaires à la phase précoce de la MP et soulignent le rôle important du

système olfactif comme une voie d’entrée pour le transport de neurotoxines dans le SNc, et

qui pourrait être reliée à l’étiologie de la MP (Prediger et al., 2006; Prediger et al., 2009). Les

deficits moteurs ne sont pas retrouvés après injection unique chez la souris (1 mg/nostril)

(Prediger et al., 2010), remettant en question l'interprétation des données obtenues dans

l'open-field chez le rat en termes de troubles moteurs. Par contre, dans les conditions de

traitement chronique chez la souris (injection intranasale journalière de MPTP pendant 30

jours; 60 mg/kg/jour), les animaux développent des deficits moteurs (diminution de l’activité

en open-field) corrélés à des pertes plus sévères en DA striatale (20%) et des pertes en

marquage TH et DAT dans la SNc et dans le striatum (Rojo et al., 2006). De plus les auteurs

ont observé de fortes réactivités astrocytaires et microgliales dans la SN et le striatum de ces

souris. Un rôle du stress oxidant a été mis en évidence avec une augmentation des niveaux de

Mn-SOD (SOD à manganèse). Néanmoins, la présence d’aggrégats d’α-synucléine n’a pas été

observée.

86

4.1.5. Roténone

L’utilisation de la roténone en tant que modèle de la MP ou en tant que toxine DA est assez

récente (Betarbet et al., 2000). La roténone est très utilisée comme insecticide ou comme

poison pour les poissons. Comme elle est très lipophile, elle traverse facilement les

membranes biologiques et a accès à tous les organes (Talpade et al., 2000) sans nécessiter de

transporteurs membranaires pour accéder au milieu intracellulaire. Comme le MPTP, la

roténone est un inhibiteur spécifique à haute affinité du complexe I de la chaine respiratoire

mitochondriale (Figure 28) et, dans la mitochondrie, il affecte la phosphorylation oxydative

(Schuler and Casida, 2001). La roténone a cependant d’autres effets biologiques, notamment

elle inhibe aussi la formation de microtubules à partir de la tubuline (Brinkley et al., 1974;

Marshall and Himes, 1978). Bertabet et ses collaborateurs en 2000 avaient signalé que

l’administration systémique (par voie intraveineuse) de roténone provoque une

dégénérescence sélective des neurones DA de la SNc. Cependant, des études ultérieures ont

montré une neurotoxicité moins spécifique de la roténone qu’initialement suggérée

(Hoglinger et al., 2003; Lapointe et al., 2004). De plus, l’étendue de la lésion des axones DA

dans le striatum est très variable (Betarbet et al., 2000; Sherer et al., 2003; Zhu et al., 2004;

Lapointe et al., 2004) et des pertes de neurones striataux comme les interneurones

cholinergiques ont également été observées (Hoglinger et al., 2003; Zhu et al., 2004; Lapointe

et al., 2004). Au niveau comportemental, les rats injectés à la roténone sont hypokinétiques,

avec une posture fléchie, et dans certains cas ils montrent aussi une rigidité. Cependant, même

dans certains cas où les pertes DA ne sont pas présentes, ces symptômes moteurs sont

également observés (Sherer et al., 2003). Certains auteurs ont également observé que

l’étendue de la perte DA n’était pas corrélée avec les déficits moteurs (Fleming et al., 2004b).

Contrairement aux modèles 6-OHDA et MPTP, le modèle roténone possède une

caractéristique neuropathologique intéressante : la présence dans certains neurones DA

d’inclusions positives pour l’ubiquitine et l’α-synucléine (Betarbet et al., 2000).

Le modèle roténone par injection intraveineuse présentant une variabilité, d’autres voies

d’administration ont été testées, comme l’injection sous-cutanée, qui conduit aussi à une

grande variabilité et à une forte mortalité. La voie intra-péritonéale par injection répétée tous

les jours pendant 60 jours conduit à une plus grande reproductibilité des lésions (Cannon et

al., 2009). De la même façon que les études précédentes, ce modèle semble générer des pertes

DA spécifiques, accompagnées par la présence d’aggrégats positifs pour l’α-synucléine et

87

l’ubiquitine dans les neurones restants, même si la dénervation striatale présente toujours un

pattern assez focal. Plus récemment d’autres voies d’administration ont également été testées

comme la voie orale (Inden et al., 2007) ou nasale (Rojo et al., 2007) mais ce sont encore des

études isolées avec peu d’analyses pathologiques. Un autre problème du modèle roténone est

représenté par les effets non spécifiques dûs à l’injection systémique (Lapointe et al., 2004;

Fleming et al., 2004b) ce qui conduit à une forte mortalité dûe à des problèmes cardiaques,

estomac et foie. De plus, la relation entre les effets comportementaux et les pertes DA n'est

pas clairement établie. En effet la posture courbée et l’hypokinésie présentes chez les rats

injectés à la roténone pourraient être reliées aux troubles périphériques sévères observés dans

cetraines études (Lapointe et al., 2004). Même si l’injection d’apomorphine corrige certains

des symptomes suggérant l’implication des systèmes DA dans les troubles comportementaux,

aucune autopsie n’a été réalisée pour évaluer les dommages périphériques qui pourraient

contribuer à certains troubles comportementaux. Le troisième problème soulevé par ce

modèle est la non-spécificité dans la SNc et le fait que le pattern de dégénérescence striatale

n’est pas vraiment proche de celui observé dans la MP. Une récente revue (Hoglinger et al.,

2006) conclut que le modèle roténone ne reproduit pas la pathologie de la MP mais induit un

pattern de changements pathologiques qui sont plutôt proche d’un parkinson atypique

caractérisé, par exemple, par une dégénérescence striatale ajoutée à une perte neuronale au

niveau de la SNc.

4.1.6. Paraquat

Le paraquat est un herbicide (1,1’-dimethyl-4-4’-bipyridinium) et, selon des études

épidémiologiques, son exposition pourrait augmenter le risque de développer la MP (Liou et

al., 1997). Il ne traverse pas facilement la barrière hémato-encéphalique (Shimizu et al.,

2001), mais des études montrent des dommages cérébraux chez des individus décédés après

exposition au paraquat, notamment des œdèmes généralisés et des hémorragies

subépendymales et subarachnoïdiennes (Grant et al., 1980). Le paraquat présente des

similitudes structurales avec le MPP+. Son mode d’action (Figure 28) impliquerait la

formation de radicaux superoxide (Day et al., 1999; Przedborski and Ischiropoulos, 2005).

L’administration systémique de paraquat chez la souris cause une perte dose-dépendante des

neurones DA de la SNc et de ses projections, ainsi qu’une diminution de l’activité motrice

88

(Brooks et al., 1999; McCormack et al., 2002). Les effets toxiques du paraquat sur les

neurones DA de la SNc sont tout de même un peu controversés. Certaines études ne

retrouvent pas de tels changements au niveau du système DA nigro-strié après injection de

paraquat (Thiruchelvam et al., 2000), mais une étude récente (Rappold et al., 2011) démontre

que le paraquat à fortes doses a un effet toxique sur les neurones DA de la SNc par un

mécanisme impliquant le transporteur de la DA et Oct-3 (organic cationic transporter-3).

Comme pour le modèle roténone, l’injection de paraquat induit également la présence

d’inclusions intracytoplasmiques positives pour l’α-synucléine dans les neurones DA de la

SNc. De plus, le paraquat induit une élévation des niveaux d’α-synucléine dans le cortex

frontal et dans le mésencéphale ventral (Manning-Bog et al., 2002). Néanmoins, le

mécanisme moléculaire par lequel le stress oxydant induit la mort des neurones DA dans ce

modèle est toujours inconnu ; de ce fait, ce modèle est surtout utilisé pour étudier la formation

des CL et le rôle de l’α-synucléine dans la MP.

L’exposition combinée au paraquat et au maneb (fongicide manganese

ethylenebisdithiocarbamate) a un effet toxique amplifié sur les neurones DA nigro-striée en

comparaison avec l'action de chacun des composés seul (Thiruchelvam et al., 2000). Le

maneb diminue l’activité locomotrice (Morato et al., 1989) et potentialise également l’effet

toxique du MPTP (Takahashi et al., 1989).

Figure 28. Schéma récapitulatif des mécanismes d’action des toxines utilisées dans les modèles de MP. (DAT : Transporteur de la DA ; C-1 : complexe 1 de la chaine respiratoire mitochondriale).

89

4.1.7. Lipopolysaccharide

De nombreuses études ces dernières années ont montré un rôle important de la neuro-

inflammation dans la dégénérescence des neurones DA de la SNc. La neuro-inflammation

implique d’abord l’activation des cellules gliales macrogliales et microgliales. Le

lipopolysaccharide (LPS) est une endotoxine que l’on retrouve dans la membrane extérieure

des bactéries gram-négatives (Figure 29). Il est formé de 3 composants : O-antigen composés

de monosaccharides, un cœur de polysaccharides avec un sucre spécifique (β-keto-3-

deoxyoctonate), et un lipide A qui consiste en une unique chaine de diglucosamine à laquelle

6 chaines d’acides gras sont attachées. Le LPS s’associe avec sa protéine de liaison soluble

(LBP) et CD14, qui est attaché au feuillet externe de la membrane plasmique. La transduction

du signal à travers la membrane plasmique s’effectue grâce à l’interaction du complexe LPS-

CD14 avec le récepteur transmembranaire Toll-like receptor 4 (TLR-4) et la protéine

extracellulaire MD-2. Les membres de la famille des récepteurs TLR sont importants pour la

détection des agents pathogènes par les cellules du système immunitaire inné et la

communication entre cellules (Lu et al., 2008; Leulier and Lemaitre, 2008; Dutta et al., 2008).

Pour TLR4, l’association avec le complexe LPS-CD14 conduit à l’activation de plusieurs

kinases impliquées dans des voies intracellulaires variées et à la transcription de gènes codant

pour des facteurs pro-inflammatoires et des enzymes responsables de la formation de radicaux

libres. Le LPS est un puissant activateur des cellules immunitaires périphériques

(macrophages et monocytes) et de la glie du SNc (microglie et astrocytes), et provoque la

libération de plusieurs cytokines immunorégulatrices et pro-inflammatoires et de radicaux

libres (Raetz et al., 1991; Dentener et al., 1993; Medvedev et al., 2000; Sanlioglu et al., 2001).

Par contre, il ne semble pas que le LPS agisse directement sur les neurones, certainement car

ils ne possèdent pas le récepteur TLR-4 (Lehnardt et al., 2003), ce qui en fait un bon outil

pour étudier les effets de la neuro-inflammation sur la vulnérabilité des neurones DA (Liu et

al., 2002).

90

Figure 29. Représentation schématique des voies moléculaires impliquées dans la dégénérescence DA

induite par le LPS. La protéine de liaison au LPS (LBP) augmente la liasion du LPS à son récepteur CD14.

L’association du complexe LPS-CD14 avec TLR-4 et la protéine adaptatrice MD2 induit une grande variété de

voies de signalisation en aval faisant intervenir notamment les MAPK et NF- B. L’activation de la transcription génique conduit à la libération de plusieurs cytokines, l’activation de la cyclo-oxygenase-2, et de la iNOS, ce qui

conduit à la perte des neurones DA par stress oxydatif (Issu de : (Dutta et al., 2008)).

L’injection aiguë de LPS dans la SN de rats provoque une perte marquée de neurones DA de

la SNc (Castano et al., 1998; Lu et al., 2000; Liu et al., 2000). La perte induite par le LPS est

sélective des neurones DA de la SNc, les neurones non-DA de la SN ainsi que les neurones

DA de l’AVT étant épargnés. L’injection de β µg de LPS dans la SN conduit à une

diminution de 50% des taux de DA dans la SN et dans le striatum jusqu'à 21 jours après

l’injection de LPS (Castano et al., 1998). Les taux de sérotonine restent inchangés 7 jours

après l’injection de γ0 µg ou même 1 an après l’injection de β µg de LPS dans la SN (Herrera

et al., 2000; Arai et al., 2004). Ce modèle est informatif pour essayer de comprendre, dans un

contexte de vulnérabilité des neurones DA de la SNc à l’inflammation, la relation temporelle

entre activation de la glie (astrocyte et microglie) et dégénérescence des neurones DA.

L’injection de LPS conduit à une activation rapide de la microglie dans les heures qui suivent ,

où l’on peut observer un changement morphologique des cellules microgliales, une up-

91

régulation des cytokines pro-inflammatoires, et la présence de radicaux libres (Liu et al.,

2000; Arai et al., 2004; Iravani et al., 2005). L’activation astrocytaire est plus lente et devient

significative seulement une semaine environ après l’injection de LPS (Herrera et al., 2000).

La perte des neurones DA de la SNc n’est également pas observée avant 1 semaine après

l’injection de LPS (Herrera et al., 2000; Liu et al., 2000). De ce fait, l’activation de la

microglie précède la perte des neurones DA dans un contexte de neuroinflammation.

Dans plusieurs études, le LPS a été délivré au niveau de la SN par infusion chronique pendant

2 semaines avec des micropompes (Gao et al., 2002; McCoy et al., 2006). Dans ce cas, dès le

premier point étudié (γ jours après le début de l’infusion) il y a déjà une activation marquée

de la microglie. La microglie au niveau de la SNc est complètement activée entre une et deux

semaines après le début de l’infusion. A ce temps là, aucune perte de neurones DA n’est

encore observée. La perte des neurones DA de la SNc commence entre 2 et 4 semaines mais

n’est significative que 6 semaines après le début de l’infusion. 10 semaines après le début de

l’infusion (i.e. κ semaines après l’arrêt de l’infusion), 60% des neurones DA de la SNc ont

dégénéré (Gao et al., 2002; McCoy et al., 2006). La perte est relativement spécifique de cette

population : en effet, les neurones DA de l’ATV ainsi que les neurones non-DA de la SN,

comme les neurones GABA de la SNr, sont relativement épargnés. Ceci suggère qu’une

période de neuroinflammation assez brève (2 semaines dans ces études) est capable d’induire

une activation gliale marquée et une perte retardée des neurones DA qui progresse dans le

temps. Néanmoins, il manque encore une caractérisation plus étendue de ce modèle, en

particulier la déplétion striatale en DA et l’apparition de déficits moteurs.

Plusieurs médiateurs ont été identifiés comme étant impliqués dans les effets toxiques du

LPS :

Le monoxyde d’azote, qui est produit en excès par l’activation gliale et en particulier

microgliale, contribuerait à la perte DA induite par le LPS (Liu et al., 2002a). En effet, le LPS

conduit à une up-régulation de la iNOS et la libération de NO dans des cultures microgliales,

astrocytaires mais pas neuronales (Zielasek et al., 1992; Simmons and Murphy, 1992; Chao et

al., 1992). De plus, après l’injection de LPS dans la SN, une augmentation de l’activité de la

NOS est observée (Arimoto and Bing, 2003; Ruano et al., 2006). Deuxièmement, la libération

de NO induite par le LPS précède la mort des neurones DA (Dawson et al., 1994). Enfin, le

blocage de la production de NO en inhibant l’activité de la iNOS réduit les pertes DA induites

par le LPS (Iravani et al., 2002; Arimoto and Bing, 2003; Ruano et al., 2006). Le NO

92

contribuerait à l’effet toxique du LPS sur les neurones DA via plusieurs mécanismes : i) sa

réaction avec des radicaux libres superoxyde pour former des radicaux peroxynitrite très

réactifs et donc très toxiques pour les neurones (Bal-Price et al., 2002) ; ii) le NO peut

également inhiber le complexe I et IV de la chaine respiratoire mitochondriale et ainsi causer

une diminution de la synthèse d’ATP (Moss and Bates, 2001) ; iii) le NO peut aussi réverser

les transporteurs gliaux du glutamate et ainsi augmenter les niveaux extracellulaires de

glutamate et engendrer une mort par excitotoxicité (McNaught and Jenner, 2000).

Les ROS sont également générées par la glie activée, et surtout la microglie, et sont des

acteurs majeurs de la dégénérescence DA induite par l’inflammation (Facchinetti et al., 1998).

Les cytokines, et en particulier les cytokines pro-inflammatoires IL-1 et TNF-α, seraient les

plus impliquées dans la dégénérescence DA induite par le LPS (Sawada et al., 1989; Yao et

al., 1992). Leur implication est supportée notamment par une étude montrant que le blocage

du TNF-α et d’IL-1 par des anticorps diminue la perte des neurones DA induite par le LPS

(Gayle et al., 2002).

La COX-2 a une expression qui est augmentée par le LPS, qui augmente également la

libération microglialede prostaglandine E2, un médiateur lipidique (Hoozemans et al., 2002;

Wang et al., 2004). L’inhibition pharmacologique de l’activité de la COX-2 protège les

neurones DA de l’effet toxique du LPS en culture et in vivo (Shibata et al., 2003; Hunter et

al., 2007).

Le modèle LPS apparaît être un bon modèle pour comprendre la vulnérabilité des neurones

DA à des évènements neuro-inflammatoires qui sont présent dans la MP. La relevance de ce

modèle à la MP est toutefois limitée. La neuroinflammation dans ce modèle est un mécanisme

primaire de l’atteinte des neurones DA qui est présent même avant la disparition des

neurones, ce qui n’est pas vraiment en accord avec la vision actuelle de la MP où des

processus neuroinflammatoires interviendraient plutôt secondairement dans l’entretien du

mécanisme de dégénérescence (Hirsch and Hunot, 2009; Hirsch et al., 2012a).

Deuxièmement, l’injection de LPS conduit, en plus de l’activation microgliale, à une forte

activation astrocytaire qui n’est pas une composante majeure des réactivités gliales présentes

dans la pathologie. Troisièmement, l’injection stéréotaxique aiguë de LPS ne conduit pas à

une perte progressive des neurones DA et le seul moyen d’obtenir une dégénérescence

« progressive » est de répéter les injections ou de faire des infusions continues chroniques par

93

micropompes. A noter toutefois qu'une neuroinflammation chronique et une dégénérescence

progressive ont été rapportées après une seule injection systémique de LPS chez la souris

(Qin et al., 2007). Le dernier défaut du modèle LPS est qu’il ne reproduit pas le cadre

pathophysiologique dans les autres régions affectées dans la MP.

4.2. Modèles génétiques

4.2.1. Modèles utilisant la transgenèse

4.2.1.1. Modèles α-synucléine

Les premières mutations à l’origine de formes familiales de la MP ont été identifiées sur le

gène de l’α-synucléine (Polymeropoulos et al., 1997; Kruger et al., 1998). Cependant, même

si l’α-synucléine s’accumule dans les CL (Spillantini et al., 1998), l’immense majorité des

patients ne présente pas de mutations sur le gène de l’α-synucléine. Un grand nombre de

modèles ont été créés par surexpression de l’α-synucléine (Figure 30) avec différents

transgènes et différents promoteurs. Un avantage de ces modèles est l’accumulation

progressive de l’α-synucléine, ce qui est une caractéristique de la MP même si le halo

caractéristique des CL n’est pas reproduit (Maries et al., 2003). La plus grande limitation des

modèles basés sur la surexpression de l’α-synucléine est l’absence de pertes de neurones DA

de la SNc. Les souris surexprimant l’α-synucléine humaine présentent des déficits olfactifs,

des dysfonctionnements du système nerveux autonome, des accumulations

intracytoplasmiques d’α-synucléine et des déficits moteurs précoces en l’absence de

dégénérescence de la voie nigrostriée (Rockenstein et al., 2002; Fleming et al., 2004a;

Fleming et al., 2008; Chesselet et al., 2008). L’utilisation du promoteur Thy-1 provoque une

expression plus étendue de l’α-synucléine, qui n’est plusrestreinte aux neurones

catécholaminergiques (Rockenstein et al., 2002). La perte en neurones DA n’est retrouvée que

dans quelques études, alors que la plupart détectent une perte de DA dans le striatum, des

déficits moteurs et non-moteurs (van der Putten et al., 2000; Fleming et al., 2004a; Ono et al.,

2009; Ikeda et al., 2009). Certaines de ces souris Thy1/α-synucléine développent des

symptômes moteurs et non-moteurs, suggérant qu'elles pourraient être utiles pour l’étude des

phases précoces, précliniques de la MP. Cependant, d’autres études trouvent un démarrage

94

beaucoup plus tardif des déficits moteurs et d’autres n’en trouvent pas du tout (Neumann et

al., 2002; Freichel et al., 2007; Zhou et al., 2008).

4.2.1.2. Modèles parkine, PINK1, DJ1

Les mutations récessives des gènes PARKINE, PINK1 et DJ1 ont été reproduits le plus

souvent par des stratégies de knockout (KO) qui résultent en l’absence de la protéine (Figure

30). Les mutations les plus fréquentes responsables de MP récessives à début précoce

affectent le gène de la PARKIN. La perte de son activité jouerait un rôle pathogénique dans

les formes sporadiques et génétiques de la MP (Dawson and Dawson, 2010). Nous avons vu

que La PARKIN est une ubiquitine E3 ligase, agit comme un represseur de p53 et joue

également un rôle dans le maintien de l’homéostasie mitochondriale en participant à

l’adressage des mitochondries endommagées vers un processus de mitophagie. Les souris KO

pour la PARKINE présentent des déficits moteurs légers et progressifs et des caractéristiques

de la phase précoce de la MP, comme une réduction de la libération de DA, des détériorations

mitochondriales, et une augmentation du stress oxydant. Cependant, aucun de ces modèles ne

montre une perte progressive des neurones DA (Itier et al., 2003; Goldberg et al., 2003;

Palacino et al., 2004; Periquet et al., 2005; Zhu et al., 2007; Rodriguez-Navarro et al., 2007;

Martella et al., 2009) excepté un modèle de KO conditionnel du gène de la parkine utilisant

un vecteur lentiviral où l’ablation a été réalisée dans des souris adultes, dans lesquelles des

dégénérescences DA apparaissent 10 mois après injection du lentivirus dans la SN (Shin et

al., 2011). Une perte de neurones DA peut être induite par injection de LPS (Frank-Cannon et

al., 2008), ce qui montre tout de même que la mutation du gène de la PARKINE rend les

neurones DA plus vulnérables aux agressions environnementales. De façon similaire aux KO

du gène de la PARKINE, les KO des gènes PINK1 et DJ1 ne conduisent pas à de pertes

spontanées des neurones DA (Morais et al., 2009; Aron et al., 2010). De même pour un

modèle triple transgénique où les gènes PARKIN, DJ1 et PINK1 ont été délétés (Kitada et al.,

2009). Cependant la plupart de ces modèles présentent une diminution de l'activité des

neurones DA, un stress oxidant élevé, et une vulnérabilité plus élevée aux toxines

mitochondriales (Kim et al., 2005; Chen et al., 2005; Gautier et al., 2008; Gispert et al.,

2009). A noter que dans un modèle DJ1-C57 (DJ-1−/− dans un fond C57BL/6J), une partie des

souris présente un processus dégénératif progressif (Rousseaux et al., 2012). Une perte DA

95

unilatérale est observée dès 2 mois. La prévalence de l'atteinte DA augmente avec l'âge, avec

un pic à 12 mois, évolue vers une atteinte DA bilatérale et est associée à des déficits moteurs

d'apparition tardive (14-16 mois) ; l'atteinte avec l'âge concerne également le locus coeruleus.

Enfin, un groupe de polymorphismes a pu être associés au phénotype. Ce modèle ouvre de

nouvelles voies de recherche sur la cascade de modifications pathogéniques sous-tendant une

forme familiale de MP et pour explorer des stratégies de neuroprotection.

4.2.1.3. Modèle LRRK2

Récemment, des mutations dominantes sur le gène LRRK2 ont été identifiées comme

intervenant dans des formes familiales de la MP. Les porteurs hétérozygotes peuvent

développer la MP avec des caractéristiques similaires aux formes sporadiques (Cookson et al.,

2008). La pénétrance est fortement dépendante de l’âge (Healy et al., 2008). Il existe plusieurs

mutations sur le gène LRRK2 responsables de formes familiales de la MP, cependant la plus

fréquente est la mutation G2019S. Plusieurs modèles de souris ont été générées (Figure 30),

comme la souris KO, des souris transgéniques avec surexpression de la forme sauvage

humaine, du mutant G2019S, ou avec délétion du domaine kinase de LRRK2 (Lin et al.,

2009). Ni la délétion, ni la surexpression de ces constructions ne causent de réelles

dégénérescences mais conduisent à la présence d’inclusions positives pour l’α-synucléine et

exacerbent les effets pathologiques de la mutation A5γT de l’α-synucléine.

96

Figure 30. Voies intracellulaires impliquant les génes impliqués dans les formes familiales de la MP. A

noter leurs impliquations souvent multiple dans plusieurs mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP,

comme la fonction mitochondriale, le système ubiquitine/protéasome, le stress oxydatif ou encore la formation

d’aggrégats d’α-synucléine. Les flèches vertes indiquent les relations établies, les flèches rouges indiquent une

inhibition et les flèches bleues une interaction putative (Adaptée de : (Moore et al., 2005).

4.2.2. Modèles utilisant des vecteurs viraux

A côté des modèles transgéniques, des stratégies utilisant des vecteurs viraux sont utilisés

pour surexprimer des formes mutées ou normales de gènes impliqués dans la MP, comme l’α-

synucléine ou LRRK2

4.2.2.1. Surexpression de l’α-synucléine par virus adéno-

associés

Les virus adéno-associés (AAVs) sont utiles pour délivrer une expression ciblée d’un gène

dans une région d’intérêt. Si la titration est bonne, une injection de β-3 µl de vecteurs

contenant l’AAV infecte κ0-90% des neurons TH+. La surexpression par AAV de l’α-

synucléine conduit à une diminution du nombre de neurones TH+ de la SN d’environ 50-60%

(Kirik et al., 2002; Kirik et al., 2003; Yamada et al., 2004a; Yamada et al., 2005; Maingay et

97

al., 2006; Gorbatyuk et al., 2008; Chung et al., 2009) et à une perte similaire du marquage TH

au niveau du striatum. Le décours de la dégénérescence est néanmoins variable selon les

études : cette variabilité peut être due en partie à la construction de l’AAV et en particulier du

promoteur choisi. Chez le rat, les déficits moteurs sont là aussi variables et observés

seulement chez environ 25% des rats injectés. La surexpression affecte préférentiellement les

neurones DA situés dans la SNc : en effet l’injection de l’AAV dans l’ATV ne cause pas de

perte neuronale dans cette structure, même si les niveaux d’expression d’α-synucléine sont

similaires (Maingay et al., 2006). Cependant la fonction de ces neurones semble être altérée et

des troubles comportementaux mesurés dans l’open-field sont observés. Chez la souris, la

perte des neurones DA au niveau de la SN après injection de l’AAV est beaucoup moins

marquée : environ 20-25% (St Martin et al., 2007). De ce fait, les souris ne montrent pas de

troubles comportementaux majeurs. Chez la souris également, les neurones de l’ATV

semblent moins affectés. Ce modèle présente également comme caractéristique

neuropathologique la formation d’inclusions cytoplasmiques positives pour l’α-synucléine. La

surexpression de l’α-synucléine via l’injection de l’AAV induit également une réaction

inflammatoire qui ressemble à celle observée dans la MP (Theodore et al., 2008; McGeer and

McGeer, 2008; Chung et al., 2009; Sanchez-Guajardo et al., 2010). Celle-ci consiste en une

activation rapide de la microglie, l’expression de marqueurs neuroinflammatoires et

l’infiltration de lymphocytes. Récemment, plusieurs travaux du même groupe ont montré que

l’utilisation du promoteur synapsyn-1 couplé à un enhancer (activateur) de type WPRE

(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) conduit en une

dégénérescence progressive des neurones DA de la SNc et l’apparition de troubles moteurs

(Decressac et al., 2012).

Les limites de ce modèle sont tout d’abord inhérentes aux contraintes techniques : en effet, le

titrage du vecteur est un paramètre important. En fonction du titrage, l’injection va conduire à

un taux de transfection variable des neurones et donc des effets variables. Il faut également

s’affranchir d’une toxicité non-spécifique qui serait dûe à une expression trop élevée ou à un

processus de purification pas suffisant conduisant à la présence de particules capsidiques

vides ou d’autres protéines qui seraient à l’origine de toxicité non-spécifique ou de réactions

immunitaires. Comme la production, la purification et la titration sont souvent effectuées de

façons différentes selon les laboratoires, cela rend les comparaisons de résultats pas toujours

évidentes. Un exemple est que l’expression de la GFP par cette technique d’AAV, qui est de

plus souvent utilisé comme marqueur contrôle pour vérifier l’expression de la construction,

98

est toxique à fortes concentration et peut conduire à des pertes importantes notamment des

neurones DA et une réactivité microgliale (Ulusoy et al., 2009). Pour éviter ces problèmes il

faudrait donc, pour chaque nouveau lot, avant l’utilisation du vecteur pour des expériences,

tester sa dilution optimale in vivo, qui puisse assurer une transfection étendue de la SN sans

pour autant être à l’origine d’effets toxiques non-spécifiques. Une des limites est également la

difficulté de cibler la SNc et seulement la SNc : en effet, il existe une variabilité dans la

transfection qui dépend de la localisation de l’injection et du fait qu’il faut injecter un volume

suffisant pour infecter la quasi-totalité des neurones de la SNc, ce qui conduit à l’infection des

structures aux alentours (Ulusoy et al., 2010).

4.2.2.2. Surexpression de LRRK2

Des travaux récents (Dusonchet et al., 2011) ont utilisé des AAV pour induire l'expression

neurone-spécifique de la forme sauvage ou mutée G2019S de LRRK2 dans le système

nigrostrié de rats adultes. L'injection virale est réalisée dans le striatum pour induire une

infection rétrograde des neurones DA. Malgré un déclin progressif au cours du temps, la

surexpression est maintenue jusqu'à 42 jours après l'injection. La forme sauvage de LRRK2

ne produit aucune perte neuronale significative, alors que la forme mutante G2019S de

LRRK2, avec des niveaux d'expression équivalents, induit une dégénérescence progressive

des neurones DA de la SNc, atteignant 21% à 42 jours. Toutefois, les souris exprimant les 2

formes, mutante et sauvage, présentent une réduction équivalente de la densité de fibres TH

dans le striatum et ne montrent aucune accumulation ou aggregation de l’α-synucléine ni de

réactivité gliale par rapport aux contrôles exprimant la GFP. Ainsi, contrairement au modèle

transgénique, ce modèle reproduit une caractéristique majeure de la MP représentée par la

perte des neurones DA.

4.2.3. Autres modèles génétiques

Plusieurs facteurs de transcription sont impliqués dans le développement des neurones DA

mésencéphaliques. Ceux-ci incluent par exemple Nurr1 (nuclear receptor-related subfamily

1), Pitx3 (pentraxin-related gene 3), et En1/En2 (Engrailed 1 et 2). Nurr1 interviendrait très

99

tôt dans la determination DA des neurones (Prakash and Wurst, 2006) ; Pitx3 et En1 sont des

homéogènes qui interviendraient plus tardivement dans le développement des neurones DA

(Simon et al., 2001; Smidt et al., 2004; Sonnier et al., 2007). Les souris KO pour ces facteurs

de transcription présentent des pertes DA mésencéphaliques et peuvent être considérées

comme des modèles d’études de la MP. Cependant, l’ablation constitutive de ces gènes

provoque des pertes DA mesurées pendant le développement, qui ne sont ainsi pas corrélées à

l’âge rendant difficile la relevance à la pathologie. A noter que les souris hétérozygotes pour

En1 et sauvages pour En2 présentent des pertes progressives de neurones DA

mésencéphaliques. Toutefois, les pertes DA chez ces souris sont assez faibles (ne dépassant

pas les 40%) et ne progressent plus après 24 semaines (Sonnier et al., 2007). Une perte plus

importante est mesurée chez les souris En1+/- et En2-/- (Sgado et al., 2006).

Enfin, il existe des modèles de MP basés sur la délétion d’un gène essentiel pour la survie

cellulaire spécifiquement dans les neurones DA. Le plus connu de cette catégorie est le

modèle MitoPark, où le facteur de transcription mitochondrial A (Tfam) est délété

spécifiquement dans les neurones DA. Ce facteur de transcription est essentiel pour

l’expression et le maintien de l’ADN mitochondrial. Les souris MitoPark présentent plusieurs

caractéristiques de la MP, comme une perte âge-dépendante des neurones DA

mésencéphaliques et une amélioration des symptômes par la L-DOPA (Ekstrand and Galter,

2009).

Il a également été développé récemment un modèle génétique de délétion du récepteur au

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), Ret, spécifiquement à l’intérieur des

neurones DA. Ces souris presentent une perte progressive des neurons DA de la SNc, une

perte de terminaisons dans le striatum et une forte réactivité gliale (Kramer et al., 2007).

Néanmoins, elles n'ont pas de déficits moteurs et présentent une perte des neurones de

projections du striatum.

100

V. La transmission glutamatergique

Cela fait plus de 75 ans que l’effet du glutamate au niveau du SNC est reconnu. Au départ le

rôle que l’on donnait au glutamate dans le SNC était métabolique (Krebs, 1935; Weil-

Malherbe, 1936), étant donné qu’on le trouve dans le cytosol et les mitochondries de tous les

types cellulaires du SNC. L’effet excitateur d’acides aminés sur des neurones a été décrit pour

la première fois en 1959 (CURTIS et al., 1959). Les auteurs ont montréque l’acide glutamique

infusé par iontophorèse exerce un effet dépolarisant sur des neurones de la moelle épinière.

D’autres acides aminés ont montré des actions similaires, et ces composés ont été regroupés

sous le terme d’acides aminés excitateurs (CURTIS and WATKINS, 1960; CURTIS and

WATKINS, 1963). Outre le glutamate lui-même, cette catégorie regroupe un autre acide

aminé constitutif, l’acide aspartique, ainsi que des composés exogènes d’origine naturelle

(acides quisqualique, kaïnique et domoïque) ou synthétique [N-methyl-D-aspartic acid

(NMDA)]. Il était déjà suggéré que l’action excitatrice de ces molécules devait passer par des

récepteurs spécifiques dont des sous-types particuliers étaient supposés présenter des

spécificités pour ces différents composés. Il aura cependant fallu une vingtaine d’année pour

accumuler suffisamment de preuves et qualifier le glutamate comme un neurotransmetteur

selon tous les critères, notamment la démonstration qu’il exerce ses effets post-synaptiques

via des récepteurs spécifiques (McLennan et al., 1968). Il est maintenant reconnu que le

glutamate est le neurotransmetteur excitateur principal du SNC, responsable de la

neurotransmission à près d'un tiers des synapses excitatrices « rapides » (WATKINS and

Evans, 1981; Cotman and Monaghan, 1986; Doble, 1999).

Le fonctionnement de la synapse glutamatergique est illustré en figure 31. Une fois libéré par

les neurones glutamatergiques, le glutamate est rapidement capturé par un mécanisme de

transport présent dans les neurones et dans les astrocytes (Danbolt, 2001). De ce fait, les

concentrations extracellulaires de glutamate sont particulièrement faibles : 3-4 µM dans le

liquide extracellulaire et 10 µM dans le liquide céphalorachidien (Danbolt, 2001). Le

glutamate peut également être utilisé comme co-transmetteur par des neurones définis à

l’origine comme étant non-glutamatergiques, par exemple certains neurones

monoaminergiques ou cholinergiques (Johnson, 1994; Sulzer et al., 1998; Fremeau, Jr. et al.,

2002; Hnasko and Edwards, 2012). Le glutamate peut également être libéré de diverses

façons par les astrocytes et notamment par exocytose calcium-dépendante (Bezzi et al., 1998;

101

Araque et al., 2000). Les astrocytes expriment des protéines SNARE impliquées dans le

processus d’exocytose telle que la synaptobrévine (Araque et al., 2000), les transporteurs

vésiculaires du glutamate (Fremeau, Jr. et al., 2002) ainsi que les différents sous types de

récepteurs glutamatergiques présents sur les neurones (von and Kettenmann, 1991; Conti et

al., 1997; Santello et al., 2012). En plus de son rôle dans la transmission synaptique, le rôle

métabolique du glutamate est également très important. Il est utilisé comme précurseur du

neurotransmetteur inhibiteur GABA et de la principale molécule antioxydante du cerveau, le

GSH. Il intervient également dans la synthèse protéique et peut être utilisé comme substrat

énergétique (Fonnum, 1984).

Lorsque sa concentration extracellulaire augmente, le glutamate peut également être toxique

par hyperactivation des récepteurs ionotropiques ou excitotoxicité.

Figure 31. La synapse glutamatergique (Issue de (Niciu et al., 2012))

102

5.1. Synthèse du glutamate

Comme tous les acides aminés, le glutamate possède une extrémité N-terminale, une C-

terminale et une chaine carbonée, l’extrémité C-terminale et lachaîne carbonée étant dérivée

du glucose. Le glucose traverse la barrière hémato-encéphalique via les pieds astrocytaires ;

une fois à l’intérieur de la cellule, il est métabolisé par la glycolyse qui aboutit à la formation

de pyruvate. Le pyruvate à son tour entre dans le cycle des acides tricarboxyliques pour

générer l’α-cetoglutarate, qui sera transaminé en glutamate en recevant un groupement amine

d’un acide aminé donneur préférentiellement en provenance de l’alanine via l’action de

l’alanine amino-transférase (Westergaard et al., 1995; Niciu et al., 2012). Le glutamate ainsi

formé est transformé en glutamine par l’enzyme glutamine synthétase, dont la localisation est

restreinte aux astrocytes. La glutamine peut être ensuite exportée vers les neurones (Tansey et

al., 1991) où elle est reconvertie en glutamate par la glutaminase-phosphate activée, une

enzyme mitochondriale présente sélectivement dans les neurones (Kvamme et al., 2000). Ce

cycle glutamate/glutamine entre les neurones et les astrocytes permettrait également le

recyclage du neurotransmetteur dans les astrocytes après sa recapture (Westergaard et al.,

1995). Des études métaboliques montrent qu’une très grande majorité du glucose qui pénètre

dans le SNC est converti en glutamate, ce qui est cohérent avec le fait que le glutamate a un

rôle central dans plusieurs aspects physiologiques du SNC (Shen et al., 1999). Toutefois,

certaines populations de neurones glutamatergiques n’expriment pas la glutaminase-

phosphate activée (Laake et al., 1999) et la synthèse de glutamate peut avoir lieu même en

l’absence de glutamine. En effet, les neurones glutamatergiques sont capables de carboxyler

le pyruvate (Hassel and Brathe, 2000), et le glutamate peut également être formé à partir de

l’α-cétoglutarate et d’ammonium par la glutamate déshydrogénase. En accord avec cette

dernière possibilité, cette enzyme est détectée dans des terminaisons glutamatergiques

(McKenna et al., 2000). Enfin, selon une hypothèse de longue date, une partie du glutamate

présent dans les terminaisons synaptiques pourrait provenir directement de sa recapture par

ces terminaisons (Erecinska and Nelson, 1987).

103

5.2. Libération du glutamate

5.2.1. Libération vésiculaire

La dépolarisation des terminaisons glutamatergiques entraîne l’ouverture de canaux calciques

voltages-dépendants et une libération vésiculaire du glutamate via un mécanisme

exocytotique dépendant d’une augmentation des concentrations cytoplasmiques de calcium

libre (Nicholls and Attwell, 1990). La libération de glutamate est maximale à 5 µM de

calcium libre (Kish and Ueda, 1991).

L’accumulation de glutamate dans les vésicules synaptiques se fait par un processus

dépendant de l’ATP, des ions Mg2+, du Cl- et d’un gradient électrochimique de protons

(Danbolt, 2001). Ce transport dépend de l’énergie fournie par l’ATP, qui active la pompe

H+/ATPasique localisée au niveau de la membrane vésiculaire (Danbolt, 2001). Celle-ci

génère un gradient protonique électrochimique de part et d’autre de la membrane vésiculaire.

En l’absence d’ATP et d’ions Mg2+ pour alimenter la pompe ATPasique, le gradient de

concentration diminue et le glutamate sort des vésicules par inversion des transporteurs

vésiculaires (Danbolt, 2001). Les protéines assurant le transport vésiculaire du glutamate sont

les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Dans le système nerveux, deux

isoformes de ces transporteurs, VGLUT1 et VGLUT2 sont restreintes aux neurones

glutamatergiques et sont fortement exprimés dans les synapses excitatrices (Herzog et al.,

2001; Kaneko et al., 2002) suggérant qu’elles peuvent définir le phénotype excitateur des

neurones. Les transporteurs VGLUT1 et VGLUTβ montrent des patterns d’expression

complémentaires dans le cerveau adulte (Herzog et al., 2001; Kaneko et al., 2002). VGLUT1

est exprimé dans le cortex cérébral, le cortex cérébelleux et l’hippocampe, alors que VGLUTβ

est présent notamment dans le tronc cérébral, les noyaux cérébelleux profonds et la couche 4

du néocortex. Bien que les deux isoformes soient présentes dans le thalamus, l’expression de

VGLUT2 prédomine. La localisation de ces deux isoformes est exclusivement présynaptique

dans les terminaisons nerveuses. Il existe une troisième isoforme, le transporteur VGLUT3

qui est peu présent dans le cerveau et est exprimé dans d’autres organes tels que le foie ou les

reins (Fremeau, Jr. et al., 2004). Contrairement à VGLUT1 et VGLUT2, VGLUT3 a une

expression dans le cerveau i) non seulement au niveau axonal mais aussi dans le

compartiment somatodendritique et ii) dans des populations neuronales traditionnellement

considérée comme libérant d’autres neurotransmetteurs classiques tels que le GABA ou

104

l’acétylcholine. Ainsi, VGLUTγ a été visualisé dans des interneurones de l’hippocampe et du

cortex exprimant la GAD (glutamic acid decarboxylase, enzyme de synthèse du GABA), ainsi

que dans des terminaisons axonales présentant les caractéristiques morphologiques de

synapses inhibitrices, soulignant la possibilité d’une co-libération de glutamate et de GABA

(Fremeau, Jr. et al., 2002; Fremeau, Jr. et al., 2004). Ce transporteur est également exprimé

par les interneurones cholinergiques du striatum, les neurones sérotoninergiques du raphé et

par les neurones DA de la SNc et de l’ATV (Fremeau, Jr. et al., 2002; Gras et al., 2002).

Concernant les neurones DA, une co-libération de DA et de glutamate (VGLUT2-dépendante)

interviendrait au niveau de leurs projections sur le noyau accumbens mais pas sur le striatum

dorsal (Stuber et al., 2010).

5.2.2. Libération par inversion du transport

Le glutamate pourrait également être libéré du compartiment cytoplasmique vers le milieu

extracellulaire par inversion du processus de capture transmembranaire du glutamate. Ce

phénomène pourrait avoir lieu aussi bien dans les neurones que dans les cellules gliales, suite

à une déficience du métabolisme énergétique, comme dans l’ischémie cérébrale (Rossi et al.,

2000; Grewer et al., 2008) (Figure 32). De plus, dans les neurones, des conditions de

dépolarisation chronique conduisant à une altération des gradients de part et d’autre de la

membrane plasmique entraînant une augmentation extracellulaire de la concentration en ions

K+ et intracellulaire en ions Na+ pourrait également conduire à une inversion du transport du

glutamate en diminuant la force motrice du transport (Szatkowski et al., 1990; Attwell et al.,

1993; Grewer et al., 2008). De ce fait, une telle inversion pourrait contribuer à la libération de

taux neurotoxiques de glutamate dans certaines conditions physiopathologiques de décharge

neuronale intense et répétée.

105

Figure 32. Libération pathologique du glutamate par inversion du fonctionnement des transporteurs du

glutamate. L’augmentation de la concentration extracellulaire en K+ comme observée en condition d’hypoxie peut conduire à l’inversion du transport du glutamate augmentant ainsi la concentration extracellulaire de glutamate pouvant conduire à une mort neuronale par sur-activation des récepteurs ionotropiques du glutamate

(excitotoxicité) (Issue de : Attwell et al., 1993).

5.2.3. Autres modes de libération

Hormis le fonctionnement inversé des EAATs, différents mécanismes peuvent conduire à une

libération non vésiculaire du glutamate (Figure 33).

Le glutamate peut être libéré au travers de l’échangeur antiporteur cystine-glutamate xc-, une

protéine membranaire qui permet l’échange d’une molécule de cystine extracellulaire contre

une molécule de glutamate intracellulaire de manière sodium-indépendante (Danbolt, 2001).

Cet échangeur est exprimé ubiquitairement dans le cerveau et essentiellement par les

astrocytes (Cho and Bannai, 1990; Murphy et al., 1990). Il représente une source majeure de

glutamate extracellulaire ; il a été montré que 60% du glutamate extracellulaire mesuré au

niveau du striatum provient des astrocytes au travers de l’échangeur xc- (Baker et al., 2002).

Un autre processus est représenté par la libération d’acides aminés excitateurs (AAE) activée

par l’augmentation du volume cellulaire (Danbolt, 2001) au travers de protéines appelées

VSOAC pour « volume sensitive organic anion channels » (Patel et al., 1998; Danbolt, 2001)

dont l’ouverture est dépendante des taux de calcium et d’ATP intracellulaires.

106

Les hémi-jonctions GAP peuvent également représenter une source de libération de glutamate

notamment dans des conditions de faibles concentrations d’ions divalents et de dépolarisation

membranaire, comme dans l’ischémie cérébrale (Trexler et al., 1996).

Les récepteurs purinergiques P2X, qui sont des récepteurs purinergiques perméables au

calcium et activés par l’ATP, peuvent aussi participer à la libération de glutamate, notamment

via P2X7(Duan et al., 2003; Ando and Sperlagh, 2013). Ce mécanisme de libération, comme

celui faisant intervenir les hémi-jonctions GAP, peut se produire dans des conditions de

faibles concentrations extracellulaires d’ions divalents (Duan et al., 2003).

Figure 33. Schéma illustrant les différents modes de libération du glutamate

5.3. Les récepteurs du glutamate

5.3.1. Généralités

Au début des années κ0, il est devenu clair qu’il existe plusieurs sous-types de récepteurs

pour les acides aminés excitateurs qui médient les réponses excitatrices observées par des

approches électrophysiologiques (WATKINS and Evans, 1981). Des études utilisant des

107

ligands radioactifs (Foster and Fagg, 1984) ont conduit à l’identification de trois sous-types

de récepteurs aux acides aminés excitateurs reconnaissant préférentiellement le NMDA,

l’acide quisqualique et l’acide kaïnique. Avec l’identification de ligands agonistes ou

antagonistes de plus en plus sélectifs, cette classification s’est affinée dans la fin des années

80 et au début des années 90 (Collingridge and Lester, 1989). Plus tard, le clonage de sous-

unités des récepteurs quisqualate/kaïnate (Hollmann et al., 1989) et des récepteurs NMDA

(Moriyoshi et al., 1991) a permis de fournir une classification de ces récepteurs avec une base

solide. Les récepteurs des acides aminés excitateurs sont maintenant divisés en 2 grandes

familles : les récepteurs ionotropiques, comprenant les récepteurs NMDA, AMPA et kaïnate,

et les récepteurs métabotropiques (Collingridge and Lester, 1989; Monaghan et al., 1989)

(Figure 34).

Les récepteurs ionotropiques sont responsables de la transmission synaptique rapide du

glutamate. Ce sont des récepteurs canaux tétramériques, les quatre sous-unités qui le

composent étant arrangées autour d’un unique pore central, le canal ionique. Ils diffèrent dans

leur composition en sous-unités, leur liaison à des ligands spécifiques et les conductances

ioniques engendrées par leur activation. Alors que les récepteurs AMPA et kaïnate peuvent

être des homo- ou des hétéromères dont chaque sous-unité lie une molécule de glutamate, les

récepteurs NMDA sont des hétéromères. Les récepteurs métabotropiques, à l’inverse, sont des

récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G et leur rôle est plutôt de

moduler l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique via la production de seconds

messagers.

La structure et la fonction des récepteurs NMDA sera développée dans le paragraphe

suivant.

Les récepteurs de type AMPA sont des complexes formés par des combinaisons de 4 sous-

unités (GluR1, GluR2, GluR3 et GluR4) issues de quatre gènes différents. Les sous-unités

formant le récepteur vont déterminer ses caractéristiques électrophysiologiques. Les

récepteurs AMPA forment un canal ionique perméableaux ions K+ et Na+ mais qui présente

une perméabilité limitée aux ions Ca2+ (Greger et al., 2007; Liu and Savtchouk, 2012). Les

récepteurs AMPA sont activés très rapidement et sont impliqués dans le déclenchement de la

neurotransmission glutamatergique. Ils sont latéralement mobiles à la membrane et présents

en quantités importantes au niveau synaptique mais aussi en dehors de la synapse (Groc and

108

Choquet, 2006). L’activité neuronale et la plasticité synaptique régulent le nombre de

récepteurs AMPA synaptiques (Groc et al., 2004; Collingridge et al., 2004).

Les récepteurs de type Kaïnate sont des complexes formés à partir de 5 sous-unités (GluR5,

GluR6, GluR7, KA-1 et KA-2) issues de 5 gènes. KA-1 et KA-2 doivent toujours être

associés à une sous-unité de type GluR pour permettre l’adressage du récepteur à la

membrane (Gallyas, Jr. et al., 2003). Ces récepteurs forment un canal cationique perméable

aux ions K+, Na+ et, selon les types de sous-unités, aux ions Ca2+ (Bettler and Mulle, 1995).

Les récepteurs kaïnate seraient plus souventlocalisés de manière pré- ou extra-synaptique, et

joueraient un rôle de modulateurs de la transmission synaptique (Lerma, 2003).

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluRs) sont des récepteurs couplés aux

protéines G. Au travers des couplages enzymatiques que possèdent les protéines G, les

mGluRs contrôlent les concentrations intracellulaires de différents seconds messagers et

déclenchent des modifications durables du métabolisme cellulaire (Doble, 1999). Ils

participent à la modulation de la transmission synaptique et de l’excitabilité neuronale dans le

SNC. Huit sous-types de mGluRs ont été identifiés et classés en trois groupes selon leurs

homologies de séquence et leur couplage à un second messager.

- Les mGluRs du groupe I (mGluR1 et mGluR5) ;

- Les mGluRs du groupe II (mGluR2 et mGluR3) ;

- Les mGluRs du groupe III (mGluR4, mGluR6, mGluR7 et mGluR8).

Les mGluRs du groupe I sont couplés positivement à la phospholipase C au travers d’une

protéine Gq/G11. Ils sont plutôt qualifiés d’activateurs et sont localisés au niveau post-

synaptique. Les récepteurs des groupes II et III sont couplés négativement à l’adenylate

cyclase au travers d’une protéine Gi/Go ; ils sont considérés comme plutôt inhibiteurs et

préférentiellement localisés au niveau présynaptique pour moduler la libération de

neurotransmetteurs (Conn and Pin, 1997; Cartmell and Schoepp, 2000; Kew and Kemp, 2005)

109

Figure 34. Classification des récepteurs glutamatergiques

5.3.2. Les récepteurs NMDA

Les récepteurs NMDA sont ceux qui possèdent la plus grande affinité pour le glutamate (EC50

1µM). Trois typesde sous-unités ont été identifiées : NR1, NR2A à D, NR3A et B (également

appelées GluN1, GluN2A-D, GluN3A-B). Par des expériences d’HIS, il semble que

l’expression de la sous-unité NR1 soit ubiquitaire et nécessaire dans le cerveau. Son rôle

semble être crucial dans le développement, étant donné que les souris KO pour NR1 meurent

peu de temps après la naissance du fait de défauts respiratoires. Trois points majeurs

différencient les récepteurs NMDA des récepteurs non-NMDA :

- Pour être pleinement actifs, les récepteurs NMDA nécessitent la présence de

l’agoniste (L-glutamate) et d’un co-agoniste (glycine ou D-sérine) (Johnson and

Ascher, 1987; Kleckner and Dingledine, 1988; Dalkara et al., 1992).

- Lorsque le neurone est hyperpolarisé, ces récepteurs sont bloqués par la présence d’un

« bouchon magnésium ». C’est seulement lorsque le neurone est dépolarisé (par

110

exemple via l’intervention des récepteurs AMPA/kaïnate) que le Mg2+ est libéré du

canal, et ainsi le récepteur peut participer à la transmission synaptique. L’activation de

ce canal est donc voltage-dépendante ce qui n’est pas le cas des autres récepteurs

ionotropiques du glutamate (Mayer et al., 1984; Nowak et al., 1984; Kupper et al.,

1998).

- Ces récepteurs sont beaucoup plus perméables que les autres récepteurs au Ca2+, ce

qui rend ce canal essentiel dans certains processus neurophysiologiques comme lors

du développement cérébral et les processus cognitifs, mais également à des troubles

pathologiques comme les troubles bipolaires, les accidents vasculaires cérébraux ou la

MP (Dingledine et al., 1999; Mayer and Armstrong, 2004).

5.3.2.1. Structure

Les récepteurs NMDA sont des récepteurs canaux tétramériques composés le plus souvent de

deux sous-unités NR1 et deux sous-unités NR2 (A, B, C ou D) (Dingledine et al., 1999).Dans

les cellules exprimant la sous-unité NR3, la conformation la plus vraisemblable serait la

formation de récepteurs hétérotrimériques NR1/NRβ/NRγ, même s’il a été mis en évidence la

présence de récepteurs hétérodimériques NR1/NR3 au niveau de la myéline du nerf optique

(Pina-Crespo et al., 2010). La sous-unité NR1 ainsi que la sous-unité NR3 semblent fixer le

co-agoniste (glycine ou D-sérine), tandis que le site de liaison au glutamate est sur NR2

(Dingledine et al., 1999; Furukawa et al., 2005; Yao and Mayer, 2006).

Les sous-unités des récepteurs NMDA sont composées i) d’un domaine N-

terminalextracellulaire ; ii) de trois domaines transmembranaires (M1, M3, M4) et une boucle

M2 entrant partiellement dans la membrane pour former le canal ionique ; iii) d'un domaine

de liaison à l’agoniste appelé S1,bilobé et formé par le segment distal restant après le domaine

N-terminal et par la grande boucle extracellulaire reliant les domaines transmembranaires M3

et M4, appelée S2 ; iv) d'un domaine C-terminal cytosolique (Dingledine et al., 1999; Mayer

and Armstrong, 2004) (Figure 35). En plus des sites glycine et glutamate dans le dimère

NR1—NR2, la région extracellulaire de NR2 contient des sites de liaison pour d'autres

ligands endogènes, comme les polyamines; ces sites exerceraient un effet régulateur sur

l'activité du récepteur NMDA en permettant des augmentations ou réductions du flux calcique

au travers du récepteur dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

111

Figure 35. Représentation schématique de

l’organisation moléculaire d’une sous-unité

de récepteur NMDA. Le domaine N-terminal

(ATD), les 2 lobes S1-S2, les 3 domaines

transmembranaires (M1, M3, M4), la boucle

M2 et le domaine C-terminal (CTD) (Issu de :

(Ng et al., 2008)).

A noter qu'il existe 8 variantes de la sous-unité NR1 résultant d’épissages alternatifs (NR1-

1a/4a et NR1-1b/4b). Ces variantes diffèrent au niveau du domaine N1 situé en N-terminal

et/ou des domaines C1, Cβ et Cβ’ enC-terminal (Zukin and Bennett, 1995; Holmes et al.,

2002). Le domaine N1 (exon 5) est important pour la régulation des propriétés du canal, sa

sensibilité à la spermine, au pH et au Zn2+ (Dingledine et al., 1999). Dans les isoformes

contenant l’exon N1, ni les polyamines ni le Znβ+ n’augmentent la stimulation exercée par le

glutamate. Cet exon est également impliqué dans la sensibilité au pH ; en effet, les récepteurs

contenant cet exon sont activés complètement à pH physiologique alors que dans les formes

où ce domaine est déplété le récepteur est inhibé partiellement (Traynelis et al., 1995; Low et

al., 2003). Les exons situés dans la partie C-terminale jouent quant à eux un rôle important

dans la régulation et la localisation du récepteur NMDA à la membrane.

5.3.2.2. Localisation

La sous-unité NR1 semble être exprimée dans quasiment tous les neurones pendant tous les

stades développementaux. Les différentes sous-unités NR2 présentent des profils

d’expression spatio-temporel différents (Watanabe et al., 1993). NR2B et NR2D sont les

sous-unités prédominantes durant le développement embryonnaire ; cette distribution change

complètement dans le cerveau adulte, où NRβA est quasiment ubiquitaire, l’expression de

NR2B est restreinte surtout au cerveau antérieur, NR2C est très enrichie dans le cervelet alors

112

que NR2D est faiblement exprimé dans le cerveau antérieur et le tronc cérébral (Watanabe et

al., 1992; Watanabe et al., 1993; Akazawa et al., 1994; Monyer et al., 1994; Yamakura and

Shimoji, 1999) (Figure 36).

Figure 36. Distribution des ARNm des sous-unités des récepteurs NMDA dans le cerveau de souris à P21.

(A) NR2A, (B) NR2B, (C) NR2C, (D) NR2D et (E) NR1. (Issu de Watanabe et al., 1993).

Chez l’adulte, NRβA est exprimé dans tout le cerveau sauf les noyaux hypothalamiques.

NRβB est fortement exprimé dans le cortex (surtout les couches II/III), l’hippocampe,

l’amygdale, les noyaux ventraux du thalamus et le bulbe olfactif (Watanabe et al., 1993). Au

niveau subcellulaire, les récepteurs contenant la sous unité NR2B sont localisés aux

niveauxsynaptique, périsynaptique et extrasynaptique (Kohr, 2006). Dans les synapses

glutamatergiques immatures, il est établi que des récepteurs NMDA contenant la sous-unité

NR2B sont localisés au niveau synaptique et sont responsable de la transmission synapique

directe. Lors de la maturation des synapses, il y a une augmentation de l’expression de NRβA

qui conduit à une diminution de la sensibilité des courants synaptiques aux antagonistes

NR2B. De nombreuses études ont également montré que les récepteurs NMDA

extrasynaptiques sont enrichis en sous-unité NR2B en comparaison avec les récepteurs

NMDA synaptiques. Ces récepteurs extrasynaptiques sont activés par un « spillover » du

glutamate provenant de synapses voisines, ou encore d'une libération par les cellules gliales

113

(voir plus loin). Cependant la ségrégation NRβA/synaptique et NRβB/extrasynaptique n’est

pas absolue et il y a des exemples de synapses adultes où NR2B prédomine (Lopez de and

Sah, 2003; Fujisawa and Aoki, 2003; Janssen et al., 2005; Kohr, 2006) et d’autres où NRβA

est retrouvée en extrasynaptique (Li et al., 1998; Kohr, 2006; Thomas et al., 2006).Après la

naissance, l’expression de la sous-unité NRβD diminue fortement, et chez l’adulte on retrouve

NR2D principalement dans le diencéphale et le tronc cérébral (Paoletti, 2011). NR2D a été

longtemps considéré comme étant exprimé uniquement en extrasynaptique ; il est maintenant

démontré qu’on peut également retrouver cette sous-unité en position synaptique (Logan et

al., 2007; Brothwell et al., 2008; Harney et al., 2008).

5.3.2.3. Caractéristiques fonctionnelles

Les sous-unités NRβA et NRβB sont caractérisées par de grandes conductances ainsi qu’une

forte sensibilité vis-à-vis du blocage au Mgβ+. A l’inverse, les récepteurs contenant NRβC ou

NR2D possèdent des conductances plus petites et une sensibilité plus faible au blocage par le

Mg2+. Cette dernière caractéristique est attribuée au fait que les ions Mg2+ se détachent plus

rapidement de leur site sur la sous unité NR2D (Qian et al., 2005). La perméabilité calcique

diffère également entre les différents sous types de récepteurs NMDA : elle est plus élevée

pour les récepteurs NMDA contenant NR2A ou NR2B que pour ceux contenant les sous

unités NR2C ou NR2D (Burnashev et al., 1995; Schneggenburger, 1996). Les récepteurs

NR1/NR2A possèdent une faible affinité à la glycine par rapport aux autres récepteurs

hétérodimériques (Paoletti, 2011). La sensibilité au glutamate est également très variable

d’une sous-unité à l’autre avec un rapport allant de 1 à 10 avec de la plus faible à la plus forte

sensibilité NR2D (0,4µM) < NR2C (1 µM) ~NR2B (2 µM) < NR2A (4 µM). Ce même

classement est obtenu pour la cinétique de désactivation (Monyer et al., 1994; Vicini et al.,

1998; Yuan et al., 2009; Paoletti, 2011). Ce paramètre est très important car il contrôle la

durée de la composante lente (médiée par les récepteurs NMDA) des courants post

synaptiques excitateurs (Lester et al., 1990). La durée du temps de désactivation varie en

fonction des sous-unités (Figure 37). Les récepteurs NR1/NR2A ont la cinétique la plus

rapide (~ 40 - 50 ms) alors que les récepteurs NR1/NR2D possèdent la cinétique la plus lente

(~ 1,5 - 2 s). Ce temps de désactivation lorsque la sous-unité NR2D est présente est

exceptionnellement long pour un récepteur « canal ». La sous-unité NR1 participe également

114

à la cinétique de désactivation ; la présence de l’exon 5 (NR1b) accélère cette cinétique

(Rumbaugh et al., 2000).

Figure 37. Illustration des

différences de cinétique de

désactivation des différents sous-

types de récepteurs GluN1/GluN2

(Adapté de : (Rumbaugh et al., 2000)).

La probabilité maximale d’ouverture, qui correspond à la probabilité pour un canal de se

trouver à l’état ouvert lorsque les sites de liaison de l’agoniste sont tous occupés, est une autre

caractéristique importante qui varie beaucoup entre les différents sous-types de récepteurs

NMDA. Cette probabilité est relativement haute (~0,5) pour les récepteurs NR1/NR2A,

intermédiaire (~0,1) pour les récepteurs NR1/NR2B et très faible (~0,01) pour les récepteurs

NR1/NR2C et NR1/NR2D (Wyllie et al., 1998; Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005; Dravid

et al., 2008). Non seulement les canaux des récepteurs NMDA NR1/NR2C et NR1/NR2D

possèdent des probabilités d’ouverture très faible, mais en plus l’état ouvert de ces canaux

n’est pas très stable, ce qui se reflète par un temps d’ouverture moyen beaucoup plus faible de

ces canaux par rapport à ceux des récepteurs NMDA NR1/NR2A et NR1/NR2B. La

composition en sous-unités NRβ d’un récepteur NMDA influence donc fortement les

propriétés du canal. Les sous-unités NR2C et NR2D donnent aux récepteurs des activités

faibles et prolongées, alors que les sous unités NR2A et dans une moindre mesure NR2B

confèrent au récepteur une activité relativement élevée mais plus courte.

115

5.3.2.4. Localisation synaptique versus extrasynaptique

et survie ou mort neuronale

Les récepteurs NMDA peuvent être placés en position synaptique ou à l’extérieur de la

synapse, en position périsynaptique ou extrasynaptique. Les récepteurs synaptiques sont

présents dans la densité post-synaptique et sont activés de façon phasique lors d’évènements

synaptiques de faibles fréquences (évoqués, spontanés et libération synaptique indépendante

de potentiels d’actions (Hardingham and Bading, 2010). Les récepteurs extrasynaptiques ne

sont pas activés pendant les évènements synaptiques de faibles fréquences ; ils sont activés de

façon chronique lors d’élévation des taux de glutamate.Les récepteurs extrasynaptiques sont

retrouvés à différentes localisations dont le corps cellulaire, l’arborisation dendritique, le cou

de l’épine dendritique et également adjacent à la densité post-synaptique (ou récepteurs

périsynaptiques) (Hardingham and Bading, 2010). Environ 1/3 des récepteurs

extrasynaptiques localisés sur les dendrites se trouvent à proximité d’un élément glial et

environ la moitié est localisée à côté d’axones. La fonction attribuée à ces récepteurs NMDA

extrasynaptiques fut tout d’abord de constituer un pool de récepteurs mobilisables en cas de

demande. Cette vision a été reconsidérée sur la base d’observations de mouvements propres

de diffusion de ces récepteurs à la membrane et de leur distribution en clusters liée à la

présence dans le domaine extrasynaptique, de protéines d’échafaudage comme la GAIP-

interacting protein, C terminus (Groc and Choquet, 2006; Yi et al., 2007).

La localisation extrasynaptique versus synaptique des récepteurs NMDA pourrait rendre

compte du paradoxe entre les effets toxiques attribués à leur activation excesssive (Choi,

1992; Doble, 1999) et leur implication dans la survie de plusieurs populations neuronales

(Ikonomidou and Turski, 2002; Hetman and Kharebava, 2006; Hardingham, 2006) : les

récepteurs NMDA synaptiques auraient un rôle neuroprotecteur alors que les récepteurs

NMDA extrasynaptiques activeraient préférentiellement des voies de mort cellulaire

(Hardingham et al., 2002). Ainsi, la survie des neurones ne serait pas déterminée uniquement

par l’intensité de l’activation globale des récepteurs NMDA mais également par la proportion

de récepteurs synaptiques et extrasynaptiques activés. Même lorsque des quantités

équivalentes de Ca2+ passent à travers des récepteurs NMDA synaptiques ou

extrasynaptiques, les voies déclenchées en aval sont différentes (Hardingham et al., 2002). En

plus de ne pas être toxique pour les neurones, le flux calcique provoqué par l’activation des

116

récepteurs NMDA synaptiques peut induire l’expression de gènes de survie ou inhiber

l’expression de gènes pro-apoptotique, pouvant conduire à une neuroprotection

neuroprotection de longue durée en comparaison avec la cinétique d'activation du récepteur et

des voies de signalisation associées (Papadia et al., 2005). Au contraire, des flux calciques

comparables induits par l’activation de récepteurs NMDA extrasynaptiques conduisent à un

dysfonctionnement mitochondrial et une mort cellulaire (Hardingham et al., 2002;

Hardingham and Bading, 2010). Dans des conditions chroniques d’activation des récepteurs

NMDA, l'équilibre entre l’activité des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptiques est

importante (Okamoto et al., 2009) et influence le point à partir duquel une dose de glutamate

devient toxique (Soriano et al., 2006). Ceci est remis en considération par une étude récente

montrant que l’activation des récepteurs NMDA synaptiques peut également provoquer des

dommages exitotoxiques notamment en conditions hypoxiques (Wroge et al., 2012).

Effets opposés des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptiques sur l’activation de

voies de survie (Figure 38 A)

L’entrée de Ca2+ consécutive à l’activation des récepteurs NMDA synaptique conduit à

l’activation de la CREB par plusieurs voies. Les gènes activés par la voie CREB sont des

gènes important pour la survie neuronale comme le BDNF par exemple (Hardingham et al.,

2002). L’activation de la voie CREB nécessite la phosphorylation de CREB afin de recruter

son co-activateur CBP (CREB binding protein) (Chrivia et al., 1993; Kwok et al., 1994).

Cette phosphorylation peut être induite la voie CaM (Ca2+/calmoduline dependent protein)

kinase IV ou par la voie ERK1/2 qui sont toutes les deux activées par l’activation des

récepteurs NMDA synaptiques (Hardingham et al., 2001; Wu et al., 2001). De plus, l’entrée

de Ca2+ provoquée par l’activation de ces récepteurs provoque la déphosphorylation de

TORC (transducer of regulated CREB activity) au travers de la calcineurine ce qui provoque

la translocation nucéaire de TORC représentant une étape clef de l’activation de CREB

(Screaton et al., 2004; Kovacs et al., 2007). A l’inverse l’activation des récepteurs

extrasynaptiques supprime l’activité de la voie CREB au travers de l’inactivation de la voie

ERK1/2 et de la translocation nucléaire de jacob (juxtasynaptic attractor of caldendrin on

dendritic boutons protein) (Hardingham et al., 2002; Ivanov et al., 2006; Leveille et al., 2008;

Dieterich et al., 2008). Par ce biais, jacob joue un rôle central dans les effets toxiques de

l’activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques (Dieterich et al., 2008).

117

Figure 38. Effets opposés de la signalisation mise en jeu par les récepteurs NMDA synaptiques et

extrasynaptiques sur l’expression de gènes. Effets au travers de la voieCREB (A) et de la voie FOXO (B).

(A) Alors que l’activation des récepteurs NMDA synaptique contribue à activer la voie CREB via notamment

l’activation de ERK1/β, l’activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques conduit à un effet opposé via l’inhibition de ERK1/β et l’activation de jacob. (B) L’activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques provoque la translocation de FOXO vers le noyau et son activation, conduisant à des voies de mort cellulaire,

alors que l’activation des récepteurs NMDA synaptique conduit à un effet opposé (Issu de : Hardingham and

Bading, 2010).

Effets opposés des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptiques sur les voies pro-

apoptotiques (Figure 38 B)

L’activation des récepteurs NMDA synaptiques conduit également à supprimer l’expression

de gènes pro-apoptotiques comme Puma (Lau and Bading, 2009; Leveille et al., 2010).

L’expression de Puma est suffisante pour induire la mort cellulaire et nécessaire pour induire

une mort apoptotique après blocage des récepteurs NMDA (Leveille et al., 2010).

L’activation des récepteurs NMDA synaptiques conduit également à l’activation de la voie

Pi3K/Akt, qui conduit à la phosphorylation et la sortie du noyau du facteur de transcription

Forkhead box O (FOXO). Ce facteur de transcription a comme cible des gènes importants

impliqués dans les voies de mort cellulaires (Fasl, Noxa…) (Papadia et al., 2008; Al-Mubarak

et al., 2009). A l’inverse, l’activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques, induit une

localisation nucléaire de FOXO, ce qui contribue à la mort cellulaire par excitotoxicité via

l’activation de ses gènes cibles (Dick and Bading, 2010). Un autre facteur de transcription

pro-apoptotique régulé négativement par l’activation des récepteurs NMDA synaptique est

p53 (Lau and Bading, 2009).

118

Effets protecteurs de l’activation des récepteurs NMDA synaptique contre les

dommages oxydatifs :

Le bloquage des récepteurs NMDA in vivo provoque une mort neuronale associée à la

carbonylation de certaines protéines, ce qui est un indicateur de stress oxydatif. L’activité des

récepteurs NMDA synaptiques contrôle la vulnérabilité neuronale à la mort provoquée par un

stress oxydatif in vitro (Papadia et al., 2008) au travers du système thioredoxine-

peroxyredoxine (Figure 39). En particulier, l’activité des récepteurs NMDA synaptiques

augmente l’activité des thioredoxines et facilite la réduction des peroxyredoxines

hyperoxydée, qui sont des enzymes antioxydantes très importantes. Ceci est dû à l’inhibition

transcriptionnelle du gène cible de FOXO, thioredoxin-interacting protein (Txnip), et

l’activation transcriptionnelle de deux gènes sulfiredoxine 1 homologue (Srxn1) et sestrin 2

(Sesn2). Néanmoins, les changements d’expression géniques ne semblent pas sous-tendre

l’ensemble des effets antioxydants de l’activation des récepteurs NMDA synaptique, ainsi il

serait possible que d’autres systèmes soient également contrôlé par ces récepteurs comme le

GSH par exemple (Hardingham and Bading, 2010) (Figure 39).

119

Figure 39. Voies de signalisation neuroprotectrices activées par les récepteurs NMDA synaptiques. Des

changements incluant une régulation positive de gènes protecteurs (antiapoptotiques, pro-survie, gènes impliqués

dans les défenses antioxydantes) et l’inhibition de gènes impliqués dans la mort neuronale sont observés après activation des récepteurs NMDA synaptiques. Ces changements réduisent le potentiel apoptotique du neurone,

augmentent les défenses contre les dommages antioxydantes (vert foncé), excitotoxiques (rouge clair),

empêchant ainsi la mort cellulaire apoptotique (rouge foncé) et non-apoptotique ainsi que des

dysfonctionnements cellulaires (gris) (Issu de Hardingham and Bading, 2010).

Activation des calpaines par l’activation des récepteurs NMDA extrasynaptiques :

En plus des actions précédemment décrites, l’activation des récepteurs NMDA

extrasynaptiques provoque une forte activation des calpaines (Xu et al., 2009) (Figure 40).

L’activation de ces calpaines provoque notamment le clivage de l’enzyme STEP (striatal

enriched tyrosine phosphatase). Celle-ci n’est plus capable d’interagir avec ses substrats

comme la p38 MAP kinase qui est normalement régulé négativement par STEP. p38 MAP

kinase est fortement représentée au niveau des membrane en extrasynaptique et son activation

contribue à la mort neuronale provoquée des expositions chroniques au NMDA ou au

glutamate (Kawasaki et al., 1997; Soriano et al., 2008; Xu et al., 2009). Cette voie est très

importante, en effet, l’inhibition du clivage de STEP par les calpaines est suffisante pour

120

protéger les neurones de la toxicité du glutamate et d’une déprivation en oxygène-glucose (Xu

et al., 2009)

Figure 40. Activateurs et effecteurs des récepteurs

NMDA extrasynaptiques. L’ischémie induit une activation des récepteurs NMDA extrasynaptique au

travers de l’inversion du fonctionnement des transporteurs du glutamate et de la DAPK (death

associated protein kinase). Ces récepteurs sont

également activés dans un modèle mutant souris de la

maladie d’huntington (mtHTT). L’activation des récepteurs NMDA extrasynaptique va conduire en

l’activation de plusieurs voies responsables de la mort cellulaire (Issu de Hardingham and Bading, 2010).

121

VI. TRANSPORT A HAUTE AFFINITE DU GLUTAMATE

DANS LE SNC

L’étendue de l’activation des récepteurs du glutamate présents sur la surface des cellules

dépend de la concentration extracellulaire de glutamate. Il est essentiel que la concentration

extracellulaire de glutamate soit régulée et maintenue à des niveaux faibles (<1 µM).

Premièrement, pour garder un rapport signal/bruit (bruit de fond) élevé au niveau de la

transmission synaptique et extrasynaptique. Deuxièmement, l’activation excessive des

récepteurs glutamatergiques est toxique : de ce fait, le glutamate à haute concentration est

excitotoxique. Troisièmement, pour des raisons « économiques »:il est important que le

glutamate libéré soit conservé et recyclé.

Hormis la diffusion passive du glutamate hors de la synapse, le mécanisme le plus important

pour l’élimination du glutamate de la fente synaptique estsa recapture par des

transporteursmembranaires à haute affinité, dont le fonctionnement dépend des gradients

ioniques et notamment sodiques. Ce système de transport est présent à la fois dans les cellules

gliales et neuronales, il n’est pas spécifique du glutamate puisqu’il transporte aussi bien

l’aspartate que d’autres acides aminés excitateurs. C’est pourquoi ces protéines sont

dénommées transporteurs des AAE (EAAT) (Danbolt, 2001). Le transport du glutamate par

ces protéines membranaires est un processus électrogénique qui utilise comme force motrice

le gradient électrochimique du sodium et du potassium.

Il existe également un système de transport à faible affinité (Km>500µM) qui serait chargé

d’éliminer de très hautes concentrations de glutamate, et serait donc plutôt utile pour fournir

aux cellules des acides aminés à des fins métaboliques. Il serait de plus indépendant du

gradient sodique et sa spécificité pour le glutamate reste controversée. Ce système reste

encore faiblement caractérisé et ne sera pas traité dans ce manuscrit.

122

6.1. La famille des transporteurs du glutamate

Les transporteurs du glutamate font partie d’une famille de gènes (SLC1 pour solute carrier

family 1) différente de la famille des transporteurs des neurotransmetteurs tels que le GABA,

la glycine, la sérotonine, la noradrénaline et la DA,ou de la choline (Danbolt, 2001). Cinq

protéines différentes des transporteurs à haute affinité du glutamate présents dans le SNC ont

été caractérisés et leurs gènes clonés. En effet, GLAST (pour glutamate-aspartate transporter)

(Storck et al., 1992) et GLT1 (pour glutamate transporter 1) (Pines et al., 1992) ont été clonés

indépendamment à partir du cerveau de rats, EAAC1 (pour excitatory amino acid carrier 1) à

partir de l’intestin de lapin (Kanai and Hediger, 1992) et EAAT4 (Fairman et al., 1995) et

EAAT5 (Arriza et al., 1997) à partir du cerveau humain. Les homologues humains de

GLAST, GLT1 et EAAC1 sont respectivement appelés EAAT1, EAAT2 et EAAT3.

Les séquences de ces cinq types de transporteurs présentent une forte homologie entre

elles allant de 35 à 65% avec, pour le même transporteur, un degré de conservation entre

espèces très important. Ces séquences présentent également une forte homologie (30-40%)

avec les transporteurs d’acides aminés neutres ASCT1 et ASCT2 (pour alanine-serine-

cystéine transporter). Depuis, les homologues des cinq transporteurs ont été isolés à partir de

différentes espèces. Chez les mammifères, les protéines correspondantes sont identiques à

90% (Danbolt, 2001).

L’affinité des différents sous-types de transporteurs du glutamate ayant été déterminée dans

des systèmes d’expression variables, les valeurs de Km proposées peuvent parfois varier d’un

coefficient loin d’être négligeable. Néanmoins, suivant les préparations, on peut constater que

les valeurs de Km de GLAST, GLT1 et EAAC1 sont toujours proches les unes des autres :

pour leurs homologues humains EAAT1, EAAT2, EAAT3 exprimés dans des cellules COS-7

ont respectivement été mesurées des valeurs de Km de 97, 48 et 62 µM (Arriza et al., 1994) ;

exprimés dans des ovocyes de Xénope, les Km respectifs sont de 18, 20 et 28-30 µM (Arriza

et al., 1994; Kanai et al., 1994). Pour GLAST et GLT1 de rat et EAAC1 de lapin, des Km de

11, 17 et 1β µM ont respectivement été déterminés dans des sytèmes d’expression d’ovocytes

de Xénope ou de cellules CHO (Kanai and Hediger, 1992; Klockner et al., 1993; Levy et al.,

1998). Pour EAAT4 humain et EAAT4 de rat exprimés dans des ovocytes de Xénope, des

Km de 3,3 et 1,3 µM ont respectivement été mesurés (Fairman et al., 1995; Lin et al., 1998).

123

6.2. Mécanismes du transport du glutamate

Les transporteurs du glutamate fonctionnent comme des navettes activespermettant

l’accumulation intracellulaire de glutamate contre son gradient de concentration, en utilisant

comme source d’énergie la force motrice des gradients électrochimiques transmembranaires

des ions sodium etpotassium et des protons (Zerangue and Kavanaugh, 1996; Levy et al.,

1998). Le processus de transport est thermodynamiquement couplé à un mouvement passif

d’ions Na+ et H+ dans le même sens que le glutamate et à un mouvement d’ions K+ dans le

sens opposé (Levy et al., 1998). De ce fait, les ions Na+ sont indispensables pour la liaison et

la fixation de la molécule de glutamate sur le transporteur tandis que les ions K+ sont

nécessaire pour l’accomplissement d’un cycle complet de transport (Kanai and Hediger,

2003). En effet le transport de glutamate implique dans une première étape la liaison de trois

ions Na+, du proton H+ et du glutamate, suivie par la translocation du transporteur chargé au

travers de la membrane plasmique et la libération des substrats à l’intérieur de la cellule, la

face externe du transporteur étant du côté intracellulaire. Ensuite, la fixation de l’ion K+ pour

sa libération extracellulaire permet la translocation du transporteur au travers de la membrane

plasmique, la face interne du transporteur revenant ainsi du côté intracellulaire (Kanai and

Hediger, 2003). En fait, le cycle de transport (Figure 41) est réversible à chaque étape, ce qui

peut donner naissance à des transports incomplets et à des mécanismes d’échanges (Danbolt,

2001).

Figure 41. Fonctionnement des

transporteurs du glutamate. Dans les

conditions normales, le transport de

glutamate implique le transport de 3

Na+ et 1 H+ avec la molécule de

glutamate suivi de la translocation du

transporteur puis de la libération

intracellulaire des substrats. La fixation

d’1 K+ est indispensable pour la relocation du transporteur (Issue de

Kanai and Hediger, 2003).

124

Le transport du glutamate est donc un processus électrogénique stimulé par un potentiel de

membrane négatif, générant ainsi une charge positive à l’intérieur de la cellule, l’apport

d’énergie étant fourni par les gradients sodiques et potassiques maintenus par la pompe

Na+/K+ ATPasique.

6.3. Activité de canal ionique des transporteurs du glutamate

Il était traditionnellement pensé que les transporteurs et les canaux ioniques étaient des entités

structurellement et fonctionnellement distinctes. En fait, il semble qu’une seule protéine

pourrait jouer à la fois le rôle de transporteur et de canal ionique (Sonders and Amara, 1996;

Kavanaugh, 1998). Plusieurs transporteurs ainsi ont également un rôle de canal ionique qui

est thermodynamiquement découplé de l’activité de transport. De telles activités de canal

ionique ont été observées pour les transporteurs du GABA, de la DA, de la noradrénaline, de

la proline et de la sérotonine (Mager et al., 1993; Cammack et al., 1994; Mager et al., 1994;

Cammack and Schwartz, 1996; Galli et al., 1996; Galli et al., 1997; Sonders et al., 1997; Cao

et al., 1998; Galli et al., 1999; Ingram and Amara, 2000).

La caractérisation des activités et des propriétés de canaux ioniques des transporteurs de

glutamate est née à partir de travaux sur des cellules photoréceptrices de salamandre. Dans

ces cellules, le glutamate semble activer une conductance chlore dépendante de la

concentration extracellulaire en Na+ (Sarantis et al., 1988). Ce courant pourrait être expliqué

par le fait que les transporteurs du glutamate peuvent fonctionner comme des canaux

anioniques (Fairman and Amara, 1999; Seal and Amara, 1999) dont l’amplitude et le flux

sont supposés être thermodynamiquement indépendants du processus de transport du

glutamate (Arriza et al., 1997). En ce qui concerne le fonctionnement des transporteurs du

glutamate en tant que canaux chlore, l’activation de ce type de courant nécessite la fixation de

sodium et de glutamate (Fairman et al., 1995; Wadiche et al., 1995). Cependant, le transport

de glutamate a parfaitement lieu en son absence et son efficacité ne dépend pas de la

concentration de ces anions. Pourtant cette conductance au chlore n’est pas totalement inerte

puisque la présence de ces anions dans le canal des transporteurs ralentirait le transport de

glutamate en altérant les changements conformationnels nécessaires à la transition de

positionnement membranaire ‘face externe / face interne’ du transporteur (Auger and Attwell,

125

2000). La proportion relative de courant généré par le transport de glutamate et par la

conductance chlore varie considérablement d'un transporteur à l'autre. Le courant anionique

ne représente qu'une faible composante du courant total pour EAAT1, EAAT2, and EAAT3,

alors qu'il est particulièrement important pour EAAT4 and EAAT5. Ces propriétés avaient

suggéré que certains EAATs joueraient un rôle de transporteur de glutamate alors que d'autres

(EAAT4/5) jouerait un rôle de canal anionique dépendant du glutamate impliqué dans la

régulation de l'excitabilité cellulaire. Il a été montré que ces proportions de courant distinctes

seraient entièrement dues à des différences de taux de transport de glutamate et non à des

modifications de conductance unitaire au chlore (Torres-Salazar and Fahlke, 2007). Le

courant Cl- pourrait limiter la dépolarisation locale produite par le transport de glutamate et

maintenir ainsi le gradient électrochimique nécessaire à la clairance du glutamate. Une

conductance H+ dépendante de la fixation du glutamate et activée par l’acide arachidonique a

également été mise en évidence pour EAAT4 (Fairman et al., 1998).

Il semblerait que les deux fonctions des EAATs, translocation du glutamate et fonction de

canal chlore (Figure 42) mettraient en jeu des domaines transmembranaires différents mais

proches (Ryan and Vandenberg, 2005).

Figure 42. Fonction de transporteur de glutamate et de canal

chlore des EAATs. Ce shéma illustre la stoechiométrie du

transport du glutamate: la capture d’une molécule de glutamate s’accompagne d’un influx de γ Na+, 1H+ et d’un efflux d’un K+. De plus les EAATs possèdent une conductance anionique au

Cl-, provoquant un influx de chlore en conditions physiologiques

(Issue de (Jiang and Amara, 2011)).

6.4. Structure des transporteurs du glutamate

Les EAATs contiennent entre 500 et 600 acides aminés. La structure primaire des différents

transporteurs présente un degré de similarité très important. Les modèles initiaux de structure

des transporteurs du glutamate des mammifères proposaient trois modèles de topologies

126

différentes avec 10, 8 et 6 domaines transmembranaires putatifs (Storck et al., 1992; Pines et

al., 1992; Kanai and Hediger, 1992). Ensuite, les hypothèses se sont resserrées autour de deux

modèles de 10 ou 8 domaines transmembranaires (Danbolt, 2001). Dans ces modèles il existe

aujourd’hui un consensus établi sur les six premiers domaines transmembranaires (organisés

en hélices α), sur la boucle extracellulaire entre les 3ème et 4ème domaines transmembranaires,

et sur la position intracellulaire des extrémités N- et C- terminales (Danbolt et al., 1998). De

plus, le modèle à κ domaines transmembranaires (Figure 4γ) n’est pas très éloigné de celui à

10 domaines transmembranaires, puisqu’il comprendrait deux autres domaines partiellement

transmembraires. Néanmoins, la nature exacte de ces deux domaines pseudo-

transmembranaires est elle-même encore débattue notamment entre les équipe étudiant plutôt

GLAST et celles étudiant plutôt GLT1 (Danbolt, 2001).

Figure 43 : Topologie transmembranaire des EAATs. (Issue de : Kanai and Hediger., 2003)

Enfin, il a été montré, in vivo et in vitro, que les transporteurs du glutamate forment des

multimères où les sous-unités sont liées de façon non covalente (Haugeto et al., 1996). Ceci a

été observé après des expériences de cristallographie par rayons X, de la microscopie

électronique, du FRET, « chemical crosslinking »… indiquant une structure quaternaire

vraisemblablement trimérique (Haugeto et al., 1996; Yernool et al., 2004; Gendreau et al.,

2004). Des travaux menés principalement en microscopie électronique ont suggéré

127

l’association en pentamère pour le transporteur EAAC1/EAATγ (Eskandari et al., 2000) mais

ces observations contradictoires avec le reste de la littérature sont attribuées à la technique

utilisée qui est utilisable pour des protéines avec un nombre de domaines transmembranaire

bien défini ce qui n’est pas le cas des trasporteurs du glutamate. Même si les sous-unités sont

associées en multimères, chacune peut fonctionner indépendamment pour le transport (Koch

and Larsson, 2005). Même s’il a longtemps été proposé que l’association concernait trois

mêmes sous-unités, en homotrimère, des récents travaux démontrent que ce n’est pas toujours

le cas et que des hétérotrimères peuvent également exister (Peacey et al., 2009; Nothmann et

al., 2011). Notamment, l’étude de Nothmann et al., β011, démontre que EAAT3 et EAAT4,

mais pas EAAT1 et EAAT2 ni EAAT2 et EAAT3, peuvent s’assembler en hétérotrimères.

L’association en multimères favoriserait le passage de molécules chargées comme le Na+ ou

le glutamate (chargé négativement) (Koch and Larsson, 2005). Une étude récente a par

ailleurs montré que la cavité centrale formée par l'association homotrimérique pour EAAT3

augmenterait l'activité de capture en limitant la diffusion du ligand (Leary et al., 2011).

6.5. Expression des transporteurs du glutamate

6.5.1. Expression de GLT1/EAAT2

Le transporteur GLT1 est quantitativement le transporteur majoritaire du cerveau antérieur

(Figure 44). Plus précisément, GLT1 est présent dans la quasi-totalité du SNC des

mammifères excepté certaines régions telles que le cervelet, les organes circumventriculaires,

la rétine et l’oreille interne, dans lesquelles le transporteur GLAST (EAAT1) est hautement

exprimé (Danbolt, 2001). L’expression du transporteur est faible à la naissance, elle augmente

de manière significative pendant la deuxième semaine postnatale et continue d’augmenter

massivement et rapidement pour atteindre son niveau d’expression adulte dès Pβ6 dans le

cerveau humain (Furuta et al., 1997). Sur le plan cellulaire, le transporteur est exprimé dans

plusieurs populations neuronales durant le développement, notamment dans la moelle épinière

et dans les cellules de Purkinje (Danbolt, 2001). Cette expression est cependant transitoire et

disparait lors de la maturation neuronale. Dans le cerveau adulte, GLT1 est exprimé par les

astrocytes, à l’exception de la rétine où il est uniquement exprimé par les cellules bipolaires et

les photorécepteurs. GLT1 estgénéralement exprimés par les mêmes astrocytes,

128

protoplasmiques et fibreux, aussi bien au niveau du corps cellulaire que des prolongements

(dans des proportions différentes) (Danbolt, 2001). La notion de localisation exclusivement

astrocytaire de GLT1 dans le cerveau adulte est encore débattue. Plusieurs études ont montré

que les ARNm de GLT1 sont également localisés dans les neurones notamment dans

l’hippocampe ou le néocortex (Berger and Hediger, 1998), sans association avec l’expression

de la protéine. De plus, des travaux rapportent que les neurones peuvent exprimer GLT1 en

conditions pathologiques comme dans des situations d’hypoxie-anémie ou dans des modèles

de dépendance à la morphine (Martin et al., 1997; Xu et al., 2003). De plus, l’hypothèse de

GLT1 comme transporteur présynaptique a été rapportée dans une étude où les auteurs ont

montré une expression faible du transporteur par les terminaisons glutamatergiques

hippocampiques adulte (Chen et al., 2004).

6.5.2. Expression de GLAST/EAAT1

Le transporteur du glutamate GLAST est exprimé dans toutes les régions du SNC, mais à des

niveaux variables (Figure 44). GLAST est le transporteur du glutamate le plus abondant dans

le cervelet où la plus forte expression est détectée dans la glie de Bergmann (Danbolt, 2001).

Jusqu’à la naissance, le niveau d’expression de la protéine est très faible dans le cerveau et la

moelle épinière, puis augmente de façon progressive avec la maturation au niveau du cervelet

et du cerveau antérieur (Furuta et al., 1997). La protéine est également présente à des taux

élevés dans l’hippocampe, le BO, le cortex cérébral et le striatum. Plusieurs études ont montré

que GLAST est exprimé par les astrocytes et les cellules de Müller de la rétine (Danbolt,

2001). L’expression de GLAST a également été détectée sur les progéniteurs gliaux

(Maragakis et al., 2004) et dans la glie radiaire pendant le développement (Danbolt, 2001).

GLAST est localisé à la fois au niveau des corps cellulaires et des prolongements

astrocytaires. Cependant, des variations de l’intensité de marquage sont observées aussi bien

pour GLAST que pour GLT1, indiquant que la densité en protéine est plus élevée sur les

membranes astrocytaires faisant face au neuropile que sur celles faisant face à l’endothélium

ou aux corps cellulaires (Takumi et al., 1997).

129

Figure 44. Immunoréactivité de GLAST (A, E, I, M), GLT-1 (B, F, J, N), EAAC1 (C, G, K, O), et EAAT4

(D, H, L, P) sur des coupes sagittales de rat à E18 (A-D), P1 (E-H), P10 (I-L) et P24 (M-P). Barre d’échelle : 5mm (Issue de : Furuta et al., 1997).

6.5.3. Expression d’EAAC1/EAAT3

Les données concernant l'expression et sa localisation cellulaire de EAAC1 sont limitées,

probablement du fait de ses concentrations dans le cerveau qui semblent être plus faibles que

celles de GLAST et GLT1 (Haugeto et al., 1996) et de sa localisation préférentiellement

cytoplasmique (Conti et al., 1998), rendant le transporteur difficilement détectable. Dans le

cerveau (Figure 44), EAAC1 est fortement présent au niveau de l’hippocampe, du cortex

cérébral, du cervelet et des ganglions de la base (Conti et al., 1998). Au stade embryonnaire,

la protéine EAAC1 est significativement exprimée dans les organes périphériques tels que le

foie, les reins, le cœur et les intestins. Elle est également présente de manière importante dans

la moelle épinière et le cerveau notamment au niveau du néocortex, de l’hippocampe, du

cortex périrhinal, de l’amygdale et du striatum. Le niveau d’expression d’EAAC1 augmente

régulièrement pendant le développement mais de façon moins importante que GLAST ou

GLT1 (Furuta et al., 1997; Holmseth et al., 2012). Les niveaux d’EAAC1 augmentent

légèrement après la naissance et atteignent un pic à P14, avant d’être réduits de moitié durant

130

les six semaines suivantes, suggérant une augmentation transitoire de la demande en EAAC1

durant le début de la période post-natale (Holmseth et al., 2012). Les niveaux d’EAAC1 se

stabilisent ensuite à l’âge adulte. EAAC1 est exprimé dans plusieurs types de

neurones :GABAergiques, glutamatergiques, mais également les neurones cholinergiques et

monoaminergiques (Rothstein et al., 1994; Shashidharan et al., 1997; Coco et al., 1997;

Danbolt et al., 1998; Sepkuty et al., 2002). D’autres études rapportent par contre que le

transporteur EAAC1 n’est pas exprimé dans les axones glutamatergiques des cellules

pyramidales de l’hippocampe, ni dans les neurones granulaires du cervelet (Danbolt, 2001).

Dans les neurones, EAAC1 est présent à la fois à la membrane et dans le cytoplasme et serait

même principalement intracytoplasmique (Conti et al., 1998; Kugler and Schmitt, 1999). Des

expériences d’immunomarquages à haute résolution ont montré qu’EAAC1 est présent dans

l’arborisation dendritique et dans les épines situées autour des zones actives. De manière

intéressante, l’immunoréactivité est plus intense au niveau de la zone péri-synaptique (He et

al., 2000). EAAC1 a également été observé dans les terminaisons présynaptiques de neurones

GABAergiques où il pourrait servir à maintenir les niveaux de GABA en fournissant le

glutamate pour la synthèse de GABA (Sepkuty et al., 2002; Mathews and Diamond, 2003;

Stafford et al., 2010). Ceci suggère qu’EAAC1 est présent de façon importante à la fois dans

les membranes pré et post-synaptiques. Par ailleurs, quelques études ont suggéré que le

transporteur pouvait être exprimé par les oligodendrocytes (Kugler and Schmitt, 1999) et par

quelques astrocytes du cortex (Conti et al., 1998). Ces quelques études sont en désaccord avec

plusieurs autres où EAAC1 n’est détecté que dans le compartiment neuronal (Kanai and

Hediger, 1992; Rothstein et al., 1994; Shashidharan et al., 1997; Coco et al., 1997; Torp et al.,

1997; Holmseth et al., 2005; Holmseth et al., 2012). Notamment, cette dernière étude de

Holmseth et al., en β01β suggère que la détection d’EAAC1 dans des cellules non-neuronales

pourrait être causée par la similarité entre une partie de la séquence d’EAAC1 avec celle de la

tubuline, ce qui peut causer une réaction croisée des anticorps.

131

6.5.4. Expression d’EAAT4

Les cellules de Purkinje de la couche moléculaire du cervelet semblent être les cellules qui

expriment sélectivement le transporteur EAAT4 dans le SNC adulte de rat (Yamada et al.,

1996) (Figure 44) et humain (Inage et al., 1998). La concentration d’EAAT4 est faible dans le

cerveau antérieur, où le transporteur est transitoirement exprimé durant le développement

chez le rat. Au stade postnatal, le niveau d’immunoréactivité augmente pendant la première

semaine au niveau du cervelet. Le transporteur est aussi exprimé mais faiblement dans le

cerveau antérieur et le thalamus. Le niveau d’expression dans le cervelet atteint le niveau

adulte à P24. A ce stade, le transporteur est faiblement exprimé dans le néocortex, le striatum,

l’hippocampe et le thalamus (Furuta et al., 1997). Le transporteur EAAT4 est exprimé au

niveau des membranes plasmiques du compartiment somato-dendritique des cellules de

Purkinje, y compris dans les épines (Yamada et al., 1996). EAAT4 est principalement localisé

en extrasynaptique (Tanaka et al., 1997a) même s’il est également détectable en position

synaptique de façon significative. Par contre son expression semble être exclue des sites péri-

synaptiques. Ainsi, EAAT4 est localisé au niveau des épines dendritiques post-synaptiques,

avec des niveaux d’expression extrêmement élevés au niveau extra-synaptique. Une étude a

également montré la présence d’EAAT4 sur des astrocytes au niveau de la rétine (Ward et al.,

2004).

6.5.5. Expression d’EAAT5

Très peu d’études ont été consacrées à la localisation et l’expression développementale

d’EAAT5. Plusieurs études montrent toutefois une expression au niveau de la rétine dans les

neurones bipolaires et les photorécepteurs ainsi qu’une absence de signal dans le cerveau

(Arriza et al., 1997; Pow and Barnett, 2000; Lee et al., 2012a).

132

6.6. Régulation des transporteurs du glutamate

L’activité du transport du glutamate n’est pas constante. Elle est sujette à régulation à la fois

au cours du développement et à l’âge adulte. La régulation du transport du glutamate

représente un processus fondamental contrôlant l’efficacité de la neurotransmission

glutamatergique. Ce processus peut avoir lieu au travers de changements des niveaux

d’expression des transporteurs, ainsi que de la modulation de leur activité (Gegelashvili and

Schousboe, 1997; Anderson and Swanson, 2000). Plusieurs études ont en effet montré que le

transport du glutamate peut être régulé à presque tous les niveaux, de la synthèse des ARNm à

la synthèse et l’adressage des protéines, en passant par les mécanismes de modulation directe

de l’activité du transport, avec des effets à court et/ou à plus long terme (Danbolt, 2001).

Les séquences des trois principaux transporteurs du glutamate GLT1, GLAST et EAAC1

comportent des sites consensus de phosphorylation par les protéines kinases (PK) A et C

(Storck et al., 1992; Pines et al., 1992; Kanai and Hediger, 1992). Les PK sont impliquées

dans le contrôle du trafic des transporteurs entre le cytoplasme et la membrane plasmique,

ainsi que dans le contrôle de la traduction des transporteurs. Il a été décrit que la

phosphorylation de GLT1 par la PKC augmente sa vitesse de transport de 50%, et que

l’activité de la PKC diminue l’activité de transport de GLAST de 75% sans modification de

son expression à la surface cellulaire (Conradt and Stoffel, 1997). La PKC s’associe

physiquement à GLT1, phosphoryle le transporteur et induit son endocytose. Récemment il a

été montré que l’endocytose de GLT1 suite à la phosphorylation par la PKC dépend de

l’ubiquitinylation du transporteur à la surface cellulaire (Gonzalez-Gonzalez et al., 2008;

Sheldon et al., 2008; Garcia-Tardon et al., 2012). L’activation de la PKC agit également sur le

trasporteur EAAC1 en augmentant à la fois son activité et son expression à la membrane

(Davis et al., 1998; Gonzalez and Robinson, 2004). Par ailleurs, des expériences conduites

dans le laboratoire ont montré que l’inhibition de la PKA ou la PKC diminue l’activité de

transport du glutamate des neurones corticaux en culture (Lortet et al., 1999). Le rôle de ces

PK pourrait donc être de modifier l’activité de transport du glutamate en régulant le trafic des

transporteurs entre le cytoplasme et la membrane plasmique (Gonzalez and Robinson, 2004).

Il a également été montré que l’activation de la PKC induit la formation du complexe

EAAC1-PKCα qui permet la stabilisation d’EAAC1 à la membrane (Gonzalez et al., 2003).

Par ailleurs, des études suggèrent que l’AMPc pourrait jouer un rôle majeur dans la régulation

transcriptionnelle, puisque ce second messager entraînerait une augmentation des taux

133

d’ARNm codant pour GLAST et GLT1 (Schlag et al., 1998), au travers de l’activation de la

PKA et de la voie MAP/ERK kinases (Zelenaia et al., 2000).

Un deuxième mécanisme de régulation du transport du glutamate s’exerce au niveau de la

séquence des transporteurs. Les transporters du glutamate sont inhibés par l’oxydation de

groupements thiols ce qui est en accord avec le fait que la recapture du glutamate est régulée

par l’état d’oxydo-réduction de résidus cystéine dans la séquence du transporteur (Trotti et al.,

1997a; Trotti et al., 1997b). Des conversions de l’état des cystéines entre forme réduite

(groupement sulfhydryls libres) et forme oxydée (pont disulfide) sont accompagnées par des

variations de l’activité de transport : une activité maximale est observée dans l’état réduit et

une activité minimale dans l’état oxydé, qui pourrait être attribué à des conformations plus ou

moins flexible/rigide de la conformation des transporteur (Trotti et al., 1998). Ces

interconversions influencent donc la Vmax du transport mais pas l’affinité apparente pour le

glutamate (Km) ni de la conductance Cl- (Trotti et al., 1997a). L’état d’oxydo-réduction a été

montré inflencer EAAC1, GLT1 et GLAST ; pour l’instant il n’y pas d’informations

disponibles pour EAAT4 et EAAT5.

L’adressage, la localisation et l’activité des transporteurs du glutamate dépendent de protéines

associées aux transporteurs du glutamate ou GTRAP. Parmi ces protéines GTRAP3-18

semble avoir un rôle important dans la régulation du transporteur EAAC1. GTRAP3-18 est

localisée dans le cytoplasme ou la membrane des cellules nerveuses et se lie au transporteur

EAAC1 en interagissant avec son extrémité C-terminale. L’augmentation de l’expression de

GTRAP3-18 provoque une diminution du transport de glutamate par le transporteur EAAC1

en diminuant son affinité pour le glutamate (Km multiplié par 6) (Lin et al., 2001). GTRAP3-

18 régule négativement le transport d’EAAC1 du réticulum endoplasmique vers l’appareil de

golgi (Ruggiero et al., 2008). En accord avec ces données, les souris KO pour le gène

GTRAP3-1κ présentent une augmentation de l’expression d’EAAC1 à la membrane

plasmique, une augmentation du contenu en GSH neuronal et ainsi un effet neuroprotecteur

contre le stress oxydant (Aoyama et al., 2012a).

Plusieurs études notamment menées au laboratoire ont permis de montrer que plusieurs

neurotransmetteurs ont une action régulatrice sur le transport de glutamate comme la DA ou

l’acétylcholine (Kerkerian and Nieoullon, 1983; Kerkerian et al., 1987; Bloc et al., 1995).

Une stimulation électrique du cortex préfrontal chez le rat augmente le transport du glutamate

dans le striatum (Nieoullon et al., 1983) ; à l’inverse, une lésion corticale conduit à une

134

diminution du transport du glutamate de 50% ainsi qu’une diminution de GLAST et de GLT1

dans le striatum de 20-30% (Levy et al., 1995).

De plus, l’activité neuronale influence l’expression des transporteurs gliaux. En effet, des

astrocytes cultivés en l’absence de neurones expriment GLAST ainsi que de très faibles taux

de GLT1. La co-culture astrocytes/neurones augmente l’expression de ces deux

transporteurs ; l’effet des neurones peut être mimé par le traitement des astrocytes avec du

dibutyril AMPc (dbAMPc), un analogue peu métabolisable de l’AMPc (Gegelashvili and

Schousboe, 1997; Swanson et al., 1997; Schlag et al., 1998), suggérant que le mécanisme

intracellulaire des facteurs neuronaux fait intervenir l’AMPc. En retour, l'expression et

activité de EAAC1 dépend de facteurs diffusibles libérés par les astrocytes (Canolle et al.,

2004).

A noter que le LPS, un agent pro-inflammatoire qui a été utilisé pour induire des lésions des

neurones DA, induit une augmentation de l’expression à la membrane de GLT1 et non de

GLAST dans les astrocytes et la microglie, associée aux modifications morphologiques de ces

cellules (O'Shea et al., 2006).

6.7. Rôles des transporteurs du glutamate

La fonction majeure des transporteurs du glutamate est d’assurer l’élimination rapide du

glutamate libéré dans la synapse.En maintenant les taux extracellulaires de glutamate à des

niveaux faibles, aux alentours de 1 µM, les transporteurs du glutamate jouent un rôle

important dans la prévention des effets toxiques du glutamate. De plus, ce mécanisme de

capture permet la modulation de la transmission glutamatergique et le maintien de son aspect

phasique. En effet, le transport du glutamate permet de terminer la transmission synaptique et

évite la désensibilisation des récepteurs des récepteurs du glutamate. Egalement, les

transporteurs semblent jouer un rôle dans la régulation de la neurotransmission. Ils sont

impliqués dans des phénomènes de plasticité synaptique (Pita-Almenar et al., 2012). L’autre

rôle important de ces transporteurs est métabolique. Les transporteurs du glutamate

permettent en effet d’alimenter et d’approvisionner les cellules en glutamate, ce glutamate

pouvant avoir différentes destinées métaboliques telles que la synthèse de glutamine, de

135

GABA, de GSH ou de protéine, ou tout simplement pour être utilisé comme substrat

énergétique.

6.7.1. Rôle des transporteurs dans la transmission

glutamatergique

Le glutamate doit être éliminé de la totalité de l’espace extracellulaire car les récepteurs du

glutamate sont présents sur la plupart des éléments cellulaires (dendrites, terminaisons, corps

cellulaires de même que sur les cellules gliales). Ainsi, la recapture du glutamate est

importante non seulement pour maintenir des concentrations faibles au sein de la synapse

mais également en dehors de la synapse (en extrasynaptique). Ce mécanisme permet la

modulation ainsi que le maintient de l’aspect phasique de la neurotransmission

glutamatergique. De plus, contrairement à d’autres neurotransmetteurs il n’existe pas

d’enzyme extracellulaire capable de métaboliser le glutamate. De ce fait, l’unique moyen

rapide d’élimination du glutamate du milieu extracellulaire est sa recapture cellulaire. La

diffusion simple intervient également dans l’élimination du glutamate synaptique, mais celle-

ci est efficace uniquement pour de très courtes distances (quelques centaines de nanomètres)

(Danbolt, 2001).

Les transporteurs du glutamate jouent un rôle indirect dans la régulation de la transmission

glutamatergique en contrôlant la quantité de glutamate qui pourrait atteindre les récepteurs

présynaptiques (comme les mGluRs du groupe II et III). En acccord avec cette idée, il a été

montré que l’inhibition du transport du glutamate conduit à une diminution de la libération de

glutamate (Maki et al., 1994) et de GABA (Semyanov and Kullmann, 2000).

Les transporteurs du glutamate jouent également un rôle important dans l’élimination du

glutamate synaptique. La durée de présence du glutamate dans la fente synaptique influence la

durée ainsi que la forme de la réponse post synaptique excitatrice (EPSP). Ce rôle des

transporteurs du glutamate est dépendant de l’architecture de la synapse. En effet, plus une

synapse possède un diamètre large plus la diffusion passive du glutamate hors de la synapse

sera longue et plus la présence de transporteurs sera nécessaire à son élimination. La

couverture gliale de la synapse influence également l’importance du processus de diffusion

136

passive vs. élimination par recapture. Lorsque la synapse est totalement entourée d’astroglie,

l’élimination du glutamate synaptique semble être très dépendante du mécanisme de transport.

Les transporteurs du glutamate, en limitant son spillover préviennent d’une activation

excessive des récepteurs du glutamate extrasynaptiques qui ont été largement impliqués dans

des mécanismes néfastes pour les neurones (voir plus haut). En effet, une altération des

transporteurs du glutamate induit une activation anormale des récepteurs extrasynaptiques

pouvant être responsable de la mort neuronale (Gouix et al., 2009; Nie and Weng, 2009).

Les transporteurs astrocytaires jouent un rôle majeur dans l’élimination massive du glutamate.

La diminution de l’expression de GLAST et GLT1 par injection chronique intraventriculaire

d’oligonucléotides anti-sens, conduit à une augmentation de fortes taux de glutamate

extracellulaire dans diverses structures cérébrales (Rothstein et al., 1996). De plus les rats

présentent des neurodégénérescences caractéristiques de processus excitotoxiques. Dans cette

étude, les auteurs montrent que l’injection d’oligonucléotides anti-EAAC1, à l’inverse ne

produit pas d’augmentation significative des taux extracellulaires de glutamate, et seulement

une légère neurotoxicité est observée. Ceci suggère que les transporteurs gliaux accomplissent

la majorité du travail de recapture massive du glutamate, qu’ils sont essentiels pour le

maintien de concentrations faibles de glutamate extracellulaire et pour prévenir de l’effet

toxique du glutamate. En accord avec ces résultats, l’étude des souris KO pour les différents

EAATs montrent une importance prépondérante du transporteur GLT1 dans l’élimination

massive du glutamate libéré. En effet les souris KO pour ce transporteur développent des

lésions hippocampiques et des crises épileptiques létales (Tanaka et al., 1997b). Chez ces

souris, le transport de glutamate cérébral total serait réduit à moins de 5% des capacités

normales (Tanaka et al., 1997b; Maragakis and Rothstein, 2004). Le KO de GLAST ne

provoque pas de changements anatomiques et électrophysiologiques majeurs au niveau du

cervelet comme on aurait pu penser. Néanmoins, les souris présentent des déficits dans le test

du rotarod surtout à vitesses élevées (Watase et al., 1998). Le KO du transporteur EAAC1

provoque en périphérie une aminoacidurie dicarboxylique au niveau rénal mais seulement des

pertes neuronales régionalisées sont observées tardivement et n’impliqueraient pas des

processus excitotoxiques mais plutôt un rôle métabolique de ces transporteurs (Aoyama et al.,

2006).

137

6.7.2. Rôle métabolique

Outre leur role dans l’élimination du glutamate synaptique, les EAATs jouent également un

rôle métabolique important notamment dans la synthèse du GSH.

En effet, les transporteurs du glutamate possèdent une forte affinité pour le glutamate et

l’aspartate, mais également pour la cysteine et/ou cystine (Zerangue and Kavanaugh, 1996;

Hayes et al., 2005) qui est le substrat limitant pour la synthèse de GSH. Les transporteurs

gliaux présentent une affinité plus importante pour la cystine alors qu’EAAC1 transporte

préférentiellement la cystéine directement (Hayes et al., 2005).

Dans les cellules gliales, le glutamate transporté par les EAATs peut soit être utilisé

directement pour la synthèse de GSH ou contribuer au transport de cystéine via sa libération

par le système xc- (Had-Aissouni, 2012). Il a été montré que la synthèse de GSH dans les

cellules de Müller dépend fortement de la capacité des EAATs à transporter le glutamate dans

le compartiment intracellulaire (Reichelt et al., 1997). En accord avec cette étude, les souris

déficientes pour GLAST présentent une déplétion en GSH au niveau des cellules de Müller de

la rétine (Harada et al., 2007). De plus, dans des cultures astrocytaires, le dysfonctionnement

des EAATs provoque une mort astrocytaire, notamment des astrocytes différenciés. Ceci a été

montré en utilisant un inhibiteur substrat des EAATs, le PDC. La mort provoquée par le PDC

n’est pas liée à une augmentation des taux extracellulaires de glutamate mais à une déplétion

intracellulaire en glutamate transporté. En effet, la perte est associée à une déplétion en GSH,

une augmentation des contenu en ROS et peut être prévenue par une molécule antioxydante

comme la NAC, ou par l’addition de glutamate dans le milieu de culture 6h avant le

traitement au PDC (Re et al., 2003; Re et al., 2006). Allant dans le sens d’une toxicité liée à

une déplétion en glutamate intracellulaire plutôt qu’une augmentation des taux

extracellulaires de glutamate, cette perte n’est pas prévenue par des antagonistes

glutamatergiques.

Comme suggéré précédemment, dans les neurones, EAAC1 jouerait un rôle mineur en

comparaison avec les transporteurs gliaux dans la clairance du glutamate extracellulaire.

EAAC1 aurait plutôt un rôle métabolique, en partie car ils représentent la principale voie

d’entrée pour la cystéine dans ces cellules (Nieoullon et al., 2006; Aoyama et al., 2012b).

L’utilisation d’oligonucléotides anti-sens anti-EAAC1 dans les neurones corticaux en culture

a été montré réduire de 30% le transport de cystéine et de 25% les taux intracellulaires de

138

GSH (Himi et al., 2003). Ainsi, les EAATs sont importants pour le maintien des taux de GSH

en approvisionnant les cellules en substrats (glutamate et cyst(é)ine) pour sa synthèse. En

accord avec ce principe, les souris déficientes pour EAAC1 présentent une déplétion en GSH

neuronal, une neurodégénérescence âge-dépendante associée à une augmentation du volume

des ventricules, une atrophie corticale et une diminution du nombre d’axones dans le corps

calleux (Aoyama et al., 2006; Aoyama et al., 2012b). Ces changements sont prévenus par

l’adiministration de la NAC, un dérivé synthétique de la cystéine capable de traverser la

barrière hématoencéphalique, qui peut être transformée en cystéine confirmant qu’EAAC1

contribue à la protection des neurones contre le stress oxydant.

De façon intéressante, ce rôle métabolique d’EAAC1 dans les défenses anti-oxydantes serait

prépondérant dans certaines populations neuronales et notamment pour les neurones DA. En

effet, dans des cultures primaires mésencéphaliques, l’application de PDC provoque une perte

péférentielle des neurones DA en comparaison avec les autres populations neuronales. Ceci

est dû à des mécanismes de mort différents, alors que les neurones non-DA ne sont

vulnérables qu’aux processus excitotoxiques à de fortes doses de PDC, les neurones DA

présentent une déplétion en GSH, et un stress oxydatif qui vulnérabilisent ces neurones aux

processus excitotoxiques. En effet alors que des antioxydants comme la NAC sont capables

de prévenir la mort des neurones DA dans ce modèle, seuls des antagonistes des récepteurs

glutamatergiques peuvent empêcher la perte des neurones non-DA (Nafia et al., 2008). La

vulnérabilité préférentielle des neurones DA aux dysfonctionnements des EAATs à été

confimée sur le modèle de souris KO pour EAAC1 dans lequel les animaux présentent des

dégénérescences des neurones DA mésencéphaliques, associées à une déplétion en GSH ainsi

que des index de stress oxydatif dans ces neurones. La perte de ces neurones chez ces souris

peut être empêchée par traitement chronique avec la NAC (Berman et al., 2011).

En plus de son rôle important dans la synthèse de GSH, le glutamate est également un

précurseur de la synthèse de GABA. Ainsi, l’approvisionnement en glutamate est également

important dans les terminaisons GABA pour la régulation du contenu des vésicules

synaptiques, étant donné que la synthèse de GABA et le remplissage vésiculaire sont

étroitement liés. Les mécanismes contrôlant cet approvisionnement en glutamate ne sont pas

encore totalement découverts, mais ils pourraient au moins en partie impliquer les EAATs

(ainsi que la conversion à partir de la glutamine). Des données électrophysiologiques ont

montré que la capture du glutamate par les transporteurs membranaires situés sur les neurones

GABA de l’hippocampe régule le remplissage vésiculaire ainsi que l’efficacité de la synapse

139

à travers le métabolisme du GABA (Mathews and Diamond, 2003; Hartmann et al., 2008).

Plusieurs découvertes suggèrent qu’EAATγ serait le transporteur principalement impliqué : i)

l’ARNm de ce transporteur est présent dans les terminaisons GABA de l’hippocampe (Berger

and Hediger, 1998; Kugler and Schmitt, 1999), ii) la protéine est présente dans les

terminaisons des neurones inhibiteurs (Rothstein et al., 1994; He et al., 2000) et iii) le knock-

down d’EAATγ chez le rat diminue les taux tissulaires de GABA et altère la synthèse de

GABA (Sepkuty et al., 2002).

6.8. Transporteurs du glutamate et atteintes

neurologiques

Etant donné le rôle critique de la transmission glutamatergique et de l’effet potentiellement

neurotoxique du glutamate, il n’est pas surprenant que le dysfonctionnement des EAATs soit

d’ores et déjà impliqué dans bon nombre de pathologies neurologiques comme dans

l’ischémie cérébrale, les traumas, l’épilepsie, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou la

maladie d'Alzheimer… Plusieurs mécanismes peuvent conduire à un dysfonctionnement des

EAATs comme : des altérations de l’expression, d’épissage des ARNm, une augmentation du

turnover, des altérations de l'adressage à la membrane, des phosphorylations ou clivages

anormaux, une oxydation, une diminution de la capacité de transport ou encore une inversion

du transport (Maragakis and Rothstein, 2004; Benarroch, 2010). Ainsi, un fonctionnement

inversé des EAATs pourrait être responsable des augmentations de glutamate extracellulaire

et contribuer à mort neuronale dans les atteintes ischémiques cérébrales (Danbolt 2001). Une

altération du transport de glutamate et une expression neuronale aberrante d'EAAT1 co-

localisée avec le marqueur tau ont été mises en évidence dans le cerveau de patients atteints

de la maladie d'Alzheimer (Scott et al., 2002; Chen et al., 2011). En outre, l’oxydation du

transporteur GLT1 via le 4-hydroxyphenal (HNE), produit de la péroxydation lipidique, a été

reportée comme mécanisme potentiel de l’inactivation de GLT1 et du dyfonctionnement glial

dans cette maladie (Lauderback et al., 2001). Une diminution de l’activité de transport du

glutamate en cental (Rothstein et al., 1992) et en périphérique (Ferrarese et al., 2001a) ainsi

qu'une réduction importante de l'expression de la protéine GLT1 (Rothstein et al., 1995) dans

le cortex moteur et la moelle épinière ont été rapportées dans la sclérose latérale

140

amyotrophique. A noter que des polymorphismes du transporteur EAAC1 sont associés à la

schizophrénie (Dickel et al., 2006; Horiuchi et al., 2012) et aux troubles obsessionnels

compulsifs (Dickel et al., 2006; Arnold et al., 2006).

Implications dans la MP

Les neurones DA expriment à haut niveau le transporteur neuronal du glutamate EAAC1

(Shashidharan et al., 1997; Plaitakis and Shashidharan, 2000), ainsi que des enzymes de

défense contre le stress oxydant telle que la -glutamylcystéine synthétase (Kang et al., 1997;

Yantiri et al., 2001) et du métabolisme du glutamate telle que la glutamate déshydrogénase

(Shashidharan et al., 1997; Plaitakis and Shashidharan, 2000). Il a été suggéré que

l'expression importante de protéines impliquées dans le transport et le métabolisme du

glutamate pourrait servir des processus biologiques particuliers dans ces cellules et contribuer

à la vulnérabilité préférentielle de ces neurones.

Comme nous venons de le voir dans le chapitre précédent, les EAATs sont non seulement

impliqués dans le maintien des concentrations extracellulaires du glutamate à des niveaux non

cytotoxiques mais également dans l'approvisionnement intracellulaire des précurseurs de la

synthèse de GSH (Danbolt, 2001; Hayes et al., 2005). Ainsi, un dysfonctionnement de ces

transporteurs pourrait constituer un lien entre déplétion en GSH, stress oxydant et

excitotoxicité dans la MP.

Plusieurs mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP peuvent altérer le fonctionnement

des EAATs:

- Les ROS et les produits d'oxydation de la DA inhibent le transport du glutamate

(Trotti et al., 1996; Berman and Hastings, 1997) ;

- le NO peut aussi inverser le fonctionnement des transporteurs gliaux du glutamate et

ainsi augmenter les niveaux extracellulaires de glutamate et engendrer une mort par

excitotoxicité (McNaught and Jenner, 2000) ;

141

- Une depletion en ATP due à un dysfonctionnement mitochondrial entraîne une

altération du fonctionnement de la pompe Na+/K+ ATPase, ce qui va altérer les

gradients ioniques à la base du fonctionnement des EAATs, pouvant ainsi provoquer

une inversion du fonctionnement de ces derniers (Danbolt, 2001) ;

- Les neurones DA de la SNc en condition parkinsonienne reçoivent une stimulation

intense et répétée provenant de terminaisons glutamatergiques hyperactives. Ces

conditions de dépolarisations membranaires sont connues pour favoriser un

fonctionnement inversé des transporteurs du glutamate (Szatkowski et al., 1990;

Grewer et al., 2008).

Cependant, il existe peu d’évidences montrant un dysfonctionnement des EAATs dans la MP

et ces liens sont essentiellement indirects. Alors que le polymorphisme du gène SLC1A2

(codant pour EAAT2) a été associé au tremblement essentiel (Thier et al., 2012), aucun

polymorphisme des EAATs n'a été associé à la MP (Tan et al., 2013). Toutefois, une

réduction de la capture de glutamate a été mesurée dans les plaquettes de patients

parkinsoniens, correlée à la sévérité de la maladie (Ferrarese et al., 2001b). Les neurotoxines

comme le MPTP, la 6-OHDA ou encore la roténone sont toutes capables d’inhiber le

transport du glutamate (Hazell et al., 1997; Di Monte et al., 1999; Yang et al., 2005; Sheldon

and Robinson, 2007; Aoyama et al., 2008). Ainsi, il a été montré que le MPTP pouvait inhiber

de façon réversible la capture du glutamate dans des cultures astrocytaires (Hazell et al.,

1997). Le MPTP pourrait aussi altérer le fonctionnement de EAAC1 au travers de sa nitration

(Aoyama et al., 2008); la nitration est suggérée inactiver EAAC1, étant donné que la capture

de la cystéine est diminuée sur des tranches de mésencéphales après traitement au MPP+.

Dans le modèle MPTP/probenicide, les niveaux de glutamate dans la SN sont augmentés de

façon conséquente alors qu'une translocation d’EAAC1 à la membrane des neurones DA et

une augmentation de l’affinité des EAATs pour leurs substrats sont mis en évidence

(Meredith et al., 2009). Une interprétation possible, est que l'élévation des taux

extracellulaires de glutamate soit liée à une libération du glutamate par les EAATs suite à une

inversion de leur fonctionnement. En effet, des travaux récents du laboratoire ont montré sur

des cultures mésencéphaliques qu'un traitement avec un inhibiteur substrat des EAATs,

mimant le fonctionnement inversé de ces transporteurs, conduit à une élévation de glutamate

extracellulaire et une mort préférentielle des neurones DA par un mécanisme associant

excitotoxicité et stress oxydant. Alors que l’altération du transport du glutamate conduit à une

mort oxydative des astrocytes et une mort uniquement excitotoxique des neurones non-DA, la

mort des neurones DA implique ces deux mécanismes, le stress oxydant réduisant le seuil

142

d'excitotoxicité, pouvant ainsi rendre compte de leur vulnérabilité préférentielle. In vivo,

l’injection d’un inhibiteur substrat des EAATs conduit à une perte dose-dépendante du

marquage TH dans la SNc ainsi que la formation d’aggrégats intracytoplasmique d’α-

synucléine (Nafia et al., 2008) (Figure 45).

Figure 45. L’injection de PDC in vivo cause une perte dose

dépendante des neurones DA marqués avec un anticorps anti-

tyrosine hydroxylase (A). L’injection de 300 nmoles de PDC s’accopagne d’agrégats intracytoplasmiques postitifs à l’α-synucléine

(B) (Issu de Nafia et al., 2008)

De plus, la délétion de EAAC1 (KO) induit une perte âge-dépendante des neurones DA de la

SNc pouvant être prévenue par un antioxydant (N-acetylcystéine) (Berman et al., 2011).

Ainsi, les neurones dopaminergiques présentent une vulnérabilité préférentielle à

l'altération du fonctionnement des EAATs, ce qui conduit à considérer ces transporteurs

comme des acteurs potentiels du processus dégénératif caractérisant la MP, malgré

l'absence d'évidences directes de leur implication dans cette pathologie.

A

B

143

MATERIELS

ET

METHODES

144

145

I. Les Animaux

1.1. Les rats

Les expériences de ce projet ont été conduites sur des rats Wistar-HAN mâles de 6 semaines

(environ 160-1κ0g) à leur livraison (fournisseur Charles River, L’Arbresle) et réalisées en

accord avec la Directive de la Communauté Européenne du 24 novembre 1986

(86/609/CEE). Seuls les enregistrements électrophysiologiques in vitro ont été réalisés sur des

tranches de cerveaux provenant de rats de la même espèce mais âgés de 4 semaines.

Les animaux sont hébergés par quatre dans chaque cage et stabulés dans une animalerie avec

un cycle lumineux de 12h (lumière entre 8h et 20h), une température et humidité contrôlées

(211°C, 605%) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson.

Des lots différents d’animaux ont été utilisés pour conduire les expériences

d’immunocytochimie, d’HIS et de microdialyse, ainsi que les études de neuroprotection et les

enregistrements électrophysiologiques. Dans chaque série expérimentale, un groupe sham

(rats contrôles injectés au NaCl 0,9%) a été conduit en parallèle des groupes d’animaux

injectés au PDC.

1.2. Les souris

Un groupe de quatre souris a été utilisé pour vérifier si le modèle PDC est transposable à une

autre espèce animale que le rat. Ces souris sont issues de la souche C57/BL6 et âgées de 5-6

semaines pour un poids d’environ β0g.

146

II. Chirurgie stéréotaxique et traitements

pharmacologiques

2.1. Injection intranigrale unilatérale de PDC et des

antagonistes des récepteurs NMDA

Le PDC (Tocris Biosciences) a été dissous dans une solution de NaCl 0,9% à une

concentration de 60mM à pH 7. Les animaux sham sont injectés avec le véhicule du PDC

(NaCl 0,9%). Pour les expériences de neuroprotection, le PDC a été co-injecté avec différents

antagonistes des récepteurs NMDA : la mémantine et/ou l’ifenprodil à une concentration de

2mM. Les injections sont réalisées de façon unilatérale dans la SNc gauche, sauf pour les

mesures biochimiques relatives au GSH où le PDC a été injecté en bilatéral.

Avant l’acte chirurgical, les animaux sont anesthésiés par injection intra-péritonéale

d’équitésine (composition : 5.75 g hydrate de chloral + β.65 g MgSO4 dans γκ ml de NaCl

0.9% ; pentobarbital sodique 1.1 g dans 20 ml; 53.5 ml propylène glycol; 13.5 ml éthanol;

injection à 4 ml/kg) et placés dans l’appareil stéréotaxique (David Kopf). Après incision de la

peau, et dégagement des tissus, un trou est pratiqué dans le crâne à l’aide d’une fraise

électrique montée sur un bras de l’appareil stéréotaxique. Un injecteur métallique placé sur un

deuxième bras de l’appareil, est descendu au travers de ce trou jusqu’à atteindre la SNc.

Après γ min d’attente, 5µl de la solution de PDC (associé ou non aux antagonistes NMDA)

ou un volume équivalent de NaCl 0,9% sont injectés par pression à un débit de 1µl/min, à

l’aide d’une seringue Hamilton de 10µl montée sur une pompe motorisée (CMA/100,

Phymep, Paris). L’injecteur est remonté γ min après la fin de l’injection. Les coordonnées

stéréotaxiques utilisées pour atteindre la SNc ont été déterminées à partir de l’atlas

stéréotaxique de De Groot (De Groot, 1959) réalisé pour des rats d’environ β00g, la barre

d’incisives étant placée à +5,0 mm au-dessus du plan interaural: Antéro-postériorité : +2,2

mm ; Latéralité : +/- 2,0 mm ; Dorso-ventral (par rapport au plan interaural) : +3,3 mm

(Figure 46).

Pour les souris, 1 µl d’une solution identique à celle utilisée pour les rats est injectée aux

coordonées : Antéropostériorité : -3 mm ; Latéralité : +1,3 mm ; Dorso-ventral : -4,3 mm (par

147

rapport aux coordonnées du bregma), la barre d’incisive étant placée à -1 mm. L’injection a

été réalisée à un débit de 0,3 µl/min.

Figure 46. Représentation schématique du site d’injection stéréotaxique du PDC entre la SNc et la SNr.

2.2. Implantation des guides de microdialyse

Le guide de microdialyse (CMA/11, Phymep, Paris) est implanté au niveau du striatum dorsal

gauche (ipsilatéral à l’injection de PDC) ou droit (controlatéral à l’injection de PDC) (Figure

47). Les coordonnées stéréotaxiques utilisées pour l’implantation des guides de microdialyse

ont été définies à partir du bregma d’après l’atlas stéréotaxique (Paxinos and Watson, 1998)

avec une barre d’incisives placée à -3,3mm : Antéro-postériorité : +0,7mm ; Latéralité : +/-

2,8mm ; Dorso-ventral (à partir du contact avec la dura) : -2,8mm. Le guide, obstrué par un

mandrin, est fixé sur le crâne à l’aide de ciment dentaire et de γ vis d’ancrage (diamètre de

0,6mm et longueur de 1,βmm) permettant d’assurer le maintien du dispositif sur le crâne de

l’animal. Puis un cylindre en plastique est fixé autour du guide pour le protéger. Après

polymérisation intégrale du ciment dentaire, la plaie est suturée et des soins postopératoires

sont apportés (antiseptique et antalgique) avant que les animaux ne soient replacés dans leurs

cages de stabulation, en groupe afin d’éviter les effets comportementaux (augmentation de

l’anxiété) et cellulaires (diminution de la neurogénèse) dus à l’isolement.

148

Figure 47. Photographie d’un rat Wistar implanté avec un guide de microdialyse dans le striatum. Le guide obstrué par un mandrin (jaune) est protégé par un cylindre en plastique (transparent).

2.3. Traitement à la N-acétylcystéine

L’effet neuroprotecteur potentiel de la NAC a été examiné après traitement oral de 4 jours

consécutifs, débutant le jour de l’injection intranigrale de PDC. La NAC a été dissoute dans

l’eau de boisson à la dose de βmg/mL avec ajustement du pH à environ 7 par ajout de soude

(NaOH). Les animaux témoins reçoivent une eau de boisson classique.

2.4. Injection intrapéritonéale du BrDU

Les animaux reçoivent 4 injections espacées de 2h de BrDU à 90mg/kg (dissous dans une

solution de NaCl 0,9% légèrement chauffée) 30 jours avant le sacrifice (120 jours après

l’injection de PDC).

149

III. Test Comportementaux

3.1. Le test du cylindre

Nous avons utilisé le test du cylindre (Schallert et al., 2000) (Figure 48) afin d’évaluer le

déficit de type akinétique résultant de la perte de neurones DA induite par le PDC qui affecte

l’utilisation des pattes antérieures. Ce déficit se manifeste par une difficulté de l’animal à

utiliser sa patte controlatérale à la lésion dans un modèle d’atteinte unilatérale.

Figure 48. Photographie illustrant un rat placé dans un cylindre et effectuant un double appui.

Dans ce test, les animaux sont placés dans des cylindres en plexiglas® transparents de 20 cm

de diamètre et de 30 cm de hauteur, puis filmés pendant 15 min. Lors de leur comportement

exploratoire, les animaux se redressent sur leurs pattes arrière et s’appuient grâce à leurs

pattes avant sur les parois du cylindre. Des rats témoins vont utiliser de façon équivalente les

pattes droite et gauche, soit en doubles appuis (c’est-à-dire en utilisant les deux

pattes simultanément) dans la majorité des cas (60% des appuis) soit en appui simple avec

l’une ou l’autre patte (40% des appuis) Les rats présentant une lésion DA unilatérale utilisent

majoritairement leur patte ipsilatérale au détriment de leur patte controlatérale seule et des

doubles appuis. Nous avons choisi de présenter les résultats sous la forme d’un score

d’asymétrie : pourcentage d’appuis controlatéraux - pourcentage d’appuis ipsilatéraux, les

150

doubles appuis étant indexés à la fois comme appuis ipsilatéraux et controlatéraux. De ce fait,

le score d’asymétrie sera proche de zéro chez un rat témoin et négatif, du fait de l’akinésie de

la patte controlatérale, chez un animal présentant une lésion DA unilatérale.

3.2. Le test de l’open-field

Dans le test de l’open-field, les animaux sont placés dans une arène carrée de 45x45cm et leur

comportement locomoteur spontané est mesuré pendant 15min (ACTIV-METER-R pour rats,

Bioseb, Vitrolles) grâce à la présence de capteurs de pression sous l’arène. Ce test permet des

mesures de différents paramètres moteurs et non moteurs. Nous intéressant ici aux aspects

moteurs du comportement de l’animal, nous nous sommes focalisés sur la mesure du temps

pendant lequel les animaux sont actifs sur les 15min ainsi que de la distance parcourue

pendant le temps du test. Les résultats sont exprimés en pourcentage du groupe sham.

151

IV. Approches Biochimiques

4.1. La microdialyse intracérébrale chez l’animal éveillé.

4.1.1. Principe

Basée sur le principe de l’osmose, la microdialyse intracérébrale est une technique permettant

le recueil de molécules endogènes présentes dans le milieu extracellulaire de structures

cérébrales. Une membrane semi-perméable est introduite dans la structure d’intérêt et

perfusée à faible débit avec un liquide céphalo-rachidien (LCR) artificiel contenant ou non

des composés pharmacologiques (Figure 49). Les molécules présentes de part et d’autre de la

membrane de dialyse vont diffuser selon leur gradient de concentration, permettant ainsi soit

de recueillir un échantillonnage des molécules présentes dans le milieu extracellulaire, soit, en

dialyse inverse, de libérer dans le tissu un composé déterminé à partir du perfusat. Cette

technique est utilisée notamment pour mesurer les niveaux basaux de neurotransmetteurs dans

le cerveau et les changements induits par l’administration de drogues. Ainsi, couplée à une

technique d’analyse appropriée, la microdialyse permet d’étudier qualitativement et

quantitativement les composés présents dans le milieu extracellulaire de la structure ciblée.

Figure 49. Photographies illustrants un guide de microdialyse obstrué par un mandrin (à gauche) et une

sonde de microdialyse (à droite)

152

4.1.2. Procédure expérimentale et dispositif

Le jour de l’expérimentation, la sonde de microdialyse est rincée pendant 40 min avec du

LCR artificiel avant son insertion intracérébrale. Pour la microdialyse in vivo chez l’animal

éveillée, la sonde de microdialyse est introduite au travers du guide canule préalablement

implanté de sorte que la membrane semi-perméable soit correctement placée dans la structure

d’intérêt. Chaque rat est placé dans un bol cylindrique (60 cm de hauteur et 45 cm de

diamètre) en plexiglas® transparent, sur lequel est fixé une potence (CMA/1β0) équipée d’un

contre balancier. À l’autre extrémité du bras est fixé un connecteur tournant à deux voies

(Instech Laboratories, Plymouth, PA, États Unis) sur lequel est fixé un filin d’entraînement

qui sera accroché à un collier disposé autour du cou de l’animal. Ce système mobile est

destiné à compenser les mouvements et les rotations de l’animal dans le bol et éviter ainsi le

sectionnement des cathéters et/ou le décrochement de la sonde. Un débit constant à l’intérieur

du système de perfusion est assuré par une pompe de microdialyse (CMA/102) à deux voies

équipées de seringues calibrées (1 ml, CMA/100) reliées par des cathéters en ethyl propylène

fluoré à des « switchs » qui permettent de changer de perfusat. Ces expériences de

microdialyse étant conduites sur l’animal éveillé, la longueur du cathéter doit être

considérablement plus élevée que lorsque l’animal est anesthésié. Ceci provoque donc un

volume mort plus important et un délai entre le début de la perfusion et son apparition dans le

tube de dosage qu’il faut prendre en considération. Nous disposons de 4 postes permettant

ainsi de dialyser 4 rats simultanément.

4.1.2.1. Sondes utilisées et rendement

Une illustration des sondes utilisées et de leur guide-canule est présentée dans la Figure 49.

Les sondes utilisées (CMA/11) ont les caractéristiques suivantes :

- La membrane de dialyse en cuprophane a une limite de perméabilité de 20 000 Daltons

- Le diamètre de la partie en inox de la sonde est de 0,38 mm

- Le diamètre de la membrane semi-perméable est de 0,24 mm

- La longueur de la membrane semi-perméable est de 3 mm

153

Le rendement des sondes utilisées ou rapport entre les taux d’une molécule recueillis dans le

dialysat et présentes dans le milieu est déterminé in vitro pour chaque sonde avant et après la

microdialyse, ce qui permet de vérifier leurs propriétés et éventuellement en cas de

différences, d’appliquer un facteur de correction. Dans ce travail nous n’avons pas estimé le

rendement in vivo de la microdialyse, qui dépend non seulement de la composition du liquide

de perfusion et de son débit mais aussi du coefficient de diffusion des molécules dans le tissu,

de sorte que les mesures effectuées représentent des concentrations relatives et non pas

absolues.

4.1.2.2. Liquide de perfusion

La concentration ionique du LCR artificiel doit être la plus proche possible de la composition

du liquide interstitiel cérébral pour ne pas modifier les échanges ioniques, ni le métabolisme

des différents neurotransmetteurs. Nous avons également voulu déterminer la libération des

neurotransmetteurs en réponse à un choc potassique. Dans ce cas le LCR « classique » est

remplacé par un LCR enrichit en potassium (Tableau 1).

Tableau 1. Composition en mM des liquides céphalo-rachidiens classique et enrichis en potassium pour les

expériences de microdialyse

4.1.2.3. Recueil des échantillons

La vitesse de perfusion appliquée au cours des expériences de microdialyse est de 1 µl/min.

Les échantillons sont recueillis manuellement à la sortie de la sonde, toutes les 20 min, dans

un tube de dosage d’HPLC (chromatographie liquide à haute performance) placé sur la

potence. Les deux premières heures suivant la mise en place de la sonde représentent la phase

Composants LCR"classique" LCR"potassium"

NaCl 147mM 52,8mM

CaCl2 2,5mM 2,5mM

KCl 4mM 70mM

154

d’équilibration où aucun échantillon n’est récupéré afin d’éviter les contaminations liées aux

perturbations parenchymateuses causées par l’implantation de la sonde. Cette première phase

permet de stabiliser les taux en molécules recueillies. Les dialysats suivants sont recueillis

toutes les β0 minutes dans des tubes contenant 10 µM d’acide ascorbique et 1 µM

d’homosérine. L’acide ascorbique est ajouté pour la bonne préservation des amines et

notamment de la DA dans les échantillons, et l’homosérine nous sert de standard interne pour

l’analyse en HPLC. Les échantillons sont ensuite rapidement mis dans la glace à l’abri de la

lumière, et, à la fin de l’expérience, dans un congélateur -80°C. Six échantillons sont

recueillis pendant 120 min afin de déterminer les niveaux de base des neurotransmetteurs

dans le striatum. Puis, un choc potassique est réalisé pendant 40 min (2 échantillons) où le

liquide de perfusion LCR « classique » est remplacé par un LCR dit « potassium » enrichit en

KCl. Six autres échantillons sont ensuite recueillis après le retour au LCR « classique »

(Figure 50).

Figure 50. Protocole des expériences de microdialyse

4.2. Mesure des taux extracellulaires de dopamine

Les taux de DA dans les dialysats ont été mesurés par HPLC couplée à une détection

électrochimique. L’HPLC permet la séparation des constituants chimiques de mélanges

complexes. Les constituants de l’échantillon à analyser sont entrainés au travers d’une phase

stationnaire, la colonne de chromatographie, par une phase liquide mobile, le solvant,

traversant la colonne sous haute pression. La séparation des molécules dépend des

155

mécanismes d’échange entre le soluté, la phase mobile et la phase stationnaire. Les propriétés

de chaque molécule (poids moléculaire, polarité, charge ionique) vont conditionner leur temps

d’élution respectif. Au sortir de la colonne, l’identification et le dosage des molécules se fait

par couplage de L’HPLC à un détecteur. Pour la détection de la DA, l’HPLC est couplée à un

détecteur électrochimique, basé sur la coulométrie, qui s’adresse aux molécules dotées de

propriétés oxydo-réductrices ; en effet les catecholamines, composés phénoliques peuvent

s’oxyder en quinones.

Dans nos conditions, les dialysats sont injectés (injecteur Waters 717plus) dans une colonne

de type C-18 (ODS2, 4.6x150 mm ; Waters, Milford, MA, USA) thermostatée à 25°C. La

phase mobile polaire est composée de : acétate de sodium 0.1 M, sulphate d’octyl 0.17 mM,

8% méthanol, EDTA 0.7 mM, pH 4.5. Ce solvant est délivré par une pompe Shimadzu LC-

10ADvp (Kyoto, Japan) à débit constant de 1ml/min. Au sortir de la colonne, les molécules

traversent la cellule électrochimique d’un détecteur Coulochem II, (ESA ; Chelmsford, MA,

USA). Le potentiel des électrodes de référence et de travail est réglé respectivement à -50 mV

et +βκ0 mV. La limite de détection est de β0 fmol ∕ échantillon. Les courants d’oxydation sont

intégrés via un module interface (Waters bus SAT ∕ IN module) et l’acquisition réalisée par le

logiciel WATERS MILLENIUM. L’identification et la quantification des pics sont réalisées

en comparaison avec une solution standard contenant les composés d’intérêt à des

concentrations déterminées.

4.3. Dosages du glutathion et enzymes associées

Préparation des tissus

Pour les dosages biochimiques relatifs au GSH, l’injection de PDC a été effectuée

bilatéralement afin de pouvoir utiliser les deux SNc d’un même animal. Ceci est nécéssaire

pour obtenir une quantité de tissu suffisante pour effectuer les dosages.

Les animaux sont perfusés sous anesthésie (équithésine) avec une solution de PBS (pH 7,4)

contenant 0,16 mg/ml d’héparine et les cerveaux sont ensuite rapidement prélevés. Le

striatum est immédiatement prélevé sur des coupes de tissu frais réalisées en utilisant une

matrice de cerveau de rat. Pour la SNc, les prélévements sont effectués sur coupes de tissu

congelé réalisées au cryostat. Les échantillons collectés sont ensuite pesés et homogénéisés

dans un tampon HEPES à β0 mM (pH 7,β) contenant 1 mM d’EDTA.

156

Les homogénats sont centrifugés à 1600 g pendant 10 min à 4°C. Une partie du surnageant est

utilisée pour déterminer le contenu en protéines, en TBARS (thiobarbituric acid reactive

substances) et l’activité de la -GT. Le reste du surnageant est de nouveau centrifugé à 10000

g pendant 15 min à 4 °C et le surnageant résultant est utilisé pour déterminer les contenus en

GSH ainsi que les activités des autres enzymes impliquées dans le métabolisme du GSH.

Mesure du contenu en protéines

Nous avons utilisé la méthode de Bradford en utilisant le kit « Coomassie Protein Assay »

(Pierce, Rockford, IL, USA) ; la BSA étant utilisée comme standard (Bradford, 1976).

Mesure du contenu en TBARs

La péroxidation lipidique a été mesurée via les TBARs par la méthode développée par

Richard et collaborateurs. (Richard et al., 1992). Brièvement, les échantillons sont incubés

pendant 1 h à λ5 °C dans une solution contenant de l’acide thiobarbiturique à 55,γ6 mM et

7% d’acide perchlorique. La réaction est ensuite arrêtée en plaçant les échantillons dans la

glace. Du butanol-1 est ensuite ajouté afin d’extraire les TBARs. Les phases sont ensuites

séparées par centrifugation (1500 g, 10 min, 4 °C) et le contenu en TBARs est déterminé en

utilisant un lecteur de plaque fluorescent (Fluoroskan Ascent FL ; ex = 5γ0 nm et emm =

590 nm). Des standards contenant du malondialdehyde sont inclus dans chaque mesure, et le

contenu en TBARS est calculé en nmol de malondialdéhyde/mg de protéine.

Mesure du contenu en GSH

Les contenus en GSH total et en GSSG sont mesurés en utilisant un kit « GSH assay kit »

(Cayman Chemical, Spibio, Montigny, France). Les échantillons sont dilués à 1/10 dans du

tampon MES, déprotéinés en ajoutant un volume équivalent d’acide métaphosphorique à 10%

(Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Après 5 min d’incubation à température ambiante, les

échantillons sont centrifugés à 2500 g pendant 2 min et le surnageant est neutralisé par ajout

de triethanolamine (0,β M). Une partie de l’échantillon est traitée avec du 2-vinylpyrididine

(10mM) utilisé pour la derivatisation du GSH et ainsi mesurer seulement le contenu en

GSSG. Le contenu GSH total ainsi que du GSSG est déterminé en mesurant la production de

5-thio-2-nitrobenzoic acid à 405 nm après β5 d’incubation avec les réactifs du kit.

Mesure de l’activité de la γ-GT

L’activité de cette enzyme est déterminée en utilisant le kit « -GT reagent » (Biolabo, Malzy,

France) en mesurant la formation de p-nitroaniline à 405 nm.

157

La -GT, dans un tampon 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol (AMPD), catalyse le transfert

d’un groupe gamma glutamyl du L-gamma-glutamyl-p-nitroanilide (GPNA) vers le

glycylglycine pour former du -glutamylglycylglycine et du p-nitroaniline. Ainsi, la formation

de p-nitroaniline mesurée à 405 nm est proportionnelle à l’activité de la -GT.

Mesure de l’activité de la GCL

L’activité de la GCL est mesurée à γ7 °C avec la méthode de Seelig and Meister (Seelig and

Meister, 1985). Une solution contenant 0,1 M de tampon Tris-HCl, 150 mM de KCl, 5 mM de

Na2ATP, 2 mM de phosphoenolpyruvate, 10 mM de L-glutamate, 10 mM d’α-aminobutyrate,

20 mM de MgCl2, 2 mM de Na2EDTA, 0,2 mM de NADH, 10 IU de pyruvate kinase, 10 IU

de lactate deshydrogénase est ajoutée aux échantillons. L’activité enzymatique est déterminée

en suivant la consommation de NADH à 340 nm.

Mesure de l’activité de la GPx

L’acivité de la GPx est déterminée en utilisant un kit « GPx assay kit » (Cayman Chemical,

Spibio, Montigny, France) en mesurant la consommation de NADH à 340 nm après

incubation avec les réactifs contenus dans le kit.

Mesure de l’activité de la GST

L’activité de la GST est déterminée en utilisant un kit « GST assay kit » (Cayman Chemical,

Spibio, Montigny, France) en mesurant la formation de 1-chloro-2,4-dinitrobenzene à 340 nm

après incubation avec les réactifs contenus dans le kit.

158

V. Approches morphologiques

5.1. Préparation des tissus

5.1.1. Tissus perfusés

L’essentiel des expériences en immunocytochimie a été réalisé sur tissu perfusé. Après une

période de survie post-injection allant de 4 à 120 jpi, les animaux sont anesthésiés et perfusés

en intracardiaque en utilisant une pompe peristaltique assurant un débit de perfusion de 40 à

60 mL/min. Tout d’abord, 50mL d’une solution de NaCl 0,λ% sont perfusés par ce système

afin de « nettoyer » le contenu des vaisseaux sanguins et éviter au maximum la présence

d’hématie. Ensuite les animaux sont perfusés avec une solution de fixation composée de

paraformaldéhyde (PFA) à 4% dans un tampon phosphate (NaH2PO4 / K2HPO4) 0,2M à pH

7,4. La canule de perfusion est placée dans le ventricule gauche et l’aorte descendante est

clampée afin de diriger l’essentiel du liquide de perfusion vers la partie supérieure de

l’animal. L’oreillette droite est ensuite sectionnée afin de faciliter l’évacuation de la solution

de perfusion.

Après ouverture de la boîte crânienne, les cerveaux sont récupérés et recueillis dans un tube

Falcon contenant la solution de fixation de PFA à 4% pour une post-fixation de 24h. Ils sont

ensuite transférés dans une solution de sucrose à 30% pour 2 bains successifs de 48h chacun

afin d’assurer une cryoprotection du tissu perfusé. Les cerveaux sont finalement congelés,

immergés dans de la neige carbonique, puis conservés à -80°C. Des coupes frontales de 50µm

d’épaisseur sont réalisées au cryostat sur l’étendue antéropostérieure de la SNc et du striatum,

récoltées de façon sériée en « free floating », dans un milieu cryoprotectant (pour 400 mL :

0,6βκg de NAHβPO4, β,14g de NaβHPO4, 160 mL d’HβO, 1β0 mL d’éthylène glycol et 120

mL de glycérol), puis conservées à -20°C.

159

5.1.2. Tissus non perfusés

Les expériences d’HIS, le marquage au bleu de toluidine et la combinaison de

l’immunocytochimie et de l’HIS ont été réalisées à partir de tissus non perfusés. Après une

période de survie allant de 4 à 120 jpi, les animaux sont sacrifiés par décapitation. Après

ouverture de la boîte crânienne, les cerveaux sont rapidement récupérés et directement

immergés dans de la neige carbonique puis conservés à -κ0°C jusqu’à la réalisation des

coupes au cryostat. Les sections réalisées sont des coupes frontales de 14 µm d’épaisseur sur

l’étendue antéro-postérieure de la SNc et du striatum. Les coupes sont récupérées directement

sur lames superfrost et conservées à -80°C.

5.2. Marquage au bleu de toluidine

Le bleu de toluidine, ou chlorhydrate de triméthylthionine, est un colorant basique progressif,

qui colore divers éléments cellulaires, en particulier les noyaux. Les lames superfrost

contenant les coupes frontales de 14 µm d’épaisseur au niveau de la SNc sont d’abord

plongées dans un bain de PFA 4% pendant 3 min pour procéder à une légère fixation.

Les coupes passent ensuite dans un bain de PBS 0,1M, puis dans la solution de bleu de

toluidine pendant quelques minutes en fonction du degré de coloration souhaité. Le surplus de

bleu de toluidine est évacué par 2 bains rapides de rinçage dans du PBS 0,1M puis dans de

l’eau distillée. Les coupes sont ensuite déshydratées dans des bains d’alcool successifs de

degré croissant : 70° (5 min), 80° (5 min), 95° (5 min), 100° (2x10 min) et ensuite délipidées

dans deux bains de xylène (2x10 min). Les coupes sont ensuite incluses entre lame et lamelle

à l’aide d’un milieu de montage synthétique : le Depex.

160

5.3. Marquages Immunocytochimiques

5.3.1. Protocoles expérimentaux

L’immunocytochimie permet de détecter sur une coupe histologique une molécule d’intérêt

en utilisant un anticorps spécifique. L’observation du complexe a été ici réalisée par des

méthodes indirectes utilisant des anticorps secondaires dirigés contre les IgG de l’espèce chez

laquelle a été produit l’anticorps primaire. Nous avons utilisé cette approche afin de visualiser

ou quantifier différents marqueurs DA (TH, DAT) des marqueurs gliaux (Iba-1 et GFAP), des

marqueurs des mécanismes pathogéniques (autophagie : MAP1-LC3A ; excitotoxicité :

NR2B-P ; dystrophie axonale : AT8) dans la SNc et/ou le striatum. Concernant la SNc, une

coupe sur trois a été utilisée pour chaque marquage, chaque coupe étant donc séparée de la

suivante de 150 µm. Des doubles marquages ont également été réalisés. Dans le cas de l’étude

de la neurogenèse adulte on a utilisé un marqueur de la prolifération cellulaire, le

Phosphohistone-H3 (PHH3), qui est un marqueur mitotique, sur des coupes frontales de

striatum (contenant la ZSV). Nous avons également utilisé un marqueur de la survie

cellulaire, le Bromodéoxyuridine (BrDU), qui est un nucléoside synthétique analogue de la

thymidine, pouvant être incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé des cellules en cours

de réplication, sur des coupes sagittales de bulbe olfactif.

Le tableau 2 présente la liste des anticorps primaires et secondaires et leurs conditions

d’utilisation.

Au cours du traitement immunohistochimique, toutes les incubations des coupes sont faites

sous agitation modérée, et des rinçages sont effectués à la fin de chaque étape dans 4 bains

successifs de tampon phosphate. A la sortie du milieu antigel et rinçage abondant, les coupes

sont mises en immersion dans β bains de 15 min d’une solution d’H2O2 à 0,3% contenant de

la lysine à 1,κβ7 g/100 mL de PB. La présence d’H2O2 permet d’inactiver les péroxydases

endogènes et la lysine permet de saturer les sites aldéhydiques de la PFA restés libres après la

fixation et qui pourraient lier les anticorps par la suite.

Pour améliorer la spécificité de la fixation de l’anticorps sur les sites antigéniques et saturer

les sites qui pourraient fixer les anticorps de façon non spécifique, les coupes sont incubées

pendant 1 h à température ambiante, avec une solution de PB contenant 5% de BSA et 5% de

sérum normal issu de la même espèce que l’anticorps secondaire. Les coupes sont ensuite

161

incubées la nuit à température ambiante ou deux jours à 4°C avec l’anticorps primaire, puis

pendant βh à température ambiante avec l’anticorps secondaire, différent en fonction du mode

de révélation.

Dans le cas de l’immunomarquage BrDU une étape de dénaturation de l’ADN est nécessaire à

la détection de Bromodéoxyuridine (HCl 2N, 30 min à 37°C).

- Pour un marquage en immunofluorescence, l’anticorps secondaire est directement

couplé à un fluorophore permettant la détection du signal (Alexa 488 ou Alexa 555), dans ce

cas, les coupes une fois montées sur lames gélatinées, sont incluses entre lames et lamelles

avec un milieu de montage pour révélation fluorescente (fluosave, calbiochem).

- Pour un marquage en immunoperoxidase, l’anticorps secondaire est biotinylé et la

détection va se faire par réaction avec un complexe avidine-peroxydase (kit Elite Vectastain

ABC). Le complexe ainsi formé va ensuite être révélé après incubation dans une solution de

γ,γ' diaminobenzidine (0.005%) en présence d’H2O2 (0.001%). Le résultat de la révélation du

complexe peroxydasique est une coloration brun-marron spécifique de la présence de

l'antigène considéré. Après d’abondants rinçages, les coupes sont montées sur des lames

gélatinées puis déshydratées par passages successifs dans des bains d’alcool de degré

croissant : 70° (5 min), 80° (5 min), 95° (5 min), 100° (2x10 min), puis 2 bains successifs de

xylène (2x10 min) pour délipider les sections. Enfin, elles sont montées entre lame et lamelle

dans un milieu de montage synthétique (Depex).

Tableau 2. Liste des anticorps primaires et secondaires utilisés.

162

5.3.2. Quantification de la perte des neurones TH-positifs de

la SNc

L’atteinte neuronale induite par l’injection intranigrale de PDC a été quantifiée par comptage

stéréologique des neurones TH-positifs de la SNc après marquage fluorescent. Les coupes de

SNc effectuées au cryostat étant récupérées de façon sériée, nous pouvons reconstruire

l’intégralité de l’étendue antéro-postérieure de la SNc et effectuer une étude stéréologique.

Une coupe sur trois a été utilisée pour ce marquage TH fluorescent (donc deux coupes

consécutives sont séparées de 150 µm), et la zone d’étude est de 1γ50 µm centrée sur le site

d’injection. Nous avons subdivisé cette zone en trois zones de taille équivalente de 450 µm;

antérieure, péri-injection et postérieure par rapport au site d’injection (Figure 51). La

quantification du nombre de neurones TH-positifs dans l’analyse cinétique s’est effectuée sur

les 1350 µm, alors que dans les expériences de neuroprotection avec les antagonistes des

récepteurs NMDA et le N-acetyl-cysteine, l’analyse porte uniquement sur la région peri-

injection de 450 µm.

Figure 51. Protocole de récupération en sériée des coupes de la SNc et répartition en zones antérieure

(violet) péri-injectée (bleue) et postérieure (orange). A noter que chaqe barre de la même couleur a été utilisée

pour un même marquage immunocytochimique (barres rouges : marquage TH ; barres jaunes : marquages

gliaux ; barres grises : NR2B ou MAP1-LC3A).

L’analyse s’est faite sur un microscope Leica DMR, équipé d’un détecteur de platine, d’une

caméra CCD Sony DXC-λλ0P, d’un adaptateur de caméra Sony CMA-D2 et le logiciel

d’analyse d’image Explora Nova Mercator. Pour chaque coupe, la SNc est délimitée à

l’objectif x10 et le comptage par stéréologie est réalisé à x40. Pour déterminer le nombre total

163

de neurones dans la région analysée, les neurones sont comptés sur des fractions du volume

de la coupe en utilisant un échantillonnage par fractionnateur optique. Ces fractions (aire de

100µmx100µm dans une profondeur de coupe h de 50µm) sont espacés de 300µm. La somme

des cellules comptées sur l’ensemble des coupes est multipliée par le ratio entre le volume

total de la structure et le volume représenté par la somme des fractions.

De plus, nous avons examiné si le volume de la SNc est modifié chez les animaux injectés au

PDC. L’échantillonnage des coupes ayant été réalisé de façon systématique avec des

intervalles équivalents, l’estimation du volume de la région analysée a été réalisée avec le

principe de Cavalieri qui multiplie la somme des surfaces mesurées sur toutes les coupes avec

la distance entre les coupes. Nous avons vérifié que le coefficient d’erreur, qui prend en

compte notamment des variations de l’épaisseur des coupes ou des erreurs d’échantillonnage,

est inférieur à 0.15 (compris entre 0.0079 et 0.0143).

Les résultats sont des moyennes des valeurs obtenues sur les n animaux de chaque groupe

expérimental et sont exprimés en pourcentage des valeurs sham. Les illustrations ont été faites

à l’apotome (AxioImager Z1, Zeiss).

5.3.3. Quantification du marquage DAT

Les effets de l’injection intranigrale de PDC sur les terminaisons DA dans le striatum ont été

analysés par immunomarquage en peroxydase de DAT. La quantification s’est faite sur quatre

coupes par animal réparties dans l’antéro-postériorité du striatum, grâce au système d’analyse

BIOCOM, avec une caméra restituant l’image des sections placées sur un banc optique. Pour

chaque coupe, les niveaux de gris (255) déterminés dans le striatum des 2 côtés du cerveau

sont traduits en densité optique (DO). Les DO des 4 coupes par animal sont moyennées. Les

résultats représentent les moyennes des valeurs obtenues à partir des n animaux pour chaque

groupe et sont exprimés en pourcentage du sham correspondant.

5.3.4. Quantification du marquage NR2B-P

L’immunomarquage en peroxydase de NRβB-P a été réalisée au niveau de la SNc avec un

échantillonnage d’une coupe sur six dans l’étendue antéropostérieure de la structure. La

164

quantification et l’expression des résultats sont réalisées de la même façon que pour le

marquage DAT.

5.3.5. Quantification des marquages Iba-1 et GFAP

La quantification de l’expression des marqueurs gliaux GFAP et Iba-1 a été faite sur un jeu de

9 coupes de SN équidistantes, consécutives aux sections utilisées pour le marquage de la TH.

La DO de la fluorescence des marquages GFAP et Iba-1 est mesurée sur une région

représentant 0,13 mm2 dans la SNc avec le même microscope et la même caméra utilisée

pour la quantification des neurones TH dans la SNc et le logiciel Explora Nova Mercator.

5.3.6. Quantification des cellules BrDU et PHH3.

Au niveau de la ZSV, la quantification du nombre de cellules marquées avec l’anticorps anti

PHHγ s’est faite sur 5 sections par rat avec un échantillonnage d’une coupe sur quatre

réparties dans le striatum médian (entre les coordonnées 9,2 et 10,2 mm par rapport à

l’interaural).

Le nombre de cellules BrDU ont été comptées dans le BO, dans la région des cellules

granulaires sur une surface de 0,278 mm2 sur γ sections par rat avec un échantillonnage d’une

coupe sur trois.

Pour ces deux marquages la quantification s’est réalisée grâce à un microscope Nikkon

eclipse κ0i à l’objectif x40.

5.4. Protocoles d’hybridation in situ radioactive

L’HIS permet de localiser les ARNm d’un gène d’intérêt au sein d’un tissu grâce à

l’utilisation de sondes de séquence complémentaire. Pour cette étude, nous avons utilisé des

sondes oligonucléotidiques radio-marquées pour une analyse quantitative des niveaux

d’expression du gène considéré.

165

5.4.1. Marquage radioactif des sondes oligonucléotidiques

Pour nous, la sonde utilisée est complémentaire de la séquence de l’ARNm codant pour la

tyrosine hydroxylase (TH) afin d’évaluer son niveau d’expression dans les neurones DA de la

SNc. Cette sonde synthétique est un oligonucléotide formé de 44 nucléotides dont la séquence

est la suivante :

5’ TGT CTG GGT CAA AGG CTC GGA CCT CAG GCT CCT CTG ACA GGG AG γ’

La sonde est marquée par ajout à son extrémité γ’ de 35S-dATP (1γ00 Ci/mmol) à l’aide

d’une terminale transférase (Roche). Les sondes radio-marquées sont purifiées sur colonne

absorbante de type mini Quick spin (Roche Diagnostics ; Indianapolis, USA). Une fois

purifiée, l’activité spécifique de la sonde est mesurée dans un compteur à scintillation à partir

d’1 µl de solution (400 000 - 1 000 000 cpm/min).

5.4.1.1. Etape de préhybridation

Toutes les solutions utilisées lors de l’HIS sont traitées au diethyl pyrocarbonate puis

autoclavées afin de détruire les RNAses. Les bains de préhybridation ont pour but, d’une part

de contribuer à une meilleure conservation des tissus (fixation), et d’autre part de réduire le

bruit de fond en saturant les sites de liaison non spécifiques de la sonde avec des protéines,

des polysaccharides ou des acides nucléiques. Cette étape de préhybridation a été effectuée

sous agitation lente et à température ambiante.

Les coupes de tissu sorties du congélateur -80°C sont séchées rapidement sous air froid pour

éviter toute condensation et rangées dans des jars stériles. Elles sont post-fixées 5 min dans un

bain de PFA 3%. Les sections sont ensuite incubées dans un bain contenant 2% de Standard

Saline Citrate (SSC) avant d’être acétylées pendant 10 min dans un bain de triéthano lamine

(0,1M) comprenant 0,β5% d’anhydride acétique puis traitées durant γ0 min dans un bain de

Tris glycine (0,1M). Après déshydratation dans des bains successifs d’une minute dans de

l’éthanol (70°, κ0°, λ5° et 100°), les coupes sont placées au dessicateur pendant au moins 1h.

166

5.4.1.2. Etape d’hybridation

Chaque coupe est recouverte de 16 µl d’une solution d’hybridation (50% de formamide, 10%

de sulfate de dextran, 1X de solution de Denhardt, SSC 4X, 0,β5 mg/ml d’ARNt d’E. Coli et

0,5 mg/ml d’ADN dénaturé de sperme de saumon) contenant la sonde radiomarquée au 35S

(environ 500 000 cpm) et 20 mM de DTT. La solution est étalée de façon homogène par

application d’une fine bande de Parafilm. Les lames sont ensuite incubées à 47°C pendant 1β

à 14 heures dans une chambre humide.

5.4.1.3. Etape de post-hybridation

Les bandes de Parafilm sont retirées par passage des lames dans un bain de SSC 2X froid

(4°C). Les coupes vont ensuite passer par une série de rinçages afin d’éliminer les sondes

fixées de façon aspécifique. Pour optimiser la spécificité de l’hybridation, la stringence du

milieu est augmentée en élevant la température des bains (45°C) et en diminuant la force

ionique. Les coupes sont ensuite déshydratées dans des bains d’éthanol λ5% puis 100% et

laissées au dessiccateur pendant au moins 1h30.

5.4.1.4. Révélation du signal

Un film autoradiographique (Kodak Biomax MR1) est apposé à température ambiante contre

les lames dans une cassette à l’abri de la lumière. Le temps d’exposition est ajusté en fonction

du niveau d’expression de l’ARNm étudié et selon l’activité spécifique relative de la sonde

utilisée. Pour la TH, ce temps est d’environ 1 semaine. Les films sont développés par passage

de γ min dans un bain de révélateur (Kodak D1λ), puis dans de l’eau durant quelques

secondes suivi d’un bain de 10 min de fixateur (Kodak). Pour effectuer une analyse au niveau

cellulaire, les lames sont immergées dans une émulsion photographique liquide (GE

healthcare LM-1) à 4β°C et exposées pendant une semaine environ à 4°C à l’abri de la

lumière. Les lames sont ensuite développées selon le même protocole que celui utilisé pour

les films ; le seul changement étant la température du révélateur qui doit être abaissée à

13,5°C. Les coupes sont ensuite colorées au bleu de toluidine afin de permettre le repérage

des structures anatomiques et de visualiser les éléments neuronaux lors de la quantification.

167

5.4.1.5. Analyse à l’échelle cellulaire

La quantification consiste en la détermination d’un nombre de grain d’argent par cellule. Les

grains d’argent sont quantifiés à l’aide du logiciel Visioscan (BIOCOM) relié à un

microscope équipé d’une lampe à épiluminescence, d’une caméra COHU qui transmet les

images à l’ordinateur équipé du logiciel. Dans ce cas, l’observation des coupes en fond noir

permet de ne visualiser que la lumière réfléchie sur les grains d’argent, le reste de la coupe

étant opaque. Une courbe d’étalonnage est alors construite, en considérant tout d’abord la

valeur de l’intensité lumineuse d’un grain, puis de deux grains d’argent. A la suite de cet

étalonnage, l’appareil va transformer la mesure globale de niveaux de gris d’un neurone

éclairé en épiluminescence en nombre de grains d’argent par cellule. Le nombre de grains

d’argent est déterminé à partir d’un minimum de 50 cellules (présentant au moins 10 grains

d’argent) par hémicoupe, et trois coupes sont quantifiées pour chaque animal. De la valeur

moyenne obtenue, le bruit de fond, évalué sur la même section, est soustrait. Les résultats sont

des moyennes des valeurs déterminées à partir de n animaux par groupe et sont exprimés en

pourcentage du groupe sham.

5.4.2. Hybridation in situ fluorescente de la GAD67

La sonde utilisée est complémentaire de la séquence de l’ARNm codant pour l’isoforme de 67

kDa de la GAD de rat, enzyme de synthèse du GABA. Cette sonde est un oligonucléotide

formé de 43 nucléotides complémentaires des bases 487 à 529. Sa séquence est la suivante :

5’ GGA GCG ATC AAA CGT CTT GCG GAC ATA GTT GAG GAG TAT GTC A γ’

La sonde est ensuite marquée par ajout à son extrémité γ’ d’une queue de dUTP couplés à la

digoxigénine (Dig) à l’aide de l’enzyme terminal transférase. Pour ce faire, la sonde (100

pmol.) est incubée à 37°C pendant 30 min dans un mélange constitué de 6 µl de tampon de

réaction ; 6 µl de chlorure de cobalt (CoCl2) ; 1,5 µl de Dig-dUTP ; 1,5 µl de dATP et 1,5 µl

de terminal transférase. La réaction est arrêtée par ajout d’une solution d’EDTA à 0,βM (pH

8) (Figure 52).

168

5.4.2.1. Etape de préhybridation

Identique à celle de l’HIS radioactive (voir plus haut)

5.4.2.2. Etape d’hybridation

Chaque coupe est recouverte de γ5 µl de solution d’hybridation contenant la sonde marquée

(0,5 à 1 pmol./coupe). La composition de la solution d’hybridation ainsi que la suite de cette

étape sont les même que pour l’HIS radioactive.

5.4.2.3. Etape de posthybridation

Les bains de rinçages dans le SSC sont identiques à ceux de l’HIS radioactive. La différence

se trouve après ces bains de rinçages, où les coupes sont mises en présence d’une solution de

tampon Tris-NaCl (0,1M ; pH 7,5) contenant l’anticorps anti-Dig (Roche ; 1:500). Elles sont

ensuite incubées dans une solution de tyramide fluorescente (fluoresceine).

Figure 52. Schéma illustrant le protocole de marquage par hybridation in situ fluorescente

169

VI. Analyse statistique

Pour le comptage des neurones exprimant l’ARNm de la GAD67 ou de la TH, ainsi que les

expériences de comptages des neurones immunopositifs pour la TH ou marqués au bleu de

toluidine dans la SNc totale, l’analyse statistique a été faite en utilisant une analyse de

variance à un facteur contrôlé (one-way ANOVA) suivi par le test post-hoc Newman-Keuls

comme test de comparaisons multiples.

Pour les analyses régionales des pertes neuronales dans la SNc ainsi que les études

comportementales, l’analyse statistique a été faite en utilisant une analyse de variance à deux

facteurs (two-way ANOVA) suivi par le test post-hoc de Bonferroni comme test de

comparaisons multiples.

Pour l’analyse de l’immunomarquage NRβB ainsi que des réactivités gliales, l’analyse

statistique a été faite en utilisant le test t de Student non-apparié.

Pour les mesures des activités enzymatiques, l’analyse statistique a été faite en utilisant soit le

test t de Student non-apparié soit le test de Mann Whitney.

Dans tous les cas, les différences sont considérées comme significatives lorsque p<0,05.

170

VII. Approche électrophysiologique

Les rats utilisés pour cette étude sont des rats Wistar naïfs âgés de 4 semaines. Après le

sacrifice, le cerveau est rapidement récupéré et des coupes coronales de β50 µM d’épaisseur

au niveau de la SN sont réalisées à l’aide d’un vibratome (Leica VT 1000S) dans une solution

glacée contenant (en mM) : 110 de choline, 2,5 de KCl, 1,25 de NaH2PO4, 7 de MgCl2, 0,5 de

CaCl2, 25 de NaHCO3, 7 de glucose avec un pH de 7,4. La solution est « bullée » avec 95%

d’O2 et 5% de CO2. Les tranches sont ensuite conservées dans une solution « bullée » de LCR

artificiel à température ambiante contenant (en mM) : 126 de NaCl, 2,5 de KCl, 1,2 de MgCl2,

1,2 de NaH2PO4, 2,4 de CaCl2, 11 de glucose avec un pH de 7,4 composée également de 250

µM d’acide kynurénique et 1 mM de pyruvate de sodium pour réduire la toxicité liée au

glutamate et maintenir les tranches en bon état (ces deux drogues sont éliminées rapidement

lorsque la tranche est placée dans la chambre d’enregistrement). Les enregistrements en

patch-clamp ont été réalisés à 35°C en utilisant la solution de LCR artificiel standard (sans

l’ajout d’acide kynurénique ni de pyruvate de sodium) circulant à un débit de β,5 ml/min. Les

micropipettes utilisées sont en borosilicate, possédant une résistance de 4-5 MΩ , et sont

remplies d’une solution contenant (en mM) : 125 de K-gluconate, 10 de NaCl, 1 de CaCl2, 2

de MgCl2, 0,5 de 1,2-bis (2-aminophenoxy) ethane-N,N,N,N-tetraacetic acid (BAPTA), 19 de

N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N-s-ethanesulphonic acid (HEPES), 0,3 de guanosine

triphosphate (GTP) et 1 de Mg-adenosine triphosphate (Mg-ATP), ajustée à un pH de 7,3.

Une solution de β0 µM d’Alexa Fluor 56κ est ajoutée à la solution intrapipette afin de pouvoir

identifier, après l’expérience, les neurones enregistrés. Les neurones DA et GABA de la SN

sont identifiés sur les tranches par videomicroscopie infrarouge et enregistrés via un

amplificateur AxoPatch 200B ou Multiclamp 700B et le logiciel pClamp 10 (Molecular

Devices, USA).

A la fin de l’enregistrement, les tranches sont immergées dans une solution de PFA 4%

pendant la nuit, puis placées dans deux bains de sucrose 30% successifs (24 h chacun) ; elles

suivent ensuite un protocole d’immunomarquage de la TH (même protocole que celui décrit

précédemment). Ce marquage nous permet de confirmer à posteriori le phénotype DA ou non-

DA des neurones enregistrés. Les drogues utilisées (Tocris-Cookson, UK) sont dissoutes aux

concentrations voulues dans la solution de LCR artificiel. Les données sont finalement

analysées grâce aux logiciels pClamp et MiniAnalysis (Synaptosoft, USA).

171

RESULTATS

172

173

Les caractéristiques et les conséquences fonctionnelles de la neurodégénérescence induite par

l’injection aiguë de PDC dans la SN chez le rat ont été analysées selon les points suivants :

- spécificité de réponse au PDC des neurones DA de la SNc versus GABA de la SNr,

- mécanismes associés à la mort cellulaire à court terme (4 jours): métabolisme du

GSH, stress oxydant, excitotoxicité, neuroinflammation, autophagie;

- évolution ou non du processus dégénératif : pertes neuronales dans la SN, atteinte des

terminaisons nerveuses et tonus DA au niveau de la cible striatale, mécanismes

adaptatifs, réactivité gliale dans la SN ;

- et expression des troubles moteurs (activité locomotrice et déficit de type akinétique).

I. Spécificité de l’atteinte

1.1. Effet du PDC in vivo sur la viabilité des neurones

dopaminergiques et GABAergiques de la substance noire

Une des caractéristiques neuropathologiques majeures de la MP est la perte préférentielle des

neurones DA de la SNc sans perte des neurones GABAergiques de la SNr. L’injection a été

réalisée entre la SNc et la SNr afin d’évaluer si ces deux populations neuronales présentent

une vulnérabilité différentielle à l’atteinte induite par le PDC (Figure 53 A, B).

Figure 53. Coupe marquée au bleu de toluidine (A) et représentation schématique (B ; atlas stéréotaxique

de Paxinos et Watson, 1998) illustrant le site d’injection du PDC dans la SN.

Les flèches blanches en A indiquent la trace de l’injecteur. barre d’échelle = 100 µm.

A B

174

Pour visualiser sur les mêmes coupes ces deux populations neuronales, nous avons réalisé un

double marquage fluorescent couplant HIS de l’ARNm de la GAD67 et immunodétection de

la TH. La quantification du nombre de cellules a été réalisée à 4 jpi sur 3 coupes consécutives

localisées dans la région péri-injectée. Le nombre de cellules TH-positives dans la SNc est

réduit de β6±4,β%, alors que le nombre de neurones exprimant l’ARNm de la GAD67 dans la

SNr n’est pas significativement modifié (-4,β±4,7%). Ceci montre que l’injection intranigrale

de PDC cause une perte sélective des neurones DA de la SNc sans affecter les neurones

GABA de la SNr (Figure 54 A-C). Nous avons également réalisé un marquage histologique

au bleu de toluidine sur des coupes frontales de SNc prises également dans la région péri-

injectée, et le comptage cellulaire montre une perte significative de 25±2.3% du nombre de

cellules chez les animaux ayant reçu une injection intranigrale de PDC en comparaison avec

les animaux sham (Figure 54 C). Ce pourcentage de perte est équivalent à celui obtenu après

comptage des cellules TH positives ; ceci indique que la perte du marquage TH correspond

bien à une mort des neurones DA et non pas à une sous-expression de la TH ou une

modification de phénotype de ces neurones.

Figure 54. Vulnérabilité différentielle des neurones DA de la SNc vs. les neurones GABA de la SNr, 4

jours après injection intranigrale de PDC.

(A-B) : Photographies représentatives de SN prises au niveau de la zone péri-injectée d’animaux sham (A) ou

injectés au PDC (B). Les coupes sont ensuite traitées par un double marquage fluorescent : un marquage

immunocytochimique de la TH (rouge) pour identifier les neurones DA de la SNc, couplé à une hybridation in

situ de l’ARNm de la GAD 67 pour marquer les neurones GABA de la SNr (vert). L’injection de PDC conduit à une perte de neurones TH+ de la SNc qui n’est pas accompagnée de pertes de neurones marqués avec la sonde ARNm de la GAD 67 au niveau de la SNr (Barre d’échelle = 50 µm). (C) Analyse quantitative montrant une

atteinte équivalente des neurones TH+ (-26±4,2%) et de cellules marquées au bleu de toluidine (-25.3±2.3%) au

niveau de la SNc, et la conservation du nombre de neurones exprimant la GAD 67 dans la SNr. Les résultats sont

exprimés en pourcentage des animaux sham et représentent les valeurs moyennes ± SEM. La comparaison

statistique s’est faite en utilisant une ANOVA à un facteur suivi par le test post-hoc Newman-Keuls (**p<0,01

en comparaison avec les animaux sham ; n=6).

175

1.2. Réponses électrophysiologiques des neurones DA et non DA de

la substance noire à l’application de PDC in vitro.

Nous avons examiné les effets de l’application de PDC in vitro sur l’activité

électrophysiologique des neurones DA de la SNc et GABA de la SNr enregistrés en patch-

clamp en utilisant des tranches de cerveau de rat juvénile (4 semaines). Les 2 populations

neuronales sont identifiées au moment de l’enregistrement électrophysiologique par leur

taille, leur localisation dans la SN et leurs propriétés membranaires (Seutin and Engel, 2010).

Leur phénotype est confirmé après l’enregistrement, par la co-localisation ou non de l’Alexa

Fluor 56κ introduit par l’électrode d’enregistrement et l’immunomarquage TH (Figure 55 A,

B). Les neurones DA ont des corps cellulaires plus gros que ceux des neurones GABA

(respectivement 30-50 vs. 25-30 µm). Ils présentent une activité pacemaker caractéristique

avec une fréquence moyenne de 1,46±0,25 Hz (n=4), attribuée en partie à la présence du

courant Ih, un courant cationique activé par l’hyperpolarisation. Les neurones GABA ne

possèdent pas ce courant Ih et présentent une activité de décharge spontanée à une fréquence

plus élevée (18±4,27 Hz) (Seutin and Engel, 2010) (Figure 55 A, B).

Figure 55. Identification morphologique et

électrophysiologique des neurones enregistrés

dans la SN. (A) Neurone DA de la SNc identifié par

la co-localisation de l’Alexa Fluor 568 (rouge, injecté par la pipette de patch) et

l’immunomarquage TH (vert). A droite, tracé électrophysiologique représentatif des réponses

membranaires d’un neurone DA à des créneaux

de courant hyperpolarisants et dépolarisants (ligne de base = -50 mV). Les caractéristiques sont i) la faible

fréquence à laquelle sont émis les potentiels d’actions après l’injection de courant positif et ii) le « sag »

important correspondant à l’inflexion du tracé après injection de courant hyperpolarisant reflétant l’activation du courant Ih suivi par un rebond du potentiel membranaire. (B) Neurone GABAergique de la SNr identifié par

l’absence de co-localisation de l’Alexa Fluor 568 (rouge) et de l’immunomarquage TH (vert). Barre d’échelle = 20 µm. A droite, tracé électrophysiologique représentatif des réponses membranaires d’un neurone GABAergique observées après injection de créneaux de courants hyperpolarisants et dépolarisants (ligne de

base = -55 mV). Dans ce cas le « sag » est absent et la fréquence de décharge en réponse à l’injection de

courant dépolarisant est plus élevée que pour les neurones dopaminergiques. A noter aussi la différence de taille

entre les neurones en A et B.

176

Lorsque le PDC est appliqué dans le bain (300 µM, 3-6 min), les neurones DA répondent par

une augmentation de la fréquence de décharge qui passe de 1,46±0,25 à 2,39±0,38 Hz (n=4,

p<0,05 vs. contrôle, test de Wilcoxon). Cette augmentation de la fréquence de décharge est

réversible après lavage, où la fréquence de décharge mesurée est de 0,99±0,37 Hz (Figure 56).

Figure 56. L’activité de décharge des neurones DA est fortement augmentée par l’application de 300 µM de PDC et est réversible après lavage.

A des potentiels membranaires hyperpolarisés (obtenus par injection de courant négatif),

situés sous le seuil de déclenchement des potentiels d’actions, le PDC induit une

dépolarisation membranaire soutenue et une décharge de potentiels d’action qui se maintient

pendant toute la durée d’application de la drogue (15 min), et ce, dans 77% (βγ/γ0) des

neurones DA enregistrés ; cet effet est réversible après lavage (Figure 57 A).

Dans les mêmes conditions de potentiel membranaire hyperpolarisé, 78% (7/9) des neurones

GABA répondent à l’application de PDC (de 6 à 15 min) par une dépolarisation membranaire

et l’émission de potentiels d’actions. Cependant, contrairement aux neurones DA, leur

excitation n’est pas maintenue mais présente une succession de courtes périodes d’excitation

(accompagnées par l’émission de potentiels d’actions) et de retours à la ligne de base (Figure

57 B).

Figure 57. Réponses électrophysiologiques différentes des neurones DA (A) et des neurones GABA (B) de

la SN à l’application de PDC in vitro.

Les neurones sont hyperpolarisés sous le seuil de déclenchement des potentiels d’actions par injection de

courant négatif pour empêcher la décharge spontanée. Le PDC provoque une dépolarisation continue des

neurones DA pendant toute sa durée d’application (barre grise) alors que l’activation des neurones GABA est intermittente (ligne de base = -55 mV).

177

II. Mécanismes impliqués dans la mort cellulaire

2.1. Déplétion en GSH et stress oxydatif

Les EAATs ont un rôle important dans l’approvisionnement des cellules en substrats pour la

synthèse du GSH. Dans cette partie de l’étude nous avons voulu déterminer si l’injection de

PDC engendre des modifications précoces (4 jpi) du métabolisme du GSH similaires à celles

décrites dans la SN de patients parkinsoniens (Sian et al., 1994a; Sian et al., 1994b) et induit

un stress oxydatif.

Les taux de GSH total (GSH réduit + GSSG) sont diminués (-32% vs. Sham) dans la SN

(Figure 58 A). Par contre, les niveaux de GSSG sont inchangés (Figure 58 B), suggérant une

déplétion sélective de la forme réduite du GSH, qui est celle utilisée pour la détoxification. De

plus, les niveaux de TBARS, marqueur de la péroxidation lipidique, sont augmentés dans la

SN (+45% vs. Sham), ce qui indique la présence d’un stress oxydatif (Figure 5κ C). Ces

marqueurs ne montrent pas de modification significative au niveau du striatum. Dans la SN,

nous n’avons mesuré aucun changement de l’activité de GCL, enzyme catalysant la première

étape de la synthèse du GSH, ni des enzymes GPx et GST qui utilisent le GSH dans des

mécanismes de défense contre les dommages oxydatifs induit par les radicaux libres (Figure

58 D) ; la réduction de GSH ne serait donc pas liée à un défaut de la capacité de biosynthèse

ou à une augmentation de son utilisation. Par contre, l’activité de la -GT, enzyme impliquée

dans le recyclage du GSH, est augmentée (+69% ; Figure 58 D).

Figure 58. Etat d’oxydo-réduction

mesuré à partir de tissu nigral et

striatal à 4 jours post-injection de

PDC. (A) Taux de glutathion total

(GSH). (B) Taux de la forme oxydée

du GSH (GSSG). (C) Taux de

substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS). (D)

Activités des enzymes reliées au

GSH dans la SN: GCL : γ-glutamylcysteine ligase ; GPx :

glutathione peroxidase ; GST :

glutathione-S-transferase. *p<0.05

et **p<0.01 en comparaison avec

les valeurs du groupe sham en

utilisant un test t de Student non

apparié (n = 4-7 par groupe).

178

L’étude de l’implication d’un stress oxydatif dans la mort des neurones DA induite par le

PDC a été poursuivie par une approche pharmacologique visant à évaluer le potentiel

neuroprotecteur d’un agent anti-oxydant, la NAC, un dérivé synthétique de la cystéine. Pour

cela, les rats ont reçu 2 mg/ml de NAC dans leur eau de boisson, pendant les 4 jours suivant

l’injection de PDC. Ce traitement induit une neuroprotection partielle : les animaux traités

NAC présentent une réduction du nombre de neurones TH-positifs dans la SNc (-16,5±6,3%)

qui ne diffère pas significativement de celle mesurée chez les animaux PDC seul mais qui

n’atteint toutefois pas le seuil de significativité par rapport aux valeurs shams (Figure 5λ).

Figure 59. Protection partielle de la perte neuronale

induite par le PDC à 4 jpi après traitement oral avec la N-

acétylcysteine.

Les résultats sont exprimés en pourcentage des valeurs

mesurées chez les animaux sham. Les données représentent

des moyennes ± SEM des valeurs déterminées à partir de n

animaux par groupe expérimental (sham n=5, PDC n=7,

PDC+NAC oral n=4). Les comparaisons statistiques sont

réalisées par une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc

de Newman-Keuls. **p<0.01 vs. sham

2.2. Excitotoxicité

Le PDC étant un inhibiteur substrat des EAATs, sa présence conduit à une libération de

glutamate par hétéroéchange et ainsi à une augmentation de glutamate extracellulaire

(Volterra et al., 1996; Oh et al., 1997).

L’implication de processus excitotoxiques médiés par les récepteurs NMDA dans la perte des

neurones DA induite par le PDC a déjà été établie in vitro (Nafia et al., 2008). Afin d’évaluer

le rôle de l’excitotoxicité dans la perte des neurones DA in vivo à court terme (4 jpi), le PDC a

été co-injecté avec différents antagonistes des récepteurs NMDA.

Tout d’abord, nous avons utilisé un antagoniste compétitif sélectif et à large spectre des

récepteurs NMDA, le 2-amino-5-phosphonopentanoic acid ou APV. La co-injection d’APV

avec le PDC ne réduit pas les pertes neuronales induites par le PDC mais, à l’inverse, il

amplifie ces pertes (Figure 60 ; PDC+APV : -40,9±1,3% vs. PDC seul : -26,1±2,3%). Une

explication de cet effet négatif pour la survie neuronale serait que l’APV agit sur un ensemble

179

de récepteurs de composition en sous-unité et de localisation (synaptique ou extrasynaptique)

différentes, pouvant être impliqués soit dans des voies de survie soit de mort neuronale.

Figure 60. Aggravation des pertes induites par le PDC à 4 jpi après co-injection avec un antagoniste

compétitif des récepteurs NMDA

Les résultats sont exprimés en pourcentage des valeurs mesurées chez les animaux sham. Les données

représentent les moyennes ± SEM des valeurs déterminées à partir de n animaux par groupe expérimental (n=5)

et les valeurs de p sont calculées par une ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc Newman-Keuls.

***p<0,001 en comparaison avec le groupe sham ; $p<0,05 en comparaison avec le groupe PDC.

Afin d’évaluer plus précisément le rôle des récepteurs NMDA impliqués dans les phénomènes

de toxicité cellulaire, nous avons co-injecté le PDC avec deux autres antagonistes des

récepteurs NMDA :

- L’ifenprodil, un antagoniste non compétitif spécifique des récepteurs NMDA contenant

la sous-unité NRβB, cible d’intérêt pour les stratégies de neuroprotection (Mony et al.,

2009). Ce composé présente une affinité 140 fois plus élevé pour les récepteurs

NR1/NR2B que pour les récepteurs NR1/NR2A.

- La mémantine, un antagoniste non compétitif des récepteurs NMDA, d’affinité faible

et dépendante du voltage. Ce composé est un « open channel blocker » qui serait

capable d’inhiber l’influx prolongé d’ions Ca2+ à la base de l’excitotoxicité neuronale

tout en préservant la fonction physiologique des récepteurs NMDA. La mémantine

possède une affinité préférentielle pour les récepteurs comportant la sous-unité NR2D,

et inhibe préférentiellement les récepteurs NMDA extrasynaptiques.

La perte en neurones TH+ provoquée par l’injection de PDC quantifiée à 4 jpi (-30,9±3,4%)

est prévenue lorsque celui-ci est co-injecté avec l’ifenprodil à β mM (-7,4±6,8%), la

mémantine à 2 mM (-11,9±3,8%) ou les 2 ensembles (-9,2±5,7%) (Figure 61). Cette

neuroprotection indique l’implication de processus excitotoxiques au travers des récepteurs

180

NMDA possédant les sous unités NR2B et/ou NR2D dans la perte neuronale induite par le

PDC.

Figure 61. Protection des pertes induites par le

PDC à 4 jpi après co-injection avec des

antagonistes NMDA.

Les résultats sont exprimés en pourcentage des valeurs

mesurées chez les animaux sham. Les données

représentent des moyennes ± SEM des valeurs

déterminées à partir de n animaux par groupe

expérimental (sham n=5, PDC n=7, PDC+if n=5,

PDC+mem n= 5, PDC+if+mem n=5). Les

comparaisons statistiques sont réalisées par une

ANOVA à un facteur suivie du test post-hoc de

Newman-Keuls **p<0.01 vs. sham

Nous avons également examiné les effets de la mémantine et de l’ifenprodil sur les réponses

électrophysiologiques des neurones DA induites par l’application PDC in vitro sur tranches.

Ces composés réduisent fortement l’effet excitateur du PDC (-67.6±14% dans 8/8 neurones ;

Figure 62).

Figure 62. L’effet excitateur du PDC in

vitro est bloqué par la mémantine (mem. ;

10 µM) ou par l’ifenprodil (Ifen. ; 10 µM).

Les neurones sont hyperpolarisés sous le

seuil de déclenchement des potentiels

d’actions par injection de courant négatif pour empêcher la décharge spontanée (ligne

de base -55 mV sur le tracé du haut et -65

mV pour le tracé du bas). Les barres grises

indiquent les durées d’application des drogues.

Pour confirmer l’implication d’une activation des récepteurs NMDA contenant la sous-unité

NR2B dans la mort cellulaire induite par le PDC, nous avons réalisé un immunomarquage

avec un anticorps dirigé contre la forme phosphorylée du résidu Tyr 1472 de la sous-unité

NR2B. La phosphorylation sur ce résidu est un élément clef dans la régulation du transport,

de l’adressage, et de la localisation des récepteurs NMDA comportant cette sous-unité et est

considérée comme un index de l’activation de ces récepteurs (Prybylowski et al., 2005;

Nakazawa et al., 2006; Goebel-Goody et al., 2009; Quintana et al., 2010). Comme illustré

181

dans la Figure 6γ A, l’immunomarquage dans la SN injectée à 4 jpi est fortement augmenté

en comparaison avec le côté non injecté. L’analyse quantitative en DO de ce marquage

(Figure 63 B) montre que cette augmentation est de plus de 300% dans le côté injecté

(ipsilatéral) par rapport au côté controlatéral.

Figure 63. Augmentation de l’expression de la forme phosphorylée de la sous-unité NR2B sur le résidu

Tyr 1472 dans la SN ipsilatérale à l’injection de PDC à 4jpi.

(A) Photographie illustrative et (B) analyse quantitative en densité optique (DO) du marquage en

immunoperoxydase de phospho-NMDA NR2B (pTyr1472). Le côté injecté est identifié par une étoile ; barre

d’échelle = β00 µm. Les données en B représentent les moyennes ± SEM calculées à partir de n=4 animaux et

l’analyse statistique est réalisée en utilisant un test t de Student non-apparié ***p < 0,001.

2.3. Autophagie

L’analyse ultrastructurale de SNc de patients parkinsoniens montre des caractéristiques

apoptotiques et d’autophagie dans les neurones en dégénérescence de la SNc (Anglade et al.,

1997). De plus, le rôle pathogénique de l’autophagie dans la MP a été démontré par le fait que

l’α-synucléine est dégradée par macroautophagie et par autophagie médiée par des protéines

chaperonnes (Webb et al., 2003 ; Cuevo et al., 2004 ; Vogiatzi et al., 2008). Pour déterminer

l’intervention de processus autophagiques dans l’atteinte induite par le PDC, nous avons

réalisé une immunodétection de la « microtubule-associated protein 1 light chain 3 » (MAP1-

LCγA), un marqueur de la formation d’autophagosomes. A 4 jpi, nous avons détecté la

présence de corps cellulaires immunopositifs pour la MAP1-LC3A dans la SN injectée, alors

qu’aucun marquage de ce type n’a été observé dans la SNc controlatérale (Figure 64).

Figure 64. Présence de processus autophagiques dans la

SN ipsilatérale à l’injection de PDC à 4jpi.

Détection par immunofluorescence (vert) de MAP1-LC3A.

Barre d’échelle = β0 µm.

182

III. Caractéristiques neuropathologiques du processus

dégénératif induit par le PDC

Les caractéristiques du processus dégénératif engendré par l’injection intranigrale de PDC

(cinétique de la perte neuronale et des réactivités gliales dans la SN, marqueurs de la fonction

DA dans le striatum) ont été examinées sur des groupes d’animaux injectés au PDC ou Sham

sacrifiés à : 4, 15, 30, 60 ou 120 jpi.

3.1. Cinétique de la perte neuronale dans la substance noire

Le nombre de cellules TH+ a été quantifié dans la SNc par une analyse stéréologique sur une

étendue antéro-postérieure de 1γ50 µm centrée sur le site d’injection, pour chaque temps

post-injection de 4 à 120 jours. Les analyses ont été réalisées pour les SNc ipsilatérales et

contralatérales à l’injection chez les animaux shams et PDC. Aucune différence significative

n’étant mesurée dans les groupes d’animaux shams entre les valeurs obtenues dans les SNc

ipsi et controlatérales ni entre les groupes expérimentaux sacrifiés à différents temps post-

injection, toutes les valeurs shams ont été regroupées. Ce groupe sham compte un nombre

moyen de 111γ5,51±1κ6,4λ cellules dans l’étendue antéropostérieure de la SNc examinée.

Comme décrit plus haut, les animaux PDC présentent une réduction significative du nombre

de neurones TH+ à 4 jpi dans la SNc ipsilatérale (-21,18±4%) (Figure 65 A, B). Cette perte

ipsilatérale se maintient jusqu’à 1β0 dpi et s’accentue avec le délai post-injection, révélant

une progression du processus neurodégénératif (-31,16±4,69%, -39,26±3,3%, -46,65±1,99%,

-57,39±2,68% à 15, 30, 60 and 120 jpi, respectivement ; Figure 65 A, B). Nous avons

également comparé à 60 jpi les données quantitatives obtenues en immunomarquage TH et

après marquage histologique au bleu de toluidine. Comme décrit à 4 jpi, des baisses

équivalentes du nombre de cellules TH-positives et marquées au bleu de toluidine sont

mesurées (-46,6±1,9% de cellules TH+ vs. -46,1±1,2% de cellules marquées au bleu de

toluidine dans la SNc), confirmant ainsi la progression de la perte neuronale (non montré).

L’analyse du nombre de cellules TH+ dans la SNc controlatérale à l’injection de PDC ne

montre aucune modification significative à 4, 15 et 30 jpi vs. sham. De façon intrigante, une

183

réduction faible mais significative est mesurée à 60 jpi (-19.1±5.4%) et la perte cellulaire est

significativement plus marquée à 120 jpi (-35.9±4.6%) (Figure 65 A, B).

Figure 65. Progression bilatérale de la perte des

neurones dopaminergiques de la SN suite à

l’injection aiguë, unilatérale, de PDC.

(A) Photographies représentatives de de la

détection en immunofluorescence de la TH sur des

coupes frontales de SN et (B) analyse quantitative

du nombre de neurones TH-positifs, chez des

animaux shams ou injectés au PDC, à 4, 15, 30,

60, 1β0 jpi. Barre d’échelle en A= β00 µm. Les résultats en B sont des moyennes ± SEM et sont

exprimés en pourcentage du groupe sham (n=5-7

PDC par temps et n=17 shams). **p<0.01 vs.

sham; $$ p<0.01 vs PDC à 4 jpi; ££ p<0.01 vs.

PDC à 15 jpi; @@ p<0.01 vs. PDC à γ0 dpi; € p<0.05 vs. PDC à 60 dpi selon le test post-hoc de

Newman-Keuls après ANOVA à un facteur.

Chez les patients parkinsonniens, les pertes des neurones DA au niveau de la SNc ne sont pas

uniformes : en effet, la partie caudale de la SNc semble être affectée plus précocément et de

façon plus importante (Damier et al., 1999b). Dans ce contexte, nous avons poursuivi

l’analyse du processus dégénératif dans la SNc ipsilatérale par une étude régionale

subdivisant la zone d’étude (de 1γ50µm) en trois zones équivalentes de 450 µm : antérieure,

péri-injectée et postérieure. Les résultats montrent un gradient caudo-rostral de l’atteinte : les

pertes dans la région postérieure ne diffèrent pas des celles mesurées dans la région péri-

injectée alors que la région antérieure montre des pertes moins importantes aux différents

A B

184

délais examinés (significatives vs zone peri-injectée à 4, 15, 60 et 120 jpi), suggérant une

vulnérabilité moindre ou une atteinte retardée de cette région (Figure 66).

Figure 66. Evolution caudo-rostrale de la neurodégénérescence dans la substance noire ipsilatérale à

l’injection de PDC.

L’image du haut illustre la subdivision en antéropostériorité de la SN en γ régions équivalentes centrées sur le

site d’injection. En bas, l’analyse quantitative montre que la perte cellulaire dans la région antérieure est plus faible alors que celle dans la région postérieure est équivalente à la perte mesurée dans la région peri-injection.

Les résultats sont des moyennes ± SEM (n= 5-7 PDC par délai post-injection; n=17 sham) et les comparisons

statistiques sont réalisée par une ANOVA à deux facteurs suivie du test post-hoc de Bonferroni. **p<0.01 et

***p<0.001 vs. peri-injection

3.2. Cinétique des réactivités gliales dans la substance noire

Les réactivités gliales, astrocytaire et microgliale, ont été analysées dans la SN ipsilatérale

jusqu’à 60 jpi (Figure 67). Etant donné que l’injection du véhicule pour le groupe sham

conduit à des réactivités gliales dépendantes du temps, les valeurs des différents groupes

injectés au PDC ont été comparées aux valeurs sham correspondantes à chaque temps post-

injection. Sur l’intégralité de l’étendue de SN analysée, la réactivité microgliale, évaluée par

l’immunomarquage Iba-1, est forte et maximale à 4 jpi (+75,4±17%). Cette réactivité diminue

ensuite de façon marquée à 15 jpi (+40,9±4,9%) pour se normaliser à 60 jpi (Figure 67 A, B).

Des modifications morphologiques des cellules Iba-1-positives témoignent aussi de

l’activation microgliale : corps cellulaire plus gros et prolongements plus courts (Figure 67

C). La réactivité astrocytaire, évaluée par l’immunomarquage GFAP, est retardée par rapport

à la réactivité microgliale. En effet, l’immunomarquage GFAP n’est pas significativement

185

modifié à 4 jpi (+14,8±9,6%), augmente à 15 jpi (+58,2±12,4%) et 30 jpi (+41,9±13,1%),

puis se normalise à 60 jpi (Figure 67 A, B).

Figure 67. Décours temporels différents

des réactivités astrocytaire et

microgliale dans la SN ipsilatérale à

l’injection de PDC.

(A) Photographies représentatives du

double immunomarquage de la GFAP

(rouge) et Iba-1 (vert) à 4 jpi pour la

condition sham et à 4 et 15 jpi pour PDC

(les flèches blanches désignent la trace de

l’injecteur). Barre d’échelle = β00 µm.

(B) Analyse quantitative des

immunomarquages GFAP et Iba-1 dans la

SN à 4, 15, 30 et 60 jpi. Les résultats sont

exprimés en pourcentage du groupe sham

respectif. La réactivité microgliale est

plus précoce et se normalise plus vite que

la réactivité astrocytaire. Les données

représentent des moyennes ± SEM de n

animaux par groupe (sham 4 jpi n= 2,

sham 15 jpi n=3, sham 30 jpi n= 3, sham

60 jpi n=4, PDC 4jpi n=5, PDC 15 jpi

n=3, PDC 30 jpi n=4, PDC 60 jpi n=6).

Les comparaisons statistiques sont

réalisées en utilisant le test t de Student

non apparié. *p<0.05 et **p<0.01 en

comparaison avec le groupe sham

homologue.

(C) Illustration des différences

morphologiques des cellules Iba-1

positives dans les conditions sham et PDC

à 15 jpi. Barre d’échelle = 10µm

L’analyse régionale indique que la réactivité dans la région postérieure précède celle dans la

région antérieure, et ce, pour les deux marqueurs (Figure 68). La réactivité astrocytaire est

observée dans la région postérieure dès 4 jpi, est maximale à 15 jpi et se normalise à 30 jpi,

alors que pour la région antérieure, elle n’est détectée qu’à partir de 15 jpi , se maintient à γ0

jpi et se normalise à 60 jpi (Figure 68 A). Pour la microglie, la réactivité maximale est

186

observée à 4 jpi dans la région postérieure et à 15 jpi dans la région antérieure (Figure 68 B) ;

s’ensuit une normalisation dès 15 jpi en postérieur et à γ0 jpi en antérieur. A noter que,

comme pour les pertes neuronales, la réactivité microgliale est similaire dans les régions

postérieure et péri-injection, alors que pour la réactivité astrocytaire, c’est la région antérieure

qui se rapproche de la courbe péri-injectée.

Figure 68. Evolution caudo-rostrale des réactivités gliales.

Les données sont analysées et exprimées comme en Figure 67.

3.3. Conséquences de la perte dopaminergique au niveau de la cible

striatale

3.3.1. Analyse morphologique

Des changements potentiels de l’expression de marqueurs DA ont été recherchés au niveau de

la cible des neurones DA de la SNc : le striatum. De façon surprenante, malgré la perte en

neurones TH-positifs au niveau de la SNc dépassant 50% du côté injecté et 30% du côté

controlatéral à 1β0 dpi, aucune modification significative des niveaux d’expression de la TH

(détection par immunoperoxidase et mesure de DO) n’est observée dans le striatum ipsilatéral

et controlatéral, et ce, quel que soit le temps post-injection analysé (Figure 69 A).

L’immunodétection de DAT révèle des altérations biphasiques dans le striatum ipsilatéral

(Figure 69 B) : une diminution précoce de l’immunomarquage est mesurée dès 4 jpi (-

β1,5±γ,λ%), s’accentuant à 15 jpi (-33,8±5,2% ; Figure 69 C) ; après normalisation à 60 jpi (-

1,5±2,8%), une deuxième phase de perte est observée à 120 jpi (-26,1±3,7%). Aucun

187

changement significatif de l’immunomarquage DAT n’est observé dans le striatum

controlatéral. L’immunodétection d’ATκ (un index de l’hyperphosphorylation de la protéine

tau) révèle la présence de neurites dystrophiques à tous les temps entre 4 et 120 dpi dans le

striatum ipsilatéral (illustration en Figure 69 D). Cet ensemble de résultats suggère

l’association de mécanismes compensatoires à des pertes axonales dans le striatum.

Figure 69. Evolution de l’expression de marqueurs des terminaisons dopaminergiques et dystrophie

axonale dans le striatum.

(A) Analyse quantitative de la DO de l’immunomarquage TH et (B) de l’immunomarquage DAT dans le striatum à 4, 15, 30, 60 et 120 jpi chez des animaux sham (n=17) et chez des animaux injectés au PDC (n=5-7

par délai post injection). (C) Coupe frontale illustrative de la réduction de l’immunomarquage DAT dans le striatum ipsilatéral (gauche sur la photo) à 15 dpi chez des animaux PDC. (D) Image illustrant la détection en

immunopéroxydase d’ATκ, anticorps reconnaissant un épitope de la protéine tau phosphorylée, révélant la

présence d’axones dystrophique dans le striatum (Barre d’échelle = 10 µm). Les données représentent les moyennes ± SEM et sont exprimées en pourcentage du sham. Les comparaisons statistiques sont réalisées en

utilisant une ANOVA à un facteur suivie par le test post-hoc Newman-Keuls. *p<0.05, **p<0.01 et ***p<0.001

en comparaison avec le groupe sham.

C D

A B

188

3.3.2. Libération de dopamine par microdialyse

Nous avons recherché les modifications potentielles des taux extracellulaires de DA, en

condition basale et potassium évoqué, à moyen (15 jpi) et long terme (90 jpi) après injection

intranigrale de PDC. En condition basale, les taux extracellulaires de DA ne montrent aucune

modification significative à 15 ou 90 jpi, du côté ipsilatéral ou controlatéral à l’injection de

PDC en comparaison avec les valeurs shams (Figure 70 A). La libération de DA évoquée par

le potassium (KCl 70 mM) est significativement plus faible à 15 jpi du côté ipsilatéral à

l’injection que du côté controlatéral ou que chez les animaux shams ; à ce temps, les valeurs

obtenues du côté controlatéral ne diffèrent pas significativement des valeurs shams. A 90 jpi,

la réduction de la libération évoquée de DA est plus marquée et bilatérale (Figure 70B).

Figure 70. Réduction de la libération striatale de dopamine évoquée par le potassium chez les animaux

PDC : évolution d’un effet unilatéral à 15 jpi à un effet bilatéral à 90 jpi.

La dialyse a été répétée aux 2 temps sur les mêmes animaux. Les mesures du côté ipsilatéral et contralatéral à l’injection de PDC ont été réalisées sur β groupes d’animaux différents. (A) L’efflux basal de DA n’est pas significativement modifié (ANOVA à un facteur). Les données représentent des moyennes des 4 points basaux par animal et sont exprimés en moyennes ± SEM des valeurs déterminées à partir de n animaux par groupe expérimental (n= 4-6 animaux par groupe). (B) Libération évoquée par le KCl (40 minutes). Sont représentés les 4 points basaux, les 2 points sous KCl et les 4 points après retour au LCR. Le KCl induit une libération importante de dopamine chez les shams, qui est réduite uniquement du côté ipsilatéral à 15 jpi (à gauche) et en bilatéral à 90 jpi (à droite). Les résultats sont des moyennes ± SEM des valeurs déterminées à partir des n animaux par groupe et sont exprimés en pourcentage de la moyenne des valeurs basales respectives de chaque groupe (montrées en A) ; l’analyse statistique a été réalisée par une ANOVA à deux facteurs (avec mesures répétées) suivie du test post-hoc de Bonferroni.

189

3.4. Changements adaptatifs dans les neurones DA épargnés

Dans cette partie de l'étude, nous avons voulu évaluer s’il existait des adaptations

fonctionnelles des neurones DA de la SNc épargnés. Nous avons quantifié les niveaux

d’expression de l’ARNm de la TH dans les neurones restants par HIS avec une sonde radio-

marquée. Nous avons mesuré une augmentation des taux intraneuronaux de l’ARNm de la TH

dans la SNc qui est significative à 30 et 60 jpi (respectivement +44,7±9,7% et +48,1±19,7% ;

Figure 71 A, B). Aucun changement significatif n’a été observé au niveau controlatéral

quelque soit le temps post injection (Figure 71 B).

Figure 71. Augmentation de l’expression de l’ARNm de la TH dans les neurones nigraux épargnés.

(A) Images illustratives du marquage par hybridation in situ utilisant une sonde radiomarquée de la TH prises à

60 jpi chez un animal sham (en haut) et PDC (en bas). (B) Analyse quantitative du nombre de grains d’argent par cellule à 4, 30, 60 et 120 jpi chez des animaux sham (n = 14) et injectés au PDC (n = 6-10 animaux par temps

post injection) dans la SNc. Une augmentation de l’expression de l’ARNm de la TH est mesurée à γ0 et 60 jpi dans la SN injectée avec le PDC, sans aucune modification dans la SN controlatérale Les données représentent

les moyennes ± SEM et sont exprimées en pourcentage du sham. *p<0.05 et **p<0.01 en comparaison avec le

groupe sham; les valeurs de p sont obtenues après une ANOVA à un facteur suivie par le test post-hoc Newman-

Keuls.

3.5. Impact sur la neurogenèse adulte

Dans cette partie, nous avons voulu déterminer si la dégénérescence de la voie nigro-striée

induite par le PDC est associée à des modifications de la neurogenèse adulte au niveau de la

ZSV et du BO à 120 jpi. Nous avons mesuré deux index : la prolifération cellulaire, en

comptant le nombre de cellules PHH3-positives dans la ZSV ; et la survie cellulaire en

mesurant le nombre de cellules BrDU-positives dans le BO (le BrDU ayant été injecté 30

190

jours avant le sacrifice). Des modifications significatives sont mises en évidence avec une

réduction du nombre de cellules PHH3-positives dans la SVZ, suggérant une baisse de

prolifération (-34,9% ; Figure 72 A). De façon surprenante, cette réduction de prolifération est

mesurée de façon bilatérale (-35% du côté controlatéral ; Figure 72 A) et est associée à une

augmentation bilatérale du nombre de cellules BrDU-positives dans le BO témoignant d’une

augmentation de la survie cellulaire (+23,8% du côté ipsilatéral; +19,85% du côté

controlatéral ; Figure 7β B). Ainsi, le processus dégénératif induit par le PDC n’est pas

restreint à la voie nigrostriée mais impacte également la neurogenèse adulte au niveau du

complexe ZSV-BO. Ces changements sont toutefois surprenants, avec des effets opposés sur

la prolifération dans la ZSV et la survie dans le BO.

Figure 72. Effets différentiels de l’injection de PDC sur la prolifération et la survie cellulaire à 120 jpi.

La quantification du nombre de cellules immunomarquées avec un anticorps anti-PHH3 révèle une diminution

bilatérale du nombre de cellules en prolifération dans la ZSV (A). Les résultats sont des moyennes ± SEM

obtenues à partir de n animaux et sont exprimés en nombre de cellules PHH3-positives par coupe de ZSV. La

quantification du nombre de cellules immunomarquées avec un anticorps anti-BrDU montre une augmentation

bilatérale de la survie cellulaire au niveau du BO (B). Les résultats sont des moyennes ± SEM obtenues à partir

de n animaux et sont exprimés en nombre de cellules BrDU positives comptées dans une zone de 0,278 mm2 au

niveau de la couche de cellules granulaires. *p<0,05 et **p<0,01 selon le test t de Student non apparié ; n = 5-7

par groupe.

3.6. Conséquences fonctionnelles au plan moteur

Nous avons évalué les conséquences de l’injection de PDC sur le comportement moteur des

animaux en utilisuant deux tests : i) le test de l’open-field, qui permet de mesurer l’activité

191

locomotrice spontanée, et ii) le test du cylindre, qui permet d’évaluer la symétrie/asymétrie de

l’utilisation des pattes antérieures.

Placés dans l’open-field, les animaux injectés au PDC parcourent significativement moins de

distance en comparaison avec le groupe sham à partir de 60 jpi (Figure 73 A). Ceci est associé

avec une diminution de la période d’activité des animaux (non montré).

Dans le test du cylindre, les animaux injectés au PDC présentent un score d’asymétrie négatif

traduisant la diminution du % d'appuis avec la patte controlatérale, qui est significativement

différent de celui mesuré pour le groupe sham à 120 jpi (-32,9±7.6 vs. -1.07±4.3 pour le

groupe sham). Ce score d’asymétrie négatif indique donc une akinésie de la patte antérieure

controlatérale à l’injection de PDC (Figure 7γ B). Ainsi, la perte en neurones DA provoquée

par l’injection de PDC induit l’instauration tardive de déficits moteurs.

Figure 73. Expression de déficits moteurs à long terme après injection intranigrale de PDC

(A) Test de l’open-field : les animaux injectés au PDC parcourent significativement moins de distance en

comparaison avec le groupe sham à partir de 60 jpi. (B) Test du cylindre : les rats injectés au PDC présentent une

asymétrie dans l’utilisation des pattes antérieures (akinésie de la patte controlatérale à l’injection) qui est significative à 120 jpi. Les données représentent les moyennes ± SEM. *p<0.05 et **p<0.01 en comparaison

avec le groupe sham; n = 5 pour chaque groupe; les valeurs de p sont calculées en utilisant une ANOVA à 2

facteurs (avec mesures répétées) suivie par le test post-hoc de Bonferroni.

score d'asymétrie

-50 -40 -30 -20 -10 0 10

Sham

PDC

**

60 jp

i120 jp

i

A B

Jours après l'injection de PDC

Dis

tan

ce

parc

ou

rue

en

15 m

in (

cm

)

0 15 30 45 60 75 90 105 120

0

1000

2000

3000

4000

5000

ShamPDC

*

*

192

IV. Transposabilité à une autre espèce : la souris

Nous avons également testé l’effet du PDC à court terme (4 jpi) sur la souris. L’injection de

PDC provoque également une perte du nombre de neurones TH+ au niveau de la région péri-

injectée de la SNc (-33,68±5,97% vs côté controlatéral ; Figure 74 A, B). Ceci montre que

l’action du PDC n’est pas spécifique de l’espèce rat et peut également être utilisé sur l’espèce

souris.

Figure 74. Mort des neurones DA de la SNc chez la souris 4 jpi.

(A) Images illustratives de l’immunomarquage de la TH à 4 jpi du côté controlatéral (à gauche) et du côté ipsilatéral à l’injection (à droite), au niveau de la zone péri-injectée (barre d’échelle : 200 µm). (B) Analyse

quantitative du nombre de cellules TH+ du côté ipsilatéral et controlatéral. Les résultats sont exprimés en

pourcentage du côté controlatéral et représentent les valeurs moyennes ± SEM obtenues à partir de n animaux.

***p<0,001 selon le test t de Student non apparié; n=4.

Ipsi Contro

TH

A B

193

DISCUSSION

194

195

Il a été suggéré depuis longtemps que des mécanismes impliquant le glutamate jouent un rôle

dans plusieurs maladies affectant le SNC, dont la MP (Blandini, 2010; Lau and Tymianski,

2010; Gonda, 2012). Dans la MP, ces mécanismes interviendraient dans la pathogenèse et la

pathophysiologie de la maladie ainsi que dans les dyskinésies induites par le traitement DA de

référence utilisant la L-DOPA, ce qui a conduit à la recherche et au développement de

stratégies thérapeutiques ciblant les systèmes glutamatergiques (Blandini et al., 1996; Johnson

et al., 2009; Duty, 2012). Concernant la pathogenèse de la MP, l'hypothèse d'une

excitotoxicité au travers d'une stimulation excessive des récepteurs ionotropiques (en

particulier les récepteurs de type NMDA) est classiquement privilégiée. Les EAATs, en

assurant la régulation des taux extracellulaires de glutamate (Danbolt, 2001), pourraient jouer

un rôle important dans ces processus pathogéniques.

Ici, nous montrons qu’un dysfonctionnement aigu des transporteurs du glutamate au niveau de

la SN reproduit certaines caractéristiques pathogéniques et neuropathologiques de la MP. En

effet, il engendre une perte spécifique des neurones DA de la SNc qui implique, au moins en

partie, des mécanismes excitotoxiques, mais fait également intervenir d’autres mécanismes

tels que stress oxydant, déplétion en GSH et autophagie. De plus, il induit un processus

dégénératif progressif comme décrit dans la MP, avec une évolution des pertes neuronales

selon un gradient caudo-rostral, une bilatéralisation de l'atteinte et l'apparition tardive des

symptômes moteurs.

L’ensemble de ces résultats confirme le rôle important des EAATs dans l'homéostasie des

neurones DA nigraux, comme précédemment présumé (Plaitakis and Shashidharan, 2000). Il

permet également de suggérer que l'implication de ces transporteurs dans les atteintes

neurodégénératives peut être effective même si leur expression ou leur fonction n’est pas

altérée de façon chronique. Ainsi un dysfonctionnement aigu des EAAT serait capable de

déclencher une cascade d’évènements pathogéniques à l’origine d’un processus dégénératif

capable de s’auto-entretenir. Au-delà de la meilleure compréhension du lien existant entre un

dysfonctionnement des EAATs et des mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP, ce

travail amène également un nouveau modèle d’étude pertinent de la MP, ciblant de façon

indirecte les neurones DA.

196

I. Atteinte spécifique des neurones dopaminergiques

L’injection intranigrale de PDC provoque une perte sélective des neurones DA de la SNc. En

effet, bien que l'injection soit réalisée entre la SNc et la SNr, les neurones GABAergiques de

la SNr sont épargnés. La perte neuronale dans la SNc a été vérifiée par quantification du

nombre de cellules marquées au bleu de toluidine, montrant que la diminution du nombre de

cellules TH+ n’est pas liée à une diminution de l’expression de la TH ou à un changement de

phénotype de ces neurones. Ces résultats sont en accord avec les données du laboratoire

précédemment obtenues in vitro montrant une vulnérabilité préférentielle des neurones DA vs

non-DA au traitement par le PDC dans un modèle de culture primaire de neurones

mésencéphaliques embryonnaires (Nafia et al., 2008). Il est à noter que l'altération aigüe du

fonctionnement des EAATs par différents inhibiteurs, dont le PDC, n'induit pas seule de

neurodégénérescence dans d'autres structures cérébrales comme le striatum ou l'hippocampe

malgré une élévation massive des taux extracellulaire de glutamate ; le dysfonctionnement des

EAATs entraine cependant des dommages neuronaux dans ces structures lorsque le

métabolisme énergétique est altéré (Massieu et al., 1995; Sanchez-Carbente and Massieu,

1999; Massieu et al., 2001). Dans ce contexte, nos données soulignent la vulnérabilité

particulière des neurones DA de la SNc à l'altération des EAATs.

Nous avons par la suite examiné les mécanismes pouvant sous-tendre cet effet différentiel du

PDC sur les populations neuronales DA et non-DA par des enregistrements

électrophysiologiques in vitro sur des tranches coronales de SN. Nous montrons que

l’application prolongée de PDC sur des tranches coronales conduit à des réponses

différentielles dans les deux populations neuronales de la SN. En effet, dans les deux

populations, l’application de PDC induit une dépolarisation et la décharge des neurones

enregistrés, mais lors d’application prolongée, l’excitation provoquée par le PDC est

maintenue pour les neurones DA alors qu’elle est seulement intermittente pour les neurones

non DA. Des études électrophysiologiques antérieures ont montré que les neurones DA et

GABAergiques de la SN expriment des sous-unités de récepteur NMDA similaires (Suarez et

al., 2010). Cette même étude montre toutefois que les réponses induites par le NMDA sont

différentes dans ces deux populations. Les neurones DA de la SNc sont moins sensibles à la

désensibilisation après une exposition prolongée ou des applications répétées de NMDA qui

pourrait être due à des différences de modulation et/ou de « trafficking » des récepteurs

(Suarez et al., 2010). De façon surprenante, les neurones DA de la SNc ne présentent pas ce

197

mécanisme protecteur ; les récepteurs NMDA ne se désensibilisent pas lorsque l’ATP n’est

pas ajouté. Lors d’une libération excessive de glutamate, ou lors d’un dysfonctionnement des

mécanismes de recapture, ce manque de désensibilisation des récepteurs NMDA pourrait

contribuer à la vulnérabilité préférentielle des neurones DA de la SNc aux processus

excitotoxiques.

Ainsi, il est possible que les réponses différentielles des neurones DA et non-DA de la SN à

l’application de PDC sous-tendent au moins en partie leur vulnérabilité différentielle dans

notre modèle. La réponse « particulière » des neurones GABAergiques de la SNr montrant

des périodes courtes d’excitation et de retour à la ligne de base pourrait être due à cette

différence de désensibilisation des récepteurs NMDA dans les deux populations neuronales de

la SN. Le retour à la ligne de base correspondrait à la désensibilisation des récepteurs NMDA

présents à la surface des neurones GABA après une période d’excitation prolongée ; les

récepteurs NMDA présents à la surface des neurones DA ne désensibilisant pas, ce retour à la

ligne de base ne s’effectue pas, ainsi la dépolarisation est soutenue.

Une autre explication proviendrait de l’interaction mutuelle inhibitrice existant entre les

neurones de la SNr. Les neurones de projection de la SNr possèdent des collatérales

récurrentes qui sont responsables de l’inhibition de neurones voisins présents le plus souvent

dans le même territoire fonctionnel (Mailly et al., 2003), ce qui pourrait contribuer à

désynchroniser les neurones de projection de la SNr innervant la même cible et ainsi renforcer

la nature tonique de leur influence synaptique (Deniau et al., 2007). Dans ce contexte,

l’activation des neurones GABAergiques de la SNr par le PDC pourrait conduire à une

libération GABA qui pourrait agir sur les neurones voisins en inhibant leur décharge, ce qui

produirait ce type de décharge en alternance. Un moyen de s’en assurer serait d’utiliser lors de

l’enregistrement électrophysiologique des antagonistes des récepteurs du GABA (GABAA et

GABAB).

198

II. Mécanismes impliqués dans la perte dopaminergique

L’injection aiguë unilatérale de PDC dans la SN provoque une perte de neurones DA. Ceci

montre que des pertes DA peuvent être provoquées par un dysfonctionnement des systèmes

glutamatergiques. Le deuxième résultat majeur de ce travail est que cette perte est progressive

sur la période temporelle étudiée (de 4 à 1β0 jpi). L’étude de la cinétique de la perte des

neurones DA du côté injecté montre une perte précoce assez rapide entre 0 et 4 jpi puis une

dégénérescence plus lente entre 15 et 120 jpi. Ce profil des pertes neuronales suggère que les

mécanismes conduisant à la mort cellulaire pourraient être de nature différente dans la phase

initiale (0 à 4 jpi) et secondaire (15 à 1β0 jpi) de l’atteinte. Avec un délai de plus de γ0 jours,

le processus dégénératif affecte également, de façon surprenante, la SNc contralatérale à

l'injection de PDC. Il est peu probable que le PDC lui-même intervienne toujours dans la

dégénérescence observée plusieurs semaines voire plusieurs mois après son injection, et tout

particulièrement du côté controlatéral. Se pose alors la question de savoir i) quels mécanismes

sont activés par le PDC et impliqués dans les pertes à court terme, et ii) si ces mêmes

mécanismes pourraient être auto-entretenus et également impliqués à plus long terme, ou s’ils

sont impliqués uniquement de façon transitoire suite à l’injection aiguë de PDC et activent

secondairement d’autres mécanismes dans la phase lente et tardive. Alors que la progression

de la neurodégénérescence du côté injecté peut faire intervenir des mécanismes locaux,

"primés" par le PDC, l'atteinte controlatérale, elle, n'est pas directement imputable au PDC et

fait très probablement intervenir un dysfonctionnement de réseaux neuronaux et/ou gliaux.

2.1 Mécanismes impliqués à court terme

2.1.1. Excitotoxicité

Les pertes neuronales DA induites par le PDC ne sont plus mesurées suite à la co-injection

avec la mémantine et/ou l’ifenprodil, des antagonistes des récepteurs NMDA contenant

respectivement les sous-unités NR2D et NR2B. Nos données suggèrent donc que la perte DA

à court terme s’effectue au moins en partie par l’activation de processus excitotoxiques. Ceci

est confirmé par la forte augmentation de l’immunomarquage NRβB-P qui est un index de

199

l’activation de cette sous-unité et de sa présence au niveau de la synapse (Prybylowski et al.,

2005; Quintana et al., 2010). De façon intéressante, une augmentation de NR2B-P après

diminution de l’activité de transport du glutamate a déjà été observée dans un contexte

d’altération métabolique dans l’hippocampe. Dans ce modèle, les auteurs ont également

observé une augmentation transitoire de l’expression de NRβB après l’inhibition du

métabolisme du glucose (Camacho et al., 2007). Des changements de l’expression de NRβB

n’ont pas été recherchés pour le moment dans notre modèle, mais pourrait être présents

consécutivement à l’élévation des taux extracellulaires de glutamate.

Il a été montré au niveau de diverses structures cérébrales, dont le striatum, que le PDC,

conduit à une augmentation des taux extracellulaires de glutamate (Massieu et al., 1995; Bloc

et al., 1995), ce qui pourrait provoquer sa diffusion hors de la synapse permettant ainsi non

seulement l’activation des récepteurs NMDA synaptiques mais également des récepteurs

extrasynaptiques. Comme nous l'avons vu dans les rappels bibliographiques, un nombre

important de données suggère que l’activation de ces β pools de récepteurs aurait des effets

opposés sur la survie cellulaire : l’activation des récepteurs synaptiques favoriserait la survie

neuronale alors que l’activation des récepteurs extrasynaptiques aurait un effet délétère

(Hardingham et al., 2002; Hardingham and Bading, 2010). Les données de la littérature

indiquent que les neurones DA de la SNc possèdent des récepteurs NMDA hétérotrimériques

fonctionnels composés notamment des sous-unités NR2B et NR2D dont la signification

fonctionnelle n’est pas bien connue; toutefois les récepteurs comportant ces sous-unités

seraient majoritairement localisés en extrasynaptique (Misra et al., 2000; Brickley et al.,

2003). Nos résultats vont dans le sens de cette dichotomie fonctionnelle sur la survie

cellulaire des récepteurs NMDA synaptiques et extrasynaptiques. En effet, contrairement aux

effets neuroprotecteurs des antagonistes des récepteurs NMDA comportant la sous-unité

NR2B ou NR2D, la co-injection du PDC avec l’APV, un antagoniste compétitif à large

spectre des récepteurs NMDA, aggrave au contraire les pertes induites par l’injection

intranigrale de PDC. Il serait néanmoins important d’injecter l’APV seul dans la SNc ce qui

nous permettrait d’exclure une toxicité due à l’APV lui-même. Pour confirmer l’implication

de l’activation des récepteurs NMDA contenant des sous-unités NR2B et/ou NR2D, nous

pourrions injecter le PDC dans des modèles de souris KO pour ces sous-unités de récepteurs

NMDA. Une absence d’effet du PDC chez ces souris permettrait de renforcer le lien entre la

dégénérescence induite par le PDC et la présence de ces sous-unités.

200

Une étude récente a montré que l’activation de NRβB, indépendamment de sa localisation

synaptique ou extrasynaptique, était toxique pour la survie neuronale due à son domaine C-

terminal (Martel et al., 2012). Ceci serait dû à une liaison préférentielle de son domaine C-

terminal à la PSD-λ5 nNOS qui altère l’activation de la voie CREB. Etant donné que

l’injection de PDC conduit à l’augmentation de l’activation de la sous-unité NR2B

(augmentation de l’immunomarquage NRβB-P), il serait intéressant d’analyser les

changements au niveau de ces voies intracellulaires.

2.1.2. Stress oxydatif

Nous avons vu que les EAATs sont non seulement responsables de la clearance du glutamate

extracellulaire mais aussi de l'approvisionnement des cellules en acides aminés nécessaires

pour la synthèse de GSH, anti-oxydant majeur du cerveau. Le stress oxydatif est également

impliqué dans les pertes neuronales à court terme après l’injection de PDC. En effet, à 4 jpi,

on mesure une déplétion en GSH total (forme réduite + forme oxydée), une augmentation du

contenu en TBARS (indicateur d’un stress oxydatif) et les pertes neuronales DA peuvent être

au moins partiellement empêchées par addition de NAC (un agent antioxydant) dans l’eau de

boisson. La déplétion en GSH ne s’accompagne pas de modification d’activité de son enzyme

de synthèse la GCL, indiquant qu’elle n’est pas due à une altération du mécanisme de

synthèse. Nous n’avons observé aucun changement des taux de GSSG. Ainsi, la déplétion en

GSH affecte uniquement la forme réduite qui est celle utilisée pour détoxifier les ROS.

L'hypothèse selon laquelle la déplétion en GSH n’est pas due à l’augmentation de l’utilisation

du GSH pour la détoxification est confirmée par le fait que l’activité des enzymes de

détoxification GPx et GST qui utilisent le GSH n'est pas augmentée. Ainsi, la déplétion en

GSH serait une cause plutôt qu’une conséquence du stress oxydant dans notre modèle et serait

attribuable à une diminution du transport des acides aminés substrats de la synthèse de GSH

(le glutamate et la cyst(é)ine) via le dysfonctionnement des EAATs induit par le PDC. La

seule enzyme montrant une augmentation significative de son activité est la -GT, ecto-

enzyme astrogliale contribuant au catabolisme du GSH extracellulaire. Etant donné que les

neurones ne peuvent capter le GSH directement, l'augmentation de l'activité de la -GT est

interprétée comme un processus adaptatif en réponse à la déplétion en GSH pour tenter de

201

produire plus de GSH au travers de l’approvisionnement en précurseurs dipeptidiques pour sa

synthèse neuronale (Schulz et al., 2000).

Des études menées au sein du laboratoire ont d’ores et déjà montré l’importance du

fonctionnement des EAATs pour la survie des astrocytes. La mort astrocytaire induite par le

PDC n’est pas excitotoxique mais oxydative, associée à une déplétion en GSH (Re et al.,

2003; Re et al., 2006). De plus, dans des cultures primaires mésencéphaliques, une déplétion

en GSH est également observée et serait en partie responsable de la perte des neurones DA

mesurée après application de PDC (Nafia et al., 2008). De façon intéressante, les souris KO

pour le transporteur neuronal EAAC1 présentent une déplétion en GSH, des pertes neuronales

et notamment des pertes en neurones DA de la SNc qui apparaissent avec l’âge (Aoyama et

al., 2006; Berman et al., 2011). Comme dans notre modèle, ces pertes peuvent être prévenues

par la NAC (Berman et al., 2011). Nos résultats confirment donc l’importance des EAATs

dans le maintient des taux de GSH et la vulnérabilité au stress oxydant des neurones DA.

2.1.3. L’autophagie

La mort neuronale DA provoquée par le PDC à 4 jpi est associée à l’activation de processus

autophagiques. En effet, sur des coupes de mésencéphale d’animaux traités par le PDC, nous

pouvons observer des cellules positives pour MAP1-LC3A, un marqueur de la formation des

autophagosomes.

L’autophagie est un mécanisme d’autodigestion permettant la dégradation de protéines et

d’organites. L’autophagie pourrait avoir un rôle dans la survie cellulaire en permettant la

dégradation de protéines endommagées, notamment des agrégats protéiques dans des cas de

dysfonctionnement du SUP, ou encore en dégradant des organites cellulaires endommagés

comme les mitochondries (mitophagie). En revanche, la dérégulation des processus

autophagiques, pourrait conduire à accélérer le processus dégénératif comme observé dans

l’ischémie cérébrale (Uchiyama et al., 2008; Puyal et al., 2009).

La forme reconnue par l’anticorps anti MAP1-LC3A que nous avons utilisée est LC3II, une

protéine qui est liée à la membrane des autophagosomes. Si l’étude de ce marquage permet de

démontrer effectivement la présence d’autophagie, elle ne nous permet malheureusement pas

de définir le rôle protecteur ou délétère de l’autophagie. Afin de préciser le rôle joué par

l’autophagie, nous pourrions utiliser le modèle de souris KO pour ATP1γAβ, modèle dans

202

lequel on observe une diminution de la clairance des autophagosomes (Dehay et al., 2012;

Schultheis et al., 2013) en testant l’effet du PDC sur ces souris. Une diminution de l’effet du

PDC montrerait un rôle causal de l’autophagie dans les pertes neuronales. Une alternative

envisageable serait de mesurer les pertes induites par le PDC dans un modèle de sur ou sous-

expression de certaines protéines importantes dans les processus autophagiques (Beclin-1 par

exemple). Il serait également important de rechercher l'implication de processus apoptotiques

dans la mort cellulaire induite par le PDC.

2.1.4. La neuroinflammation

Une des caractéristiques principales des réactions neuroinflammatoires est la présence de

cellules microgliales activées qui constituent les cellules immunitaires résidentes du cerveau.

La quantification du marquage Iba-1 montre une forte réactivité microgliale associée au

processus dégénératif dans notre modèle. C’est à 4 jpi que cette réactivité est la plus forte,

montrant ainsi l’existence d’une réaction inflammatoire précoce. Le rôle des cellules

microgliales dans les processus neurodégénératif n’est pas encore établi car lors de processus

neuroinflammatoires, elles secrètent des cytokines, des protéines et des radicaux libres

(comme l’anion superoxyde) pouvant aggraver les lésions ou, au contraire, avoir un rôle

neuroprotecteur (Czeh et al., 2011; Aguzzi et al., 2013).

L’expression précoce d’une forte réactivité microgliale dans notre modèle, suggère

l’implication potentielle de processus neuroinflammatoires dans la neurodégénérescence

primaire. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons envisagé de moduler le processus

neuroinflammatoire soit en l’augmentant (co-injection avec un agent pro-inflammatoire

comme le LPS) soit en le diminuant (en couplant l’injection intranigrale de PDC avec un anti-

inflammatoire comme l’ibuprofène) et de mesurer les pertes neuronales après ces co-

traitements.

2.1.5. Interactions potentielles entre ces différents mécanismes

Il existe des évidences de liens étroits entre les mécanismes associés à la perte cellulaire

induite par le PDC précédemment décrits, notamment entre excitotoxicité et stress oxydant

(Figure 75). Ainsi, la vulnérabilité préférentielle des neurones DA au PDC dans des cultures

203

primaires mésencéphaliques serait liée à une réduction du seuil d'excitotoxicité par un stress

oxydatif spécifiquement dans ces neurones (Nafia et al., 2008). Nos résultats in vivo sont en

accord avec cette hypothèse en montrant une protection avec des antagonistes NMDA

(ifenprodil et mémantine) ou avec l’antioxydant NAC, suggérant la participation de

l’excitotoxicité et du stress oxydant dans un mécanisme commun. Pour vérifier la relation

entre excitotoxicité et stress oxydatif, on pourrait envisager de mesurer les taux de GSH dans

la SNc d’animaux ayant reçu une co-injection du PDC avec l’ifenprodil ou la mémantine. Les

données de la littérature suggèrent que les transporteurs gliaux seraient responsables de 90%

de l’élimination du glutamate synaptique alors qu’EAAC1 aurait plutôt un rôle métabolique

en fournissant notamment les précurseurs pour la synthèse de GSH (Nieoullon et al., 2006).

Ainsi, le PDC étant un bloqueur à la fois des transporteurs gliaux et neuronaux peut combiner

la toxicité liée à l’altération des fonctions de ces deux types de transporteurs :

- Le blocage des transporteurs gliaux conduisant à l’augmentation du glutamate

extracellulaire et ainsi expliquer les pertes induites par excitotoxicité,

- Le blocage du transporteur neuronal EAAC1 pouvant, quant à lui, expliquer

l’augmentation du stress oxydant consécutive à la baisse en GSH qui est

vraisemblablement due à un défaut d’approvisionnement en substrats.

Afin de préciser les rôles respectifs joués par les transporteurs gliaux et neuronaux, nous

envisageons de remplacer l’injection de PDC par celle de bloqueurs spécifiques soit du

transporteur neuronal (le LA HA) soit des transporteurs gliaux (le DHK) et mesurer les pertes

neuronales dans ces conditions. Ce résultat nous permettra, après comparaison des pertes

induites avec le PDC, de montrer s’il est nécessaire de bloquer l’ensemble des EAATs pour

induire une mort des neurones DA ou si le blocage de l’un ou l’autre type de transporteur est

suffisant. Etant donné le rôle métabolique clé du transporteur EAAC1, il serait également

important de tester l’effet du PDC sur le modèle de souris KO pour le transporteur neuronal

EAAC1. Le KO d’EAAC1 étant suffisant pour induire une perte des neurones DA (Berman et

al., 2011), il est envisageable que les pertes DA provoquées par l’injection de PDC dans notre

modèle ne soient dues qu’au blocage du transporteur neuronal. Dans ce cas, l’injection de

PDC chez ces souris n’aggraverait pas les pertes induites par le KO lui-même. A l’inverse si

les pertes induites par le PDC sont dues au blocage des deux types de transporteurs

(neuronaux et gliaux), l’injection de PDC conduirait à une aggravation des pertes DA de la

SNc.

204

A noter qu’il existe également des interactions fortes entre d’autres mécanismes mis en jeu

dans la mort neuronale induite par le PDC et notamment entre le stress oxydatif et la neuro-

inflammation (Hirsch and Hunot, 2009), au travers de la production élevée de radicaux libres

par les cellules microgliales activées ; entre l’excitotoxicité et l’autophagie mis en évidence

sur des modèle d’excitotoxicité (Yue et al., 2002) et pouvant faire intervenir particulièrement

la sous-unité NR2B (Bigford et al., 2009) ; entre le stress oxydatif et l’autophagie notamment

au travers de la régulation de la fonction mitochondriale (Lee et al., 2012b) (Figure 75).

D'autres mécanismes que nous n'avons pas encore investigué peuvent également contribuer à

la mort des neurones DA, notamment un dysfonctionnement mitochondrial ou encore un

dysfonctionnement du système UPS. Cette dernière possibilité est étayée par l'observation

d'agrégats d' α-synucléine après injection intranigrale de PDC (Nafia et al., 2008). Il est à

noter que ces mécanismes peuvent aussi interagir avec les mécanismes précédemment décrits.

Par exemple, une étude montre qu’une altération du transport du glutamate et un

dysfonctionnement mitochondrial peuvent se potentialiser pour induire une mort cellulaire.

En effet la présence de PDC avec une toxine mitochondriale induit une mort cellulaire à des

concentrations infraliminaires où aucun de ces composés n’a un effet toxique sur la survie

cellulaire (Garcia and Massieu, 2003).

L’association entre tous ces mécanismes rend le tableau assez complexe. De plus, il est

probable que plus de deux mécanismes soient interconnectés dans la mort neuronale induite

par le PDC. L’étude de l’interaction entre ces mécanismes dans notre modèle est très

intéressante et permettrait de mieux comprendre la vulnérabilité préférentielle des neurones

DA aussi bien dans notre modèle que dans un cadre pathologique comme la MP. De plus les

interconnexions entre tous ces mécanismes pourraient également rendre compte de la

formation d’un cercle-vicieux de mécanismes dégénératifs capables de s’auto-entretenir et

pouvant être responsable d’un mécanisme neurodégénératif progressif (Figure 75).

205

Figure 75. Mécanismes potentiellement impliqués dans la mort cellulaire induite par un

dysfonctionnement des EAATs.

2.1.6. Pourquoi le PDC affecte-t-il spécifiquement les neurones

dopaminergiques ?

Nous avons vu que le PDC utilisé en aigu dans la même gamme de concentration que celle

que nous avons utilisée dans notre étude ne provoque pas de dommages dans d’autres

structures cérébrales comme le striatum ou l’hippocampe (Massieu et al., 1995; Montiel et al.,

2005) suggérant un effet différentiel selon la structure injectée. Par ailleurs, les injections

intranigrales de PDC provoquent une perte spécifique des neurones DA de la SNc sans

atteinte de la population GABA de la SNr. Cette atteinte différentielle suggère un effet

différent selon le phénotype neuronal. Savoir pourquoi les neurones DA présentent cette

caractéristique unique de vulnérabilité pour le PDC est une question d'intérêt. Des données de

la littérature permettent d’ores et déjà de formuler plusieurs hypothèses :

Les neurones DA de la SNc constituent la population neuronale mésencéphalique qui exprime

le plus haut niveau du transporteur EAAC1 (Plaitakis and Shashidharan, 2000). Ainsi le

blocage de ces transporteurs pourrait avoir une plus forte répercussion sur cette population

neuronale que sur d’autres vis-à-vis de la déplétion intracellulaire en GSH. Au-delà de ce

point, il semble que le maintien des taux de GSH soit particulièrement important dans les

206

neurones DA. En effet, la « downregulation » de la synthèse de GSH induit une perte des

neurones DA de la SNc (Chinta et al., 2007; Garrido et al., 2011) sans affecter les neurones

GABAergiques de la SNr ou du noyau parabrachial et n’affectant que très faiblement les

neurones striataux (Garrido et al., 2011). Ceci peut être sous-tendu par le fait que le

métabolisme même de la DA est constitutivement générateur de ROS (Lotharius and Brundin,

2002; Choi et al., 2003). Ainsi il est aisément compréhensible que pour ces neurones les

mécanismes de détoxification, et notamment l’approvisionnement en précurseurs du GSH,

soient essentiels à leur survie. Cette hypothèse est confirmée par la souris KO pour le

transporteur neuronal EAAC1 où des pertes neuronales DA sont observées associées à une

déplétion en GSH et un stress oxydatif (Berman et al., 2011).

Les neurones DA de la SNc expriment des récepteurs NMDA atypiques hétérotrimériques

avec des sous-unités présentant une localisation préférentiellement au niveau extrasynaptique

et impliqués dans les processus d’excitotoxicité (Brickley et al., 2003). L’augmentation

extracellulaire de glutamate peut conduire à l’activation des récepteurs NMDA

extrasynaptiques et pourrait rendre compte d’une vulnérabilité préférentielle à des élévations

de la concentration extracellulaire du glutamate. La DA elle-même rendrait les neurones plus

vulnérables aux processus excitotoxiques. La toxicité du glutamate impliquerait notamment

une surproduction de DA au travers de la voie ERK (Izumi et al., 2009).

Il semble également que les neurones DA de la SNc soient particulièrement vulnérables aux

dérégulations des processus autophagiques. Des mutations du gène ATP1γAβ sont à l’origine

du syndrome de Kufor–Rakeb dont la caractéristique principale est un syndrome parkinsonien

très précoce (Usenovic et al., 2012). In vitro, le KO de ce gène dans des fibroblastes dérivés

de patients parkinsoniens, ou dans des lignées cellulaires DA provoque une diminution de la

clairance des autophagosomes associée à une mort cellulaire (Dehay et al., 2012). De plus le

KO du gène Atg7 dans les neurones DA de la SNc conduit à une perte de ces neurones avec

l’âge (Ahmed et al., 2012).

Deux autres éléments ne seraient pas liés aux neurones DA eux-mêmes, mais plutôt à leur

environnement. En effet, la SN est une des régions contenant les plus fortes concentrations de

cellules microgliales du cerveau (Lawson et al., 1990). Cette forte densité en cellules

microgliales pourrait rendre compte d’une vulnérabilité préférentielle aux processus

neuroinflammatoires. De façon intéressante, l’injection de LPS in vivo provoque des pertes

neuronales au niveau de la SN mais pas au niveau du cortex ou de l’hippocampe (Castano et

al., 1998; Kim et al., 2000). De plus, la SN possède une couverture astrocytaire très faible

207

(Damier et al., 1993), qui pourrait également rendre compte d’une vulnérabilité préférentielle

de ces neurones.

Il semble donc que les neurones DA présentent une vulnérabilité préférentielle à un ensemble

de mécanismes pouvant être initialisés par le dysfonctionnement des EAATs. De plus il est

important de noter que ces mécanismes n’agissent pas forcément de manière isolée mais

interagissent entre eux, et cette interaction pourrait renforcer la vulnérabilité préférentielle des

neurones DA de la SNc à l’injection de PDC.

2.2. Mécanismes impliqués à long terme

La caractéristique la plus surprenante de l’effet de l’injection aiguë intranigrale de PDC est la

perte progressive des neurones DA de la SNc ipsilatérale pendant au moins 4 mois et

l'extension de l'atteinte à la SNc controlatérale non-injectée tardivement dans le processus

dégénératif. Les mécanismes responsables de ces pertes ne sont pas encore élucidés mais

plusieurs hypothèses peuvent être formulées.

Du côté ipsilatéral, on pourrait envisager que le PDC est encore actif et dans cette hypothèse,

les mécanismes sous-tendant les pertes à court et long termes seraient identiques. Une autre

hypothèse plus probable et plus intéressante serait que le PDC n’étant plus présent dans le

tissu, les mécanismes impliqués dans la perte cellulaire à court terme initiés par le PDC soient

capables d’engendrer un processus dégénératif évolutif capable de s’auto-entretenir. Dans

cette hypothèse, la question est de savoir si ce sont les mêmes mécanismes qui s’auto-

entretiennent, ou si les mécanismes initiaux conduisent à la mise en place de mécanismes de

mort cellulaire spécifiques à la perte à long terme.

Du côté controlatéral, la différence majeure est que le PDC n’a pas été injecté dans cette

structure, de sorte que les mécanismes à l’origine de cette perte ne peuvent pas être initialisés

directement par le PDC contrairement au côté ipsilatéral. L’atteinte controlatérale met

probablement en jeu des réseaux cellulaires. Même s’il n’y a pas, à ma connaissance, de

preuves montrant une connexion directe entre les deux SNc, les données de la littérature

montrent une interdépendance étroite des deux voies nigrostriées. La première évidence

directe fut la démonstration qu’une lésion de la SNc engendre un arrêt de la libération de DA

dans le striatum ipsilatéral à lésion et une augmentation dans le striatum controlatéral

208

(Nieoullon et al., 1977a). De plus, l’application nigrale unilatérale de glycine ou de GABA

induit des effets bilatéraux symétriques dans les deux striatum (Leviel et al., 1979b). Par

ailleurs, il existe des projections nigrostriatales croisées, qui concerneraient un faible

pourcentage des neurones DA de la SNc (1-10%) (Lieu and Subramanian, 2012). Ces

neurones DA projetant vers le striatum controlatéral seraient plutôt localisés dans la région

caudale de la SNc (Morgan et al., 1986). Dans des cas de lésions DA, les changements induits

au niveau de cette voie nigrostriée croisée sont sujets à discussion : alors qu’une étude montre

que la lésion DA par la 6OHDA provoque une augmentation du nombre de neurones projetant

vers le striatum controlatéral à court terme avant de revenir au niveau des contrôles à long

terme (Pritzel et al., 1983), d’autres études suggèrent à l’inverse une perte de ces connexions

croisées après lésions DA (Altar et al., 1983; Douglas et al., 1987). Nous allons voir qu’il

existe plusieurs systèmes capables d’influencer de façon bilatérale la SNc.

2.2.1. Implication de l’excitotoxicité ?

Une première expérience permettant de mesurer l’implication de l’excitotoxicité à long terme

serait de réaliser des expériences de neuroprotection avec un traitement chronique avec la

mémantine et/ou l’ifenprodil débutant après la phase de perte à court terme. Si ces composés

induisent une protection ou un ralentissement de la dégénérescence à long terme, alors nous

pourrons conclure que l’excitotoxicité au travers d’une sur-activation des récepteurs NMDA

est également impliquée dans la progression du processus dégénératif. Cette excitotoxicité à

long terme pourrait être consécutive à celle observée à court terme, ce qui montrerait que dans

notre modèle l’injection de PDC peut provoquer un excitotoxicité qui est capable de s’auto-

entretenir en l’absence de PDC dans le tissu.

La source la plus évidente de cette excitotoxicité à long terme serait les afférences

glutamatergiques de la SNc. Les principales proviennent du NST et du PPN. Il a été

déterminé qu’une perte des neurones DA de la SNc est associée à une augmentation de

l’activité des neurones du PPN et du NST (Vila et al., 1997; Hirsch et al., 2000) même s’il

n’est pas évident que le lien soit direct entre déplétion en DA et hyperactivité des neurones de

ces structures (Hirsch et al., 2000; Guatteo et al., 2009).

L’atteinte controlatérale pourrait également faire intervenir des processus excitotoxiques. De

façon intéressante il existe des afférences glutamatergiques contrôlant la SNc de façon

209

bilatérale notamment en provenance du cortex, des noyaux intralaminaires du thalamus

(comme le Cm/Pf) ou du PPN (Cheramy et al., 1983; Cheramy et al., 1984; Parent et al.,

1999). Il a été montré que la stimulation électrique du cortex moteur ou de plusieurs noyaux

thalamiques provoque une libération équivalente de DA dans les deux striatum, et que cette

libération controlatérale est abolie après section du corps calleux (Nieoullon et al., 1978;

Cheramy et al., 1983).

La dégénérescence controlatérale pourrait également être causée par une hyperactivité du

NST rendu hyperactif. Même s’il n’existe pas d’études montrant une projection bilatérale du

NST vers les SNc, il existerait une « communication » entre les deux NST, où des

changements d’activité induits au niveau d’un NST peuvent se répercuter sur l’autre NST

(Brun et al., 2012). La majorité de ces évidences nous proviennent de la stimulation haute

fréquence de ce noyau dans un contexte parkinsonien où la stimulation du NST provoque des

effets bilatéraux sur le STN ainsi que sur les symptômes moteurs (Gubellini et al., 2009; Brun

et al., 2012). De plus la stimulation du NST chez des rats sains provoque une diminution

bilatérale du nombre de cellules gliales néoformées dans les deux SNc (Steiner et al., 2008).

Afin de déterminer l’implication de ces structures afférentes à la SNc dans les processus

dégénératifs à long terme affectant les deux SNc, une première approche envisageable serait

d’effectuer un marquage par HIS quantitative de la sous-unité I de la cytochrome oxydase

(CoI), en tant qu’index métabolique de l’activité neuronale, dans ces structures

glutamatergiques afférentes à la SNc ce qui nous permettrait de mesurer une hyperactivité des

neurones présents dans ces structures. Une approche plus fonctionnelle consistant en

l’enregistrement électrophysiologique in vivo de l’activité de ces noyaux chez des rats après

l’injection de PDC permettrait de préciser leurs éventuels changements de pattern d’activité,

et de voir si l’on retrouve comme dans plusieurs études une augmentation de la fréquence de

décharge mais surtout le passage d’un pattern de décharge régulier à un pattern irrégulier en

bursts (Hassani et al., 1996; Vila et al., 2000). Il semblerait que les modifications d’activités

du NST ne soient pas les même en fonction du degré de la lésion. Une atteinte partielle

entraînerait l’induction d’un pattern en bursts sans modification du rythme de décharge alors

que dans le cas d'une lésion totale le rythme de décharge augmente (Breit et al., 2007). Une

lésion ou stimulation cérébrale profonde de ces structures glutamatergiques afférentes après

l’injection de PDC nous permettrait finalement de déterminer le rôle causal de leur

hyperactivité dans la perte des neurones DA de la SNc à long terme. Nous avons d'ores et déjà

réalisé une hybridation quantitative de la CoI dans le NST à 4, 30 et 120 jpi et nos données

210

préliminaires montrent une forte asymétrie du signal en faveur du NST ipsilatéral à 30 jpi et

au contraire en faveur du NST controlatéral à 120 jours. La quantification à un niveau

cellulaire par rapport aux shams est en cours de réalisation, mais ces premières observations

suggèrent déjà une cinétique d’activation complexe des NST des β hémisphères dans notre

modèle. De telles données soutiendraient l’hypothèse d’une excitotoxicité à long terme

indépendante de l’action directe du PDC et faisant intervenir des adaptations fonctionnelles

du réseau, d’autant plus si les changements d’activité des structures glutamatergiques se

produisent avant même la perte cellulaire controlatérale.

2.2.2. Implication du stress oxydatif ?

Plusieurs données de la littérature suggèrent qu’un stress oxydatif peut affecter le transport du

glutamate (Trotti et al., 1998). Le dysfonctionnement des EAATs pouvant lui-même en retour

générer un stress oxydatif ; l’induction d’un stress oxydatif pourrait donc contribuer à

entretenir un cercle vicieux conduisant à une perte neuronale en altérant le fonctionnement

des EAATs.

La déplétion en GSH ou un stress oxydatif peuvent altérer le fonctionnement des

transporteurs du glutamate soit indirectement, via un déficit énergétique résultant d’un

dysfonctionnement mitochondrial, soit directement, via les ROS générés à partir du péroxyde

d’hydrogène ou par la xanthine oxydase qui inhibent le transport du glutamate (Trotti et al.,

1998). Parmi les agents déjà testés, le peroxynitrite (ONOO-) est de loin le plus puissant, avec

une action quasi immédiate (Trotti et al., 1996). Ces molécules inhibent le transport du

glutamate par une action directe au travers de l’oxydation ou de la nitrosylation des EAATs

(Trotti et al., 1998). Il serait particulièrement intéressant de déterminer si dans notre modèle,

le stress oxydatif induit par le PDC conduit à de telles modifications des EAATs, et si

l’activité de transport est altérée à long terme, ce qui permettrait de suggérer une influence du

stress oxydatif notamment au travers de la production des ROS dans l’entretien d’un

dysfonctionnement des EAATs et du processus dégénératif.

Nous pourrions également quantifier les taux de GSH ainsi que les activités des enzymes

associées dans la SNc à long terme ce qui permettrait de voir si la déplétion en GSH est

encore présente à ces délais et si elle est toujours associée aux pertes cellulaires tardives. Par

211

ailleurs, un traitement chronique à la NAC démarré après la phase aiguë de dégénérescence

permettrait de mettre en évidence un rôle causal du stress oxydant dans les pertes tardives

induites par le PDC. Un effet neuroprotecteur de ce traitement soulignerait l’importance de ce

mécanisme dans les pertes neuronales à long terme et serait en phase avec la neuroprotection

observée avec ce même composé chez les souris KO pour EAAC1 (Berman et al., 2011).

Afin de mesurer l’implication du NO et de son métabolisme dans les pertes à long terme

induite par le PDC, nous envisageons de réaliser une étude histologique de l'activité de la

NADPH-diaphorase, marqueur de l'activité de l'oxyde nitrique synthase (NOS), permettant

d'identifier les neurones produisant de NO (Hope et al., 1991). Les neurones de la SNc

n’expriment normalement pas cette enzyme, ainsi la présence de neurones positifs pour la

NADPH-diaphorase dans la SNc à long terme du côté ipsilatéral et controlatéral fournira une

indication de l’implication du NO dans les pertes cellulaires. Il a récemment été montré que

les neurones de la SNc exprimaient cette enzyme après traitement à la roténone (Madathil et

al., 2013). La production de NO semble très importante dans les pertes cellulaires induites par

plusieurs toxines, étant donné que des inhibiteurs de la NOS bloquent les pertes induites par

la roténone ou le MPTP par exemple (Kurosaki et al., 2002; Madathil et al., 2013). Ainsi, ce

résultat sera d’autant plus important que le NO est capable d’inverser le fonctionnement des

EAATs gliaux (McNaught and Jenner, 2000), et pourrait ainsi entretenir un cercle vicieux.

.

2.2.3. Réactivités gliales

Nous avons montré à 4 jpi une forte réactivité neuroinflammatoire au niveau de la SN alors

que la réactivité astrocytaire est négligeable. L’évolution spatio-temporelle ces deux

réactivités gliales a également été analysée jusqu’à 60 jpi. La réactivité microgliale induite au

niveau de la SN est très intense et précoce et décroît avec le temps pour revenir à la normale

60 jpi. La réactivité astocytaire est plus tardive, puisqu’elle présente un pic à 15 et γ0 jpi.

Ces réactivités gliales sont généralement considérées comme ayant un rôle protecteur

(McGeer and McGeer, 2008) mais elles peuvent également participer aux processus

chroniques de dégénérescence dus à l’inflammation (Teismann et al., 2003). La microglie,

correspondant aux macrophages résidents du SNC forme la principale défense immunitaire

active du système nerveux central (Hirsch and Hunot, 2009). Les cellules microgliales

peuvent produire un grand nombre d’anions superoxydes et d’autres neurotoxines. Leur

212

toxicité envers les neurones DA a été démontrée en culture ainsi que dans des modèles

animaux (Hirsch and Hunot, 2009).

Une atteinte aiguë de la SN peut induire une inflammation locale capable de se maintenir. En

revanche, les données conférant un rôle à la réactivité astrocytaire dans la SN sont plus rares.

Ces cellules sont connues comme pouvant secréter des molécules à la fois pro- et anti-

inflammatoires et pourraient jouer un rôle dans la modulation de l’activation microgliale

(Teismann et al., 2003).

Dans notre modèle, la réactivité microgliale est plus précoce que la réactivité astrocytaire qui

a l’air de suivre, ou au moins, être concomitante de la perte neuronale observée dans la SNc.

Ceci se confirme également lors de l’analyse régionalisée. En effet, dans la région antérieure

de la SNc, la réactivité microgliale est déjà très élevée avant l’apparition de dégénérescence

cellulaire ; alors que la réactivité astrocytaire devient maximale après que le processus

dégénératif soit mesuré. Ainsi, ces deux réactivités se déroulent dans une fenêtre temporelle

laissant suggérer leur implication dans l’évolution du processus dégénératif. La réactivité

microgliale étant précoce, elle pourrait contribuer à la perte cellulaire observée après

l’injection de PDC du côté ipsilatéral alors que la réactivité astrocytaire, plus tardive, pourrait

soit contribuer au ralentissement des pertes cellulaires dans la première phase de

dégénérescence soit, à l’inverse, participer au maintien de la seconde. Nos premières

observations dans la SN controlatérale ne montrent aucune réactivité microgliale jusqu'à 60

jours post-injection de PDC, alors qu'une neurodégénérescence est déjà observée, ce qui est

en défaveur d'une contribution de processus neuroinflammatoires dans la bilatéralisation de

l'atteinte. Afin de trancher sur le rôle de la réaction neuroinflammatoire dans la progression

des pertes neuronales dans notre modèle, nous pourrions déterminer si des molécules aux

propriétés anti-inflammatoires comme l’ibuprofène ou la minocycline peuvent stopper ou

freiner la perte secondaire soit analyser si l’injection d’un agent pro-inflammatoire aggrave

les pertes.

Les cellules astrocytaires communiquent entre elles au travers de jonctions GAP (Giaume and

Liu, 2012). Ces connexions s’établiraient entre un très grand nombre de cellules astrocytaires

formant un véritable syncytium (Giaume and Liu, 2012). Celui-ci peut être très étendu et l’on

pourrait imaginer que cette connexion entre cellules astrocytaires pourrait également être

responsable de l’atteinte controlatérale. Nos données préliminaires semblent indiquer une

réactivité astrocytaire dans la SN controlatérale dès 15 jpi se maintenant jusqu’à 60 jpi. Le

rôle du syncytium astrocytaire dans ces pertes controlatérales pourrait être évalué sur des

213

souris où un des allèles de la connexine 4γ, la protéine formant les jonctions GAP

astrocytaire, a été inactivé. Si, chez ces souris, l’atteinte controlatérale n’est plus observée,

une implication directe du syncytium astrocytaire dans les pertes DA controlatérales pourra

être envisagée.

214

III. L’injection de PDC récapitule les caractéristiques

pathogéniques et neuropathologiques majeures de

la maladie de Parkinson

La cause primaire responsable du processus dégénératif ayant lieu dans les cas de MP

sporadiques est toujours inconnue. Les hypothèses actuelles privilégient une origine

multifactorielle, où le processus à l’origine de la perte des neurones DA proviendrait

d’interactions réciproques entre plusieurs mécanismes impliqués. Ces mécanismes incluent

par exemple une déplétion en GSH, un stress oxydatif, une neuro-inflammation,

l’excitotoxicité, des processus autophagiques, un dysfonctionnement mitochondrial, ou encore

un dysfonctionnement du SUP (Olanow, 2007; Blandini, 2010).

Nous avons montré que la plupart de ces mécanismes peuvent être initiés par un

dysfonctionnement aigu des EAATs, au travers de l’injection intranigrale de PDC. En plus,

comme dans la pathologie, il semble que ces mécanismes peuvent interagir et former un

cercle vicieux capable d’entretenir le processus dégénératif à long terme.

Ainsi, en activant les mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP, on pourrait penser

que le processus dégénératif qui découle de l’injection de PDC pourrait ressembler à celui

observé dans la pathologie et créer un tableau proche de celui de la MP.

3.1. Aspects cellulaires

Perte spécifique des neurones DA de la SNc. Dans la MP, la dégénérescence au niveau de

la SN ne concerne que la population DA de la SNc. Dans notre modèle, l’injection

stéréotaxique de PDC, réalisée entre la SNc et la SNr, provoque également une vulnérabilité

différentielle de ces deux populations neuronales avec une atteinte spécifique des neurones

DA de la SNc sans altération des neurones GABAergiques de la SNr, du moins à court terme.

Il reste à examiner si cette perte préférentielle est toujours présente à plus long terme lorsque

le processus dégénératif évolue. Alors que la perte d’immunomarquage TH a été confirmée

215

correspondre à une véritable perte cellulaire à 60 jpi du côté ipsilatéral par comparaison avec

le nombre de cellules présente dans la SNc après marquage histologique au bleu de toluidine,

la spécificité de l’atteinte, mesuré après comptage des neurones exprimant la GAD67 dans la

SNr, n’a été réalisée qu’à 4 jpi et nécessite d’être ré-éditée à plus long terme. De plus, la

comparaison entre le nombre de cellules TH-positives et le nombre de cellules mesuré après

marquage histologique au bleu de toluidine du côté controlatéral, n’a pas encore été réalisée

ce qui ne nous permet pas d’exclure une diminution d’expression de la TH ou un changement

de phénotype des neurones DA de la SNc controlatérale.

Au-delà de la spécificité d’atteinte entre les neurones DA et GABAergiques de la SN, les

neurones DA mésencéphaliques présentent un degré d’atteinte différent dans la MP. Les

neurones DA de la SNc sont préférentiellement atteints alors que les neurones DA de l’ATV

sont relativement préservés (Sulzer and Surmeier, 2013). Il semble que même plusieurs mois

après l’injection de PDC dans la SNc, l’ATV reste préservée dans notre modèle, même

lorsque l’atteinte se bilatéralise et atteint la SNc controlatérale. Une analyse quantitative du

nombre de neurones de l'ATV doit cependant être réalisée pour exclure une atteinte partielle.

Pour confirmer la vulnérabilité différentielle des neurones de la SNc et de l'ATV, il est

envisagé de déterminer si l’injection de PDC dans l'ATV produit ou non des pertes neuronales

DA à ce niveau. Dans ce cas, il serait également intéressant de voir si les réponses

électrophysiologiques dans ces deux régions à l’application de PDC sont équivalentes où s’il

existe, comme entre la SNc et la SNr, des différences pouvant sous-tendre une vulnérabilité

différentielle de ces deux populations DA.

Excitotoxicité : Même s’il est généralement considéré que l’excitotoxicité ne jouerait pas un

rôle primaire dans la dégénérescence des neurones DA de la SNc, plusieurs données

suggèrent néanmoins, une implication de celle-ci dans la pathogenèse peut être plutôt

secondairement après un stress oxydatif ou un dysfonctionnement mitochondrial (Blandini,

2010). L’inhibition du complexe I mitochondrial par des toxines comme la roténone ou le

paraquat peuvent potentialiser l’effet toxique du glutamate sur les neurones DA (Shimizu et

al., 2003b; Wu and Johnson, 2009). De plus, la présence de la DA elle-même participerait à la

vulnérabilité de ces neurones aux processus excitotoxiques (Izumi et al., 2009). Enfin, il a été

montré que des antagonistes des récepteurs glutamatergiques ont un effet neuroprotecteur

dans plusieurs modèles animaux de la MP, même si leur efficacité dans la pathologie n’est

pas clairement établie (Turski et al., 1991; Yacoubian and Standaert, 2009; Blandini, 2010).

Comme nous l’avons déjà précisé, plusieurs systèmes glutamatergiques sont hyperactifs dans

216

la MP comme notamment la transmission cortco-striée ou le NST (Blandini et al., 1996;

Hirsch et al., 2000).

Ainsi, notre modèle basé sur un dysfonctionnement de transmission glutamatergique au

niveau de la SN, provoque une vulnérabilité préférentielle des neurones DA de la SNc,

pouvant être réversée par des antagonistes des récepteurs NMDA présentant un potentiel

neuroprotecteur (Yacoubian and Standaert, 2009). Toutefois, comme précisé plus haut, les

changements fonctionnels au niveau des structures glutamatergiques pouvant être impliquées

dans les processus excitotoxiques intervenant dans la pathologie sont en cours d’investigation.

Déplétion en GSH et stress oxydant. Un des changements biochimiques les plus précoces

dans la MP est une déplétion en GSH au niveau de la SN. Des changements au niveau des

enzymes associées à son métabolisme sont également observés avec une augmentation

spécifique de l’activité de la -GT sans changement de l’activité de l’enzyme de synthèse

(GCL) ou des enzymes de détoxification (GPx, GST) (Sian et al., 1994b; Schulz et al., 2000).

Une autre enzyme montre une augmentation de son activité, la GSH réductase, une enzyme

importante également pour le maintien des taux intracellulaires de GSH (Martin and

Teismann, 2009). De plus, des index de stress oxydatif comme la peroxydation des lipides est

également caractéristique de la MP (Dexter et al., 1989). Dans notre modèle, l’injection de

PDC reproduit tous ces changements au niveau des taux de GSH, de son métabolisme

(excepté l’augmentation de l’activité de la GSH reductase que nous n’avons pas explorée)

ainsi que des marqueurs de peroxydation lipidique (TBARs). Etant donné la forte homologie

entre les données de patients parkinsoniens et les nôtres, il est tentant de proposer que la

déplétion en GSH soit imputable, dans la pathologie comme dans notre modèle, à un défaut

de disponibilité des substrats pour sa synthèse et que ce défaut puisse résulter d'un

dysfonctionnement des EAATs. En faveur de cette hypothèse, il a été montré dans un modèle

souris que le MPTP conduit à la translocation d’EAAC1 à la membrane ainsi qu’une

augmentation de sa nitration, laquelle provoque une réduction des contenus en GSH

consécutive à une diminution de la capture de la cystéine (Aoyama et al., 2008). Ceci suggère

que le stress oxydatif provoqué par le MPTP, peut altérer la synthèse neuronale de GSH via

un dysfonctionnement d’EAAC1 dans le mésencéphale.

Agrégats d’ α-synucléine. Une caractéristique neuropathologique majeure de la MP est la

présence de CL dans les cellules en dégénérescence. Ces CL sont des agrégats

intracytoplasmiques positifs à l’α-synucléine. Le PDC conduit également à l’apparition

d’agrégats intracytoplasmiques positifs pour l’α-synucléine dans la SN à 4 jpi (Nafia et al.,

217

2008). Il a été montré que la déplétion en GSH peut provoquer une altération du

fonctionnement du SUP qui est responsable de la dégradation en protéines (Jha et al., 2002),

nous pouvons ainsi suggérer que la déplétion en GSH induite par le PDC pourrait affecter le

SUP conduisant à la formation d’aggrégats intracytoplasmiques d’α-synucléine. De plus, ces

agrégats ont été associés à un dysfonctionnement de la transmission glutamatergique,

notamment à une augmentation de l’expression du récepteur métabotropique du glutamate

mGluR5 chez les patients parkinsoniens ainsi que dans les modèles transgéniques (Price et al.,

2010).

Autophagie et apoptose. Des altérations des processus autophagiques ont été observés dans

la SNc de patients parkinsoniens ainsi que dans certains modèles animaux de la pathologie

(Anglade et al., 1997; Levy et al., 2009; Lynch-Day et al., 2012). L’association récente entre

des mutations au niveau de gènes impliqués dans les processus autophagiques et des formes

familiales de MP rend compte d’un intérêt croissant pour l’autophagie dans le cadre de la MP.

De plus, les mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP précédemment décrits comme

le stress oxydatif, un dysfonctionnement mitochondrial ou du SUP, sont étroitement liés à

l’autophagie et l’α-synucléine est capable d’altérer l’autophagie (Lynch-Day et al., 2012).

Dans notre modèle, une augmentation de la formation des autophagosomes est observée dans

la SN des rats injectés au PDC. De façon intéressante, il a été montré que les cellules

exprimant l’α-synucléine mutante présentent une augmentation de la mort cellulaire associée

à une accumulation d’autophagosomes (Stefanis et al., 2001). Au-delà de l’autophagie, la

mort cellulaire programmée par apoptose intervient également dans la perte des neurones DA

de la SNc dans la MP (Anglade et al., 1997; Vila et al., 2001; Vila and Przedborski, 2003;

Przedborski, 2005) où des neurones en apoptose ainsi qu’une augmentation de l’expression de

Bax et de la caspase 3 notamment (facteurs pro-apoptotique) sont observés (Anglade et al.,

1997; Tatton, 2000). Nous prévoyons de réaliser un immunomarquage de la caspase 3 afin de

voir si, comme dans la MP, la mort des neurones DA de la SNc après l’injection de PDC

associe des processus apoptotiques et autophagiques.

Réactivités gliales. Il a été montré dans la SN de patients parkinsoniens la présence

d’astrocytes et de cellules microgliales réactionnelles (Teismann et al., 2003; McGeer and

McGeer, 2008). La relation temporelle entre la perte des neurones DA et les réactivités

astrocytaires et microgliales au niveau de la SNc dans la MP n'est pas établie. En revanche,

ceci a déjà été étudié dans le modèle MPTP souris où le décours temporel des réactivités

gliales après l’injection de MPTP a été analysé. Dans ces études, il semblerait que la réactivité

218

astrocytaire apparaisse avec la perte neuronale dans la SNc et reste élevée même après la

vague principale de perte cellulaire (Czlonkowska et al., 1996; Kohutnicka et al., 1998;

Liberatore et al., 1999). Ces données suggèrent que la réactivité astrocytaire est secondaire à

la perte neuronale et non l’inverse Ceci est confirmé par le fait que le blocage de la formation

ou la capture du MPP+ protège non seulement la perte neuronale mais également la réactivité

astrocytaire (Przedborski et al., 2000). A l’inverse, la réactivité microgliale, qui est également

assez élevée dans le modèle MPTP, est beaucoup plus précoce que la réactivité astrocytaire et

atteint un maximum avant le pic de dégénérescence DA (Liberatore et al., 1999). Nos données

reproduisent ces caractéristiques cinétiques, où la réactivité microgliale est plus précoce que

la réactivité astrocytaire qui a l’air de suivre ou du moins être concomitante avec la perte

neuronale observée dans la SNc.

Influence sur les gènes impliqués dans les formes familiales de MP ? Les hypothèses des

mécanismes pouvant intervenir dans la pathogenèse de la MP viennent en partie de l’étude de

la fonction des gènes impliqués dans la MP. De façon intéressante, bien que DJ-1 soit

impliqué dans plusieurs mécanismes, sa principale fonction serait de lutter contre le stress

oxydatif. Il a été proposé que DJ-1 soit une peroxydase de type peroxyredoxine dont la

fonction est de réduire les peroxydes d’hydrogène (Andres-Mateos et al., 2007). DJ-1

régulerait la fonction de plusieurs gènes impliqués dans les défenses anti-oxydantes comme la

GCL, la SOD3 ou encore la MnSOD (Zhou and Freed, 2005; Nishinaga et al., 2005; Zhong

and Xu, 2008). DJ-1 aurait une capacité d’élimination du peroxyde d’hydrogène. DJ-1

pourrait également réguler l’expression d’autres gènes d'intérêt dans le cadre de la MP comme

la TH ou Bax (Jeong et al., 2006; Fan et al., 2008). De plus, il a été montré in vitro, que la 6-

OHDA induisait une translocation nucléaire de DJ-1 dépendante de la production de ROS

(Kim et al., 2012). Cette même étude a montré que l’effet protecteur de DJ-1 passe en partie

par la baisse d’expression de PUMA et de la forme acétylée de p5γ, qui de façon intéressante

sont impliqués dans les effets différentiels de l'activation des récepteurs NMDA

synaptiques/extrasynaptiques. Pour finir, le KO du gène DJ-1 entraine chez une partie des

souris une dégénérescence des neurones DA de la SNc asymétrique qui se bilatéralise à long

terme (Rousseaux et al., 2012). Etant donné la présence de stress oxydatif dans notre modèle

ainsi qu’un profil d’atteinte pouvant être rapproché de celui observé chez ces souris, nous

avons examiné les variations d’expression protéique de DJ-1 dans les SNc ipsilatérale et

controlatérale à plusieurs temps post-injection de PDC par quantification de l’intensité de

fluorescence du marquage immunocytochimique de DJ-1 à l’échelle cellulaire. Nos résultats

219

préliminaires semblent indiquer une diminution bilatérale de l’expression de DJ-1 à 30 jpi

(environ -β5% des deux côtés) plus marquée qu’à 60 jpi (environ -10% des deux côtés). Ces

données suggèrent qu’une diminution de l’expression de DJ-1 dans notre modèle due

possiblement à la présence de stress oxydatif pourrait également contribuer aux pertes

cellulaires à long terme et notamment controlatérales, étant donné que la baisse observée à 30

jpi est antérieure au début du processus dégénératif mesuré dans cette région. Reste à savoir si

dans notre modèle on observe également un changement de compartimentalisation de DJ-1

avec une localisation préférentiellement nucléaire, peut-être plus précocement après

l’injection de PDC, ce qui pourrait représenter un mécanisme compensatoire afin de limiter

les dommages provoqués par le stress oxydatif.

3.2. Atteinte de la voie nigro-striée et processus

compensatoires

3.2.1. Progression de l’atteinte neuronale dans la SN

La caractéristique majeure de cette étude est le caractère progressif de l’atteinte après une

injection aigüe de PDC. En effet, le processus dégénératif progresse tout au long de l’étude du

côté ipsilatéral et, de façon très surprenante, atteint plus tardivement le côté controlatéral non-

injecté rappelant la progression asymétrique de la MP.

Du côté ipsilatéral, la progression initialement rapide est suivie d’une phase de

dégénérescence plus lente. Ce décours se rapproche de celui décrit dans la MP, où il a été

montré que la perte des neurones DA évolue de façon non linéaire, avec un taux de perte

maximal en début de maladie, puis un ralentissement progressif avec l’avancée de la maladie

(Fearnley and Lees 1991). Ces données ont été confirmées par des mesures de la perte des

terminaisons DA striatales en imagerie PET ou SPECT de différents marqueurs, comme la

recapture de [18F]dopa ou la liaison de ligands sélectifs des DAT (Morrish et al., 1998; Pirker

et al., 2002; Pirker et al., 2003).

De plus, dans la MP, la région postérieure de la SNc semble être atteinte de façon plus

précoce et plus importante que la partie antérieure (Damier et al., 1999b). Dans notre modèle,

quel que soit le temps post injection de PDC considéré, la perte est plus faible dans la région

220

antérieure par rapport à la région postérieure où les pertes sont détectées plus tôt et présentent

des niveaux similaires à la région péri-injection. Nous ne pouvons pas exclure que cette

différence antéropostérieure soit due à une diffusion préférentielle du PDC en postérieur, bien

qu’un gradient de diffusion de ce type n’ait pas été rapporté pour d’autres molécules comme

la 6-OHDA. Pour vérifier l’hypothèse d’une vulnérabilité différentielle caudo-rostrale, il

faudrait injecter le PDC soit dans la région postérieure soit dans la région antérieure et

comparer les pertes au niveau de la région péri-injectée de ces différents groupes d’animaux.

Cette hypothèse sera vérifiée si la perte en neurones DA est plus élevée dans la région péri-

injectée chez les animaux injectés dans la région postérieure. Si tel est le cas, il serait

intéressant de déterminer les mécanismes sous-tendant cette vulnérabilité préférentielle,

notamment en termes de topographie d'expression des EAATs, des sous-unités NR2B et

NR2D des récepteurs NMDA, de distribution des afférences glutamatergiques ou encore de

réponses différentielles au PDC en électrophysiologie in vitro.

Au-delà du gradient de perte caudo-rostral décrit dans la MP, il a été montré que les

nigrosomes sont plus fortement atteint que la matrice (Damier et al., 1999b). Si nous

retrouvons cette topographie plus fine de répartition des pertes, ce modèle pourrait fournir un

outil pour analyser les mécanismes responsables de cette régionalisation des pertes. Pour le

mesurer, nous utiliserons un marqueur de la matrice, la calbindine (Damier et al., 1999a).

Le processus dégénératif associé à la MP présente une asymétrie qui évolue vers une

biléralisation lorsque la maladie progresse (Djaldetti et al., 2006). Ceci est d’ailleurs associé à

une présentation initialement asymétrique des symptômes moteurs. L’injection aiguë

unilatérale de PDC, reproduit cette caractéristique importante. En effet la dégénérescence est

tout d’abord unilatérale, asymétrique, puis se bilatéralise à partir de 60 jpi et le déficit de type

akinétique se manifeste du côté controlatéral à l’injection de PDC.

Dans la MP, les raisons de l’asymétrie de l’atteinte sont inconnues. Les hypothèses

potentielles pouvant sous-tendre cette asymétrie sont peu nombreuses (Djaldetti et al., 2006).

- Le nombre de cellules présentes dans la SNc à la naissance pourrait être plus faible

d’un côté que de l’autre. Dans ce cas, le processus dégénératif affecterait les deux

côtés de la même façon mais le côté possédant le moins de cellules atteindrait le point

critique (où les symptômes apparaissent) avant l’autre. Cependant, il n’existe pas de

données pouvant supporter cette hypothèse. En général, dans les études menées sur

des individus sains, le comptage n'est souvent réalisé que d’un côté du cerveau ; et

221

même lorsque les deux côtés ont été mesurés ils sont moyennés (Pakkenberg et al.,

1991; Djaldetti et al., 2006).

- La seconde hypothèse serait que pour des raisons qui restent à préciser, une des deux

SNc soit plus vulnérable que l’autre, et que, lorsque le processus dégénératif démarre,

la perte cellulaire est plus rapide d’un côté que de l’autre.

Dans notre cas, les animaux shams ne présentent aucune asymétrie droite/gauche dans le

nombre de neurones DA de la SNc et l’asymétrie de l’atteinte de ces neurones chez les

animaux PDC est générée par l’injection unilatérale du composé. Il est d'autant plus

surprenant que l'atteinte soit capable de se bilatéraliser à long terme sans devoir induire aucun

dysfonctionnement dans le côté controlatéral à l’injection de PDC, ce qui suggère une

implication de réseaux dans la progression des pertes neuronales. Nous pourrions tirer profit

de cette perte controlatérale pour déterminer si le gradient de perte caudo-rostral observé du

côté injecté est également présent en controlatéral, ce qui permettrait d’exclure l’effet

« diffusion » du PDC.

Une caractéristique neuropathologique importante de la MP est la perte neuronale dans

d’autres structures cérébrales que la SN, incluant le locus coeruleus, les noyaux du raphé ou le

complexe centre-median/parafasciculaire du thalamus (Braak et al., 2003; Sulzer and

Surmeier, 2013). La question reste posée de savoir si l’atteinte induite par le PDC provoque

des pertes neuronales dans ces structures.

3.2.2. Pertes de l’innervation dopaminergique striatale

Le striatum constituant la cible majeure des neurones DA de la SNc, la perte de ces neurones

dans la MP s’accompagne d’une perte parallèle en terminaisons DA striatales (Graybiel et al.,

1990). Cependant, dans notre modèle, l’injection de PDC n’induit aucun changement

significatif de l’immunomarquage de la TH du côté ipsilatéral à tous les temps examinés, et ce

malgré une perte neuronale effective dans la SNc atteignant 50% des neurones au temps le

plus long examiné. Les niveaux d’expression de la TH dans les structures cibles des

projections DA peuvent dépendre de la densité de terminaisons DA mais aussi des niveaux

d’expression intra-axonaux de la TH en fonction de l’activité des neurones nigrostriés. De ce

fait, nous avons donc utilisé l’immunodétection de DAT comme un marqueur plus indicatif

du nombre des terminaisons DA striatales. Cet immunomarquage montre une évolution

222

complexe dans le striatum, avec une phase de réduction à court terme (jusqu’à 15 jpi) d’une

amplitude comparable à celle de la perte neuronale mesurée dans la SNc, puis une phase de

récupération (entre 15 et 60 jpi, engageant probablement des processus compensatoires que

nous discuterons plus loin), suivie d'une seconde phase de réduction entre 60 et 120 jpi, alors

que la perte neuronale progresse durant toute cette période. Ce résultat permet donc de

montrer qu’il existe une perte des terminaisons DA présentant une cinétique complexe.

Confirmant cette perte de terminaisons DA, nous avons mis en évidence la présence de

neurites dystrophiques (marqués avec l’anticorps anti ATκ reconnaissant un épitope de la

protéine tau hyperphosphorylée) à tous les temps examinés. De plus, des expériences de

microdialyse, réalisées à 15 et 90 jpi, montrent une diminution de la libération striatale de DA

évoquée par le potassium à 15 jpi qui s’intensifie à λ0 jpi. Il existerait ainsi une perte des

terminaisons DA dans le striatum ipsilatéral associée à l’expression de mécanismes adaptatifs

qui ne semblent toutefois pas suffisant pour compenser le dysfonctionnement DA.

Du côté controlatéral, aucun changement des marqueurs TH et DAT n’a été observé quel que

soit le temps post-injection malgré la présence de pertes cellulaires dans la SNc à partir de 60

jpi. Toutefois, une diminution de la libération évoquée de DA est observée à 90 jpi.

L’ensemble de ces résultats suggèrent que des mécanismes adaptatifs permettraient de

compenser quantitativement mais pas fonctionnellement l’innervation DA striatale.

3.2.3. Processus compensatoires

Dans la MP, plusieurs éléments indiquent la présence de mécanismes compensatoires.

Différents facteurs seraient impliqués faisant intervenir notamment des modifications de

l’activité des neurones DA de la SNc ou de leurs afférences ainsi que des phénomènes de

plasticité morphologique neuronale (Bezard and Gross, 1998). Il semblerait que l’atteinte du

système DA nigrostrié s’accompagne de transformations fonctionnelles des neurones DA

restants qui seraient suffisantes pour normaliser les taux extracellulaires de DA dans le

striatum (Robinson and Whishaw, 1988). Il a été montré il y a maintenant 40 ans que la

destruction partielle des neurones DA de la SNc chez le rat conduit à une augmentation de

l’activité des neurones restants (Agid et al., 1973). Ce type de lésion provoquerait une

augmentation rapide de l’activité de la TH et une augmentation graduelle de la quantité en

ARNm de la TH, fournissant un processus compensatoire en réponse à une dégénérescence

223

partielle de la voie nigrostriée (Masserano and Weiner, 1983; Dravid et al., 1984; Zigmond et

al., 1989; Pasinetti et al., 1992; Blanchard et al., 1995). Dans la MP, en revanche, l’expression

génique de la TH et les taux de la protéine seraient diminués dans les neurones DA survivants

(Javoy-Agid et al., 1990; Kastner et al., 1993a; Kastner et al., 1993b). Ces différences entre

les observations cliniques et expérimentales pourraient être attribuées à l’état de

dégénérescence très avancé des neurones DA présents dans la SNc des patients parkinsoniens

(Javoy-Agid et al., 1990) ou au traitement à la L-DOPA (Rinne et al., 1979).

Dans notre modèle, la dégénérescence induite par l’injection de PDC s’accompagne

également de processus compensatoires au niveau des neurones DA restants. En effet, nous

avons mesuré une augmentation significative de l’expression génique de la TH dans les

neurones survivants de la SNc injectée aux temps de 30 et 60 jours, suggérant une

augmentation de l’activité neuronale. Une augmentation non significative est observée à 4

jours et il nous faudrait le point 15 jpi pour déterminer si ce processus intervient précocement.

A noter aussi que cette augmentation s’atténue et n’est plus significative à 1β0 jpi. Il serait

intéressant de déterminer si l’expression génique de la TH serait réduite à des stades plus

avancés de dégénérescence, comme décrit dans la pathologie.

En accord avec l’hypothèse d’une augmentation de l’activité des neurones DA épargnés, les

taux de base de DA dans le striatum restent identiques à ceux des animaux shams malgré la

perte neuronale, et ce, même plusieurs mois après l’injection de PDC. Cependant, la libération

striatale de DA évoquée par le potassium est fortement diminuée, à 15 jours du côté ipsilatéral

et dans les β hémisphères à λ0 jours. L’ensemble de ces données indique d’une augmentation

du turnover de la DA dans les neurones épargnés puisse maintenir le tonus DA basal au moins

jusqu’à λ0 jpi, mais ne pourrait pas soutenir une activité phasique. Il serait intéressant de

compléter notre analyse de la fonction DA avec des enregistrements in vivo de l’activité des

neurones DA épargnés. De façon intéressante, une augmentation du turnover DA a été

également rapportée dans la pathologie, notamment à des stades précoces, ce qui contribuerait

à maintenir une libération synaptique tonique de DA normale et retarder l’apparition des

symptômes (Sossi et al., 2002; Sossi et al., 2004).

Une augmentation de l’activité des neurones DA pourrait également rendre compte au niveau

du striatum du maintien de l’expression de la TH ou des modifications de DAT qui échappent

à la progression de la perte neuronale, au travers d’une régulation des niveaux d’expression de

ces marqueurs dans les axones des neurones épargnés. Une autre hypothèse pourrait être celle

d’un « sprouting » des terminaisons axonales des neurones restants, que nous pourrions

224

vérifier en réalisant par exemple une immuno-détection de GAP-43, protéine exprimée à haut

niveau dans les cônes de croissances neuronaux et considérée comme marqueur de repousse

axonale. Une telle hypothèse de repousse axonale a déjà été avancée pour rendre compte de la

récupération des déficits comportementaux induits par l’atteinte DA dans des conditions de

lésion partielle dans différents modèles de MP chez le rongeur ou le singe (Dravid et al.,

1984; Onn et al., 1986; Blanchard et al., 1996; Song and Haber, 2000; Bezard et al., 2000;

Finkelstein et al., 2000; Mounayar et al., 2007; Boulet et al., 2008).

3.2.4. Altérations de la neurogenèse

La neurogenèse adulte dans le système SVZ-BO est affectée de manière relativement

complexe dans les modèles animaux lésionnels de la MP (Borta and Hoglinger, 2007;

Marxreiter et al., 2013). Certaines études ont montré une diminution de nombre de cellules en

prolifération dans la ZSV, associée à des modifications régionales opposées du nombre de

neurones néoformés dans le BO, avec une diminution du nombre de neurones granulaires

GABAergiques et une augmentation du nombre de cellules TH-positives dans la couche

périglomérulaire (Hoglinger et al., 2004; Yamada et al., 2004b; Winner et al., 2006). Ces

données ont été interprétées comme un changement de destinée cellulaire des neurones néo-

formés dans le BO en faveur du phénotype DA des cellules périglomérulaires (Winner et al.,

2006). Néanmoins, certaines données obtenues à des temps post-lésionnels plus importants

(40 jours post-lésion environ) indiquent que la diminution de cellules néoformées granulaires

serait transitoire (Winner et al., 2006), ou montrent au contraire des augmentations du nombre

de ces cellules malgré la baisse de prolifération (Sui et al., 2012), suggérant une augmentation

de survie à long terme de l’ensemble des cellules néo-formées. La régulation de la survie est

un facteur important puisque environ 50% des progéniteurs neuraux ainsi que des neurones

néoformés sont éliminés par mort cellulaire programmée (Biebl et al., 2000; Winner et al.,

2002; Petreanu and Avarez-Buylla, 2002).

En accord avec les données bibliographiques, la lésion DA induite par l’injection unilatérale

de PDC dans notre modèle provoque une diminution du nombre de cellules en prolifération

dans la ZSV. Cette réduction, mesurée à 120 jpi est bilatérale, tout comme la perte en

neurones DA de la SNc observée à ce délai. Ceci pourrait aller dans le sens de la suppression

d’une influence positive directe exercée par la DA sur la prolifération cellulaire dans la ZSV,

225

même si, dans notre modèle, les changements de l’innervation DA au niveau de la ZSV après

l’injection de PDC n’ont pas été précisément étudiés. Nous avons aussi montré à 1β0 dpi une

augmentation significative et bilatérale du nombre de cellules BrDU-positives dans la zone

des cellules granulaires du BO, privilégiant l’hypothèse d’une augmentation à long terme de

la survie de ces cellules.

De fait, il semble que la prolifération et la survie cellulaire puissent être régulées de façon

indépendante. Ainsi par exemple, une étude récente du laboratoire a montré que la stimulation

à haute fréquence du NST de façon unilatérale sur un modèle de rat hémi-parkinsonien

n’impacte pas la prolifération mais augmente la survie cellulaire, et ce, de façon bilatérale

(Khaindrava et al., 2011). Au vu de l’ensemble de ces résultats, il est tentant de proposer que

la baisse de prolifération dans les modèles de MP soit liée à la déplétion en DA, alors que les

effets sur la survie ne seraient pas une conséquence directe de la déplétion en DA mais

pourraient résulter de phénomènes adaptatifs post-lésionnels plus complexes.

Ces résultats nécessitent des études complémentaires. Il faudrait notamment analyser ces

changements à différents temps post-PDC pour i) déterminer si des variations plus précoces

peuvent être observées, et notamment si on retrouve une baisse des cellules granulaires

néoformées à court terme; ii) regarder à plus long terme si l’augmentation de la survie

cellulaire au niveau du BO persiste, et essayer d’examiner ce qui pourrait la sous-tendre; iii)

déterminer le phénotype neuronal ou astrocytaire des cellules BrDU-positives dans la couche

granulaire du BO et voir si l’on retrouve une augmentation des neurones TH-positifs de la

couche péri-glomérulaire et iv) analyser l’association potentielle de ces modifications avec

des troubles olfactifs, comme cela semble être suggéré dans la littérature (Marxreiter et al.,

2013).

Par ailleurs, il faudrait aussi regarder les changements neurogéniques éventuels au niveau de

la deuxième zone majeure de neurogenèse adulte, l’hippocampe. En effet, des altérations de la

neurogenèse hippocampique ont été associées à des troubles comportementaux comme

l’anhédonie, la dépression ou l’anxiété qui sont des symptômes présents chez les patients

atteints de la MP (Marxreiter et al., 2013). Nos résultats préliminaires semblent ne montrer

aucune altération significative de la prolifération ou de la survie cellulaire dans cette région,

ni de troubles de type anxiété (hypophagie induite par la nouveauté) ou anhédonie (test du

sucrose).

226

3.2.5. Atteintes motrices

Dans la MP l’apparition des symptômes moteurs caractéristiques se fait plusieurs années

après le début du processus pathologique lorsque les pertes neuronales dans la SNc atteignent

50-60 % correspondant à une perte DA striatale de 70-80 % permettant ainsi de subdiviser le

décours de la MP en phases présymptomatique et en phase symptomatique (Bernheimer et al.,

1973; Agid et al., 1993; Vingerhoets et al., 1994). L’injection intranigrale de PDC provoque

une apparition tardive et progressive de symptômes moteurs de type parkinsonien qui

débutent à 60 jpi lorsque les pertes cellulaires ipsilatérales avoisinent les 50%, conduisant à

une baisse d’environ κ0% de libération de DA évoquée à λ0 jpi. Pour détecter l’apparition de

symptômes moteurs, nous avons réalisé 2 tests : i) le test de l’open-field permettant de

mesurer l’activité locomotrice spontanée des animaux placés dans une arène, et ii) le test du

cylindre permettant de mesurer une éventuelle asymétrie dans l’utilisation des pattes

antérieures. Dans l’open-field, les animaux injectés au PDC parcourent significativement

moins de distance que les animaux shams à partir de 60 jpi, et cette différence s’accentue à

120 dpi. Dans le test du cylindre, ils présentent une akinésie de la patte controlatérale non

significative à 60 jpi mais qui le devient à 120 jpi. Ainsi, les déficits de type akinétique

apparaissent de façon asymétrique à partir du moment où les pertes neuronales ipsilatérales

avoisinent les 50% correspondant également au délai où les processus compensatoires

ipsilatéraux semblent être dépassés. En effet à 120 jpi, on n’observe plus d’augmentation

significative de l’expression de l’ARNm de la TH dans les neurones survivants, et cette

période correspond à la deuxième phase de perte du marquage DAT striatal. Par ailleurs, il est

surprenant de remarquer que ces manifestations symptomatiques asymétriques apparaissent

alors que l'atteinte neuronale a gagné la SNc controlatérale, et qu'une réduction bilatérale de la

libération évoquée de DA est mesurée dans le striatum, bien que plus marquée du côté

ipsilatéral que controlatéral à la lésion. Il est possible qu’à ce temps post-injection des

processus compensatoires toujours présent du côté controlatéral empêchent l’apparition de

symptômes bilatéraux et que le seuil de perte, déclenchant les symptômes moteurs, n’est pas

encore atteint. De fait, il est envisageable qu’il soit nécessaire que le processus dégénératif

évolue d’avantage pour que les symptômes se bilatéralisent. En effet, la baisse de libération

évoquée de DA à λ0 jpi dans le striatum controlatéral est d’environ 60-65%, ce qui serait

inférieur au seuil de déclenchement des symptômes moteurs (Bernheimer et al., 1973).

227

3.3. Le PDC : un nouveau modèle d’étude de la MP ?

L’injection de PDC reproduit les phases présymptomatique (0 à 60 jpi) et symptomatique (à

partir de 60 jpi) de la MP (Figure 76). Durant la phase présymptomatique, des mécanismes

compensatoires sont mesurés au niveau des neurones DA restants dans la SNc et au niveau de

la cible de ces neurones, le striatum. Cette phase présymptomatique permet d’étudier les

mécanismes compensatoires et réarrangements se mettant en place au sein des GB dans un

contexte de dégénérescence progressive spontanée des neurones DA. De plus, il est possible

que des symptômes non-moteurs de type déficits olfactifs ou dépressifs apparaissent avant

même l’apparition de symptômes moteurs ce qui pourra être testé pendant cette période. Cette

phase présentant une dégénérescence progressive continue impliquant plusieurs mécanismes

pathogéniques connus pour être impliqués dans la MP, ce modèle est particulièrement adapté

pour tester plusieurs stratégies neuroprotectrices et évaluer leurs impacts sur la cinétique de

perte des neurones DA de la SNc, l’évolution de la perte en DA striatale, ou encore sur

l’instauration de troubles moteurs.

A 60 jpi, la perte en neurones DA ipsilatérale avoisine les 50 % et la SNc controlatérale

commence à être affectée. Les mécanismes compensatoires semblent être dépassés, et la

dégénérescence de la voie nigro-striée se poursuit même si elle évolue plus lentement qu’au

début de l’atteinte. Des symptômes moteurs apparaissent avec une présentation asymétrique et

s'aggravent avec le temps jusqu’à 1β0 jpi. Il sera intéressant de voir à plus long terme si i) le

processus dégénératif continue d’évoluer et ii) si les symptômes se bilatéralisent.

Figure 76. Evolution de l’atteinte consécutive à l’injection intranigrale de PDC

228

Nous envisageons également de poursuivre la caractérisation de ce modèle en termes de

réponses aux traitements existants de la MP. En effet, la validité de ce modèle dépendra de la

capacité des traitements à corriger les symptômes moteurs. Ainsi nous prévoyons de réaliser

rapidement des groupes d’animaux injectés au PDC qui, une fois les symptômes

comportementaux établis, seront traités à la L-DOPA ce qui permettra i) de confronter ce

modèle aux modèles existants et de le rapprocher encore de la pathologie, ii) de s’assurer que

les symptômes comportementaux soient bien liés au déficit DA striatal mesuré notamment par

les expériences de microdialyse. Nous pourrons également dans ce contexte évaluer les

dyskinésies induites par la L-DOPA dans notre modèle.

Nous prévoyons également d’étudier l’effet de la stimulation à haute fréquence du NST sur

des groupes d’animaux traités par le PDC. En effet, dans la MP, ce noyau est hyperactif et

présente une activité en bouffées (Rodriguez et al., 1998; Hirsch et al., 2000). La réduction de

son activité par stimulation haute fréquence est un traitement très efficace pour corriger la

triade motrice parkinsonienne (Benabid et al., 1994; Benabid et al., 2001). De plus, des

données de la littérature suggèrent que ce traitement neurochirurgical présenterait un potentiel

neuroprotecteur (Temel et al., 2006; Wallace et al., 2007; Spieles-Engemann et al., 2010). Il

serait particulièrement intéressant de tester ces deux actions symptomatique et

neuroprotectrice dans notre modèle de neurodégénérescence progressive. En effet, la

stimulation chronique à haute fréquence du NST après la phase primaire de

neurodégénérescence mais avant l'expression des symptômes, c'est-à-dire entre 15 jours et 2

mois après l'injection de PDC, permettrait de déterminer si ce traitement peut i) freiner, voire

stopper, l'évolution du processus neurodégénératif et ii) retarder ainsi l'expression des

symptômes. L’application de cette stimulation lorsque les symptômes sont manifestes (au-

delà de 2 mois post-PDC) permettrait de tester son action symptomatique dans un contexte

évolutif. Ceci permettrait de discerner l'implication de cette structure glutamatergique dans la

progression des pertes neuronales et dans la pathophysiologie. Ces expériences bénéficieront

d'un microstimulateur portable permettant de réaliser la neurostimulation de façon chronique

qui a été développé au Laboratoire.

Un autre point essentiel, notamment pour sa pertinence vis à vis la pathologie, est la

transposabilité de notre modèle à d’autres espèces animales. Les deux espèces de choix sont

la souris permettant d’accéder aux modèles transgéniques, et le primate non-humain qui est

l’espèce la plus appropriée pour l’évaluation de thérapies. Nos premiers résultats

229

préliminaires montrent que le PDC est également efficace chez la souris, son action chez le

primate est à tester.

L’apport que peuvent fournir les modèles actuels classiques dans la compréhension du

processus pathogénique est limité. En effet, la sélectivité d’action des toxines les plus utilisées

que sont la 6-OHDA et le MPTP repose sur le fait qu’elles sont captées par le DAT et non sur

une vulnérabilité préférentielle des neurones DA. De plus, ces toxines n’induisent pas

spontanément une progression des pertes neuronales (Tableau 3). Des pertes progressives ne

peuvent être induites que par la répétition d'injections de MPTP à faibles doses, ce qui ne

produit pas un mécanisme délétère capable de s’auto-entretenir, comme cela semble être le

cas dans la pathologie, mais une répétition d’effets aigus du MPTP. Cette limitation

représente un frein pour l’utilisation de ces modèles dans des études de neuroprotection,

pouvant rendre compte du fait que de nombreuses molécules montrant un potentiel

neuroprotecteur dans ces modèles ne présentent pas d'effet avéré en clinique.

Un nouvel espoir était né avec l’arrivée des modèles transgéniques basés sur des mutations,

surexpression ou délétion de gènes impliqués dans la MP, en pensant que ces modèles allaient

représenter des modèles plus « réalistes » de la pathologie avec une atteinte plus fidèle de

celle observée dans la pathologie. Bien que certains de ces modèles présentent effectivement

des dysfonctionnements de la voie nigro-striée, des agrégats intracytoplasmiques, et parfois

des troubles comportementaux, la majorité d’entre eux ne présente pas de pertes robustes des

neurones DA de la SNc, ce qui rend leur utilisation limitée notamment pour l’étude de

nouvelles stratégies thérapeutiques (Tableau 3).

A notre connaissance, à ce jour, aucun des modèles animaux existants ne reflète l’ensemble

des caractéristiques pathogéniques (stress oxydatif, inflammation, dysfonctionnement

mitochondrial, dysfonctionnement du SUP, excitotoxicité…) et neuropathologiques de la MP

(dégénérescence progressive des neurones DA de la SNc couplé à des réductions de DA

striatale, présence de CL, atteintes d'autres systèmes au niveau central et périphérique,

symptômes moteurs et non-moteurs…). Le modèle le plus approprié doit ainsi être choisi en

fonction de la question posée. Un des enjeux majeurs de la recherche actuelle sur la MP est de

créer des modèles qui rassemblent l’intégralité, ou du moins le plus possible, de ces

caractéristiques.

L’injection intranigrale de PDC pourrait représenter une alternative aux modèles classiques de

la MP. Ce modèle n'est pas basé sur une toxine DA mais sur le dysfonctionnement des

EAATs, composante importante de l'homéostasie des systèmes glutamatergiques,

230

GABAergiques et des défenses anti-oxydantes, ce qui peut rendre compte du caractère

multifactoriel du processus dégénératif initié. Il reproduit un ensemble de caractéristiques

majeures de la MP, du moins en ce qui concerne l'atteinte des neurones DA, ce qui peut

représenter un avantage pour l’expérimentation de stratégies neuroprotectrice. Ce modèle

progressif peut aussi être d'intérêt non seulement pour explorer les réorganisations anatomo-

fonctionnelles intervenant dans le réseau des GB suite à l'atteinte des neurones DA mais aussi

pour tester l’efficacité de nouveaux traitements symptomatiques. En effet ces réorganisations

ont été essentiellement caractérisées dans des modèles de dégénérescence aigüe, partielle ou

totale, et on peut penser que les réponses diffèrent dans un contexte évolutif. La limitation

principale de ce modèle est qu'il n’existe pour l’instant pas d’évidences directes de

l’implication d’un dysfonctionnement des EAATs dans la MP, ce qui limiterait sa relevance à

la pathologie. Cependant, nous avons vu que différents mécanismes pathogéniques impliqués

dans la MP peuvent affecter le fonctionnement des EAATs, et nous montrons ici qu'un

dysfonctionnement aigu de ces transporteurs peut induire un processus dégénératif progressif

et donc participer à un cercle vicieux entretenant la neurodégénérescence. Ainsi les EAATs

pourraient être impliqués dans la MP, même si leur fonctionnement ou leur expression n’est

pas altéré de façon chronique.

231

Tableau 3. Caractéristiques neuropathologéniques et comportementales majeures des principaux

modèles de la maladie de parkinson.

232

En conclusion, l’intérêt de ce travail est double :

Au niveau mécanistique : Ce modèle relie un dysfonctionnement des EAATs à un ensemble

de mécanismes pathogéniques impliqués dans la MP. Il reste néanmoins encore à examiner

l’implication d’un dysfonctionnement mitochondrial et du SUP dans notre modèle ainsi que la

contribution des différents mécanismes mis en jeu dans l'atteinte primaire dans la progression

des pertes neuronales. Ce modèle offre un outil très intéressant pour étudier les interactions et

les liens de causalité pouvant exister entre différents mécanismes pathogéniques impliqués

dans la MP, ce qui est un champ de recherche d’une grande importance car certainement à

l’origine de la vulnérabilité préférentielle des neurones DA dans la pathologie ainsi que de

l’entretien du processus dégénératif.

Au niveau de la recherche translationnelle : Ce travail a conduit au développement d'un

nouveau modèle animal qui reproduit et rassemble un nombre de caractéristiques unique de la

pathologie. La progression des pertes, ainsi que l’atteinte tardive controlatérale, font de ce

modèle un outil particulièrement intéressant pour étudier de nouvelles stratégies

neuroprotectrices. En effet, la dégénérescence étant progressive, l’effet de molécules peut être

testé en comparant les variations de cinétique des pertes cellulaires. De plus, ce modèle

faisant intervenir un grand nombre de mécanismes pathogéniques, son pouvoir prédictif quant

à l’efficacité d’un traitement pharmacologique ou chirurgical pourrait être plus élevé en

comparaison avec les modèles toxiques aigus. De par son caractère évolutif, ce modèle

permet également d’étudier les réarrangements physiopathologiques au sein des GB après

déplétion DA dans un contexte progressif. En effet, il est concevable que la perte lente et

progressive des neurones DA entraine des adaptations fonctionnelles au niveau du réseau qui

soient différentes de celles engendrées par une lésion rapide.

233

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