materijal farmaceutska biotehnologija

BIOTEHNOLOGIJA

I CJELINA

OSNOVNA PRAVILA PONAŠANJA U GENETIČKOJ LABORATORIJI

POLUOTVORENOGA TIPA

Sigurnost u laboratoriji podrazumijeva izvođenje naučno-istraživačkih, stručnih i

edukativnih aktivnosti na bezbjedan i siguran način kako za realizatora aktivnosti, tako i za

sve osobe prisutne u laboratoriju.

To ukazuje na činjenicu da je, prije obavljanja bilo kakve aktivnosti u laboratoriji, potrebno

znati slijedeće:

da li postoji određeni rizik pri realizaciji predviđenih aktivnosti;

koje mjere opreza poduzeti u cilju spriječavanja potencijalnih rizičnih situacija;

koje mjere treba preduzeti da bi se zaštitili djelatnici laboratorije;

koje mjere treba preduzeti da bi se zaštitili oprema i cjelokupni resursi laboratorije;

koje mjere preduzeti da bi se onemogućio nekontrolisano iznošenje potencijalno

opasnih materijala izvan laboratorije;

koje mjere preduzeti da bi se pravilno rukovalo opremom.

Zanemarivanje provođenja osnovnih mjera sigurnosti ne samo da ugrožava vlastitu sigurnost,

nego sigurnost i drugih uposlenika.

Par osnovnih pravila vezanih za rad u genetičkim i biotehnološkim laboratorijima:

1) prije no što se pristupi radu u laboratoriji, svaki realizator aktivnosti mora imati

osnovnu zaštitnu opremu: laboratorijski mantil, rukavice, masku za usta i kapu. Ovo

pravilo izričito vrijedi za istraživače koji rade sa humanom DNK, da bi se izbjegla

kontaminacija iste vlastitom DNK sa jedne te da bi se zaštitio realizator od

potencijalnih negativnih uticaj do kojih može doći prilikom rukovanja sa humanim

biološkim materijalom, sa druge strane

2) Radna površina u laboratoriji mora biti oslobođena svih nepotrebnih stvari, tj svih

stvari koje ne trebaju za proces koji se realizira.

*Preliminarni nerecenzirani materijal namjenjen kao uputstvo za polaganje praktičnog dijela ispita iz predmeta Farmaceutska biotehnologija (2012-2013)

BIOTEHNOLOGIJA

3) Sve posude sa hemikalijama moraju biti označene imenom hemikalije koja se u njoj

nalazi, te pohranjene na odgovarajućoj temperaturi. Nakon svake upotrebe, hemikalije

se vraćaju na svoje mjesto.

4) Iskorišteni potrošni laboratorijski materijali moraju biti odstranjeni u označene posude

namijenjene za datu vrstu otpada.

5) Ukoliko se radi sa otrovnim, isparljivim hemikalijama, neophodno je raditi u

izoliranom prostoru sa precizno reguliranim sistemom ventilatcije,

6) Većina aktivnosti u laboratoriji zahtijevaju sterilne uslove u cilju spriječavanja

kontaminacije materijala kojim se manipulira, dok u tzv «genetičkim» laboratorijama

pod pojmom «sterilno» podrazumjeva se odsustvo svake DNK stranog porijekla (DNA

free conditions). Da bi se stvorili takvi uslovi u laboratorijama svi predmeti otporni na

visoku temperaturu i pritisak moraju biti izloženi suhoj i vlažnoj sterilizaciji, te UV

zračenju. Također, neophodno je i hemijskim putem sterilisati i instrumentarij i radnu

površinu prije početka rada. To obično podrazumjeva primjenu 15% varikine.

7) Svaka laboratorija mora imati Pravilnik o ponašanju u kojem se usko specificiraju

sva pravila jasno precizirana za realizaciju aktivnosti u konkretnom laboratoriju.


BIOTEHNOLOGIJA

II CJELINA

IZOLACIJA HUMANE DNK IZ UZORKA BUKALNE SLUZNICE

Inicijalni korak u svim istraživanjima koja podrazumijevaju manipulisanje naslijednim

materijalom predstavlja ekstrakcija (izolacija) DNK iz polaznoga uzorka. Postoji više metoda

izolacije ukupnoga nasljednoga materijala, te usljed toga ova metoda danas predstavlja

rutinsku laboratorijsku proceduru..

Osnovne faze DNK ekstrakcije u širem smislu te riječi su:

1. uzorkovanje biološkog materijala (humanog, animalnog, biljnog)

2. oslobađanje DNK iz ćelijskih organela (jedra i citoplazme) a samim tim i iz ćelije

razgradnjom lipoproteinskog kompleksa membrana

3. purifikacija (pročiščavanje) DNK frakcije

4. precipitiranje ili eluiranje DNK u procesiranom uzorku

Ukupna izolirana genomska DNK sadrži oba njena kompartimenta nuklearnu i

mitohondrijalnu DNK, a ukoliko je DNK ekstrahovana iz biljnog materijala, ona također

sadrži i DNK lociranu u hloroplasta.

Postoji više metoda koje se mogu primjeniti za ekstrakciju DNK, a odabir jedne od njih zavisi

o samom tipu uzorka. Pri tome je potrebno napomenuti da količine DNK koje možemo dobiti

iz različitih uzoraka nisu identične, što naravno ovisi i o tipu uzorka i njegovoj količini koju

imamo na raspolaganju.

Dakle, zavisno od toga da li se DNK izolira iz humanog tkiva (bukalna sluznica, kosti, krvi,

idr.), te različitih animalnih i biljnih tkiva, ili pak mikroorganizama, optimizirano je više

metoda DNK ekstrakcije.

Standardna metoda koja je dosegla veliku primjenu za široki spektar biološkog materijala je

organska ekstrakcija. Ona podrazumijeva primjenu digestivnih pufera koji se baziraju na

prisustvu TRIS-a, NaCl-a, SDS-a i EDTA, te ispiranje fenolom, koji obara proteine i masti i

hloroformom, koji obara višak fenola i zaostale ćeliske ostatke, uz popratnu precipitaciju

alkoholom. Također, neophodno je prisustvo proteinaze K, čija se funkcija svodi na digestiju

proteina.Uloga digestivnog pufera je stvaranje povoljnog medija u kojem će proteinaza K

ispoljiti svoje dejstvo, digestiju proteina.


BIOTEHNOLOGIJA

Pored organske ekstrakcije, kao široko aplikativne metode na najširem dijapazonu uzoraka,

danas su popularni i kitovi za ekstrakciju ukupne genomske DNK, a koje proizvode različite

kompanije.

Jedan od najpouzdanijih ekstrakcionih setova je Qiagen kit. U slobodnoj interpretaciji može

se opisati kao kombinacija organske ekstrakcije, ali bez upotrebe fenola i hloroforma.

Proizvodi se u više varijanti, u zavisnosti od toga za koju vrstu biološkog materijala se

primjenjuje. Osnovni postulati na kojima se bazira Qiagen procedura ekstrakcije DNK jesu:

liziranje uzorka

adsorbovanje DNK za silika-gel membranu Qiagen kolonice

(QIAmps Spin Column)

ispiranje membrane ispirajućim puferima

eluiranje DNK sa membrane

Postoji još veliki broj metoda za ekstrakciju ukupne genomske DNK, a koje se baziraju na

različitim principima. Npr. CHELEX metoda je također jedna od široko primjenjivh, a bazira

se na vezivanju polivalentnih metalnih jona na DNK radi njihove zaštite tokom izlaganja

visokoj temperaturi. Osnovna procedura zasniva se na ispiranju kontaminenata, proteina i

ostalih ćelijskih ostataka inkubiranjem uzorka na temperaturi od oko 560C u 5% Chelex

soluciji. Nakon toga supernatant se dodaje direktno u PCR miks.

Puragen metoda se zasniva na lizi ćelija anionskim deterdžentom, u prisustvu DNK

stabilizatora, koji ne dopušta denaturaciju DNK. Moguće prisutnu RNK uklanja RNK

digestivni enzim. Proteini i lipidi se uklanjaju precipitacijom solima. DNK se izdvaja

alkoholnom precipitacijom i ispira se u soluciji koja sadrži DNK stabilizator.

Protokol « Qiagen » metoda ekstrakcije DNK iz uzorka bukalne sluznice

Nakon što je propisno uzorkovan bris bukalne sluznice, uslijedila je ekstrakcija DNK iz

uzorka primjenom Qiagen protokola za ekstrakciju DNK iz bukalne sluznice:

1. sterilnim makazama se odsiječe vatirani dio štapića kojim se uzorkovao bris bukalne

sluznice i stavi utubicu od 2 ml,

2. u tubicu sa uzorkom se doda 400 ul ATL pufera i 20 ul proteinaze K

3. sadržaj tubice se vorteksira u trajanju od 15 sekundi,

4. uzorak se zatim postavlja u vodeno kupatilo da se inkubira u trajanju od 1h na

temperaturi od 560 C,

5. nakon inkubacije, doda se 400 ul AL pufera i vorteksira u trajanju od 15 sekundi


BIOTEHNOLOGIJA

6. uzorak se stavi u termoblok da se inkubira na 700 C u trajanju od 10 minuta

7. doda se 200 ul etanola (96-100%), kratko vorteksira, a zatim centrifugira (spinuje) da

se odstrane kapljice sa sa poklopca tubice.

8. pažljivo se prebaci oko 700 ul lizata (miksture) u QIAmp kolonicu, centrifugira pri

brzini od 800 rpm u trajanju od 1 minute, a zatim se odstrani filtrat iz kolekcione

tubice

9. pažljivo se otvori poklopac kolonice i doda 500 ul ispirajućeg AW1 pufera,

centrifugira pri brzini od 8000 rpm u trajanju od 1 minute i nakon toga se odstrani

filtrat iz kolekcione tubice

10. otvori se poklopac kolonice i doda 500 ul ispirajućeg AW2 pufera, centrifugira pri

brzini od 14 000 rpm u trajanju od 3 minute, te se zatim odbaci kolekciona tubica sa

filtratom,

11. kolonica sa uzorkom se prebaci u čistu 1,5 ml tubicu, doda se 50 ul destilovane vode,

inkubira jednu minutu na sobnoj temperaturi, a potom centrifugira 1 minutu pri brzini

od 14 000 rpm, nakon čega se odbacuje kolonica, a uzorak u 1,5 ml tubici zatvori i

obilježi.

12. zatim se uzorak koncentrira metodom koja se bazira na upotrebi «speed-vacum»

pumpe, koja radi na principu kombinovanog dejstva centrifugalne sile i vakumskog

isisavanja. Na taj način pod djelovanjem centrifugalne sile DNK pada na dno tubice, a

va kum isisava vodu.

13. Uzorak se stornira na -200 C u zamrzivač.


BIOTEHNOLOGIJA

III CJELINA

HORIZONTALNA GEL ELEKTROFOREZA

Gel elektroforeza predstavlja skup tehnika koje se primjenjuju za separaciju bioloških

molekula, baziranu na fizičkim osobinama molekule, kao što su veličina, oblik, izoelektrična

tačka molekule. Najćešće se primjenjuje u analitičke svrhe, za separaciju i analizu DNK

fragmenata različite veličine. Snaga električnog polja podstiče migraciju fragmenata DNK

kroz gel. Gel se odnosi na matrix koji svojom konstitucijom omogućava separaciju tih

fragmenata. U većini slučajeva gel predstavlja crosslink polimer čija kompozicija i poroznost

omogućavaju separaciju. Molekula DNK putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog

negativnog naboja koji nosi DNK molekula. Kompartimenti veće molekulske mase migriraju

sporije kroz gel, u odnosu na one manje molekulske mase čija je migracija brža.

Nakon završene elektroforeze, separirani DNK fragmenti se mogu vizuelizirati primjenom

flueroscentnih boja kao što su etidium bromid, srebro nitrat, coomassie blue. Njihova veličina

se izražava u baznim parovima (bp), kilobazama (kb), ili nukleotidima, u zavisnosti od toga

da li je na gel aplicirana jednolančana ili dvolančana DNK molekula, a determinira se

komparacijom uzorka sa DNK ladder-om, koji sadrži fragmente DNK poznate veličine i služi

kao referentni sistem.

Različiti su tipovi gelova koji se koriste za elektroforezu DNK. Najčešće primjenjivani su

agarozni gel za separaciju velikih segmenata DNK (do 50000 bp), te poliakrilamidni gel za

separaciju manjih kompartimenata.

Najjednostavniji put provjeravnja uspješnosti ekstrakcije DNK i PCR-a, te aproksimativne

kvantifikacije većih molekularnih kompartimenata predstavlja agarozna gel elektroforeza.

Horizontalna agarozna gel elektroforeza

Agarozna gel elektroforeza je najjednostavnija i uobičajeni put separacije i kvantifikacije

DNK. Svrha primjene gela je da se kvantificira ili da se izolira i analizira pojedinačni band.

Na agaroznom gelu obično se vrši separacija velikih DNK molekula, koje sadrže fragmente

500-50000 bp u reinđu.

Pripremanje agarozne gel elektroforeze


BIOTEHNOLOGIJA

Važna činjenica na koju se mora obratiti pažnja prilikom pripremanja gela jeste koncentracija

agaroze u gelu. Uslovljena je veličinom fragmenata koji se apliciraju na gel, pa shodno tome,

možemo razlikovati 0.4% gel za separaciju DNK fragmenata u rasponu veličina 2000-

30000bp, 0.75% 1000-15000 bp, 1.00% 500-10000bp, 2.00% 100-2500bp. Odgovarajuće

koncentracije agaroze u gelu u skladu sa veličinom fragmenata DNK koja se aplicira na gel

omogućava dobru rezoluciju istih.

Procedura anaize izolirane DNK na 1% agaroznog gela

Instrumentarij i hemikalije neophodni za sprovođenje agarozne gel elektroforeze:

Sistem za elektroforezu (strujno kolo)

Kadica za izlijevanje gela

Češljići za uzorke

Magnetna mješalica sa grijačem

Mikropipete sa tipovima

UV transiluminator

Agaroza

TBE pufer

LDB pufer

Etidium bromid

Priprema gela se vrši prema slijedećem protokolu:

1. pripremi se kadica za elektroforezu odgovarajuće veličine

2. trakom se oblijepi gornji i donji rub kadice

3. na kadicu se zatim postavi češljić koji će napraviti prostor ("đep") na koji će se

aplicirati uzorak

4. pripremi se 1% rastvor agaroze u TBE puferu (0.4g agaroze i 40 ml TBE

pufera)

5. rastvor agaroze se u TBE puferu miješa na magnetnoj mješalici uz zagrijavanje

do ključanja

6. nakon ključanja smjesu ohladiti na oko 50 0C (kada se posuda može uzeti

rukom)

7. u ohlađenu smjesu dodati etidium bromid u količini od 1l

8. smjesu, potom, izliti u pripremljenu kadu za elektroforezu, koja je postavljena

na ravnu površinu

9. ostaviti da se gel ohladi i polimerizira


BIOTEHNOLOGIJA

10. kada se gel ohladi, uklone se češljići i trake, a potom se kada postavi u

komoru za gel elektroforezu u kojoj kadica sa gelom mora biti potopljena u

TBE puferu

11. u "đepiće" na gelu se, potom, apliciraju uzorci, koji su prethodno pomiješani s

LDB puferom (loading dye buffer). U svom sastavu sadrži boju bromofenol

plava, koja omogućava vizuelni monitoring migracije uzorka kroz gel u toku

elektroforeze, zatim glicerol koji olaksava aplikaciju uzorka u đepić jer

povećava težinu uzorka, TBE pufer i H2O. Pomiješa se 5ul uzorka i 1ul LDB-

a.

12. pored uzoraka na gel se može nanijeti i marker (ladder), kao referentni sistem

u odnosu na kojeg se može odrediti veličina fragmenata apliciranog uzorka

13. nakon nanošenja uzorka na gel, programira se aparat za elektroforezu da radi

pri konstantnom naponu od 90V u trajanju od pola sata

14. rezultati separacije gel elektroforezom posmatraju se pod UV lampom

Vizuelizacija separacije DNK fragmenata podrazumijeva primjenu etidijum bromida,

boje koja odaje narandžastu fluorescenciju pod UV lampom. Rad sa etidijum

bromidom zahtijevao poseban oprez, jer se radi o supstanici sa izrazito štetnim

djelovanjem na organizam.


BIOTEHNOLOGIJA

IV CJELINA

PCR / LANČANA REAKCIJA POLIMERAZOM

PCR (polymerase chain reaction), polimerazna lančana reakcija predstavlja in vitro metodu

umnožavanja ciljanih fragmenata DNK. Zapravo, PCR, kao molekularna "kopirnica",

predstavlja mehanizam kojim se omogućava generiranje optimalnog broja kopija ciljanih

fragmenata DNK djelomičnim imitiranjem prirodnog procesa replikacije DNK. In vivo,

replikaciju DNK iniciraju kratke RNK sekvence za čiju sintezu je odgovorna RNK

polimeraza I. RNK sekvence obezbjeđuju startno mjesto za otpočinjanje replikacije DNK. Na

3’ kraju imaju slobodnu -OH grupu. One su, zapravo supstrat za djelovanje DNK ploimeraze

I, koja na odgovarajućoj temperaturi katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid-3-

fosfata na slobodnu -OH grupu 3’ kraja RNK sekvence, dok je ista komlementarno vezana za

DNK matricu. Važan parametar koji je iskorišten za razvoj PCR tehnike jeste taj da su

vodikove veze, kojima su polinukleotidni lanci međusobno povezani, energetski jako slabe, te

da pri zagrijavanju pucaju, što konsekventno dovodi do denaturacije DNK, tj. stvaranja

jednolančanih molekula DNK /single strand DNA/. Hlađenjem se ponovo uspostavljaju iste

veze, što predstavlja proces renaturacije. Upravo različito ponašanje DNK u zavisnosti od

temperaturnog režima predstavlja osnovu na kojoj se temelji PCR tehnika umnožavanja

ciljanih fragmenata DNK.

Reakcione komponente lančane reakcije polimerazom

DNK molekula, koja se želi amplificirati

prajmeri / primers/. Postupak selekcije ciljanih fragmenata DNK koji se žele

amplificirati /umnožiti/ omogućeno je primjenom prajmera, početnica, koji u in vitro

uslovima služe kao supstrat za djelovanje DNK polimeraze. Naime, radi se o kratkim

oligonukleotidnim sekvencama DNK u rasponu od 20-30 baza koji se na bazi

komplementarnosti vežu za granične regione ciljane sekvence. Za uspješnost

amplificiranja ciljanoga segmenta potrebna su 2 prajmera, forward i reverse - po jedan

za svaki lanac DNK nastao denaturacijom primarne matrice. Prajmeri, vežući se na

bazi komplementarnosti za matricu DNK, obezbjeđuju startno mjesto za iniciranje

elongacije novosintetisanog lanca DNK. Prajmeri mogu biti ili specificni ili

univerzalni. Univerzalni prajmeri su komplementarni nukleotidnim sekvencama


BIOTEHNOLOGIJA

različitih DNK molekula. Primjera radi, bakterijska rDNK sadrzi nukleotidne

sekvence koje su zajedničke za sve bakterije, pa shodno tome, bakterijski univerzalni

prajmeri se dizajniraju upravo na osnovu tih sekvenci. Primjer bakterijskih

univerzalnih prajmera:

forward 5' GATCCTGGCTCAGGATGAAC 3'

reverse 3' GGACTACCAGGGTATCTAATC 3'

Ovakvi prajmeri najčešće su inkorporirani u sklopu komercijalnih kitova, proizvedenih

od strane različitih kompanija. Oni ne smiju biti međusobno komplementarni, da ne bi došlo

do stvaranja prajmer dimera, niti komplementarni sa nespecifičnim sekvencama DNK, što

umanjuje efikasnost PCR-a.

Taq polimeraza. S obzirom da in vivo replikaciju DNK inicira enzim iz skupine

polimeraza, DNK polimeraza I, neophodan je također enzim polimeraza koji bi vršio

istu funkciju u vještačkim, dirigovanim uslovima. Taj enzim je izoliran iz

termostabilne bakterije Thermus aquaticus. Nazvan je Taq polimeraza i optimalna

temperatura na kojoj ispoljava svoju aktivnost iznosi 72 °C. Na ovoj temperaturi

polimeraza dodaje prosječno 6000 nukleotida u minuti na prajmer. U tipičnoj PCR

enzim ima poluvrijeme života od 2h na temperaturi od 92,5°C, 40 minuta na 95°C, i

manje od 6 min. na 97, 5°C.

MgCl2 – djeluje kao katalizator PCR-a. Taq polimeraza za svoju aktivnost zahtjeva

slobodne Mg+ ione, koji se vezu i za slobodne nikleotide i za samu polaznu DNK.

Slobodni nukleotidi / dNTP/. Neophodni su slobodni nukleotidi / dATP, dTTP, dCTP,

dGTP/ i to podjednake količine svakog. Veoma niske koncentracije svakog od

nukleotida ili njihov neizbalansiran odnos vodi nepovezivanju u lance.

PCR puffer, neophodan je za uspostavljanje optimalne pH vrijednosti za efikasno

realizaciju PCR. 7,0-7,5

H2O, destilovana, DNA-free

Osnovne faze PCR-a

PCR se odvija u 3 osnovne faze, koje prvenstveno determinira odgovarajući temperaturni

režim:

1. denaturacija

2. hibridizacija (matrica-prajmer annealing)

3. elongacija lanca

Denaturacija, kao prva faza PCR-a inicirana je temperaturom od oko 90-95 stepeni na kojoj


BIOTEHNOLOGIJA

dolazi do razgradnje stabilnoga dvostrukoga heliksa i stvaranja jednolančane DNK. Tek u

takvome obliku, DNK može poslužiti kao matrica za sintezu naspramnog lanca u slijedećim

fazama PCR-a.

Drugu fazu PCR karakteriše snižavanje temperature na oko 50-60 stepeni (55) čime se

stvaraju uslovi za renaturaciju, tj. ponovno formiranje vodikovih veza. Upravo u ovoj fazi se

prajmeri na bazi komplementarnosti vežu za granične regione sekvence koja se želi

amplificirati (umnožiti). Kako su prajmeri sintetisani u 5'-3' pravcu, to se na njihovom 3' kraju

nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH grupom, što predstavlja supstrat za djelovanje taq

polimeraze. Dakle, drugu fazu PCR-a karakteriše vezivnje prajmera za specifične dijelove

sada jednolančane DNK molekule. Ovaj proces se još označava kao matrica-prajmer

annealing, a ova faza PCR-a, zbog nastajanja hibrida «matrica-prajmer», naziva se

hibridizacija.

Treću fazu PCR-a karakteriše temperaturni režim od oko 70 stepeni, pri čemu dolazi do

elongacije novosintetisanog lanca pod uticajem Taq polimeraze. Taq polimeraza prepoznaje

hibride "matrica-prajmer" nastale u prethodnoj fazi PCR-a, te katalizira vezivanje slobodnih

nukleotida za matricu, što ima za posljedicu ekstenziju lanca. Slobodni dNTP se pod uticajem

Taq polimeraze, vežu preko svoje fosfatne grupe za slobodnu –OH grupu dezoksiriboze na 3'

kraju prajmera. Rezultat navedenog je sinteza naspramnog lanca DNK molekule, koji u

drugom ciklusu može poslužiti kao matrica drugom prajmeru.

Ciklus denaturacije, hibridizacije i elongacije se može ponavljati. Povećanjem broja ciklusa

eksponencijalno raste broj kopija ciljane DNK sekvence.

Broj PCR ciklusa ovisi od polazne količine DNK reakcionoj smjesi i željene količine

produkta. Tipična PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa. Kod ponavljanja PCR ciklusa treba

voditi računa o mogućem deficitu neke od komponenti reakcije, npr. prajmera, slobodnih

nukleotida, enzima ili pak o pjavi inhibitora PCR. To su tzv. ograničavajući faktori PCR.

Primjena PCR tehnike

PCR tehnika se uspješno primjenjuje u širokom dijapazonu naučno-istraživačkih aktivnosti.

Posebna pogodnost je ta što je za njeno odvijanje je dovoljna i mala količina polaznog

biološkog materijala. Jedna od njenih bitnih primjena jeste u oblasti forenzičke DNK analize,

te u oblasti dijagnostike različitih bolesti koje se mogu definirati na nivou sekvenci molekule

DNK (npr. prenatalna dijagnostika naslijednih bolesti). Naime, danas postoji veliki broj

oboljenja za koje se predpostavlja da su naslijednog karaktera, a koje se mogu determinirati

PCR-based tehnikama.


BIOTEHNOLOGIJA

Postavljanje lančane reakcije sa polimerazom za analizu STR multiplex sistem PowerPlex 16

Najčešće se prakticira prethodna priprema smjese koja sadrži odgovarajuće količine svih

neophodnih komponenti PCR-a. Takva smjesa naziva se master mix i priprema se u posebnoj

tubici odakle se odgovarajući alikvoti prenose u pripremljene i obilježene tubice ( singlice ili

stripove) u koje se potom dodaje i DNK koju smo prethodno ekstrahovali. Dakle, master mix

predstavlja smjesu svih komponenti lančane reakcije polimerazom, izuzv DNK molekule koju

naknadno dodajemo. Također, prilikom pripremanja rekcije, bez obzira koliko precizni i

pažljivi bili, postoji uvijek mogućnost standardne greške prilikom pipetiranja. Zbog toga se

uvijek pri izradi master mixa uzima 10% više svih komponenti.

Mašina u kojoj se dešava PCR zove se PCR thermocycler, i ona se može programirati

odgovarajući temperaturni režim i podesiti željeni broj ciklusa.

Bitno je napomenuti da možemo razlikovati single PCR, duplex PCR, multiplex PCR sisteme

(reakcije) u zavisnosti od toga koliko ciljanih sekvenci želimo da amplificiramo.

Dakle multiplex PCR, predstavlja simultanu amplifikaciju više ciljanih sekvenci DNK.

Amplifikacija multiplex STR sistema PowerPlex 16, u biti, predstavlja simultano

umnožavanje 15 ciljanih fragmenata DNK (STR markeri) u jednoj reakciji.

Ukupan volumen PCR-a je iznosio 5l i to:

- 2,7l dH2O ( nuclease free)

- 0,3l Taq polimeraze

- 0,5l prajmera (Power Plex16 Primer Pair Mix)

- 0,5l pufera (Power Plex16 Gold Star buffer)

- 1ul DNK izolata

Bitno je napomenuti da se slobodni nukleotidi kao i MgCl2 nalaze u sastavu pufera u ovom

slučaju.

Tako pripremljen uzorak postavljen je u PCR thermocycler, koji je bio programiran za

odgovarajući temperaturni režim kao i za određeni broj ciklusa:

95°C 1 minuta

96°C 11 minuta

94°C 30 sekundi

60°C 30 sekundi

70°C 45 sekundi

10 ciklusa


BIOTEHNOLOGIJA

90°C 30 sekundi

60°C 30 sekundi

70°C 45 sekundi

22 ciklusa


BIOTEHNOLOGIJA

V CJELINA

VERTIKALNA GEL ELEKTROFOREZA

Prvo se postave gel – ploče, a nakon toga se pripremi i izlije poliakrilamidni gel izmedju njih.

Receptura za pripremanje gela je slijedeća:

u čistu posudu se izvaze 9 grama uree

doda se 13ml dH2O

rastvor se miješa na magnetnoj mješalici dok se urea ne otopi

napravi se mix LongRanger 25% i 10x TBE pufera, po 2.5ml svake komponente

napravljena mikstura se doda u rastvor uree

novonastali rastvor se degazira

nakon degaziranja, dodaju se akceleratori polimerizacije poliakrilamidnog gela i to

125ul 10% APS i 17,5 ul TEMEDA-a

Gel se izlije, pazeći da se pri tome ne formiraju mjehurici na njemu. Na tako pripremljen gel

se postavi češalj i sačeka 2.5 sata da se završi polimerizacija.

Pripremanje PowerPlex 16 STR postamplifikacijskog sistema za detekciju na genetičkom

analizatoru

Za detekciju se pripreme ranije amplificirani uzorci DNK. Dvije komponenete koje se zajedno

sa uzorkom apliciraju na gel jesu BD (blue dextran) i ILS (Internal Lane Standard). Blue

Dextran je faktor koji olakšava migraciju DNK kroz poliakrilamidni gel, a Internal Lane

Standard (ILS) je neophodna za sizing analizu. U prvom koraku se napravi master mix po

formuli:

(0.7ul BD + 0.3ul ILS) x broj uzoraka

Zatim se miks alikvotira u pripremljene setove tubica. U svaku tubicu se doda 1 ul

mastermixa i 0.7 ul DNK uzorka. Zajedno sa uzorcima neophodno je aplicirati i allelic ladder

koji predatavlja vjestacki sintetiziran niz DNK fragmenata, koji su zapravo sve postojece

alelne varijacije lokusa koji se koriste za analizu 16 STR markera u sklopu komercijalnog

PP16 kita. Tako pripremljeni uzorci se denaturišu na 950C, a zatim postave na kratko na led

da bi se izbjegla renaturacija.


BIOTEHNOLOGIJA

Kada gel plimerizira, vanjske strane gel ploča se očiste i cijeli komplex se postavi na

sekvencer. Prvo se softverski pokrene plate check faza, u kojoj je samo laser aktivan, ali se ne

startuje elektroforeza. Ovim postupkom mašina provjerava da li su su ploče i gel čisti, te da li

su spremni za proces detekcije. Nakon toga se pokreće opcija prerun, pokretanje

elektroforeze, ali bez uzorka na gelu, kojom se stabiliziraju uvjeti u sekvenceru i pomjeraju

eventualne manje nečistoće i mjehurići. Tek nakon toga uzorci se apliciraju na gel i starta se

run faza koja traje 3.5 sata. To je neophodan vremenski period za putovanje uzoraka od

početka gela do reading regiona, tj. regiona laserske aktivnosti.


BIOTEHNOLOGIJA

VI CJELINA

MOLEKULARNO GENETIČKI MARKERI

Pod molekularnim markerima podrazumijevamo obilježja koja mogu poslužiti u identifikaciji

određenih genetičkih sistema i njihovo razlikovanje od drugih. Definiraju se i kao osobine

genotipa koje variraju između jedinki populacije ili između samih populacija. Dakle, markeri

nam mogu poslužiti kao referentni sistemi u odnosu kojih definišemo ciljane genetičke

sisteme.

Uopćeno se mogu podijeliti na indirektne i direktne genetičke markere. Imdirektni genetički

markeri jesu fenotipska obilježja na osnovu kojih se mogu dobiti informacije o

karakteristikama genotipa. Obuhvataju morfološke i biohemijske markere. Direktne genetičke

markere predstavljaju DNK – bazirani markeri. Naime, postoje DNK regioni koji ispoljavaju

određeni stupanj varijabilnosti, i upravo ta osobina naslijednog materijala se može uspjesno

koristiti kao “marker” u genetici. DNK markere prema tipu sekvence možemo podijeliti na

single copy i repetitivne, te na kodirajuće i nekodirajuće, dok prema usmjerenosti analize na

dio sekvence, dijelimo ih na ciljane i arbitrarne. DNK – bazirani markeri obuhvataju slijedeće

oblike:

RFLP-molekularni markeri (Restriction Fragmenth length Polymorphism)

SSCP (Single-Strended Conformation Polymorphism)

RAPD-molekularni markeri (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

AFLP-molekularni markeri (Amplified Fragment Length Polymorphism)

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ili snipovi

VNTR-molekularni markeri (Variable Number of Tandem Repeats)

STR-molekularni markeri (Short Tandem Repeats)

Detekcija STR markra na poliakrilamidnom gelu primjenom AB377 sekvencera


BIOTEHNOLOGIJA

Kod detekcije STR markera princip je takav da se konačna sekvenca datog segmenta ne javlja

krajnjim rezultatom. Ta sekvenca se sastoji od već poznatih repetitivnih jedinica. Osnovni cilj

analize STR markera je utvrđivanje broja ponavljanja pojedinih STR sekvenci unutar

analiziranog lokusa. Markiranje se u ovom slučaju vrši po princicpu da se cijeli marker oboji

odgovarajućom bojom. Da bi se izbjegle nedoumice koriste se 3 boje, a u novije vrijeme I 4

boje kojima se markiraju ciljani lokusi. Istom bojom se markiraju dovoljno udaljeni lokusi,

kod kojih je isključeno preklapanje, a različitim bojama se analiziraju lokusi iste veličine, tako

da je i pored istog položaja na gelu, moguća njihova distinkcija zahvaljujući raznobojnom

fluerosciranju alelnih varijanti porijeklom iz različitih lokusa.

Dobijeni pikovi kada se softverski obrade, ne predstavljaju pojedinačne baze nego alelne

varijante, koje su pokazatelji koliko se puta poznata repetitivna jedinična sekvenca ponavlja.

Iako se i analiza STR markera realizira na sekvenceru, riječ sekvenciranje, koje se često u

laboratorijskom žargonu koristi za ovaj postupak, nije prikladna. Stoga je preciznije primjeniti

termin detekcija ili profiliranje.

Preliminarni “sirovi“ rezultati se kompajliraju I analiziraju primjenom softvera, kao što su

Data Collectin Software I Gene Scan Software. Primjenom Powertyper 16 Macro verzije

Genotyper softvera realizirano je numeriranje alelnih varijanti I dizajniranje STR DNK

profila.


BIOTEHNOLOGIJA

VII CJELINA

KULTURA BILJNIH TKIVA I ĆELIJA

Kultura biljnih tkiva i ćelija obuhvata postupke uzgajanja ćelija, tkiva i organa u vještačkim,

kontrolisanim i aseptičnim uslovima. Biljna ćelija je totipotentna. To znači da svaka biljna

ćelija sadrži informaciju koja je neophodna za diferencijaciju i stvaranje nove biljke. Dakle,

teorijski gledano, dovoljna je samo jedna ćelija biljke i to bilo kojeg njenog dijela da

dobijemo kompletnu odraslu biljku. S obzirom da uzimamo tkiva kao početni eksplantat,

dobijena novonastala biljka biće genetički identična majci biljci. Zato se razmnožavanje u

kulturi naziva još i klonsko razmnožavanje. Klonsko razmnožavanje se danas koristi u

mnogim oblastima biljne proizvodnje ali i u fundamentalnim biološkim istraživanjima.

Sinonimi koji se često koriste za kulturu biljnih ćelija i tkiva su in vitro porpagacija ( in vitro

znači u staklu - biljke se uzgajaju u prozirnim posudama) i mikropropagacija

(mikrorazmnožavanje) jer se u početku dobijaju minijaturne biljčice.

Nekoliko je tehnika kojima se biljke mogu razmnožavati in vitro. Postoje različite

klasifikacije, ali se tehnike generalno mogu podijeliti prema tipu eksplantata koji se uvodi u

kulturu na:

- Kultura ćelija predstavlja uzgoj pojedinačnih ćelija u tečnim hranljivim

podlogama.

- Kultura tkiva kao osnovni cilj ima dobijanje i neograničeno dugo održavanje

tkiva u nediferenciranom stanju. Ovo tkivo se naziva kalus i može se dobiti iz bilo

kojeg početnog ekspalnata.

- Kultura organa – u okviru ove tehnike postoji nekoliko tehnika, pa imamo

kulturu antera (polena), kulturu ovarijuma, kulturu korjenova, kulturu izdanaka i

kulturu listova

- Kultura embriona – početni eksplantat je embrion a tehnika se primjenjuje u

slučajevima kada je embrion nedovoljno razvijen.

- Kultura meristema – tehnika kod koje je polazni eksplantant meristem.

- Kultura protoplasta – tehnika koja se zasniva na mogućnosti uklanjanja

ćelijskog zida. Ovako ogoljene ćelije nazivaju se protoplasti. Uklanjanje ćelijskog zida


BIOTEHNOLOGIJA

omogućilo je raznovrsne primjene kao što su fuzija protoplasta i dobijanje somatskih

hibrida čak i taksonomski udaljenih vrsta (vrsta koje se u drugim tehnikama ne bi

mogle usavršavti).

- Somatska embriogeneza – tehnika za indukovanje i razvoj embriona iz

somatskih (tjelesnih ćelija).

U kulturi biljke rastu u kontrolisanim i vještačkim uslovima. To prvenstveno podrazumijeva

uzgoj biljaka na hranjivim podlogama. Pod hranjivom podlogom (medijum) podrazumjevamo

smjesu šećera, mineralnih soli, vitamina, aminokiselina i regulatora rasta rastvorenih u vodi.

Podloge koje sadrže učvršćivač-agar se označavaju kao čvrste hranjive podloge. Pored

čvrstih, postoje i tečne hranjive podloge koje sadrže sve gore navedene elemente osim agara.

Također je važno obezbijediti odgovarajuću kiselost podloge, jer bi kisela ili bazna podloga

negativno uticala na rast i razviće biljka u kulturi. pH vrijednost podloge kasnije mijenja i

sama biljka koja raste na toj podlozi. pH vrijednost je bitna ne samo što određuje čvrstinu

podloge, već i zato što utiče na pristupačnost pojedinih mineralnih soli, a posebno željeza. pH

vrijednost podloge varira za različite biljne vrste, ali za većinu vrsta optimalna kiselost

podloge je blago kisela ( pH 5-6,5 ).

Postoji nekoliko receptura za pripremanje hranjivih podloga a jedna od najčešće korištenih je

Murashige i Skoog (MS) podloga (Murashige i Skoog, 1962). Ova podloga se priprema tako

što se u destilovanu vodu, uz konstantno miješanje dodaju: saharoza, inozitil, makro-soli,

mikro-soli, rastvor željeza, vitamini, a ukoliko je receptura zahtjeva i regulatori rasta. Prije

dodavanja učvrščivaća u podlogu mjeri se kiselost podloge (pH metrom ili papirom za

mjerenje pH). Kada podesimo pH, podloge kuhamo uz konstantno miješenje, dok podloga ne

dosegne temperaturu ključanja.

S obzirom da hranjiva podloga sadrži sve komponente u optimalnim količinama, ona je

idealan medij za rast mikroorganizama. Mikroorganizmi, kao što je poznato, imaju kraći i brži

životni ciklus, pa će oni iscrpiti sve komponente iz podloge i onemogućiti osjetljivom biljnom

tkivu da raste. Zbog toga je potrebno sterilisati, ne samo podloge nego i sav materijal,

instrumentarij i radni prostor. Sterilizacija mora biti detaljna i temeljita kako bi se spriječila

konatminacija kultura.

Sterilizacija može biti hemijska, tj. sterilizacija pomoću hemijskih sredstava (NaOH, varkina

itd.) ili fizička – sterilizacija fizičkim postupcima (visokom temperaturom, UV zračenjem,

itd.). Sterilizacija visokom temperaturom se nadalje dijeli na suhu sterilizaciju i sterilizaciju

pod visokim pritiskom (autoklav).


BIOTEHNOLOGIJA

Hemijska sterilizacija se koristi za sterilisanje biljnog materijala koji se uvodi u kulturu. Biljni

materijal je vrlo osjetljiv na visoke temperature pa je logično da će se kao sredstvo za

sterilizaciju koristiti hemijske supstance. Međutim, treba biti pažljiv. Hemijska sredstva su

vrlo agresivna, pa je neophodno napraviti razblaženje. Uglavnom se koristi vodena otopina

natrijevog hipohlorita (1-3%) ili 15% varkina. Često se u kratkom trajanu biljni materijal

može isprati u 70% etanolu. Međutim, nekada je infekcija duboko u unutrašnjosti biljnog

uzorka, pa je takve infekcije teško eliminirati. Zato se pri uzimanju početnog uzorka –

eksplantanta izbjegavaju dijelovi biljke sa razvijenim provodnim sistemom (apikalni vrhovi

vegetacijske kupe), jer virusi skoro uvijek bivaju nošeni strujom protoka ksilema i floema.

Postupcima suhe sterilizacije se steriliše stakleno posuđe i termootporne plastične zdjele, te

instrumenti (skalpeli, pincete igle). Suha se sterilizacija se vrši u suhom sterilizatoru na

temperaturi 180°C u trajanju od 3 sata. Nakon sterilizacije posuđe i instrumenti se unose u

sterilnu komoru – laminar, gdje se izlažu dejstvu UV lampe. UV lampa zrači veoma štetno

ultravioletno zračenje koje uništava mikroorganizme. Svaka laboratorija za klonsko

razmnožavanje biljka ima UV lampu koja se pali 15- 30 minuta prije početka rada.

Instrumenti se prije same upotrebe uranjaju u čašu sa 96% etilnim alkoholom, a kontaktni

vrhovi se spaljuju na plameniku špiritusne lampe tokom rada. Laminar ima UV lampu, koja se

uključuje najmanje 1 sat prije početka rada. Prije unošenja uzorka, podloga i instrumentarija

za rad treba isključiti UV lampu, radni pult laminara prebrisati 96% alkoholom te osigurati

cirkulaciju sterilnog zraka barem 15 minuta prije početka rada.

Hranjive podloge i destilovana voda se sterilišu autoklaviranjem na 120°C i pod visokim

pritiskom. Autoklaviranje je postupak vlažne sterilizacije i obavlja se u autoklavu. Autoklav

je aparat konstruisan da obezbijedi pregrijanu vodenu paru koja na temperaturama višim od

100 ° C efikasno uništava većinu mikroorganizama. Budući da treba da izdrže pritisak veći od

atmosferskog, autoklavi su po pravilu masivno izrađeni aparati. Vrijeme sterilizacije u

autoklavu ovisi od količine podloge i njenog tipa, a najčešće traje 15 – 20 minuta. Pregrijana

vodena para i natpritisak autoklava efikasno uništava većinu mikroorganizama. Tek kada su

pripremljene hranjive podloge i obezbjeđeni sterilni uslovi može se pristupiti razmnožavanju

biljaka in vitro.

Sveukupni postupak kloniranja, od uzimanja početnog eksplantanta do dobivanja željenog

broja i vrste biljaka, sastoji se od nekoliko faza:

Nulta faza


BIOTEHNOLOGIJA

Ovo je početna faza i ona uklučuje sve postupke prije početka uvođenja biljke u kulturu in

vitro. Naziva se „nulta“ jer nije faza samog razmnožavanja, već obuhvata postupke pravilnog

prikupljanja, prenošenja i čuvanja biljnog materijala. Izvorno biljno tkivo od kojeg će se uzeti

eksplantant i postupak koji će se primjeniti imaju kritičnu ulogu u uspješnom dobijanju

kloniranih biljaka. Važno je, dakle, odabrati zdravi i vitalni dio biljke jer od stanja početnog

uzorka zavisi kompletna uspješnost kloniranja u in vitro uslovima. Kao početni materijal, u

postupcima klonskog razmnožavanja biljaka, preporučuje se vršni meristem, jer je to dio

biljke koji ima najveću diobenu aktivnost ćelija, a s obzirom da je zaštićen u pupoljku biljke

najmanja je opasnost od prisustva mikroorganizama koji su izvor zaraze u kulturi in vitro.

Prva faza- uvođenje u kulturu

Ova faza je ustvari prva faza klonskog razmnožavanja. Ona uključuje sterilnu izolaciju

dijela biljke kojeg želimo klonirati (meristem, list, tučak, korijen, prašnik i dr.) a ako postoji

unutrašnja infekcija, potrebno je primijeniti posebne tehnike. Takođe, ovo je faza

cjelokupne sterilizacije (posuđa, prostora i podloga) i pripremanja podloga. Najvažnije u

ovoj fazi je dobivanje sterilnog rasta eksplantanta. Ako se ova faza ne provede uspješno i

detaljno, cijele kulture kloniranih biljka će se kontaminirati i naredne faze u klonskom

razmnožavanju neće biti realizovane.

Druga faza – razmnožavanje

Kao što joj i ime kaže, ovo je faza razmnožavanja, odnosno umnožavanja kloniranih

biljka.Glavna svrha ove faze je postići razmnožavanje bez gubitka genetičke stabilnosti.

Umnožavanje se obavlja na različite načine a koja metoda će biti primijanjena zavisi od

rezultata koji se želi postići (broj biljki, biljke sa određenim osobinama i sl.), od vrste biljke

koja se klonira i njenih bioloških ograničenja. U ovoj fazi se koriste biljni regulatori rasta koji

podstiču rast biljke u kulturi. Tako citokinini utiču na rast biljke, auksini podstiču nastanak

korijena, a giberlini regulišu klijanje i cvijetanje. Pravilan odabir vrste i količine hormona je

veoma važan. Ukoliko se primjene optimalne koncentracije hormona, biljka će moći

nesmetano rasti u kulturi. Nepravilan odabir hormona rezultiraće slabim prinosom,

patuljastim rastom, odsustvom korijena... Kada biljka dosegne određenu veličinu i

odgovarajući broj bočnih izdanaka, ona se može multiplicirati. Umnožavanje se vrši tako što

se od jedne biljke odvoje svi bočni izdanci i postave se na sviježe pripremljene podloge. Ovi

izdanci će u narednim fazama ponovo rasti i davati nove bočne izdanke. Faza multiplikacije

se ponavlja sve dok ne dobijemo dovoljan broj biljaka.


BIOTEHNOLOGIJA

Treća faza – rizogeneza

Neke biljne vrste se zakorjenjuju spontano već u podlozi bez regulatora rasta, međutim

večini je potrebno dodavanje malih količina auksina u podlogu. Tek kada adventivno

korijenje dostigne odgovarajuću dužinu, biljke se mogu postepeno prenositi u ex vitro uslove.

Četvrta faza – priprema i prijenos biljaka u vanjske uslove

Klonirane biljke razlikuju se od biljka uzgojenih u stakleniku ili na otvorenom po brojnim

anatomskim i funkcionalnim karakteristikama. Ove biljke od samog početka imaju u podlozi

sve potrebne hranjive materije, optimalnu temperaturu, visok stupanj vlažnosti i potpunu

zaštitu u sterilnim uslovima od mikroorganizama. Sam prijelaz sa uslova in vitro na uslove

vanjske sredine predstavlja fiziološki stres koji brojne vrste teško preživljavaju te je ovo

kritična faza u klonskom razmnožavanju biljaka.

Uvođenjem siromašnije podloge u zadnjim fazama mikrorazmnožavanja, biljka se polako

navikava na autotrofiju. Prvih dana biljkama se i u stakleniku moraju obezbijediti vlaga i

temperatura na kojoj su se razvijale u uvjetima in vitro. Sve podloge u koje su biljke

prenesene moraju, u prvim fazama, biti sterilne. Postupnim smanjenjem vlage u zraku, biljke

stvaraju jaču kutikulu koja spriječava naglu dehidrataciju. I fotosintetički organi – listovi

postepeno se počinju privikavati na fotosintezu. Tek kada mlade biljke počinju stvarati nove

listove i korijenove, koji su prilagođeni funkcionalnim potrebama u izmijenjenim uslovima

sredine, možemo reći da su se biljke uspješno adaptirale.

Klonsko razmnožavanje biljaka ima niz prednosti u odnosu na konvencionalne načine

razmnožavanja. Neke od njih su:

1. Dobivanje biljaka bez patogenih klica (posebno virus free biljaka).

2. Razmnožavanje in vitro mnogo je brže u odnosu na razmnožavanje in vivo.

3. Moguće je razmnožavati i one biljke koje u uvjetima in vivo nije moguće.

4. Mikroklonirane biljke rastu mnogo brže u odnosu na biljke klonirana in vivo.

5. U kulturi in vitro razmnožavaju se samo samo zdrave biljke.

6. Prostor potreban za podizanje i razmnožavanje matičnih biljaka znatno se smanjuje

upotrebom kulture in vitro.

7. Zahvaljujući optimalnim uvjetima omogućeno je precizno vremensko planiranje

proizvodnje presadnica, čime se poništava sezonski uticaj i postiže proizvodnja kroz

čitavu godinu.


BIOTEHNOLOGIJA

8. Nova sorte mogu se komercijalno brzo razmnožavati i tako ponuditi tržištu u mnogo

kraćem vremenu.

9. Oplemenjivači mogu brže postići solidne mutante poticanjem advantivnih pupova i

izdanaka.

10. Kultura in vitro posebno je korisna za osnivanje banke gena koja čuva zdrav, od

virusa slobodni biljni materijal, na niskoj temperaturi i malom prostoru.

11. Neke biljke potrebno je ustaliti i razmnožavati vegetativno jer su spolno sterilne .

12. Za postavljane kulture potrebno je vrlo malo početnog materijala.

Ipak, klonsko razmnožavanje ima i nekoliko nedostataka od kojih su najvažniji:

1. Genetička stabilnost u nekim je sistemime razmnožavanja in vitro vrlo niska, što se

posebno odnosi na umnožavanje adventivnim izdancima i somatskom embriogenezom.

2. Biljke iz kulture in vitro mogu nakon prijenosa u vanjske uslove pokazati određene loše

osobina

3. Kod drevenastih vrsta često je vrlo teško potaknuti zakorijevanje reznica in vitro.

4. Mikroklonirani genotip biljaka, koji će se uzgajati u polju na otvorenom, može biti

osjetljiv na bolest i uništen od patogenog organizma koji ga je napao.

5. Regenerativna sposobnost kod biljke se može izgubiti nakon određenog broja

subkultura.

Kultura organa (list i peteljka) vrste Schefflera sp.

Površinska sterilizacija

Početni eksplantati (listovi i peteljke vrste Schefflera sp.) se površinski sterilišu 1 minutu u

apsolutnom alkoholu i 20 minuta u 15% varikini. Nakon toga eksplantati se ispiraju u

autoklaviranoj, destilovanoj vodi 3-4 puta po 5 minuta. Sterilisani eksplantati se suše na

sterilnom filter papiru.

Uvođenje eksplantata u kulturu

Površinski sterilisani eksplantati se režu sterilnim instrumentarijem, koji se prethodno žari na

plameniku. Ovako pripremljeni eksplantati se postavljaju na hranjivu MS podlogu sa malim

koncentracijama citokinina i auksina. Kulture se ostavljaju u klima komori sa regulisanom

temperaturom, vlažnošću zraka i intenzitetom svjetlosti.


BIOTEHNOLOGIJA


BIOTEHNOLOGIJA

VIII CJELINA

UVOD U DISKUSIJU O ETIČKO LEGALNIM ASPEKTIMA

GENETIČKIH ISTRAŽIVANJA

Nauka koja je, između ostaloga, nastala upravo kao posljedica rapidnog razvoja primijenjene

genetike i biotehnologije je bioetika. Ova naučna disciplina se prvenstveno odnosi na skup

nepisanih pravila o tome šta je zaista «dobro» (ispravno) a šta «zlo» (neispravno). Bioetička

pitanja posebno su zaoštrena pitanjima genetičkih testova i genetičkog inženjeringa, te

pitanjima kloniranja, koja otvaraju vrata za novu eugeniku (primjenu naučnih metoda sa

ciljem stvaranja najboljih nasljednih karakteristika budućih generacija).

Razvoj nauka o živim sistemima uvjetovao je da ljudska prava, poput prava na tjelesni

integritet , dostojanstvo ili privatnost dobiju nove dimenzije.

- dijelovi ljudskog tijela se upotrebljavaju u transplantaciji.

- odstranjeni organi mogu biti izvor za patentiranje novih ćelijskih linija mimo

saglasnosti onoga kome pripadaju.

- Ljudski tijelo u cijelini predstavlja potencijalni objekt biomedicinskog eksperimenta.

Pojedinačna ili grupna genetička testiranja otvraju put za dobijanje genetičkih informacija

koje ne moraju predstavljati samo dijagnostičko sredstvo već potencijalno mogu biti osnov za

diskriminaciju u društvu, u domenu zapošljavanja, osiguranja itd. Takve genetičke analize

kojima se prodire u genetičko naslijeđivanje čovjeka mogu značiti narušavanje ljudskog

dostojanstva i tzv. genetičkog identiteta, kao nove dimenzije prava na ljudsko dostojanstvo

koje bi u eri mapiranja ljudskog genoma moralo biti zaštićeno. Kroz informacije dobijene

genetičkim «skrininzima» i testiranjima moguće je identifikovati osobu, otkriti eventualne

poremećaje na nivou genotipa, te klasificirati je u „rizičnu populaciju“.

Jedan od primjera potiče iz 1907. U 27 američkih država donijet je zakon o sterilizaciji kojim

se zabranjuje određenim kategorijama, koje je su od strane zvaničnih organa proglašeni kao

genetički inferiornih ljudi – duševnim bolesnicima, epileptičarima, ljudima sa minimalnim

fizičkim sposobnostima, da ima j djecu. Jedna od demografskih metoda za zaštitu američkog

gene poola bilo je donošenje zakona kojim se ograničavalo doseljavanje iz istočne i južne

evrope za čiju se populaciju smatralo da posjeduje nepoželjan genetički materijal.


BIOTEHNOLOGIJA

Upravo ovakva zloupotreba genetike u prošlosti, opasnost od genetičke diskriminacije,

otkrivanje potencijala za razvoj bolesti koje možda nikada neće dati kliničke simptome

prdstavljaju osnovne argumente za uspostavljanje etičko- zakonske regulatve iz ove oblasti.

Osnovna pitanja koja se sama po sebi nameću su:

Gdje su granice aplikativne genetike i biotehnologije?

Ko ih postavlja?

Da li spriječiti njihov razvoj i u kojoj mjeri kad dovode do unaprijeđenja medicinske

pomoći?


BIOTEHNOLOGIJA

IX CJELINA

DETEKCIJA GENETIČKI MODIFICIRANIH ORGANIZAMA

(UVOD)

Genetička modifikacija - izmjena genetičkog materijala u nekom organizmu na način koji se

ne dešava prirodno ukrštanjem ili prirodnom rekombinacijom.

GMO – organizam u kojem je genetički materijal izmjenjen na način koji se u prirodi ne

događa križanjem ili prirodnom rekombinacijom.

GMM – (genetički modifikovan mikroorganizam), bilo koji modifikovan mikroorganizam,

ćelijski ili nećelijski, sposoban za replikaciju ili za transfer genetičkog materijala, uključujući

viruse, viroide, animalne i biljne ćelije u kulturi.

Tehnike koje rezultiraju genetičkom modifikacijom:

-Tehnike rekombinacije DNK korištenjem vektorskih sistema

-Tehnike koje podrazumjevaju direktnu introdukciju genetičkog materijala u mikroorganizam,

pripremljenog van mikroorganizma, uključujući mikroinjeciranje, makroinjeciranje. Ćelijska

fuzija ili hibridizacija, prilikom koje se formiraju žive ćelije sa novim kombinacijama

nasljednog materijala.

Metode koje ne rezultiraju genetičkom modifikacijom:

-In vitro fertilizacija

-Konjugacija ili neki drugi sličan prirodni proces

-Poliploidna indukcija

GMO detekcija podrazumijeva otkrivanje gnetički modificiranih organizama u uzorcima

biljnog, animalnog ili bakterojskog porijekla. Metode za GMO detekciju se mogu podijeliti na

kvantitativne i kvalitativne. Kvalitativne metode nam pružaju podatke smao o prisustvu ili

odsustvu GMO, a vrše se na dva nivoa:

1. detekcija na nivou proteina

2. detekcija na nivou nukleinskih kiselina


BIOTEHNOLOGIJA

Detekcija na proteinskom nivou vrši se primjenom testnih traka, a bazirana je na reakciji

antigen-antitijelo i pogodna je za skrining u vanlaboratorijskim uslovima (npr. na granicama).

Kvalitativna detekcija na nivou DNK obuhvata metode bazirane na PCR tehnici. Osim

standardnih komponenti potrebnih za PCR, poželjni su uzorci sa pouzdanim prisustvom

ciljanog DNK fragmenta (PCR pozitivna kontrola). Real-Time PCR na tehnika je

najegzaktniji način kvantifikacije prisustva transgenih organizama u uzorku. Zasniva se na

amplifikaciji transgena i njegovoj relativnoj kvantifikaciji u odnosu na standard.


materijal farmaceutska biotehnologija

Documents