marcos catanho

Marcos Catanho

Curso de Introdução àBioinformática

Laboratório de Genômica Funcional e BioinformáticaDBBM-IOC / Fiocruz

Programa de Qualificação Docente da CAPESConvênio: UFPE - UFCG - Fiocruz

Comparação de Seqüências e Busca por Similaridade

Agenda

Motivação Métodos utilizados Problemas freqüentes Heurística para alinhamento local

(BLAST) Pacotes de programas para análise

de seqüências

Os motivos...

Comparação entre seqüências biológicas (ácidos nucléicos e proteínas) uma das tarefas computacionais mais freqüentes entre pesquisadores da área biológica.

Os motivos... Este tipo de análise permite que

relações evolutivas, estruturais e funcionais existentes entre as seqüências comparadas sejam reveladas, fornecendo evidências decisivas para a caracterização das propriedades biológicas de novas seqüências com base no conhecimento acumulado sobre outras já estudadas.

Os motivos...

Se as seqüências comparadas são suficientemente similares entre si, infere-se que estas seqüências sejam homólogas.

E sendo assim, presume-se que elas tenham a mesma estrutura e função biológica.

Os problemas...

Qual o grau de similaridade mínimo entre duas seqüências para que possam ser consideradas homólogas?

Similaridade ao nível da seqüência primária por si só é suficiente para determinar se duas seqüências são homólogas ou não?

Os problemas... O que fazer quando a seqüência de

função desconhecida é bastante similar a várias seqüências de um outro organismo, mas que exercem funções diferentes no mesmo? Qual delas é o “verdadeiro homólogo”? O mais similar?

Já foi demonstrado que muitas vezes não é... “E agora José?”

Portanto, em princípio, similaridade não implica necessariamente em homologia.

Nem tudo está perdido... Será? Atualmente, os algoritmos de

comparação de seqüências são acompanhados por estimativas estatísticas que fornecem uma medida do grau de significância das similaridades observadas, auxiliando a dedução de homologia.

Mesmo assim, significado estatístico não implica necessariamente em significado biológico...

(Parênteses - algoritmo)

É um conjunto de instruções ordenadas para execução de uma ação qualquer.

Os métodos...

Durante a evolução, as seqüências mudam através de inserções, deleções e mutações.

Estes eventos podem ser traçados com uso de algoritmos de alinhamento.

Os métodos... Por exemplo, suponha que a

seqüência a tenha evoluído para a seqüência b, através de inserções, substituições e deleções. Podemos representar esta transformação da seguinte maneira:

a = A C - T T G Ab = A G A T T - A

Os métodos...

O objetivo é achar o alinhamento “correto” que representa a verdadeira série de eventos evolutivos que ocorreram.

Os métodos... Para cada alinhamento, calcula-se o

número de pontos obtidos (score), com base em um esquema de pontuação (ou matriz de substituição) e em valores arbitrados de penalidade para a abertura e extensão de espaços nas seqüências alinhadas (gap opening/extension penalties).

Os métodos...

a = A C - T T G A

b = A G A T T - A

pontuação = 1 0 -1 1 1 -1 1

score = 1+0+(-1)+1+1+(-1)+1 = 2

Esquema de pontuação:

match = 1 mismatch = 0 gap = -1

(Parênteses – matriz de substituição)

É uma matriz representando todas as possíveis trocas entre aminoácidos, onde um valor é atribuído a cada uma destas trocas.

Esses valores são proporcionais à probabilidade de ocorrência de cada troca, tomando-se como base um determinado modelo evolutivo.

(Parênteses – matrizes de substituição)

(Parênteses – matrizes de substituição) PAM (Percent Accepted Mutation)

family: Baseiam-se em alinhamentos globais

de proteínas muito próximas PAM1 é a matriz calculada a partir da

comparação de seqüências com não mais do que 1% de divergência

As demais matrizes PAM são extrapolações da PAM1

(Parênteses – matrizes de substituição) BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)

family: Baseiam-se em alinhamentos locais de

proteínas BLOSUM 62 é a matriz calculada a partir da

comparação de seqüências com não menos do que 62% de divergência

Todas as matrizes BLOSUM baseiam-se em alinhamentos observados; não há extrapolações

Dica importante! Seqüências que codifiquem proteínas ou

que potencialmente codifiquem proteínas devem ser alinhadas na forma de aminoácidos e não de nucleotídeos.

Motivos: Maior precisão (por causa da degeneração do

código genético) Maior sensibilidade (leva em conta

características físico-químicas dos aminoácidos)

Os métodos...

Alinhamento global Alinhamento de pares de seqüências

nucleotídicas ou protéicas ao longo de toda a extensão das mesmas.

Apropriado nos casos em que se espera que as seqüências estudadas sejam similares ao longo de toda a seqüência ou na maior parte dela.

Os métodos... Alinhamento local

Alinhamento de uma ou mais partes de duas seqüências nucleotídicas ou protéicas.

Apropriado nos casos em que se espera que apenas algumas regiões específicas das seqüências estudadas (e.g domínios) sejam similares entre si.

Neste caso, o alinhamento global das seqüências poderia não ser apropriado (as similaridades locais poderiam ser “mascaradas”)

Os métodos... Rigorous Dynamic Programming

Needleman & Wunsch (1970) (global) Smith & Waterman (1981) (local) SSEARCH

Heuristics Lipman & Pearson (1985,1988) (local)

FASTA Altschul et al. (1990,1997) (local) BLAST Feng & Doolittle (1987) (global) Thompson et al. (1994) (global) ClustalW

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool

Provavelmente a ferramenta computacional mais utilizada em biologia molecular e bioinformática

Busca seqüências armazenadas nos bancos de dados pela similaridade entre a estrutura primária da seqüência query e as seqüências armazenadas no banco


Propriedades biológicas descritas para seqüências armazenadas podem ser transferidas para a seqüência query desde que suas estruturas primárias sejam semelhantes

O maior problema é definir um cut-off, um limite abaixo do qual as similaridades encontradas entre a query e os hits não sejam mais significativos


É um método heurístico para alinhamentos locais

Projetado especialmente para buscas em bancos de dados

Idéia básica: bons alinhamentos irão conter pequenos trechos de combinações iguais

BLAST - versões

BLAST - algoritmo 1. Filtrar as regiões de baixa complexidade

FTLPQITTPPITTPPLTIDPINLTGFTLPQITTPPITTPPLFN |||

FTLPQ(ITTPP)2LTIDPINLTGFTLPQ(ITTPP)2LFN

FTLPQXXXXXXXXXXLTIDPINLTGFTLPQXXXXXXXXXXLFN

BLAST - algoritmo 2. Fragmentar a seqüência query e as

seqüências depositadas no banco de dados, criando “palavras“ (de comprimento 3 para proteínas e 11 para DNA) através do uso de uma janela deslizante

MEF EFP FPG PGL GLG

MEFPGLGSLGTSEPLPQFVDPALVSS

BLAST - algoritmo

3. Utilizando uma matriz de substituição (pontuação) (PAM, BLOSUM), encontrar todas as “palavras” de tamanho W que obtenham, no mínimo, um no. de pontos (score) T quando comparadas com a seqüência query, criando uma lista de “palavras” de alta pontuação

BLAST - algoritmo 4. Procurar em cada seqüência

depositada no banco de dados por uma ou mais ocorrências de cada “palavra” de alta pontuação. Cada uma destas ocorrências (hit) será uma “semente” para um alinhamento sem gaps

5. Estender os hits em ambas as direções, na tentativa de gerar alinhamentos com score acima de um limiar S

BLAST - algoritmo 5.1. BLAST original (ungapped): extensão dos

hits à esquerda e à direita da “semente”, sem gaps. Esta extensão irá continuar enquanto o score aumentar ou pelo menos continuar o mesmo. O alinhamento obtido é chamado HSP (High Scoring Pair)

5.2. Atualmente (gapped): hits ao longo da mesma diagonal (Dot plot) com uma distância A entre os dois são reunidos e a extensão se dá com a seqüência maior obtida

(Parênteses – Dot Plots - matrizes de homologia)

Auto-comparação do receptor de LDL humano. A: janela = 1, estringência = 1 B: janela = 23, estringência = 7

BLAST - algoritmo

6. Reter somente os HSPs com score acima do limiar S

7. Determinar a significância estatística de cada alinhamento remanescente (p-value e E-value)

8. Mostrar os alinhamentos locais (de acordo com Smith-Waterman)

Resultado (input) Seqüência em formato FASTA

Primeira linha: cabeçalho (header) Demais linhas: seqüência

Símbolo “>” Nome da seqüência Descrição da seqüência

Resultado (campo de busca)

Resultado (opções)

Resultado (formato)

Resultado (busca)

Resultado (BLASTN) O output é dividido em cinco

partes: 1. Header contendo a versão do BLAST,

data da compilação, referência, RID, etc. 2. Representação gráfica dos alinhamentos 3. Sumário com uma descrição em uma

linha de cada hit 4. Os alinhamentos com seus respectivos

parâmetros calculados 5. Rodapé com a descrição detalhada dos

parâmetros de busca empregados, o banco de dados, etc.

Resultado (header)

Resultado (graphical overview)

Resultado (one-line descriptions)

Resultado (links)

G: Gene (banco de dados de genes)

U: UniGene (banco de dados de clusters de genes)

E: GEO Profile (dados de expressão gênica e hibridização genômica obtidos por tecnologia high-throughput)

Resultado (alignments)

>gi|50363246|gb|AY661748.1| Polyodon spathula Hoxa-11 (Hoxa-11) gene, partial cds Length = 1452 Score = 278 bits (140), Expect = 1e-71 Identities = 203/224 (90%) Strand = Plus / Plus Query: 19 tactacgtttcgggtcccgatttctccagcctcccttcttttttgccccagaccccgtct 78 |||||||| |||||||| |||||||||||||||||||| ||||| |||||||| |||||| Sbjct: 2 tactacgtctcgggtcctgatttctccagcctcccttcctttttaccccagacaccgtct 61 Query: 79 tctcgccccatgacatactcctattcgtctaatctaccccaagttcaacctgtgagagaa 138 |||||||||||||| ||||| ||| ||||||| || ||||| |||||||||||||||||| Sbjct: 62 tctcgccccatgacgtactcttatccgtctaacctgccccaggttcaacctgtgagagaa 121 Query: 139 gttaccttcagggactatgccattgatacatccaataaatggcatcccagaagcaattta 198 || |||||||||||||||||||||||| |||||| ||||||||||| |||||||||| || Sbjct: 122 gtaaccttcagggactatgccattgatgcatccagtaaatggcatcacagaagcaatcta 181 Query: 199 ccccattgctactcaacagaggagattctgcacagggactgcct 242 |||||||||| ||| ||||||||||| ||||||| |||||||| Sbjct: 182 tcccattgctattcagcagaggagattatgcacagagactgcct 225

Score = 48.1 bits (24), Expect = 0.024 Identities = 33/36 (91%) Strand = Plus / Plus Query: 529 agcccagagtcttcttccggcaacaatgaggagaaa 564 ||||| ||||| ||||||||||||||||| |||||| Sbjct: 509 agccctgagtcctcttccggcaacaatgaagagaaa 544

Score = 46.1 bits (23), Expect = 0.095 Identities = 32/35 (91%) Strand = Plus / Plus Query: 367 caagcctttgaccagtttttcgagacggcttatgg 401 ||||||||||| |||||||| |||||||| ||||| Sbjct: 347 caagcctttgatcagttttttgagacggcgtatgg 381

HSPs

Resultado (footer)

GCG (pago) http://www.accelrys.com/products/

gcg/ EMBOSS (livre)

http://emboss.sourceforge.net/ Staden (livre)

http://staden.sourceforge.net/

Pacotes de programas para análise de seqüências

marcos catanho

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