1

Manuales Departamentales

Programa Académico, objetivos del curso, contenido temático y manual de prácticas de laboratorio

Bioquímica y Biología Molecular

Primer año 2009-2010

Departamento de Bioquímica Facultad de Medicina

Universidad Nacional Autónoma de México Cd. Universitaria, D.F. Agosto de 2009.

2

FACULTAD DE MEDICINA MANUALES DEPARTAMENTALES Obra general ISBN: 968-36-2767-6 Este volumen ISBM: 970-32-1866-0 © 2004 Nueva edición revisada y estructurada.

© 2005 primera reimpresión. © 2006 primera reimpresión.

Derechos reservados conforme a la ley. Facultad de medicina, UNAM.

Folio CAPES: 008/2005

El contenido de este Manual esta protegido por la Ley de Derecho de Autor y no puede ser reproducido, total o parcialmente, por ningún medio mecánico, electrónico o cualquier otro, sin el permiso escrito del Comité Asesor de publicaciones de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de México. El cuidado editorial estuvo a cargo del Comité Asesor de Publicaciones de la Facultad de Medicina, UNAM. El contenido de este Manual es responsabilidad de sus Autores ya que constituye un auxiliar en la enseñanza.

3

FACULTAD DE MEDICINA

Dr. Enrique Luis Graue Wiechers

Dra. Rosalinda Guevara Guzmán

Dr. Pelayo Vilar Puig

Dr. Juan José Mazón Ramírez

Dra. Irene Durante Montiel

Dr. Melchor Sánchez Mendiola

Dr. Ricardo Valdivieso Calderon

Dr. Luis Felipe Abreu Hernández

Lic. Raúl A Aguilar Tamayo

Dr. Guillermo Robles Díaz

Dra. Teresa Fortoul G

Dr. Arturo Ruíz R.

C.P. Francisco Cruz Ugarte

Director

Secretario General

Jefe de la División de Estudios de Posgrado e Investigación

Secretaria de Enseñanza Clínica, Internado y Servicio Social

Secretaria Técnica del H. Consejo Técnico

Secretario de Educación Médica

Secretario de Servicios Escolares

Secretario de Planeación

Secteraría Jurídica y de Control Administrativo

Coordinador de Investigación

Coordinadora de Ciencias Básicas

Coordinador de Servicios a la Comunidad

Secretario Administrativo

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

Dr. Edgar Zenteno Galindo

M. en C. Alicia Cea Bonilla

Dr. Raúl Chávez Sánchez

Dr. Guillermo Mendoza Hernández

M. en C. Rebeca Milán Chávez

Jefe del Departamento de Bioquímica

Coordinadora de Enseñanza de Bioquímica y Biología Molecular

Coordinador de Enseñanza de Inmunología

Coordinador de Investigación

Coordinadora del Laboratorio de Prácticas

4

Colaboradores

OBJETIVOS DEL CURSO Guillermo Álvarez Llera

Patricia del Arenal Mena

Alicia Cea Bonilla

Leonor Fernández Rivera Río

Rebeca Milán Chávez

Sara Morales López

Celia Virginia Sánchez Meza

SYLLABUS Guillermo Álvarez Llera (agua, ciclo de Krebs, oxidación de

los aminoácidos, química y metabolismo de

carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).

Patricia del Arenal Mena (ciclo celular).

Alicia Cea Bonilla (fundamentos del metabolismo,

proteínas, enzimas y coenzimas, estructura de

carbohidratos, metabolismo de carbohidratos,

regulación de la glucemia, regulación del metabolismo

de lípidos, síntesis y degradación de fosfolípidos,

regulación e integración metabólica, biología

molecular).

Leonor Fernández Rivera Río (nucleótidos).

Óscar Flores Herrera (figuras: ciclo energético, vías que

siguen los protones en las levaduras, ciclo de Krebs y

esquema de un potenciómetro).

Alberto Hamabata Nishimuta (aspectos básicos de

fisicoquímica, niveles de regulación de la expresión

genética).

Noemí Meraz Cruz (síntesis y degradación de fosfolípidos,

regulación del metabolismo de lípidos).

Rebeca Milán Chávez (equilibrio hidroelectrolítico).

Sara Morales López (agua, química y metabolismo de

carbohidratos, química y metabolismo de lípidos).

Celia Virginia Sánchez Meza (tabla periódica, enlaces,

fundamentos del metabolismo, equilibrio

hidroelectrolítico, proteínas, radicales libres,

descarboxilación del piruvato, regulación de la

glucemia, síntesis y degradación de fosfolípidos,

metabolismo del colesterol, estructura y metabolismo

de las lipoproteínas, regulación del metabolismo de

lípidos).

Haydée Torres Guerrero (modificaciones

postraduccionales).

Aída Uribe Medina (características de la materia viva).

Alejandro Zentella Dehesa (virus, oncogenes y

transformación).

INTRODUCCIÓN AL MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO Y CASOS DE CORRELACIÓN BIOQUÍMICA Y PRÁCTICA MÉDICA

Alicia Cea Bonilla (potenciometría y electroforesis).

Rebeca Milán Chávez (gota).

Celia Virginia Sánchez Meza.

ELABORACIÓN O REVISIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

1. Soluciones. Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca

Milán Chávez.

2. Regulación del equilibrio ácido-base después de

ejercicio muscular intenso y de la ingestión de

bicarbonato de sodio. Concepción González López,

Celia Virginia Sánchez Meza y Juan Luis Rendón

Gómez.

3. Cinética enzimática. Efecto de la concentración del

sustrato en la velocidad de la reacción enzimática.

Celia Virginia Sánchez Meza, Rebeca Milán Chávez y

Jesús Antonio Oria Hernández.

4. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto

de los inhibidores de la cadena de transporte de

electrones y de los desacoplantes. Juan Pablo Pardo

Vázquez y Federico Martínez Montes.

5. Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata.

Leonor Fernández Rivera Río.

5

6. Radicales libres (lipoperoxidación). José Gutiérrez y

Celia Virginia Sánchez Meza.

7. Estudio general del metabolismo de los carbohidratos.

Celia Virginia Sánchez Meza y Rebeca Milán Chávez.

8. Determinación de la transaminasa glutámico-pirúvica

sérica. Ma. Eugenia García Salazar y Celia Virginia

Sánchez Meza.

9. Determinación de glucosa en sangre total. Rebeca Milán

Chávez y Eugenia Flores Robles.

10. Integración Metabólica. Rebeca Milán Chávez y

Eugenia Flores Robles.

11. Huella génica. Rebeca Milán Chávez y Eugenia Flores

Robles.

La revisión y la actualización de los Objetivos del curso se

realizó en colaboración con el proyecto: Mejoramiento de la

Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular (EN-

206603) del Programa de Apoyo a Proyectos

Institucionales para el Mejoramiento de la Enseñanza

(PAPIME), siendo el responsable del proyecto el doctor

Federico Martínez Montes.

Corrección y cuidado de la edición: Edgar Zenteno

Galindo, Alicia Cea Bonilla, Rebeca Milán Chavez y

Eugenia Flores Robles.

VI

CONTENIDO

PROGRAMA ACADÉMICO

I. Misión de la Facultad de Medicina 8

II. Introducción 10

III. Datos generales de la asignatura 12

IV. Objetivos de aprendizaje 12

V. Metodología educativa 12

VI. Estructura del curso 13

VII. Lineamientos de evaluación 19

VIII. Obligaciones de los profesores y

alumnos 25

IX. Bibliografía 25

Unidad Temática 1: Estructura molecular

I. Lógica molecular de la vida A. Características de la materia viva 27 B. Niveles de la organización celular 29 B.1 Bioelementos 29 B.2 Moléculas precursoras y macromoléculas 29 B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y Organismos 29 II. Aspectos fisicoquímicos del funcionamiento celular A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica 31 B. Agua 33 C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base 35 D. Aminoácidos y proteínas 37 D.1. Aminoácidos 37 D.2. Proteínas 37 E. Enzimas y coenzimas 40 E.1. Características de un sistema enzimático40 E.2. Cinética enzimática 40 E.3. Aspectos médicos de la enzimología 40

Unidad Temática II: Metabolismo

III. Metabolismo y bioenergética A. Fundamentos del metabolismo celular 46 B. Carbohidratos 48

B.1. Estructura 48 B.2. Digestión y absorción 48 C. Metabolismo energético 50 C.1. Glucólisis 50

----- C.2. Papel de la mitocondria en las funciones oxidativas 51

C.3. Descarboxilación del piruvato 52 C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs) 52 C.5. Cadena de transporte de electrones

(cadena respiratoria) 54 C.6. Fosforilación oxidativa 54 C.7. Radicales libres 56 D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos.58 D.1. Gluconeogénesis 58 D.2. Glucogenólisis y glucogénesis 59 D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las

pentosas) 59 D.4. Regulación de la glucemia 60 E. Lípidos 62 E.1. Estructura 62 E.2. Digestión, absorción y transporte 62 F. Metabolismo de lípidos 64 F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ß-

oxidación) 64 F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos

cetónicos 65 F.3. Síntesis de ácidos grasos 65

F.4. Síntesis y degradación de triacilgliceroles 66

F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos 67 F.6. Metabolismo del colesterol 67 F.7. Estructura y metabolismo de las

lipoproteínas 68 F.8. Regulación y alteraciones del metabolismo de lípidos 69 G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados. 72 G.1. Aminoácidos y proteínas 72 G.2. Nucleótidos 74 H. Regulación e integración metabólica 76 Unidad Temática III: Biología Molecular IV Biología Molecular A. Organización del genoma 80 B. Flujo de la información genética 83 B.1. Flujo de la información genética 83 B.2. Síntesis del DNA (duplicación) 83 B.3. Transcripción 85 B.4. Traducción 86

VII

C. Mutaciones y reparación del DNA 89 D. Niveles de regulación de la expresión genética 90 E. Virus, oncogenes y transformación 93 F. Técnicas de manipulación del DNA 95 MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

I. Conceptos teóricos iniciales El método científico 99 El Sistema Internacional de Unidades (SI) 101 Matemáticas para el laboratorio 104 Notación científica o exponencial 104 El método del factor unitario en los cálculos 105 Logaritmos 106 Gráficas 107 Algunos métodos utilizados en bioquímica 109 Centrifugación 109 Potenciometría 110 Electroforesis 113 Soluciones 116 Manejo de material biológico 116 Medidas de seguridad 123

II. Experimentos Práctica 1. Soluciones 133 Práctica 2. Regulación del equilibrio ácido-base después de ejercicio muscular intenso y de la ingestión de bicarbonato de sodio 137 Práctica 3. Cinética enzimática. Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad

de la reacción enzimática 140 Práctica 4. Efecto de la insulina sobre la Glucemia de la rata. 145 Práctica 5. Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes 146

Práctica 6. El efecto del etanol sobre la lipoperoxi- dación 149

Práctica 7. Estudio general del metabolismo de carbohidratos 150 Práctica 8. El efecto del tetracloruro de carbono sobre las transaminasas 1155 Práctica 9.Determinaión de glucosa en sangre

total. 156

Práctica 10. Integración metabólica 160 Práctica 11. Huella génica 168

III. Casos de correlación bioquímica y práctica médica Caso 1. Cólera 174 Caso 2. Oclusión intestinal. Acidosis metabólica. Deshidratación grave 175 Caso 3. Hipoglucemia secundaria a intoxicación Alcohólica 177 Caso 4. Cetosis por inanición. Obesidad 178 Caso 5. Hipercolesterolemia y aterosclerosis 179 Caso 6. Gota 181

8

PROGRAMA ACADÉMICO

I. Misión de la Facultad de Medicina

“Formar a los líderes de las próximas generaciones de médicos mexicanos y contribuir a establecer un sistema de salud capaz de preservar y desarrollar las capacidades físicas y mentales de nuestra población y colaborar en la preparación de investigadores en el campo de las ciencias médicas.

Para ello, será necesario fortalecer el compromiso social de sus estudiantes y su vocación humanística para tener a la vida humana y a la dignidad del hombre como valores supremos, por lo que será necesario que los alumnos adquieran los conocimientos científicos más avanzados para responder cabalmente a las necesidades de salud de la sociedad mexicana.

La educación y la formación médica en la Facultad deberán ser factores de cambio e innovación en las instituciones de salud y contribuir a incrementar las aportaciones de la medicina mexicana al conocimiento universal.

El apego a la prestación de servicios de la más alta calidad, la curiosidad científica y el compromiso irrestricto con los principios fundamentales de la ética médica deberán ser la característica de sus egresados. Para ello será necesario organizarse en un ambiente de libertad intelectual, en el que se conjuguen el talento de profesores y alumnos, fomentando la creatividad y la productividad individual y colectiva”.

En suma, la Facultad de Medicina deberá caracterizarse por su calidad académica, su vitalidad, su compromiso decidido con la investigación original y los principios humanísticos de la profesión para poder consolidar el liderazgo que legítimamente le corresponde.

• Calidad académica. Que significa favorecer la formación más allá de la simple información en sus estudiantes, fortaleciendo su preparación en las ciencias básicas de la medicina que les permita seguir el ritmo de los avances en el conocimiento y sus aplicaciones en la clínica.

• Vitalidad. Para poder enfrentar el futuro en el contexto del cambio científico y tecnológico y de las modificaciones que experimenten las condiciones socioeconómicas de nuestra población. Para ello, será necesario rescatar la enseñanza tutorial orientada a la solución de problemas de manera original e innovadora y capaz de inducir en el estudiante una conciencia clara de sus necesidades de actualización permanente y educación continua.

• Investigación original. Por cuanto que es un elemento indispensable para alcanzar un sistema de salud de alta calidad y eficiencia, y porque es la única vía para atender cabalmente los complejos fenómenos que inciden en el proceso de la salud y la enfermedad en medicina, educación e investigación son inseparables.

• Humanismo. Porque el fin último del médico es el hombre mismo. Para ello habrá de desarrollar una sensibilidad singular ante el dolor y la angustia de los enfermos, ante su ignorancia y sus problemas, para que pueda ayudar a superarlos. Para poder servir a la sociedad y los individuos con plena conciencia de sus valores y potencialidades habrá que inducir en nuestros estudiantes una actitud humanitaria.

9

• Liderazgo. Entendiendo éste como la capacidad para mantener una actitud de vanguardia y compartir conocimientos y experiencia; para orientar la educación médica nacional y fortalecer tanto la investigación en salud como nuestro sistema de educación superior; para transformar la medicina mexicana y responder cada vez mejor a una sociedad que se esfuerza en superarse y demanda, con razón, una mayor calidad a todo el sistema de salud.

Congruente con la Misión de la Facultad de Medicina, la función del médico se caracteriza de la siguiente manera:

El médico es un profesional comprometido a preservar, mejorar y restablecer la salud del ser humano; sus acciones se fundamentan en el conocimiento científico de los fenómenos biológicos, psicológicos y sociales. Su ejercicio profesional se orienta primordialmente a la práctica clínica, la cual debe ejercer con conocimiento, diligencia, humanismo, prudencia y juicio critico, guiándose por un código ético que considera a la vida humana como valor supremo.

EL PERFIL PROFESIONAL DEL EGRESADO DE LA CARRERA DE MÉDICO CIRUJANO

El egresado de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México que cumple satisfactoriamente los objetivos y adquiere los conocimientos, habilidades, destrezas y actitudes que integran el Plan Único de Estudios:

• Es un profesional capacitado para ofrecer servicios de medicina general de alta calidad y, en su caso, para referir con prontitud y acierto aquellos pacientes que requieren cuidados médicos especializados.

• En la atención de los pacientes, además de efectuar las acciones curativas, aplica las medidas necesarias para el fomento a la salud y la prevención de las enfermedades, apoyándose en el análisis de los determinantes sociales y ambientales, especialmente el estilo de vida.

• Se conduce según los principios éticos y humanistas que exigen el cuidado de la integridad física y mental de los pacientes.

• Como parte integral de su práctica profesional examina y atiende los

aspectos afectivos, emocionales y conductuales de los pacientes bajo su cuidado.

• Conoce con detalle los problemas de salud de mayor importancia en nuestro país y es capaz de ofrecer tratamiento adecuado a los pacientes que los presentan.

• Promueve el trabajo en equipo con otros médicos y profesionales de la salud y asume la responsabilidad y el liderazgo que le corresponden, según su nivel de competencia y papel profesional.

• Dispone de conocimientos sólidos acerca de las ciencias de la salud, lo que le permite utilizar el método científico como herramienta de su práctica clínica habitual y lo capacita para optar por estudios de posgrado, tanto en investigación como en alguna especialidad médica.

• Tiene una actitud permanente de búsqueda de nuevos conocimientos, por lo que cultiva el aprendizaje independiente y autodirigido, lo que le permite actualizarse en los avances de la medicina y mejorar la calidad de la atención que otorga.

• Se mantiene actualizado en relación a los avances científicos y tecnológicos más recientes; utiliza la información y la tecnología computacional para la adquisición de nuevos conocimientos y como una herramienta de trabajo dentro de su práctica profesional.

10

II. INTRODUCCIÓN: 1. Mapa curricular:

PR

IME

R A

ÑO

ANATOMÍA BIOLOGÍA CELULAR Y TISULAR BIOLOGÍA DEL DESARROLLO BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR PSICOLOGÍA MEDICA I SALUD PÚBLICA I

ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN*** ASIGNATURAS DE LIBRE

ELECCIÓN***

SE

GU

ND

O A

ÑO

CIRUGÍA I FARMACOLOGÍA FISIOLOGÍA INMUNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA SALUD PÚBLICA II

ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN*** ASIGNATURAS DE LIBRE

ELECCIÓN***

TE

RC

ER

AÑ

O

PROPEDÉUTICA Y FISIOPATOLOGÍA*

PATOLOGÍA MEDICINA GENERAL I* PSICOLOGÍA MÉDICA II** SALUD PÚBLICA III*** GENÉTICA CLÍNICA* SEMINARIO CLÍNICO*

ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN*** ASIGNATURAS DE LIBRE

ELECCIÓN***

CU

AR

TO

AÑ

O

SALUD PÚBLICA IV** HISTORIA Y FILOSOFÍA DE LA

MEDICINA

11

MEDICINA GENERAL II* CIRUGÍA II*

ASIGNATURAS DE LIBRE ELECCIÓN*** ASIGNATURAS DE LIBRE

ELECCIÓN***

QU

INT

O A

ÑO

INTERNADO MÉDICO*

PE

DIA

TR

ÍA ♦

ME

DIC

INA

IN

TE

RN

A ♦

CIR

UG

ÍA ♦

GIN

EC

OLO

GÍA

Y

OB

ST

ET

RIC

IA ♦

CO

MU

NID

AD

♦

UR

GE

NC

IAS

♦

SE

XT

O A

ÑO

S E R V I C I O S O C I A L

* Estas asignaturas son la base del entrenamiento en el área clínica, en éllas el alumno

adquirirá los conocimientos acerca de la patología de los diversos aparatos y sistemas, así como las habilidades y destrezas necesarias para el manejo de los problemas de salud más frecuentes.

** Estas asignaturas corresponden al área sociomédica. *** Su propósito es permitir que el alumno profundice o complemente de acuerdo a sus

preferencias algunos contenidos del plan de estudios; tenga la posibilidad de capacitarse en ciertas áreas no consideradas en dicho plan, así como también dar flexibilidad al currículo.

♦ Áreas de rotación bimestral.

12

2. Importancia de la asignatura en la carrera.

La segunda mitad del siglo XX fue el marco temporal de una expansión acelerada de nuestro entendimiento del mundo y del Universo en general y, como consecuencia, la orientación de una mayor cantidad de recursos humanos y materiales hacia la investigación en todas las áreas de la ciencia. El campo de la medicina ha tenido grandes avances, particularmente en las áreas del conocimiento de la Bioquímica y de la Biología Molecular. La información generada por estas disciplinas ha sido fundamental para comprender mejor el fenómeno de la vida y para abordar el estudio de las enfermedades. Los conocimientos aportados por la Bioquímica y la Biología Molecular no sólo permiten entender mejor la manera en la que están estructuradas las células y los tejidos, el funcionamiento del organismo y cuáles son las fundamentos de la patogénesis existente, sino que proporcionan las bases para el uso racional de las estrategias terapéuticas, principalmente en el campo del descubrimiento de fármacos efectivos con un mínimo de efectos indeseables. Si bien es cierto que los avances son extraordinarios, aún quedan muchas interrogantes por contestar. Día con día se avanza en la búsqueda de tales respuestas. En consecuencia, la Bioquímica y la Biología Molecular forman parte de esa gran plataforma de los programas actuales de formación académica de los médicos cirujanos. El Departamento de Bioquímica ofrece a los estudiantes de la carrera de médico cirujano el programa de contenidos de este curso, el cual está dirigido e integrado con un enfoque médico, adaptado a las necesidades de una modernidad inquisitiva, demandante de conocimientos cada vez más aproximados a un contexto que permita esa aspiración superior de contar con una medicina de alta calidad. Por otro lado, ahora que inicias tus estudios profesionales es importante que sepas que el aprendizaje es una experiencia activa de descubrimiento, por lo que no sólo deberás esperar que tus maestros te guíen a lo largo de tus estudios. Entre las habilidades que deberás adquirir durante tu formación profesional están la búsqueda de información y la autoenseñanza. Los conocimientos mínimos necesarios para aprobar el curso de Bioquímica y Biología

Molecular se encuentran descritos en este Manual de objetivos del curso y prácticas de laboratorio, por lo que te sugerimos que los revises cuidadosamente; en caso de que algún concepto no se estudie en la clase, es tu responsabilidad buscar la información correspondiente y aprenderla. Te deseamos que el aprendizaje de esta disciplina te resulte grato y que lo lleves a feliz término. III DATOS GENERALES DE LA ASIGNATURA 1. Coordinación: Departamento de Bioquímica 2. Tipo de Asignatura: Teórica y práctica 3. Ubicación Primer año 4. Duración Anual 5. N° de horas Teoría: 160 h Práctica: 120 h 6. N° de créditos 22 7. Clave 1115 8. Requisitos académicos Cubrir los requisitos de ingreso a la licenciatura IV OBJETIVOS DE APRENDIZAJE 1. Que el estudiante entienda los fenómenos

biológicos desde el punto de vista molecular y que sea capaz de integrar este conocimiento en la estructura fisiológica de la célula, del tejido y del organismo.

2. Que el estudiante conozca los mecanismos

moleculares del funcionamiento del organismo humano de una manera dinámica e integral y, al mismo tiempo, comprenda cómo esos mecanismos se encuentran alterados en la enfermedad.

3. Que el estudiante demuestre, mediante

actividades ex profeso, que ha podido integrar el conocimiento a nivel molecular como una herramienta fundamental para la comprensión de los procesos fisiológicos y de la fisiopatología y con ello entienda los principios en los que se apoya la tecnología empleada en el diagnóstico de enfermedades.

4. Que el estudiante aplique el método científico

como una herramienta en la identificación, el análisis y la solución de problemas médicos.

V. METODOLOGÍA EDUCATIVA Con base en lo descrito en el Plan Único de Estudios respecto a este tema en los puntos A. 1,

13

2, 4, 6, 7, 8 y 9 y B. 1 y 2, el profesor utilizará, en la medida de lo posible, algunos procedimientos y técnicas que impliquen una metodología centrada en la solución de problemas, la vinculación teórico-práctica de los conocimientos (el desarrollo y discusión de prácticas de laboratorio de interés médico), la aplicación de técnicas de enseñanza que favorezcan la participación activa de los estudiantes (como seminarios, discusión de casos, las semanas de integración básica-clínica), así como la búsqueda y análisis crítico de la información, sea de libros como de fuentes automatizadas, para lograr los objetivos de aprendizaje. VI. ESTRUCTURA DEL CURSO

1. ACTIVIDADES PROPUESTAS: Inicio del curso 25 de agosto de 2008 y termino el 20 de mayo de 2009. El curso se divide en TRES UNIDADES TEMÁTICAS: a) Estructura molecular (correspondiente al 25% de la calificación). b) Metabolismo (correspondiente al 50% de la calificación). c) Biología molecular (correspondiente al 25% de la calificación). El contenido educativo del curso consiste en: a) Teoría. b) Trabajo de laboratorio y programas de

aprendizaje de la bioquímica asistida por computadora.

c) Revisión de casos de correlación bioquímica-práctica médica.

d) Solución de problemas. e) Semanas de Integración básica-clínica 2. UNIDADES TEMÁTICAS Y CONTENIDO

TEMÁTICO: UNIDAD TEMÁTICA I: Estructura molecular

I. Lógica molecular de la vida A. Características de la materia viva B. Niveles de la organización celular B.1 Bioelementos B.2 Moléculas precursoras y macromoléculas B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y organismos

II. Aspectos fisicoquímicos del funcionamiento celular A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica B. Agua C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base D. Aminoácidos y proteínas D.1. Aminoácidos D.2. Proteínas E. Enzimas y coenzimas E.1. Características de un sistema enzimático E.2. Cinética enzimática E.3. Aspectos médicos de la enzimología

UNIDAD TEMÁTICA II: Metabolismo

III. Metabolismo y bioenergética A. Fundamentos del metabolismo celular B. Carbohidratos B.1. Estructura B.2. Digestión y absorción C. Metabolismo energético C.1. Glucólisis

C.2. Papel de la mitocondria en las funciones oxidativas C.3. Descarboxilación del piruvato C.4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs) C.5. Cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria) C.6. Fosforilación oxidativa C.7. Radicales libres D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos D.1. Gluconeogénesis D.2. Glucogenólisis y glucogénesis D.3. Vía del fosfogluconato (ciclo de las pentosas) D.4. Regulación de la glucemia E. Lípidos E.1. Estructura E.2. Digestión, absorción y transporte F. Metabolismo de lípidos F.1. Oxidación de los ácidos grasos (ß-oxidación) F.2. Síntesis y utilización de los cuerpos cetónicos F.3. Síntesis de ácidos grasos

F.4.Síntesis y degradación de triacilgliceroles F.5. Síntesis y degradación de fosfolípidos F.6. Metabolismo del colesterol F.7. Estructura y metabolismo de las lipoproteínas F.8. Regulación y alteraciones del metabolismo de lípidos

14

G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados G.1. Aminoácidos y proteínas G.2. Nucleótidos H. Regulación e integración metabólica UNIDAD TEMÁTICA III: Biología Molecular IV Biología Molecular A. Organización del genoma

B. Flujo de la información genética B.1. Flujo de la información genética B.2. Síntesis del DNA (duplicación) B.3. Transcripción B.4. Traducción C. Mutaciones y reparación del DNA D. Niveles de regulación de la expresión genética E. Virus, oncogenes y transformación F. Técnicas de manipulación del DNA

15

3. CALENDARIO DE ACTIVIDADES:

CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA PRIMERA UNIDAD TEMÁTICA (BLOQUE 1)

Semana

Fecha

Tema

1

10 al 15 de agosto

Lógica molecular de la vida: Características de la materia viva y jerarquía de la organización celular. A. Aspectos básicos de Fisicoquímica aplicados a la Bioquímica.

2

17 al 22 de agosto

B. Agua Práctica: Soluciones

3

24 al 29 de agosto

B. Agua Amortiguadores C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base Práctica: Soluciones Revisión del caso clínico: CÓLERA

4

31 de agosto al 5 de septiembre

C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base Revisión del caso clínico: OCLUSIÓN INTESTINAL

5

7 al 12 de septiembre

D. Aminoácidos y Proteínas Práctica: Equilibrio ácido-base

6

14 al 19 de septiembre**

D. Aminoácidos y Proteínas Práctica: Equilibrio ácido-base

7

21 al 26 de septiembre

E. Enzimas y coenzimas Práctica: Cinética Enzimática

8

28 de septiembre al 3 de octubre

E. Enzimas y coenzimas Práctica: Cinética enzimática

9 5 al 10 de octubre 2a. Unidad

A. Fundamentos del metabolismo

B. Estructura y Digestión de carbohidratos

10 12 al 17 de octubre

16 DE OCTUBRE

B. Estructura y digestión de carbohidratos

PRIMER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 HRS * Día de asueto / Exámenes departamentales

16

CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA (BLOQUE 2)

Semana

Fecha

Tema

1

19 al 24 de octubre/

C. Glucólisis Descarboxilación del piruvato

2

26 al 31 de octubre///

C. Ciclo de los ácidos tricarboxilicos Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia de la rata

3

3 al 7 de noviembre/

C. Ciclo de los ácidos tricarboxilicos

Práctica: Efecto de la insulina sobre la Glucemia de la rata

4

9 al 14 de noviembre

C. Cadena de transporte de electrones C. Fosforilación oxidativa Práctica: Bombeo de Protones

5

16 al 21 de noviembre*

C. Radicales libres D. Gluconeogénesis Práctica: El efecto del etanol sobre la Lipoperoxidación

6

23 al 28 de noviembre

1ª. Semana de Integración Básica-Clínica MIELOMENINGOCELE E INSUFICIENCIA RENAL D. Vía del fosfogluconato D.Glucogénesis y glucogenólisis

7

30 de noviembre al 5 de diciembre

Discusión Semana de Integración D. Regulación de la glucemia Revisión del caso clínico: HIPOGLUCEMIA E INTOXICACIÓN ALCOHÓLICA Práctica: El efecto del etanol sobre la Lipoperoxidación

8

7 al 11 de diciembre//

D. Regulación de la glucemia

9 12 de diciembre 09 al 2 de enero 10

Vacaciones de Navidad

10 4 al 9 de enero 2010 7 de enero 2010

Práctica: Estudio General del metabolismo de Carbohidratos SEGUNDO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 09:00 -11:00

* Día de asueto / Exámenes departamentales

17

CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA SEGUNDA UNIDAD TEMÁTICA (BLOQUE 3)

Semana

Fecha

Tema

1

7 al 9 de enero 2010 E. Estructura y Digestión de lípidos

2

11 al 16 de enero F. Oxidación de los ácidos grasos F. Síntesis y utilización de cuerpos cetónicos

3

18 al 23 de enero

F. Síntesis de ácidos grasos

F. Síntesis y degradación de triacilgliceroles 4

25 al 30 de enero

Revisión del caso clínico CETOSIS POR INANICIÓN Y OBESIDAD F. Metabolismo del colesterol

Metabolismo de lipoproteínas 5

1 al 6 de febrero/ F. Regulación y alteraciones del metabolismo de lípidos

Revisión del caso clínico: HIPERCOLESTEROLEMIA Y ATEROSCLEROSIS

6

8 al 13 de febrero

G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados 1. Aminoácidos y proteínas 2. Ciclo de la urea

7

15 al 20 de febrero G. Nucleótidos 1. Purinas Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las Transaminasas

8

22 al 27 de febrero G. Nucleótidos 2. Pirimidinas Revisión del caso clínico: GOTA Práctica: El efecto del tetracloruro de carbono sobre las Transaminasas

9

1 al 6 de marzo H. Regulación e integración metabólica

Práctica: Integración metabólica 10

8 al 13 de marzo// H. Regulación e integración metabólica

Práctica: Integración metabólica

11

17 de marzo TERCER EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00 -11:00 HRS.

• Día de asueto • / Exámenes departamentales

18

CALENDARIO SUGERIDO PARA CUBRIR LAS ACTIVIDADES DE LA TERCERA UNIDAD TEMÁTICA (BLOQUE 4)

Semana

Fecha

Tema

1

18 al 20 de marzo

A. Flujo de la información genética B. Estructura de los ácidos nucleicos y sus funciones

2

22 al 27 de marzo

C. y G Organización del DNA y organización del genoma D. Mecanismos de síntesis del DNA

3

29 de marzo al 3 abril Semana Santa

4

5 al 10 de abril

2ª. Semana de integración básica-clínica E. Mecanismos de transcripción Modificación postranscripcional F. Mecanismos de traducción

5

12 al 17 de abril F. Mecanismos de traducción F. Modificación postraduccional

6

19 al 24 de abril

H. Mutaciones y reparación del DNA I. Niveles de regulación de la expresión genética Práctica: Huella Génica

7

26 al 30 de abril

Niveles de regulación de la expresión genética Práctica: Huella Génica

8

3 al 7 de mayo//* 7 de mayo

J. Virus, oncogenes y transformación

K. Técnicas de manipulación del DNA CUARTO EXAMEN DEPARTAMENTAL: 9:00-11:00 hrs.

* Día de asueto / Exámenes departamentales Los contenidos específicos correspondientes a este programa, tanto teóricos, como las prácticas de laboratorio y los casos clínicos a que hace referencia esta calendarización de actividades se encuentran en el manual de objetivos y prácticas de laboratorio de la Asignatura de Bioquímica y Biología Molecular.

19

VII. LINEAMIENTOS DE EVALUACIÓN Pendiente

20

21

22

23

24

25

VIII OBLIGACIONES DE LOS PROFESORES Y ALUMNOS Profesores Con base en el artículo 56 y 61 del Estatuto de Personal Académico de la UNAM, el profesor de Bioquímica y Biología Molecular: 1. Impartirá sus clases teóricas y/o prácticas con puntualidad, según el horario que le haya asignado el Departamento, en el calendario escolar correspondiente. 2. Impartirá su enseñanza y calificará los conocimientos de sus estudiantes sin hacer ninguna distinción entre ellos. Para realizar dicha evaluación considerará diversos aspectos como asistencia, desempeño en teoría y laboratorio, como aparece en los lineamientos de evaluación de la sección previa de este programa académico. 3. Cumplirá con el programa de la asignatura de Bioquímica y Biología Molecular aprobado por el Consejo Técnico de la Facultad y se los dará a conocer a sus estudiantes el primer día de clases, así como la bibliografía correspondiente al curso. 4. Aplicará los exámenes departamentales en las fechas y lugares indicados por la Coordinación de Enseñanza de la asignatura. Hará la retro-alimentación de sus estudiantes después de los exámenes departamentales y/o finales. 5. Se abstendrá de impartir clases particulares remuneradas o no a sus propios alumnos. Alumnos Los alumnos de la asignatura de Bioquímica y Biología Molecular: 1. deberán cumplir con el 80% de asistencias al curso teórico y al laboratorio y aprobar este último para tener derecho a la calificación final. 2. deberán presentar los exámenes, tareas y trabajos que el profesor considere indispensables para tener derecho a calificación final (Juicio del Profesor). 3. deberán adquirir y utilizar el Manual de objetivos y de laboratorio en el aula, tanto de teoría como de laboratorio. 4. No podrán realizar la práctica del laboratorio si no traen el manual correspondiente y una bata blanca. 5. Se abstendrán de introducir alimentos a las aulas y/o laboratorios de enseñanza.

IX BIBLIOGRAFÍA

BÁSICAS

1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

2. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna. 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2002.

3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.

4. McKee T, McKee RJ. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2003.

5. Murray KR, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México: IPN/Editorial El Manual Moderno; 2004.

6. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2003.

COMPLEMENTARIAS

1. Alberts B, Bray D, Lewis J. Biología molecular de la célula. 3a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 1992.

2. Bloomfield MM.Química de los organismos vivos. México: Editorial Limusa; 1997.

3. Holum JR. Fundamentos de química general, orgánica y bioquímica para ciencias de la salud. México: Editorial Limusa Wiley; 2001.

26

CONTENIDO TEMÁTICO

Primera Unidad Temática ESTRUCTURA MOLECULAR

27

I LÓGICA MOLECULAR DE LA VIDA

A. Características generales de la materia viva

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las características de la materia viva. A.1 Discutirá la organización de los seres vivos

(procariotos, eucariotos, autótrofos y heterótrofos) con base en la complejidad de las estructuras que los constituyen y la función específica que tienen.

A.2 Discutirá con base en la figura I.1 la capacidad de los seres vivos para obtener, transformar y utilizar la energía, así como su capacidad de autorregulación y de autoduplicación.

Los sistemas vivientes son organizaciones en extremo complejas que operan bajo principios fisicoquímicos. Esta organización de la vida hace posible un elevado número de procesos fundamentales que se llevan a cabo en forma organizada y regulada en todos los sistemas vivientes. Se ha propuesto que la vida está limitada por los principios de la física y la química, pero lo cierto es que logra trascender hasta los más elevados principios biológicos. Todos los seres vivos son sistemas organizados y funcionando en forma coordinada, constituidos fundamentalmente por moléculas de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Estos sistemas

Fig. I.1. Ciclo del CO 2 y del O 2 en los seres vivos.

Modificada de: Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de

bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.

intercambian materia y energía con su entorno, del cual están separados por una membrana. Las funciones básicas de transformación y utilización de la energía realizadas por estos sistemas, así como su reproducción se llevan a cabo con un alto grado de precisión por proteínas catalíticas específicas llamadas enzimas. Estas enzimas están presentes en las células y actúan como catalizadores que hacen posible que se lleven a cabo reacciones sin que la célula sufra daño alguno. La materia evoluciona aumentando su complejidad debido al incremento en la variedad de unidades que la constituyen y a la especialización que éstas alcanzan. Cuanto más complejo es un

Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá la naturaleza química de los seres vivos y

su organización. La unidad se divide en:

A. Características generales de la materia viva.

B. Niveles de la organización celular.

28

sistema más especializadas son sus partes y, por ello, más dependen unas de otras. Las características universales de los sistemas se encuentran a nivel bioquímico. Todas las células obtienen energía, ya sea de la luz del sol o de las moléculas de alimento ricas en energía y la almacenan en una molécula con un alto contenido energético: el ATP. Las células han desarrollado fundamentalmente tres vías para generar ATP: fermentación, respiración y fotosíntesis. Todas las células tienen la capacidad de autoduplicarse: las moléculas en las que se almacena esta propiedad son el DNA y el RNA. La universalidad de estas moléculas en todos los organismos vivos revela que todas las formas de vida sobre la Tierra tienen un origen común. La importancia del DNA en la reproducción y el crecimiento de las células residen en la información contenida en los genes. Las moléculas de DNA son polímeros de unidades, llamadas nucleótidos, constituidos por un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada de cuatro tipos diferentes. La secuencia precisa de bases en el DNA constituye la información genética. La función clave de esta información es la de especificar la composición de las proteínas. Más que ninguna otra molécula, las proteínas hacen que un organismo sea lo que es. El copiado exacto del DNA, aunque esencial para el desarrollo individual, no es suficiente para permitir los cambios evolutivos; tiene que existir una fuente de variación que proviene, fundamentalmente, de la aparición de mutaciones o de la recombinación del material genético. Las mutaciones surgen por un error en el proceso de copiado. Los organismos más complejos a nuestro alrededor son multicelulares. La célula es la unidad estructural y funcional de los seres vivos, así como el átomo es la unidad fundamental de las estructuras químicas. Resumiendo, la diversidad de los organismos depende de un programa genético codificado por los ácidos nucleicos, ejecutado por medio de complejos reguladores que controlan las actividades bioquímicas de las células, lo que da como resultado diferentes niveles estructurales en la organización molecular y celular de dicho organismo.

Hay dos principales clases de células: las procarióticas y las eucarióticas. Las células procarióticas tienen un solo cromosoma que ocupa un espacio dentro de la célula denominado nucleoide y se halla en contacto directo con el citoplasma. Las células eucarióticas poseen varios cromosomas contenidos en un núcleo verdadero con una envoltura nuclear. Adicionalmente presentan una serie de orgánulos que realizan funciones especializadas como por ejemplo, las mitocondrias que son potentes generadoras de ATP. Se ha propuesto en la teoría de la endosimbiosis que, desde el punto de vista evolutivo, las células procarióticas son antecesoras de las eucarióticas. Con base en el mecanismo que utilizan para obtener la energía necesaria para realizar sus funciones vitales podemos agrupar a todas las células y organismos en otras dos clases principales: los autótrofos, que utilizan el proceso de fotosíntesis para transformar moléculas inorgánicas en glucosa, a partir de la cual se construyen moléculas más complejas, y los heterótrofos, que obtienen la energía de moléculas complejas que han sido sintetizadas por organismos autótrofos. La energía que contienen estas moléculas complejas es liberada principalmente por su oxidación hasta CO2 y agua en un proceso llamado respiración.

Figura I .2. Elementos que forman parte de la materia viva. Los

más abundantes o macroelementos (negritas ), los presentes en

pequeñas cantidades en todos los organismos o microelementos

(cursivas), y los que son necesarios en algunos organismos en

cantidades mínimas o elementos traza (subrayados).

H

Li

�a

K

Rb

Cs

Fr

Be

Mg

Ca

Sr

Ba

Ra

Sc

Y

Ti

Zr

Hf

V

Nb

Ta

Cr

Mo

W

Mn

Tc

Re

Fe

Ru

Os

Co

Rh

Ir

Ni

Pd

Pt

Cu

Ag

Au

Zn

Cd

Hg

Ga

In

Tl

Al

B C

Si

Ge

Sn

Pb

�

P

As

Sb

Bi

O

S

Se

Te

Po

F

Cl

Br

I

At

He

Ne

Ar

Kr

Xe

Rn

29

Se llama metabolismo al total de reacciones que ocurren en la célula. Hay reacciones catabólicas por las cuales las sustancias complejas se degradan

a sustancias más simples y reacciones anabólicas que realizan el proceso inverso. En resumen, las células tienen las siguientes características: 1) Un programa genético específico que permite la reproducción de nuevas células del mismo tipo. 2) Una membrana celular que establece un límite que regula todos los intercambios de materia y energía. 3) Una maquinaria biológica que puede utilizar la energía adquirida por la célula a partir de la energía luminosa o de los alimentos. 4) Una maquinaria para la síntesis de proteínas y todas las demás moléculas que integran a las células de un organismo. B. Niveles de la organización celular Al finalizar esta subunidad, el alumno analizará y discutirá los diferentes niveles de la organización celular. B.1 Bioelementos.

B.1.1 Identificará en una tabla periódica (figura I.2) los elementos que forman parte de la materia viva.

B.1.2 Conocerá las características fisicoquímicas (configuración electrónica, electronegatividad e hibridación) del carbono, nitrógeno, oxígeno, hidrógeno, azufre y fósforo,

que hacen que estos elementos sean apropiados como constituyentes de la materia viva.

B.1.3 Describirá los tipos de enlace (tabla I.1, pág. 4) y funciones químicas que aparecen en las moléculas biológicas (alcohol, carboxilo, carbonilo, éster, amida, amino, éter y tiol).

B.2 Moléculas precursoras y macromoléculas.

B.2.1 Conocerá los aminoácidos, nucleótidos, monosacáridos y ácidos grasos como precursores de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos, así como las diversas funciones que llevan a cabo en el organismo.

B.3 Estructuras, orgánulos, células, tejidos y

organismos. B.3.1 Describirá la manera cómo se

ensamblan las macromoléculas para obtener un nivel mayor de organización.

B.3.2 Describirá la estructura de las membranas biológicas.

B.3.3 Definirá a la célula como la unidad mínima de organización de la materia viva.

30

Tabla I.1 CARACTERÍSTICAS DE LOS ENLACES QUÍMICOS Tipo de enlace Descripción general Energía de enlac e IÓNICO Es la fuerza de atracción entre iones con signos

contrarios que se forman por la transferencia completa de electrones desde el átomo con mayor tendencia a perderlos, al que tiene mayor afinidad por ellos.

10-20 kcal/mol 42-84kJ/mol

COVALENTE •Simple •Coordinado •Polar •Múltiple

Resulta de compartir electrones entre dos o más átomos que tienen una afinidad electrónica semejante Se forma mediante la donación de un electrón por parte de cada átomo que participa en el enlace. Ambos elctrones los da uno solo de los átomos que participan en la formación del enlace. Se establece cuando los electrones del enlace covalente se encuentran más cerca del elemento de mayor electronegatividad. En el enlace se forma un polo relativamente positivo y otro relativamente negativo. En algunos compuestos de los átomos comparten más de un par electrónico (enlaces dobles o triples).

Para la unión: C – C 83 kcal/mol 348 kJ/mol ___ O – H 111kcal/mol 464kJ/mol C – C 146kcal 611kJ/mol

Enlaces intermoleculares

Fuerzas de atracción débiles entre diferentes moléculas y iones

___

PUENTE DE HIDRÓGENO

Interacción dipolo-dipolo. Se establece cuando un átomo de hidrógeno sirve como puente entre dos átomos electronegativos, unido a uno con un enlace covalente, y al otro, con fuerzas de naturaleza electrostática.

2.5kcal/mol 8-21kJ/mol

FUERZAS DE VAN DER WAALS

Son fuerzas electrostáticas transitorias. La atracción se establece entre los extremos de dipolos momentáneos con cargas opuestas.

1kcal/mol 4kJ/mol

INTERACCIONES HIDROFÓBICAS

Enlaces polares. Las moléculas se reunen conjuntamente asociándose entre sí en el seno del agua debido a que las interacciones agua-agua son muy fuertes y rodean a las moléculas apolares

1-2kcal/mol 4-8kJ/mol

INTERACCIÓN IÓN DIPOLO

Es la atracción de un ión positivo por el extremo negativo de las moléculas de un disolvente polar (solvatación). Cuando el disolvente es el agua, se dice que las partículas de soluto se hidratan.

0.01 kcal/mol 0.04kJ/mol

31

II ASPECTOS FISICOQUÍMICOS

DEL FUNCIONAMIENTO CELULAR

A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los conceptos básicos de fisicoquímica necesarios para la comprensión de la bioquímica. A.1 Definirá el concepto de sistema y conocerá

sus diferentes tipos con base en su capacidad de intercambiar materia y energía con su ambiente (sistemas abiertos y cerrados).

A.2 Conocerá las leyes de la termodinámica y

definirá el concepto de entropía, entalpía así como energía interna.

A.3 Definirá el concepto de energía libre de

Gibbs y de energía libre estándar de una reacción y su empleo como criterio de espontaneidad de un proceso.

A.4 Identificará los procesos exergónicos y endergónicos y los relacionará con procesos reversibles e irreversibles.

A.5 Analizará la estrategia de las reacciones acopladas. Se sugiere usar como ejemplo una reacción catalizada por una cinasa.

A.6 Definirá los conceptos de energía de activación y de estado energizado de una reacción.

En termodinámica un sistema se define como la parte del Universo en estudio. Por lo tanto, un sistema puede ser un tubo de ensayo, una máquina, una planta o el hombre. El resto del Universo se conoce como ambiente. El organismo humano es un sistema abierto porque es capaz de intercambiar materia y energía con el ambiente que lo rodea; toma los nutrimientos, oxígeno y agua del ambiente; elimina productos de desecho, y genera trabajo y calor.

Al finalizar esta unidad, el alumno deberá conocer y aplicar los conceptos

fundamentales de fisicoquímica a la comprensión de la estructura y comportamiento de

las moléculas biológicas en la célula y en su interacción con el ambiente; además,

conocerá algunos aspectos médicos de ellos. La unidad se divide en:

A. Aspectos básicos de fisicoquímica aplicados a la bioquímica.

B. Agua.

C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base.

D. Aminoácidos y proteínas.

E. Enzimas y coenzimas.

32

La primera ley de la termodinámica, o ley de la conservación de la energía, dice que la energía no se crea ni se destruye, sólo se transforma.

∆U = U final – U inicial = q – w (1) Esta expresión matemática muestra que el cambio de energía, pérdida o ganancia que sufre un sistema (∆U) corresponde a la diferencia entre el contenido de energía al principio (U inicial) y al término (U final) del estudio. La segunda relación matemática: (∆U = q – w) significa que parte de ese cambio de energía se utiliza para hacer trabajo (w) sobre el ambiente y el resto se libera en forma de calor (q). Los procesos en los cuales el sistema libera calor se llaman exotérmicos (q con signo negativo por convención), y a los que absorben calor se les llama endotérmicos (q con signo positivo). La medida de este intercambio de calor, liberado o absorbido con el ambiente, se llama entalpía (∆H):

H = qp (2)

donde qp se lleva a cabo a presión constante. La segunda ley de la termodinámica dice que el Universo tiende hacia el máximo desorden. Esta ley provee un criterio para determinar si un proceso es espontáneo. Un proceso espontáneo ocurre en una dirección que aumentaría el desorden del sistema y del ambiente. La medida del desorden del sistema se llama entropía (S) y el cambio puede ser en el sentido de aumentar el desorden (∆S con signo positivo) o de disminuir el desorden (∆S con signo negativo).

La tercera ley de la termodinámica o ley cero dice que a una temperatura de 0°K (-273 °C) la entropía de un sistema es igual a cero. J. Willard Gibbs (1878) formuló el concepto de energía libre (G) que engloba los dos indicadores de espontaneidad de un proceso a temperatura y presión constantes:

G = H – TS (3)

y los cambios quedarían indicados como: ∆G = ∆H – T∆S (4)

De esta manera, un cambio en la energía libre sería la suma algebraica del cambio de la entalpía y el cambio de la entropía multiplicada por la temperatura (°K).

Un proceso con ∆G negativo (espontáneo y exergónico) puede darse por una disminución en la entalpía (liberación de calor) o por un aumento en la entropía (aumento de desorden). Por el contrario, un proceso endergónico, no espontáneo, tiene un ∆G positivo, caracterizado por un aumento en la entalpía (absorción de calor) o por una disminución en la entropía. El ∆G representa la energía que se emplea para ejercer un trabajo. En muchos sistemas, entre ellos los biológicos, un valor negativo grande predice que la reacción se puede llevar a cabo de manera espontánea, pero no dice nada acerca de la velocidad del proceso, ni del camino que éste sigue. Por ejemplo, en algunas reacciones químicas, el ∆G puede ser negativo, y esto predice que la reacción será espontánea, pero como el camino ocurre a través de un estado energizado (de mayor contenido de energía) de los reactivos, el proceso no se lleva a cabo a menos que se introduzca energía al sistema para que se alcance ese estado energizado (energía de activación); entonces, el proceso se realizaría de manera espontánea. La introducción de enzimas para realizar una reacción, tiene el efecto de disminuir la energía de activación de dicha reacción (debido a la formación del complejo enzima-sustrato). Una estrategia que se sigue en los sistemas biológicos para lograr que las reacciones no espontáneas, con ∆G positivo, se lleven a cabo, consiste en acoplarlas a otras reacciones relacionadas que tengan un ∆G muy negativo. De esta manera, en las vías metabólicas las reacciones exergónicas “empujan” o “jalan” a las reacciones endergónicas y desplazan el equilibrio químico. Por ejemplo, la fosforilación de la glucosa por ATP catalizada por la hexocinasa:

33

Ecuación: ∆G (kcal/mol)

Glucosa + Pi = Glucosa 6 fosfato + H2O +3.3

ATP + H2O = ADP + Pi + H+ –7.3

Glucosa + ATP = Glucosa 6 fosfato + ADP + H+ –4.0

B. Agua

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las propiedades fisicoquímicas del agua y los conceptos de reacción química, pH, ácido, base y amortiguador. B.1 Conocerá las siguientes propiedades

fisicoquímicas del agua: su composición, sus enlaces químicos, densidad electrónica, características de dipolo, puentes de hidrógeno, estructura en sus estados físicos, calor latente de vaporización, calor específico, tensión superficial, conductividad térmica, constante dieléctrica y su papel como solvente.

B.2 Soluciones acuosas. B.2.1 Definirá qué es una solución y los

diferentes tipos de soluciones que existen.

B.2.2 Explicará los cálculos y los procedimientos para preparar soluciones porcentuales molares, osmolares y normales, así como las diferentes diluciones de estas. Conocerá la composición de las siguientes soluciones utilizadas en medicina: solución isótonica, de Ringer, de Darrow, de Hartman.

B.2.3 Revisará las propiedades coligativas de las soluciones y su importancia en la medicina. B.2.4 Definirá los conceptos de osmolaridad, osmolalidad, hiper e hipoosmolaridad, así como el de isotonicidad.

Realización de la práctica 1 "Soluciones" (ver pág. 133)

B.3 Analizará el concepto de pH. B.3.1 Definirá lo que es una reacción

química y sus componentes. Describirá la ley de acción de masas y definirá la constante de equilibrio y su significado.

B.3.2 Conocerá la reacción de ionización del agua, su constante de equilibrio y el producto iónico del agua.

B.3.3 Conocerá el concepto de pH y establecerá su escala de medición. Aplicará dicho concepto para calcular los valores de pH a partir de la concentración de iones hidronio y de la concentración de H+ a partir de los valores de pH.

Uno de los compuestos más abundantes en nuestro planeta es el agua. Se cree que fue en los océanos primitivos donde se originaron los primeros indicios de vida. El agua constituye el medio en el cual se realizan la mayoría de los procesos celulares (de hecho podría decirse que la conformación que toman las moléculas dentro de las células depende del agua). Es por ello que el agua es una molécula muy importante para sostener la estructura de las células y los organismos. Las características peculiares del agua derivan de su estructura química particular, en la cual los dos hidrógenos y el oxígeno se encuentran formando un tetraedro irregular en el que el oxígeno ocupa el centro y los hidrógenos, junto con los dos orbitales del oxígeno no compartidos, están dirigidos hacia los vértices. La diferencia de electronegatividad entre el oxígeno y los hidrógenos hace que los enlaces entre ellos sean covalentes polares, dando cargas parciales positivas y negativas a la molécula que la constituyen como un dipolo. Esta característica permite que exista una fuerza de atracción entre los extremos cargados opuestamente de las moléculas vecinas. La atracción entre las moléculas de agua permite que se establezcan enlaces débiles llamados puentes de hidrógeno que configuran redes transitorias cuya existencia continuada confiere al agua sus propiedades fisico-químicas características:

34

ser líquida a temperatura ambiente, alto punto de fusión, alto punto de ebullición, elevada tensión superficial, alta constante dieléctrica, alta capacidad calorífica y baja tensión de vapor. Todas esas propiedades permiten que el agua desempeñe muy variadas funciones en los seres vivos; por ejemplo, servir como medio universal de solución, de suspensión y de reacción para todas las moléculas, o intercambiar cantidades importantes de calor sin mucha variación de su temperatura, lo cual le permite mantener constante la temperatura del organismo y controlarla mediante los fenómenos de vasoconstricción y de sudoración. El transporte de sustancias entre los diversos órganos y tejidos del cuerpo humano se hace por el plasma y los líquidos extracelulares, ambos de naturaleza acuosa. Las interacciones del agua con las diversas moléculas permiten el mantenimiento de las estructuras celulares. La presencia de partículas en solución va a modificar las propiedades características del agua y da origen a lo que se conoce como propiedades coligativas de las soluciones (propiedades que dependen del número de partículas en la solución y no de su naturaleza). Entre éstas, la más notable es la aparición de la presión osmótica. Una molécula de agua tiene la capacidad de ceder un protón a la molécula vecina y esto ocasiona que la molécula que cedió su protón quede con una carga neta negativa y la molécula de agua que lo acepta quede con una carga positiva. Esto indica que el agua se ioniza, ya que actúa como un ácido al donar protones (H+) y como una base al aceptarlos, según la teoría de Brönsted y Lowry. Así, el agua puede encontrarse en dos especies iónicas: el hidronio H3O

+, que funcionaría como ácido, y el hidroxilo OH–, que es la especie que queda al ceder la molécula de agua su protón, y que funciona como una base, ya que puede aceptar protones. Para facilitar la expresión de la ionización del agua se simplifica así:

H2O H+ + OH–

A las sustancias que tienen esta capacidad se las llama anfóteras o anfolitos. La velocidad de las reacciones químicas depende de la concentración de las moléculas implicadas en ellas, así como de una constante de

velocidad de la reacción (k), que es una medida indirecta de la capacidad intrínseca de las moléculas para reaccionar entre sí. En la reacción:

A + B C + D

la velocidad (v) es igual a k [A][B]. Como la mayoría de las reacciones son reversibles, existen dos constantes de velocidad, una correspondiente a la reacción directa y una correspondiente a la reacción inversa. Cuando la velocidad de la reacción directa es igual a la velocidad de la reacción inversa se establece una condición de equilibrio en la que hay una relación particular del producto de las concentraciones de los productos entre el producto de las concentraciones de los reactivos. Esta relación es lo que se conoce como constante de equilibrio (Keq) y es igual a ki/kd o [C] [D] / [A] [B]. La constante de equilibrio es característica para cada reacción y permite conocer si la reacción es más favorable hacia los productos (a la derecha), en cuyo caso el valor será siempre mayor a la unidad, o más favorable a la aparición de los reactantes (a la izquierda) cuando el valor de la constante será menor a la unidad. Si el valor es igual a uno no hay una tendencia clara en ninguna de las direcciones. En el caso del agua, la Keq tiene un valor de 1.8 X 10–16 mol/l, que es mucho menor a la unidad, lo cual indica que la molécula tiende a estar asociada; la concentración del agua sin disociar es tan elevada que puede considerarse constante. Cuando el valor de esta concentración se multiplica por la Keq se obtiene el valor del producto de la concentración de ambos iones H+ y OH–, lo que se conoce como Kw o producto iónico del agua, donde Kw = [H+] [OH–] = 1 X 10–14mol2/l2. Aquí la concentración de ambos iones es de 1 X 10–7. A partir de esta constante (Kw) se puede deducir el carácter de una solución diluida respecto a su grado de acidez o basicidad; se ha elegido al ion hidronio (H3O

+), simplificado como H+, como valor numérico para expresarla. Como las concentraciones que se manejan son tan pequeñas, aun expresadas matemáticamente como submúltiplos de 10 (potencias negativas de 10), su manejo puede resultar “complicado” por lo que se

35

utiliza el -log de base 10 para expresarlo. Esto es lo que se conoce como “p” y referido a la concentración de H+ se denomina pH. El pH, entonces, corresponde al -log de la concentración de hidrogeniones, o sea: pH = –log [H+] o bien pH = log 1/[H+] Nótese que la “p” es minúscula, ya que se trata de una sigla que indica potencial. Si se considera que el valor de la concentración de protones es de 1 x 10–7, se tiene que: pH = log 1/ (1 x 10–7) = log 1 – log 1 x 10–7 = 0 – (–7) = 7 Es a partir del agua que se define la escala de pH, por lo cual se habla de soluciones ácidas cuando tienen valores de concentración de hidrogeniones mayores de 1 X 10–7 o pH menores de 7 y de soluciones alcalinas con concentraciones de hidrogeniones menores de 1 X 10–7 y pH mayores a 7. Cuando la concentración de hidrogeniones en solución acuosa es de 1.0 M, el valor del pH es 0, ya que el log10 1 es 0. En el otro extremo, cuando la concentración de H+ es (1 X 10–14) el pH es de 14. El punto de neutralidad es de pH = 7 o en concentración de H+ de 1 X 10–7. El intervalo de pH para indicar la acidez de una solución va del 0 al 7, mientras que el correspondiente a la basicidad o alcalinidad de una solución va del 7 al 14.

C. Equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá los conceptos de electrólito, ácido, base y amortiguador; así como la composición de los compartimientos líquidos del organismo, el balance del agua y de los electrólitos. C.1 Definirá los conceptos de anión, catión,

electrólito, anfolito y conocerá la composición electrolítica de los compartimentos líquidos del organismo (plasma, líquidos intracelular e intersticial, jugo gástrico, jugo pancreático y bilis).

C.2 Definirá los conceptos de ácido y base, su fuerza, y analizará los cambios del pH de una solución al agregar un ácido o una base explicando el porqué de este fenómeno.

C.3 Analizará el concepto de sistema

amortiguador. C.3.1 Definirá el concepto de

amortiguador, de pK y explicará la importancia de los sistemas biológicos de amortiguación.

C.3.2 Aplicará la ecuación de Henderson-Hasselbalch al cálculo del pH y de la concentración de sal o de ácido de diferentes soluciones.

C.3.3 Identificará los sistemas amortiguadores más importantes en los medios intra y extracelular.

C.4 Explicará cómo se regula el pH de los líquidos orgánicos y la participación de los sistemas amortiguadores, el intercambio iónico, así como los mecanismos respiratorios y renales. C.4.1 Revisará las principales alteraciones

del equilibrio ácido-base en el organismo y los mecanismos para su control.

Realización de la práctica 2 "Regulación del equilibrio ácido-base después del ejercicio muscular intenso y de la ingestión de bicarbonato de sodio" (ver pág. 137). Discusión de los casos clínicos 1 "Cólera" y 2 "Oclusión intestinal. Acidosis metabólica. Deshidratación grave" (ver págs. 174-175). Es importante recordar que un ión es una especie química (átomo o conjunto de átomos) con carga eléctrica positiva (catión) o negativa (anión) por ganancia o pérdida de electrones; los iones disueltos en agua pueden conducir la electricidad. El paso de la electricidad a través de una solución con iones se llama electrólisis. Los solutos que pueden liberar iones en el agua por disociación o ionización y que

36

forman una solución conductora de electricidad se llaman electrólitos. El agua es el mayor constituyente de los seres vivos; su cantidad debe mantenerse dentro de un margen estrecho ya que tanto su carencia como su exceso producen problemas clínicos que se conocen como desequilibrios hídricos. El agua corporal la encontramos en diferentes compartimentos y su cantidad en éstos, depende de las concentraciones de ciertos electrólitos como Na+, K+, Cl–, HCO3

-, Mg2+ y Ca2+, fosfatos y proteinatos. Las concentraciones de estos electrólitos se mantienen dentro de ciertos límites que al alterarse, producen desequilibrios que pueden llegar hasta la muerte. En la práctica médica está indicada la cuantificación de electrólitos en cualquier paciente con síntomas neuromusculares. El tratamiento de las alteraciones hidroelectrolíticas se basa en la evaluación del agua corporal total y su distribución, así como en las concentraciones de electrólitos y en la osmolaridad del suero. Agua corporal El agua en el cuerpo humano ocupa cerca de 70% del peso corporal dependiendo de la edad, el sexo y la grasa corporal. La cantidad de agua puede variar desde alrededor de un 40% en personas mayores a más de un 75% en niños recién nacidos. Su porcentaje también es mayor en personas delgadas que en obesas, así como un hombre tendrá mayor cantidad de agua que una mujer. La cantidad de agua presente en los diferentes tejidos varía de acuerdo con las funciones y características de cada uno, siendo más abundante en células metabólicamente muy activas (~ 90%) y de menos del 10% en el tejido adiposo o aún menor, en estructuras relativamente inactivas como el esqueleto. El agua se encuentra distribuida en el líquido intracelular (30-40% del peso corporal total) y el líquido extracelular que, a su vez, está conformado por el líquido intersticial y la linfa (15%), el plasma (4.5%) y los fluidos transcelulares que incluyen los

fluidos gastrointestinales, peritoneal, sinovial, líquido cefalorraquídeo, entre otros. Electrólitos La composición electrolítica del líquido intracelular (LIC) y del líquido extracelular (LEC) difiere en forma sustancial. Para fines prácticos el LIC tiene al K+ como el principal catión y como aniones al fosfato y a las proteínas, mientras que en el LEC, el Na+ es el catión más importante y el cloruro como anión. La concentración total de cationes presentes en el plasma es aproximadamente de 150 mmol/l, siendo la concentración de sodio de 140 mmol/l. Los aniones presentes en el plasma más abundantes son el cloruro, con una concentración aproximada de 100 mmol/l y el bicarbonato, con una concentración de 25 mmol/l. Dado que en cualquier sistema biológico la suma de los cationes debe ser igual a la suma de los aniones, el resto de los aniones que constituyen la diferencia o brecha aniónica del plasma son el fosfato, el sulfato, las proteínas y los ácidos orgánicos como son el lactato, el citrato, el piruvato, el acetoacetato y el 3-β-hidroxibutirato. En la práctica, esta brecha aniónica se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación: Brecha aniónica = {[Na+] + [K+]} – {[Cl-] + [HCO3

-]} Calculada de esta forma, la brecha aniónica es de aproximadamente 12 mmol/l. Puede aumentar muchas veces en ciertos desórdenes como cuando los ácidos inorgánicos y los aniones orgánicos se acumulan, por ejemplo, en la cetoacidosis diabética y en la insuficiencia renal. El potasio es el principal catión en el LIC, cuya concentración es de 110 mmol/l, es aproximadamente 30 veces más alta que la que se encuentra en el LEC. La concentración de sodio y cloruro en el LIC es de 10 mmol/l y 4 mmol/l, respectivamente. La movilización y el metabolismo de los principales cationes extra e intracelulares depende de la actividad celular así como de transportadores específicos, entre los cuales se encuentra la bomba de Na+/K+. Los cambios en la concentración de iones conlleva a cambios en la osmolaridad del medio.

37

Osmolaridad Las diferentes moléculas disueltas en el agua corporal contribuyen a la presión osmótica, la cual es proporcional a la concentración molar de la solución. Un cambio en la concentración iónica en cualquiera de los compartimentos celulares crea un gradiente de presión y como consecuencia, existe un cambio en la cantidad de agua que fluye del compartimiento que presenta una menor osmolaridad hacia el de mayor. Para determinar la concentración osmolar de una solución que contiene una mezcla de electrólitos y no electrólitos hay que tener en cuenta las concentraciones individuales de todos sus componentes. Una fórmula sencilla para cuantificar la osmolaridad del suero y que ofrece una utilidad clínica es: Osmolaridad =2(Na+ mmol/l) + glucosa mmol/l + BUN mmol/l = 280 a 320 mOsm Osmolaridad = 2(Na+ meq/l) + glucosa mg/dl + BUN mg/dl

——--——-- ——-----— 18 2.8

donde el factor 2 se debe a que se consideran los aniones asociados al Na+ (Cl– y HCO3–); 1 mOsm de glucosa equivale a 180 mg/l (18 mg/dl) y 1 mOsm de nitrógeno ureico (NUS o BUN de sus siglas en inglés) a 28 mg/l (2.8 mg/dl) que corresponde a la masa molecular de 2 átomos de nitrógeno en la urea. Los electrólitos Na+, Cl– y HCO3–, contribuyen con más del 92% a la osmolaridad del suero; los otros electrólitos, junto con las proteínas séricas, glucosa y urea son responsables del restante 8%. El mantenimiento del agua extracelular depende básicamente de la concentración del Na+. El organismo mantiene esta concentración por medio de la hormona antidiurética. Cambios de hasta 2 meq de sodio en sangre estimulan los receptores osmolares y causan retención renal de agua cuando aumenta y su eliminación cuando la osmolaridad disminuye.

D. Aminoácidos y proteínas

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las características más importantes de los aminoácidos y de las proteínas, así como sus funciones generales. D.1 Aminoácidos.

D.1.1 Identificará en la fórmula de un aminoácido los grupos funcionales carboxilo y amino.

D.1.2 Relacionará las cadenas laterales de los aminoácidos con sus propiedades y los clasificará en grupos.

D.1.3 Reconocerá a los aminoácidos como ácidos débiles e identificará los valores de sus pKs y su punto isoeléctrico.Usar como modelos glicina, fenilalanina, ácido aspártico, lisina e histidina.

D.1.4 Identificará la carga eléctrica de los amino-ácidos en soluciones de diferentes valores de pH y su movilidad en un campo eléctrico.

D.1.5 Conocerá las fórmulas de los aminoácidos presentes en las proteínas.

D.1.6 Conocerá las funciones generales de los aminoácidos proteicos y no proteicos en los seres vivos.

D.2 Proteínas.

D.2.1 Identificará los productos de hidrólisis de las proteínas.

D.2.2 Clasificará a las proteínas con base en su composición, función y localización.

D.2.3 Conocerá las características más importantes de la unión peptídica. Describirá qué es un péptido y mencionará algunos de los polipéptidos importantes en medicina.

D.2.4 Describirá el estado nativo de las proteínas y sus diferentes niveles de organización: estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria y mencionará las fuerzas que las

38

estabilizan. Describirá el proceso general de la desnaturalización.

D.2.5 Relacionará la función de las proteínas con su estructura:

Globulares (albúmina y hemoglobina).

Fibrosas (colágena, miosina y actina).

De reconocimiento (receptores de insulina o complejo mayor de histocompatibilidad).

De membrana (porina, ATPasa de sodio/potasio).

D.2.6 Describirá los diferentes métodos de purificación de las proteínas con base en sus propiedades: ultracentrifugación, precipitación por sales, electroforesis y cromatografía por peso molecular, por intercambio iónico y por afinidad.

D.2.7 Conocerá el propósito de estudiar las proteínas plasmáticas en medicina.

Las proteínas están formadas por una o varias cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales está constituida por 20 diferentes aminoácidos unidos por enlaces tipo amida (enlaces peptídicos) en una secuencia específica para cada proteína. La masa molecular de una proteína varía desde cerca de 6 000 (>50 aminoácidos) hasta 1 000 000 Da o más. (Da o Dalton es la unidad de masa atómica y es igual a 1.6605655 X 10–27 kg). Las proteínas pueden dividirse, según su composición, en dos grupos principales: proteínas simples y proteínas conjugadas. Las proteínas simples están constituidas sólo por aminoácidos, mientras que las proteínas conjugadas presentan, además de los aminoácidos, otro componente, que puede ser de diferente naturaleza química y en ciertos casos es llamado grupo prostético. Algunos ejemplos de proteínas conjugadas son las glucoproteínas (contienen azúcares como grupo prostético), las lipoproteínas (contienen triacilglicéridos, fosfolípidos y colesterol), las nucleoproteínas (asociadas a ácidos nucleicos) y las

metaloproteínas (que pueden unir iones metálicos como en el grupo hemo). Los aminoácidos son compuestos alifáticos, aromáticos o heterocíclicos que contienen por lo menos un grupo amino y un grupo carboxilo. En los aminoácidos biológicamente activos, el grupo amino se encuentra en el átomo de carbono alfa con respecto al grupo carboxilo. Este carbono alfa es un carbono asimétrico (con excepción de la glicina) porque presenta cuatro grupos funcionales diferentes: el grupo amino, el grupo carboxilo, un hidrógeno y una cadena lateral. Los aminoácidos proteicos pueden clasificarse en función de las cadenas laterales que presentan. Así, tenemos aminoácidos no polares, aminoácidos polares sin carga y aminoácidos polares con carga, la que puede ser negativa o positiva a pH neutro. Todos los aminoácidos (con excepción de la glicina) son ópticamente activos y pertenecen a la serie L en los organismos superiores. Los aminoácidos tienen por lo menos dos grupos ionizables: el grupo alfa amino y un carboxilo. Cada aminoácido en solución tiene un pH característico en el que no se mueve en un campo eléctrico, es decir, tiene un pH en el que se presenta en forma de ion dipolo o zwitterion, donde tanto el grupo alfa amino como el grupo carboxilo se encuentran ionizados y, por lo tanto, tiene el mismo número de cargas positivas y negativas (punto isoeléctrico). Junto a los grupos ionizables principales, algunos aminoácidos contienen otros grupos que pueden ionizarse: grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo, hidroxilo o imidazol. A pH fisiológico, estos grupos pueden estar ionizados y confieren al aminoácido que los contiene cargas positivas o negativas, según sea la naturaleza del grupo ionizado. Las proteínas, como los aminoácidos, se encuentran cargadas en solución; la magnitud de la carga depende del tipo de proteína y del pH. Cada proteína posee un punto isoeléctrico característico; a pH por arriba del punto isoeléctrico presenta carga negativa, mientras que a pH por abajo del punto isoeléctrico tiene carga positiva.

Organización estructural de las proteínas

39

La función de las proteínas sólo puede entenderse en términos de la estructura de la proteína, es decir, de las relaciones tridimensionales entre los átomos que componen las proteínas. Se han descrito cuatro niveles de organización: 1. La estructura primaria es la secuencia de

aminoácidos en la cadena polipeptídica unidos mediante enlaces peptídicos.

2. La estructura secundaria es el arreglo espacial local de los átomos del esqueleto de un polipéptido sin considerar la conformación de sus cadenas laterales. La estructura secundaria es mantenida por puentes de hidrógeno entre el oxígeno y el nitrógeno involucrados en los enlaces peptídicos de aminoácidos. El enlace peptídico tiene una estructura plana, rígida, que es consecuencia de interacciones de resonancia (a) que le dan 40% de carácter de doble enlace entre los átomos de C y N (b), esta última estructura es la que le permite establecer puentes de hidrógeno.

a) b)

O O

H H

+CC C C NN

Pauling y Corey determinaron que los grupos peptídicos asumen una configuración trans, es decir, los carbonos alfa sucesivos están en lados opuestos del enlace peptídico que los une. Pueden existir varios tipos de estructura secundaria; entre ellos destacan dos: la alfa hélice, en la que los aminoácidos de la cadena polipeptídica se presentan formando una especie de cilindro orientado a la derecha y la lámina beta plegada, en la que los aminoácidos se acomodan de manera paralela o antiparalela, uno respecto al otro y se conectan entre sí por puentes de hidrógeno.

3. La estructura terciaria se refiere al arreglo tridimensional de un polipéptido y está determinada por las estructuras primaria y secundaria. Se forma espontáneamente y depende del tamaño, forma y polaridad de los aminoácidos que forman la proteína, los que interactúan entre sí y con el

medio en el que se encuentran. Esta estructura puede estar estabilizada por enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrofóbicas, los enlaces covalentes disulfuro, etcétera. Por ejemplo, las cadenas peptídicas de las proteínas globulares se organizan en una forma muy compacta en la que los aminoácidos hidrofílicos se encuentran en la superficie externa mientras que los residuos hidrofóbicos permanecen enterrados en el interior de la molécula.

4. La estructura cuaternaria es el arreglo espacial de las diversas subunidades polipeptídicas que componen algunas proteínas.

Desnaturalización

Se dice que una proteína se desnaturaliza cuando pierde sus diversos niveles de organización estructural. Algunos agentes que desnaturalizan las proteínas son: el calor, los pH extremos, los rayos X, la luz UV, o la agitación vigorosa. La desnaturalización es causada por un colapso de la estructura original con la ruptura de los enlaces de hidrógeno, de los enlaces iónicos y de las interacciones hidrofóbicas, sin cambios en la estructura primaria. La desnaturalización va acompañada de la disminución de la solubilidad, cambios en la rotación óptica, pérdida de la función biológica y una mayor susceptibilidad al ataque de las enzimas digestivas. En algunos casos, al eliminar los agentes que causan la desnaturalización, la proteína recupera su conformación original; a este fenómeno se le conoce como renaturalización. Una mezcla de proteínas puede separarse a partir de las diferentes movilidades en un campo eléctrico (electroforesis), por cromatografía de distintos tipos o por su diferente solubilidad. Clasificación de las proteínas Las proteínas pueden ser clasificadas en función de aspectos tan diversos como su composición, su disposición espacial, su función biológica y su localización. Atendiendo a su composición la proteínas pueden ser:

40

• Simples: aquellas compuestas únicamente de aminoácidos. • Conjugadas: cuando además de aminoácidos poseen un componente no proteico, el que puede ser de origen orgánico o inorgánico y que se denomina grupo prostético. Algunos ejemplos son: nucleoproteínas, formadas por la asociación de la cadena polipeptídica con ácidos nucleicos; las glucoproteínas, cuyo grupo prostético son carbohidratos; las fosfoproteínas, asociadas con fósforo o como las metaloproteínas, cuando un ión metálico está enlazado directamente a la proteína, entre otras. Con base en su disposición espacial, las proteínas pueden clasificarse en globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son de forma esférica y solubles en agua. La mayor parte de las enzimas, hormonas y anticuerpos tienen estructura globular. Las proteínas formadas por cadenas polipeptídicas dispuestas paralelamente a un eje, reciben el nombre de proteínas fibrosas, como la colágena y la fibrina. Estas proteínas son de forma alargada, baja solubilidad en agua y resistentes a la tracción. Clasificación de las proteínas de acuerdo a su función. Las proteínas desempeñan una amplia variedad de funciones muy importantes en el organismo. La lista siguiente, aunque no es exhaustiva, da una idea de la diversidad de las funciones biológicas en las cuales se sabe que intervienen las proteínas: •Catalítica: las enzimas catalizan casi todas las reacciones que se efectúan en los organismos vivos. •Estructural: las proteínas proporcionan a las células forma y soporte mecánico (como la colágena y las proteínas contráctiles). •Reguladora: algunas proteínas son hormonas o sirven como receptores de las hormonas (insulina y glucagón). •Protectora: por ejemplo las inmunoglobulinas que defienden al organismo contra las infecciones virales y bacterianas. •Transporte: las proteínas se pueden unir a otras moléculas a fin de transportarlas en el organismo (albúmina, transferrina).

•Trabajo mecánico: por ejemplo la contracción de los músculos, el movimiento de los flagelos y la separación de cromosomas en la mitosis (miosina y actina). Entre las funciones que son comunes a todas las proteínas encontramos: •Capacidad amortiguadora: debido a que las proteínas son compuestos anfóteros y poseen muchos grupos ionizables (con valores diferentes de pK), funcionan como amortiguadores para reducir al mínimo cambios súbitos en el pH. •Energética: liberan 4 kcal/g de proteína oxidada hasta CO2 y H2O. Los aminoácidos pueden ser desaminados para formar cetoácidos, los cuales pueden movilizarse para producir energía calórica o transformarse en carbohidratos y lípidos. •Participan en el mantenimiento del equilibrio osmótico entre los diferentes compartimentos del organismo. Las proteínas, por ser grandes moléculas coloidales, no son difusibles, esto es, no pueden atravesar las membranas y ejercen una presión osmótica coloidal, la cual sirve para mantener un volumen normal de sangre y un contenido normal de agua en el líquido intersticial y los tejidos. •Fuente de nutrición para los tejidos (sobre todo, la albúmina): por constituir una fuente de los aminoácidos indispensables para el organismo, las proteínas son una forma de almacenamiento de aminoácidos. Por último, en función de su localización, las proteínas pueden clasificarse en: •Hísticas o tisulares: son las proteínas de los tejidos. •Plasmáticas o hemáticas: son las proteínas de la sangre. Las proteínas de la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y las proteínas plasmáticas), por su gran accesibilidad, son muy utilizadas en el laboratorio clínico.

E. Enzimas y coenzimas

41

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá qué es una enzima y cómo actúa; podrá calcular sus principales parámetros cinéticos y el efecto de algunas moléculas que modifican su acción y describirá ciertas aplicaciones médicas de las enzimas. E.1 Características de un sistema enzimático.

E.1.1 Conocerá qué son las enzimas y su clasificación de acuerdo con su función.

E.1.2 Identificará los componentes de un sistema enzimático y mencionará las coenzimas y cofactores que participan.

E.1.3 Analizará el papel de vitaminas hidrosolubles como precursores de las coenzimas e identificará al magnesio, al manganeso y al fierro como ejemplos de cofactores metálicos.

E.1.4 Definirá los conceptos de zimógeno e isoenzima.

E.1.5 Conocerá el modo de acción de las enzimas y en qué consiste su especificidad.

E.2 Cinética enzimática. E.2.1 Analizará una reacción enzimática

para identificar al sustrato, al complejo enzima-sustrato y al producto.

E.2.2 Definirá lo que es la velocidad de una reacción enzimática y conocerá cómo se calcula su constante de equilibrio; mencionará el significado de dicha constante.

E.2.3 Analizará las ecuaciones de Michaelis Menten y de Lineweaver-Burk; describirá sus usos e identificará el significado de los valores de Vmáx y de Km.

E.2.4 Conocerá las estrategias de control de la actividad de las enzimas: disponibilidad de sustrato, modificación covalente, alosterismo, retroalimentación y concentración de la enzima.

E.2.5 Describirá la acción de los inhibidores competitivos y no competitivos y de los moduladores alostéricos sobre la actividad de las enzimas.

E.2.6 Conocerá el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática.

E.3 Aspectos médicos de la enzimología.

E.3.1 Conocerá que el uso de la determinación de la actividad de algunas enzimas en el diagnóstico contribuye al seguimiento de ciertas enfermedades (transaminasas, lactato deshidrogenasa, creatina cinasa, fosfatasas y amilasa).

E.3.2 Describirá la etiología de algunos padecimientos congénitos del metabolismo y la actividad enzimática empleada para su diagnóstico (fenilcetonuria, albinismo, anemia hemolítica, glucogenosis).

E.3.3 Describirá el uso de ciertas enzimas como reactivos de laboratorio en la cuantificación de algunos metabolitos (determinación de glucosa, de colesterol y de ácido úrico).

Realización de la práctica 3 "Cinética enzimática. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática" (ver pág.140). Las enzimas son proteínas especializadas de actividad catalítica. Algunas de ellas están formadas únicamente de aminoácidos mientras que otras presentan algún otro componente de naturaleza no aminoácida. La parte proteica se denomina apoenzima, mientras que la parte no proteica se denomina coenzima; cuando se encuentran aisladas, ambas son no funcionales, pero juntas forman una proteína funcional denominada holoenzima. Las coenzimas funcionan a menudo en la transferencia de electrones o de grupos funcionales. Generalmente son derivados de vitaminas, las cuales

42

no pueden ser sintetizadas en las células de los organismos superiores, por lo que deben ser adquiridas en la dieta. Las enzimas presentan algunas características que las diferencian de los catalizadores químicos, como: 1. Mayor velocidad de reacción, ya que las

reacciones catalizadas enzimáticamente alcanzan velocidades de reacción de 106 a 1 012 veces mayores que las reacciones no catalizadas y de varios órdenes de magnitud mayor que las catalizadas químicamente.

2 .Condiciones de reacción más suaves, ya que trabajan a temperaturas relativamente bajas, a presión atmosférica y en condiciones de pH neutro.

3. Mayor especificidad de reacción, ya que presentan una gran selectividad por la identidad de los grupos químicos de sus sustratos y productos, de tal manera que rara vez se obtienen productos colaterales o secundarios.

4. Capacidad de regulación, es decir, que sus actividades varían de acuerdo con la concentración de otras moléculas diferentes de sus sustratos. Los mecanismos de regulación incluyen la inhibición, control alostérico, modificación covalente de la enzima y variación en la cantidad de enzima sintetizada.

Las enzimas aceleran las reacciones biológicas al disminuir la energía de activación de una reacción dada sin alterar su equilibrio. Su mecanismo de acción consiste en la formación de un complejo entre la enzima y el sustrato (ES), el cual realiza la reacción química adecuada y permite la recuperación de la enzima original en el momento en que el complejo enzima-producto se rompe para liberar al producto. El sustrato se une a la enzima en el sitio activo, el cual consiste en un arreglo espacial de algunos aminoácidos de la proteína donde se encuentran generalmente el grupo prostético o la coenzima y que tienen la capacidad de interactuar con el sustrato. Hay algunas enzimas que se sintetizan directamente en su forma activa, otras se sintetizan en forma de proenzimas inactivas o zimógenos y deben ser activadas por procesos especiales para llegar a ser funcionales. Algunas otras enzimas presentan sitios diferentes del sitio activo donde se asocian moléculas

que modulan su actividad. Estas enzimas se conocen como enzimas alostéricas y el sitio donde interactúan con el modulador se llama sitio alostérico. La velocidad de las reacciones enzimáticas depende de:

a) La concentración y la actividad de la enzima. La velocidad de las reacciones enzimáticas se ve modificada por la cantidad de enzima y por su capacidad de interactuar con su sustrato. Una enzima puede atacar, dado que interactúa con su sustrato, por un reconocimiento espacial, tridimensional o estereoespecífico. Si la especificidad es absoluta, la enzima puede actuar sobre un único compuesto, mientras que, si es relativa, puede usar como sustrato varios compuestos relacionados. La estereoespecificidad indica que una enzima acepta sólo un cierto estereoisómero (L ó D). Un sustrato puede ser transformado por una o varias reacciones teóricamente posibles catalizadas por diferentes enzimas. Esto es importante en algunos procesos de control metabólico. Las unidades con que se mide la velocidad de una enzima se determinan como unidades internacionales (UI). Una UI es la cantidad de enzima en miligramos que convierte un micromol de sustrato por minuto, en katales (kat), que es la cantidad de enzima que convierte un mol de sustrato por segundo. La actividad específica de una enzima se expresa en unidades por mg de proteína.

b) La concentración del sustrato. A bajas concentraciones de sustrato la reacción enzimática sigue una cinética de primer orden, es decir, la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración del sustrato. A altas concentraciones de sustrato, la reacción es de orden cero, es decir, la enzima está saturada por su sustrato y, por lo tanto, se encuentra en su velocidad máxima. Cada enzima tiene su característica constante de Michaelis o Km, que define la concentración de sustrato a la que la reacción enzimática alcanza la mitad de la velocidad máxima.

43

c) El pH y la composición de la solución en que se lleve a cabo la reacción. Toda reacción catalizada enzimáticamente tiene su pH óptimo.

d) La temperatura. Toda reacción catalizada enzimáticamente tiene una temperatura óptima.

e) La presencia de activadores e inhibidores. La actividad enzimática puede ser modificada positiva o negativamente por algunos compuestos. Los activadores aumentan la reacción enzimática propiciando la formación de un sitio activo funcional y a menudo son iones metálicos como Mg2+, Zn2+, etcétera. La activación de las enzimas alostéricas que están compuestas por subunidades es de gran importancia en el control de los sistemas multienzimáticos y se realiza generalmente por varias moléculas orgánicas.

Los inhibidores enzimáticos pueden ser de varios tipos; los más importantes son los competitivos y los no competitivos. Los inhibidores competitivos interactúan con el sitio activo de la enzima y se parecen al sustrato en su estructura, por lo que compiten con él para unirse al sitio activo. En general, se remueven con un exceso de sustrato.

Los inhibidores no competitivos reaccionan con otra estructura importante de la molécula.enzimática. La inhibición puede ser reversible o irreversible en el caso de que el inhibidor realice un cambio permanente de un grupo funcional de la enzima. El efecto de un inhibidor no competitivo no puede revertirse por un exceso de sustrato.

El comportamiento cinético de las enzimas, así como el efecto de los diferentes tipos de moléculas sobre la actividad enzimática, puede ser estudiado mediante diversas técnicas cinéticas y gráficas. Así, al graficar la velocidad de la reacción enzimática contra la concentración de sustrato se obtiene una hipérbola rectangular (fig. II.1), descrita matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten. Las enzimas alostéricas presentan un comportamiento sigmoidal y los moduladores positivos desplazan la curva hacia la izquierda, mientras que los

moduladores negativos hacen más pronunciado el efecto sigmoidal (fig. II.2). Otra manera de estudiar el comportamiento cinético de las enzimas, es graficar la inversa de la velocidad inicial contra la inversa de la concentración de sustrato, lo que genera una línea recta, descrita matemáticamente por la ecuación de Lineweaver-Burk. En la figura II.3 se observa este comportamiento lineal de la enzima con y sin inhibidores.

44

In vivo, la mayoría de las enzimas se organiza en sistemas multienzimáticos, los cuales se unen a estructuras celulares o están libres en diversos compartimientos celulares y son una forma de hacer más eficiente la acción de las enzimas involucradas en una vía, así como su regulación. Las enzimas pueden clasificarse en seis grandes grupos según el tipo de reacción que llevan a cabo: OXIDORREDUCTASAS. Transfieren electrones o hidrógenos. TRANSFERASAS. Transfieren grupos funcionales entre dos moléculas. HIDROLASAS. Realizan reacciones de ruptura de enlaces con entrada de la molécula de agua. LIASAS. Realizan reacciones de adición a dobles enlaces y ruptura no hidrolítica del sustrato. ISOMERASAS. Realizan interconversiones de isómeros. LIGASAS. Realizan reacciones de formación de enlaces con gasto de ATP.

45

CONTENIDO TEMÁTICO

Segunda Unidad Temática METABOLISMO

46

III METABOLISMO Y BIOENERGÉTICA

A. Fundamentos del metabolismo celular

Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá los principios generales del metabolismo intermediario de una célula normal. A.1 Conocerá las funciones generales del

metabolismo. A.2 Definirá los conceptos de vía metabólica,

complejo multienzimático y encrucijada metabólica.

A.3 En un esquema general del metabolismo

identificará, con base en sus características, las vías anabólicas, catabólicas y anfibólicas.

A.4 Describirá el papel central del piruvato, la

acetil CoA, el par NAD(P)+/NAD(P)H y el ciclo del ATP en el metabolismo intermediario. Definirá los conceptos de fosforilación oxidativa y fosforilación a nivel de sustrato.

A.5 Conocerá la transformación de los diferentes

componentes de la dieta

en nutrimientos y las vías metabólicas a las que entran para satisfacer las demandas de energía y mantenimiento de los tejidos (homeostasis) con base en el esquema general del metabolismo

A.6 Conocerá los diferentes niveles de regulación del metabolismo: síntesis de enzimas (inducción-represión), compartimentalización, actividad enzimática (activación, inhibición y enzimas alostéricas).

El metabolismo puede definirse como el conjunto de todas las reacciones químicas que ocurren en el organismo. Los organismos se caracterizan por poseer miles de reacciones catalizadas por enzimas, constituyendo las vías metabólicas. El objetivo del metabolismo es mantener las funciones vitales del organismo tales como el trabajo mecánico, el transporte activo de moléculas contra gradientes de concentración y la biosíntesis de moléculas complejas, entre otras. Las rutas o vías metabólicas son secuencias de reacciones en donde un precursor o sustrato se convierte en un producto final a través de una serie de intermediarios metabólicos. El término metabolismo intermediario se aplica a las actividades

Al finalizar esta unidad, el alumno conocerá en forma integral las rutas metabólicas de las diversas moléculas biológicas en las células y las alteraciones que aparecen asociadas a su disfunción en algunas enfermedades. La unidad se compone de: A. Fundamentos del metabolismo celular. B. Carbohidratos. C. Metabolismo energético. D. Otras vías metabólicas de los carbohidratos . E. Lípidos. F. Metabolismo de los lípidos . G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados. H. Regulación e integración metabólica.

47

combinadas de todas las vías metabólicas que interconvierten sustratos, metabolitos y productos. Por ejemplo, la secuencia consecutiva de A —> B —> C —> D —> E tiene el mismo efecto neto que A —> E. Toda esta actividad celular muy coordinada y dirigida tiene como objetivo el que los sistemas multienzimáticos cooperen para cumplir cuatro funciones básicas: 1. Obtener energía química a partir de la energía

solar en los organismos fotótrofos o de la energía contenida en los nutrientes obtenidos del ambiente en los organismos quimiótrofos.

2. Convertir las moléculas nutrientes en las moléculas características de la propia célula, incluidos los precursores macromoleculares.

3. Transformar los precursores monoméricos en polímeros (proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, polisacáridos y otros componentes celulares).

4. Sintetizar y degradar las biomoléculas requeridas en las funciones celulares especializadas.

El metabolismo se divide en catabolismo y anabolismo El catabolismo, del griego katá, "abajo" es la fase degradativa del metabolismo en la que nutrientes orgánicos como carbohidratos, lípidos y proteínas se convierten en productos más pequeños y sencillos (H2O, CO2, NH3). Las rutas catabólicas generan transportadores electrónicos reducidos (NADH, FADH2 y NADPH) y liberan energía, parte de la cual se conserva en la molécula del ATP. En el anabolismo, del griego aná, "arriba", también llamado biosíntesis, los precursores pequeños y sencillos se transforman en moléculas más grandes y complejas propias de cada célula (polisacáridos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos). Las reacciones anabólicas requieren un aporte energético, que proviene generalmente de la hidrólisis del ATP y del poder reductor del NAD(P)H. En el siguiente cuadro aparece el resumen de las características de estos dos tipos de procesos.

Catabolismo

Anabolismo

Biodegradativa.

Biosintética.

Oxidativa.

Reductora.

Generador de energía.

Consumidor de energía.

Variedad de materiales iniciales, pero productos finales bien definidos (convergente)

Materiales iniciales bien definidos y variedad en los productos (divergente)

Dentro de la gran complejidad del metabolismo es posible distinguir algunos puntos de convergencia: 1. La mayoría de las vías metabólicas son

irreversibles y exergónicas. 2. Cada vía tiene una etapa obligada. Generalmente,

al principio de cada vía existe una reacción exergónica irreversible que permite que el intermediario que produce continúe a lo largo de la vía.

3. Todas las vías metabólicas están reguladas. La regulación tiene el objeto de ejercer un control enzimático sobre el flujo de metabolitos a través de una vía metabólica. En toda vía existe una reacción enzimática que funciona tan lentamente que impide que sus sustratos y productos se equilibren. Dado que la mayoría de las otras enzimas funcionan próximas al equilibrio, esta reacción enzimática es la que determina la velocidad de la vía, y por lo tanto, su regulación. Esta es la forma más eficaz de ejercer el control porque evita la síntesis innecesaria de metabolitos de la vía.

Una manera de controlar la actividad de la enzima limitante es regulando su actividad catalítica, mediante interacciones alostéricas (como en la inhibición por producto) o por modificaciones covalentes. Otra manera sería controlando la velocidad de la síntesis de enzimas particulares. El hecho de que las vías de síntesis y degradación de moléculas sean diferentes, contribuye también a la regulación metabólica.

48

4. En las células eucarióticas, la compartimentalización permite la localización específica de las vías metabólicas y su control.

B. Carbohidratos Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará la estructura química de los carbohidratos, sus fuentes, su digestión, su absorción y la función que desempeñan en la célula. B.1 Estructura.

B.1.1 Definirá qué son los carbohidratos y cuál es su importancia biológica.

B.1.2 Conocerá la clasificación de los carbohidratos con base en el número de unidades sacáridas que los componen (mono, di, tri, oligo y polisacáridos) y con base en su composición (homo y heteropolisacáridos).

B.1.3 Conocerá la estructura química de los monosacáridos con base en su grupo carbonilo, en su estructura lineal o cíclica y en el número de átomos de carbono. Señalará las siguientes características fisicoquímicas: solubilidad y propiedades ópticas. Definirá el concepto de carbono asimétrico y los diferentes tipos de isómeros ópticos: epímero, enantiómero y anómero.

B.1.4 Describirá la estructura de los carbohidratos de importancia fisiológica: ribosa, glucosa, fructosa, manosa, galactosa, sacarosa, lactosa, maltosa, almidón, glucógeno y celulosa.

B.1.5 Describirá la estructura y características de los principales heteropolisacáridos (quitina, heparina, sulfato de dermatan, condroitin sulfato, glicosaminoglucanos, peptidoglicanos). Reconocerá los carbohidratos como componentes de

las glicoproteínas y de los glicolípidos y conocerá su función como receptores y moléculas de reconocimiento.

B.2 Digestión y absorción.

B.2.1 Señalará las fuentes dietéticas de los carbohidratos y el papel de la celulosa en la dieta de los mamíferos.

B.2.2 Conocerá el proceso de la digestión y la absorción de los carbohidratos de la dieta.

B.2.3 Conocerá los cinco principales transportadores de glucosa (GLUT 1 a GLUT 5) y su distribución en los diferentes tejidos.

Realización de la práctica 4 "Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata" (ver pág.145). Lecturas recomendadas 1. Díaz HD, Burgos HLC. ¿Cómo se transporta

la glucosa a través de la membrana celular? IATREA. 2002; 15 (3): 179-189.

2. Maeder T. Sweet Medicine. Scientific American. 2002; 287(1): 24-31.

Los carbohidratos, o sacáridos, son las biomoléculas más abundantes en la naturaleza y son indispensables en los organismos vivos. Se les llama carbohidratos debido a que su estructura química semeja formas hidratadas del carbono y se representan con la fórmula (CH2O)n; químicamente se definen como derivados aldehídicos y cetónicos de alcoholes polivalentes y no puede haber menos de 3C para constituir un carbohidrato.

49

Transportador Distribuidor Propiedades

GLUT 1 Eritrocitos,

barrera

hematoencefáli

ca,

placenta,

retina,

riñón y cerebro.

Ingreso basal

de glucosa.

Km 1.6 mM.

GLUT 2 Hígado,

páncreas

e intestino

delgado

Transportador

de glucosa,

galactosa y

fructosa.

Sensor de

glucosa en

páncreas.

Km de 15 mM o

más.

GLUT 3 Cerebro, placenta, hígado, riñón y corazón.

Ingreso basal de glucosa. KM 2 mM. Transportador de glucosa y galactosa.

GLUT 4 Tejido adiposo, corazón y músculo esquelético.

Dependiente de insulina. Km de 5 mM.

GLUT 5 Yeyuno, espermatozoides, riñón, cerebro.

Transportador de fructosa.

Se clasifican según el número de unidades sacáridas en monosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos, según el número de carbonos en su molécula, se dividen en triosas (3C), tetrosas (4C), pentosas (5C), hexosas (6C), heptosas (7C), etcétera. Según su función carbonilo pueden ser aldosas o cetosas, por ejemplo, la glucosa es una aldohexosa y la fructosa una cetohexosa. Los polisacáridos son carbohidratos que resultan de la unión de varias moléculas de monosacáridos. Este grupo se puede clasificar en disacáridos, con dos unidades monosacáridas, como la sacarosa, la

maltosa, la lactosa y la celobiosa; oligosacáridos, con 3 a 10 unidades de monosacárido y polisacáridos, con más de 10 unidades de monosacárido, que tienen alto peso molecular, como el almidón, el glucógeno y la celulosa. Los carbohidratos provienen de la dieta; se encuentran en los cereales (maíz, trigo y arroz), hortalizas (bulbos, raíces, verduras), legumbres (frijol, garbanzo, lenteja), tubérculos (papa, yuca), frutas, leche y productos lácteos, así como en algunos productos procesados como dulces, jaleas, mermeladas y pastas. Los carbohidratos son los componentes más abundantes de la dieta del humano, aportan aproximadamente el 55% de las calorías de la dieta. Los carbohidratos tienen diversas funciones en el organismo son: a) La fuente principal de energía (1 g de carbohidrato produce 4 Cal); b) Precursores en la bio-síntesis de ácidos grasos y algunos aminoácidos; c) Constituyentes de moléculas complejas importantes como glucolípidos, glucoproteínas, ácidos nucleicos y nucleótidos. Estructura de los monosacáridos Los alcoholes y los aldehídos o cetonas pueden reaccionar entre sí para producir hemiacetales y hemicetales. Cuando existen estos grupos hidroxilo y carbonilo en una misma molécula provocan que la molécula se ciclice. La naturaleza del ciclo depende de la posición del grupo hidroxilo que participa. Si el compuesto es una aldosa y tiene 5 carbonos será el C 4 el que reaccione y el anillo formado es un furano. De la misma manera, si el compuesto tiene 6 carbonos, será el C 5 el que reaccione y se formará un anillo de pirano. La transferencia de un protón del grupo hidroxilo al oxígeno del carbonilo ocasiona un nuevo carbón asimétrico. La posición del hidroxilo en este carbono determina dos formas isoméricas alfa o beta que, en solución, guardan un equilibrio con la forma lineal (forma carbonilo). Glucósidos Son los compuestos resultantes de la unión covalente de azúcares con varias moléculas. Se clasifican en homoglucósidos, si se unen exclusivamente carbohidratos (osas) mediante

50

enlaces glucosídicos, y en heteroglucósidos, si forman enlaces con otro tipo de moléculas como proteínas o lípidos. Los homoglucósidos pueden clasificarse según el número de unidades en: disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los polisacáridos, también llamados poliósidos, pueden clasificarse en homopolisacáridos, que pueden ser de reserva, como el almidón, el glucógeno, la inulina, o estructurales, como la celulosa, la lignina y la quitina, y en heteropolisacáridos, que pueden dividirse en no nitrogenados, como las pectinas, el agar y la goma arábiga, o nitrogenados, como los glucosaminoglucanos. Muchos de los alimentos que se ingieren a diario contienen almidón y glucógeno que son polisacáridos de reserva. El almidón forma gránulos en las células de las plantas y el glucógeno se encuentra en el citoplasma de las células musculares y hepáticas de los animales. El azúcar que constituye la unidad estructural de estas moléculas es la glucosa, la cual se encuentra formando dos tipos de enlaces: los enlaces α 1 4 se encuentran en la amilosa (formada por unidades de maltosa) y el enlace α 1 6 conecta a la estructura llamada amilopectina. La estructura del glucógeno es similar a la del almidón, pero con una mayor cantidad de ramificaciones. El almidón está compuesto por 3 000 residuos de glucosa y tiene un peso molecular cercano a 5 X 105; el glucógeno tiene un peso molecular de 1 a 4 X 106. La degradación de estos polisacáridos es diferente si se realiza en el aparato digestivo o en el interior de las células; es hidrolítico en el primer caso y fosforolítico en las células. Durante la digestión, la amilosa es hidrolizada por una alfa amilasa, la cual rompe los enlaces α 1 4. Los productos primarios son oligosacáridos con 6 a 7 residuos; los últimos productos son una mezcla de maltosa y glucosa. En la cadena de amilopectina, la alfa amilasa rompe los enlaces α 1 4, pero no los α 1 6; éstos son hidrolizados por una α 1 6 glucosidasa. El resultado de la acción de las dos enzimas es la hidrólisis de la amilopectina hasta glucosa y maltosa. Existe también otra enzima llamada maltasa (alfa amilasa), que hidroliza los enlaces α1 4 glucosídicos de la malto-sa; la acción de esta enzima facilita la formación de la dextrina límite. Esta

partícula está constituida por moléculas de amilopectina que tienen una gran cantidad de ramificaciones. Las dextrinas límite son degradadas por la α 1 6 glucosidasa y se obtiene una mezcla de glucosa y maltosa. Los productos de la digestión de los carbohidratos se absorben en el intestino a través de GLUT2 y GLUT5 o por cotransporte con sodio y pasan a la circulación portal.

C. Metabolismo energético

Al finalizar esta subunidad, el alumno conocerá las vías involucradas directamente en la generación de la energía de la célula. C.1 Glucólisis.

C.1.1 Describirá las reacciones de la vía glucolítica, indicando las reacciones irreversibles y aquellas que generan NADH o ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

C.1.2 Señalará los productos de la vía y su destino en presencia y en ausencia de oxígeno; discutirá la importancia fisiológica de la formación de lactato.

C.1.3 Conocerá el balance energético y la regulación de la vía glucolítica; hará énfasis en el papel de las siguientes moléculas: ATP, ADP, AMP, fructosa 2,6-bisfosfato, alanina y citrato.

C.1.4 Señalará la importancia de la glucólisis en los eritrocitos, en las células musculares, en las células nerviosas y en los hepatocitos.

Las células de los organismos heterótrofos obtienen su energía de reacciones oxidativas en las cuales los electrones de un sustrato donador se transfieren a un aceptor. Bajo condiciones anaeróbicas, un compuesto orgánico sirve como aceptor de electrones; bajo condiciones aeróbicas, el oxígeno es el aceptor final. Los sustratos preferidos por la célula para obtener la energía requerida para sus funciones vitales son los azúcares (mono, di y homopolisacáridos). Asimismo, las células son

51

capaces de usarlos también como intermediarios para la formación de otros compuestos importantes en biología. La glucólisis es la vía metabólica por la que se degrada la glucosa; filogenéticamente, es la vía más antigua y consiste en una secuencia de reacciones enzimáticas en las cuales se degrada la glucosa. La glucólisis puede dividirse en dos fases: una de activación y una oxidativa. La fase de activación consiste en la transferencia de fosfatos a la glucosa con gasto de dos ATP y en su ruptura en dos moléculas de gliceraldehído 3 fosfato; en la fase oxidativa, el gliceraldehído 3 fosfato es transformado en piruvato con la obtención de cuatro moléculas de ATP por fosforilación a nivel de sustrato. Las reacciones de la glucólisis ocurren en el citoplasma y no están ligadas a estructuras celulares. El producto de la vía es el piruvato, el cual puede seguir diversos destinos según las condiciones de la célula. En condiciones anaeróbicas, el piruvato se transforma en lactato por acción de la lactato deshidrogenasa en presencia del NADH + H+ obtenido en la oxidación del gliceraldehído 3 fosfato. En las levaduras, el piruvato se descarboxila a acetaldehído y se forma etanol por la reducción del acetaldehído con el NADH mediante la acción de la deshidrogenasa alcohólica. Bajo condiciones aerobias, el piruvato se descarboxila en las mitocondrias y produce NADH y acetil CoA, la cual es el sustrato principal del ciclo de Krebs. Sólo una pequeña parte de la energía almacenada en la molécula de la glucosa se libera en la glucólisis (2 ATP netos por cada molécula de glucosa). En estricta anaerobiosis, la glucólisis es la única fuente de energía de la célula. La regulación de la vía glucolítica se realiza a nivel de la transformación de la fructosa 6 fosfato en fructosa 1,6 bisfosfato. Esta reacción es catalizada por la fosfofructocinasa I, la que es una enzima alostérica cuya actividad se estimula por AMP, ADP y fructosa 2,6 bisfosfato y se inhibe por ATP y citrato. La deshidrogenasa de gliceraldehído 3 fosfato también desempeña un papel importante en la regulación de la glucólisis. C.2 Papel de la mitocondria en las funciones

oxidativas.

C.2.1 Conocerá la biogénesis de la mitocondria.

C.2.2 Señalará la estructura de la mitocondria y describirá las características de su matriz, membrana externa, membrana interna y espacio intermembranal; hará énfasis en su papel en la transducción de energía.

C.2.3 Reconocerá que en la mitocondria se realizan, entre otras, las siguientes vías: síntesis de algunas proteínas, descarboxilación del piruvato, ß-oxidación, ciclo de Krebs, cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa.

La respiración celular es una secuencia de reacciones de óxidorreducción de la que los organismos obtienen energía para formar compuestos como el ATP. La base molecular de este proceso es una oxidación, paso a paso, de los compuestos orgánicos hasta CO2 y la transferencia de hidrógeno (protones más electrones) al oxígeno con la formación de una molécula de agua. La energía obtenida por la respiración celular es, por tanto, una parte de la energía liberada en la reacción del hidrógeno con el oxígeno. Todos estos procesos se realizan en las mitocondrias de los organismos eucariotos y en las membranas plasmáticas de los organismos procariotos. Las mitocondrias son orgánulos relativamente autónomos cuya estructura está adaptada a su función principal, es decir, a la conversión de la energía de oxidación en aquella de los compuestos de reserva con un alto contenido energético. Una mitocondria está constituida por dos membranas separadas: una membrana externa lisa y muy permeable y una membrana interna con plegamientos irregulares (crestas) y selectivamente permeable. El interior de la mitocondria está constituido por la matriz. Cada compartimiento tiene un contenido característico de enzimas y moléculas de acuerdo con los procesos que se realizan en ellos. La cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria) y la generación de enlaces de alta energía asociada a esta transferencia de electrones

52

tiene lugar en la membrana interna. La mitocondria contiene además un DNA circular específico y todos los componentes necesarios para la síntesis de proteínas, lo que podría indicar que el origen de la mitocondria pudo ser una bacteria que estableció una simbiosis con una célula eucariótica a la que infectó. C.3 Descarboxilación del piruvato.

C.3.1 Conocerá las reacciones de la descarboxilación oxidativa del piruvato e indicará sus productos y el destino de los mismos.

C.3.2 Analizará el carácter irreversible de la descarboxilación del piruvato y su regulación por producto, por alosterismo y por modificación covalente.

En los organismos aeróbicos el piruvato, producto de la glucólisis, entra a la mitocondria para ser oxidado a acetil CoA y CO2. Este proceso oxidativo irreversible es realizado por la piruvato deshidrogenasa, un complejo de tres enzimas y cinco diferentes coenzimas o grupos prostéticos: pirofosfato de tiamina (TPP), lipoato, flavin adenin dinucleótido (FAD), CoA y nicotin adenin dinucleótido (NAD). En la primera reacción se forma CO2 y un grupo α-hidroxietilo derivado del piruvato, el cual se une covalentemente al TPP de la piruvato deshidrogenasa (E1). En el siguiente paso el grupo α-hidroxietilo es oxidado a acetato y se transfiere al lipoato unido covalentemente a la dihidrolipoil transacetilasa (E2). El TPP se regenera en este paso. La siguiente reacción consiste en transferir el grupo acetato del lipoato a la CoA para formar acetil CoA. El lipoato permanece reducido. Los siguientes pasos tienen como finalidad regenerar la forma oxidada de este lipoato. Para ello, el FAD unido a la dihidrolipoil deshidrogenasa (E3) remueve los electrones del lipoato y los entrega al NAD+ reduciéndolo a NADH + H+ La actividad del complejo de la piruvato deshidrogenasa es regulada por tres mecanismos: 1. Inhibición por producto: tanto el acetil CoA como el

NADH + H+ actúan como moduladores alostéricos negativos.

2. Por disponibilidad de sus sustratos: deben existir concentraciones adecuadas de piruvato, CoA y NAD+.

3. Por modificación covalente: la piruvato deshidrogenasa (E1) existe en dos formas: una fosforilada (inactiva) y otra desfosforilada, que es activa. La fosforilación es llevada a cabo por una proteína cinasa dependiente de Mg2+ y ATP, mientras que la desfosforilación la realiza una fosfoproteína fosfatasa, cuya actividad es estimulada por altas concentraciones de Ca2+. Este último evento ocurre cuando existe una concentración elevada de ADP, el cual es indicador de carencia energética.

Los individuos que tienen deficiencia de tiamina, como ocurre en el beriberi, presentan problemas a nivel neurológico debido a que el cerebro obtiene toda su energía por oxidación aeróbica de la glucosa. C.4 Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs).

C.4.1 Definirá el concepto de óxidorreducción, par redox y potencial de óxidorreducción.

C.4.2 Señalará la localización subcelular de la vía en función de sus alimentadores y precisará el papel del ciclo en la generación de la energía celular.

C.4.3 Describirá las reacciones enzimáticas involucradas en el ciclo, sus sustratos y productos, así como las sustancias que intervienen en la regulación de la vía.

C.4.4 Conocerá el papel anfibólico de la vía y los diferentes destinos de sus intermediarios: citrato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinil CoA, malato y oxaloacetato.

C.4.5 Definirá el concepto de reacción anaplerótica y conocerá las enzimas involucradas en estas reacciones para el ciclo de Krebs.

C.4.6 Conocerá el balance energético de la vía y hará énfasis en el número y tipo de coenzimas reducidas producidas

53

en la oxidación de una molécula de acetil CoA.

La mayor parte del ATP generado en los organismos aerobios se produce en el proceso de la fosforilación oxidativa en el cual, los hidrógenos extraídos de los metabolitos mediante las reacciones de deshidrogenación son cedidos a la cadena respiratoria, en donde se genera el potencial protonmotriz que sirve de fuerza impulsora para la síntesis del ATP. La mayoría de las deshidrogenaciones de los metabolitos se llevan a cabo en una secuencia cíclica de reacciones conocida como ciclo de Krebs, ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ciclo de Krebs se lleva a cabo por enzimas solubles (a excepción de la succinato deshidrogenasa que es parte integral de la membrana interna) de la matriz mitocondrial y durante él se oxidan los residuos de acetato activo (acetil CoA) provenientes de la glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos, hasta CO2 y coenzimas reducidas. Aproximadamente dos tercios del ATP utilizado por los organismos aerobios se genera como resultado de la oxidación de los restos de acetato en el ciclo de Krebs. El ciclo de Krebs es una vía de confluencia para el catabolismo celular (fig. III.1) que, en una secuencia de ocho reacciones oxida al residuo acetato de la acetil CoA conforme a la ecuación siguiente: CH3 – COOH + 2H2O 2CO2 + 4(2H+) En el ciclo ocurren dos reacciones en las que se desprende CO2 y hay cuatro deshidrogenaciones, de las cuales tres donan sus hidrógenos al NAD+ y una al FAD. a) La oxidación de la Acetil CoA derivada de la

glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos es la función primaria del ciclo de Krebs, el cual la procesa en una serie de reacciones que se inician y terminan con el oxaloacetato; en cada vuelta del ciclo de Krebs se produce un GTP por fosforilación a nivel del sustrato y se liberan cuatro pares de hidrógeno que alimentan la

cadena respiratoria con la producción de 9 ATP en la fosforilación oxidativa.

Además de su papel central en la oxidación de la acetil CoA, el ciclo de Krebs participa en los siguientes procesos metabólicos:

b) Gluconeogénesis. Reúne numerosos sustratos que se convierten en oxaloacetato. Este compuesto sale de la mitocondria en forma de malato, citrato o aspartato y se transforma en el citosol, primero en fosfoenol piruvato y después en glucosa.

c) Biosíntesis de los ácidos grasos. Aporta la molécula de citrato que, al salir de la mitocondria, es transformada con gasto de un ATP por la citrato liasa en oxaloacetato y acetil CoA, que es el alimentador inicial de la biosíntesis de los ácidos grasos. El oxaloacetato se reduce a malato, el cual es oxidado por la enzima málica para la producción de NADPH, coenzima indispensable en la biosíntesis de los ácidos grasos.

d) Interconversión de Aminoácidos. Numerosos aminoácidos entregan sus carbonos al ciclo de Krebs al transformarse, por reacciones sucesivas, en alguno de los metabolitos clave del ciclo: α-cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato y oxaloacetato; una vez ahí, mediante las reacciones del ciclo de Krebs, pueden transformarse en algún otro aminoácido que se derive de otro intermediario del ciclo.

e) Biosíntesis de Purinas y Pirimidinas. El ciclo de Krebs alimenta la síntesis de bases púricas y pirimídicas aportando, de manera indirecta, aspartato y glutamina.

f) Biosíntesis de Porfirinas. El ciclo de Krebs aporta uno de los sustratos iniciales necesarios para que se lleve a cabo esta vía: la succinil-CoA.

Regulación del ciclo de Krebs Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a la cadena respiratoria y recibe de ella las mismas coenzimas oxidadas, el ciclo de Krebs funciona bajo el control de la cadena respiratoria y depende en última instancia de la fosforilación oxidativa. Sin embargo, el ciclo de Krebs responde a moduladores

54

alostéricos generados en el propio ciclo y también en otras vías del metabolismo; son moduladores negativos NADH, ATP, citrato, succinil CoA y oxaloacetato y moduladores positivos ADPy Ca2+. Las enzimas citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa son las enzimas reguladoras del ciclo. C.5 Cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria).

C.5.1 Describirá la naturaleza de los componentes de la cadena de transporte de electrones y señalará su secuencia con base en los potenciales de oxidorreducción. Calculará la energía generada en cada paso del transporte de electrones.

C.5.2 Identificará los alimentadores de la vía, así como su sitio de entrada a ésta y el último aceptor de los electrones.

C.5.3 Señalará el sitio de acción de los siguientes inhibidores de la cadena respiratoria: amital, rotenona, antimicina, cianuro, NaN3, CO y H2S.

C.5.4 Describirá los sistemas de transporte de los equivalentes reductores a la mitocondria (lanzaderas).

C.5.5 Citará algunos ejemplos de alteraciones en los componentes mitocondriales, como las isoenzimas e isoformas de la citocromo c oxidasa, entre otras.

Lecturas recomendadas 1. Schon EA. Mitochondrial genetics and disease.

TIBS. 2000; 25(11): 555-5560.

2. Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free

radicals, disease and aging. TIBS. 2000; 25(10):

502-508.

3. Cardellach F, Casademont J. Enfermedades

mitocondriales: un diagnóstico todavía difícil.

Medicina Clínica. 2000; 114 (4): 139-140.

4. Rubio JC, Matín MA, del Hoyo P, Bustos F,

Campos Y, Arenas J. Déficits de los complejos

enzimáticos de la cadena respiratoria

mitocondrial. Rev Neurol. 1998; 26 (supl 1): S15-

S20.

5. Castro-Gago M, Novo MI, Eirís J. Tratamiento de

las enfermedades mitocondriales durante la

infancia y adolescencia. Rev Neurol. 1998; 26

(supl 1): S92-S98.

C.6 Fosforilación oxidativa. C.6.1 Describirá brevemente la hipótesis

quimiosmótica propuesta para explicar la síntesis de ATP y los datos que existen en favor de ella. Definirá los conceptos de vectorialidad, impermea-bilidad, fuerza protonmotriz e ionóforo, empleados en esta hipótesis.

C.6.2 Con base en el cálculo de energía libre de Gibbs, señalará el número

55

de ATP que se genera al reoxidarse las coenzimas NADH y FADH2 en la cadena respiratoria. Definirá el concepto de control respiratorio indicando el papel del ADP, del transportador de adenin nucleótidos y del acarreador de fosfatos y su efecto sobre la síntesis de ATP.

C.6.3 Señalará el sitio de acción de los inhibidores de la ATP sintasa (oligomicina y venturicidina), de los desacoplantes sintéticos y naturales (dinitrofenol y termogenina) de los procesos de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa y el inhibidor del translocador de adenin nucleótidos (atractilósido) y hará énfasis en su efecto sobre la síntesis de ATP.

Realización de la práctica 5 "Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes" (ver pág.146).

Lectura recomendada 1. Hinkle PC. ¿Cómo fabrican ATP las células? Investigación y Ciencia 1978; 20: 58-75. Mientras que el CO2 se forma por la oxidación del sustrato durante el ciclo del ácido cítrico en la matriz mitocondrial, la secuencia de las reacciones que participan en la transferencia de hidrógenos y electrones (la cadena respiratoria) se localiza en la membrana interna de la mitocondria. La cadena se puede dividir en cuatro complejos: el complejo I o NADH deshidrogenasa (que cede sus electrones a la coenzima Q); el complejo II o las deshidrogenasas que ceden sus electrones al FADH2 (como la succinato deshidrogenasa) y a través de él a la misma coenzima Q; el complejo III o citocromo c reductasa, y el complejo IV o citocromo c oxidasa, que transfiere los electrones al oxígeno, que es el aceptor final. Los componentes de la cadena respiratoria están arreglados de acuerdo con potenciales de oxidorreducción crecientes (de valores negativos a

positivos). La energía liberada en el curso de la transferencia de hidrógeno y electrones a través de la cadena respiratoria se utiliza para la formación de ATP por la llamada fosforilación oxidativa. La energía requerida para la formación de un ATP a partir de un ADP es equivalente a una diferencia de potencial redox de 0.15 V. En promedio, la oxidación de una molécula de NADH da origen a 2.5 moléculas de ATP, mientras que se forman 1.5 moléculas de ATP cuando se oxida FADH2 vía succinato (no involucra NADH). El rendimiento de energía de la fosforilación oxidativa es alrededor de 40% del valor teórico de la energía liberada en la reacción del hidrógeno con el oxígeno. El transporte de los electrones entre los diferentes componentes de la cadena respiratoria puede ser inhibido por diversos compuestos, entre ellos: los barbituratos, la rotenona, la antimicina, el CO, las azidas, el H2S y el cianuro, los que actúan en distintos sitios de la cadena respiratoria. Las reacciones de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa están acopladas; si se desacoplan, la energía se pierde como calor y no hay síntesis de ATP. Pueden desacoplarse in vitro por 2,4 dinitrofenol o compuestos similares e, in vivo, por la termogenina presente en tejido adiposo pardo, el que es abundante en recién nacidos. La membrana interna de la mitocondria debe estar intacta para generar ATP. Las moléculas de ATP formadas en el interior de la mitocondria son translocadas al exterior en intercambio con moléculas de ADP presentes fuera de la mitocondria por medio de un acarreador altamente específico presente en la membrana mitocondrial: la translocasa de los adenin-nucleótidos. Hay otro mecanismo de síntesis de ATP no asociado al transporte de electrones en el que los donadores de la energía y del fosfato final del ATP son compuestos con enlaces fosfato de alta energía. Este tipo de fosforilación se conoce como fosforilación a nivel de sustrato. Los sustratos metabolizados dentro de la mitocondria son transportados al exterior por mecanismos específicos (transporte de ácidos dicarboxílicos, de aminoácidos, de iones, etcétera). Este transporte, como el del ATP, se convierte en

56

uno de los factores de control en la función mitocondrial. Dado que la membrana interna de la mitocondria es impermeable para el NAD+ y el NADH y a que una forma eficiente, energéticamente hablando, de reoxidar al NADH que se obtiene en la glucólisis es un proceso mitocondrial, existen lanzaderas que son sistemas de transporte de los hidrógenos citoplasmáticos (equivalentes reductores) a través de la membrana mitocondrial. Las dos lanzaderas más importantes son la del glicerol fosfato y la del malato. C.7 Radicales libres.

C.7.1 Definirá el concepto de radicales libres y cuáles son derivados del oxígeno.

C.7.2 Describirá cómo y dónde se generan los radicales superóxido, hidroxilo y otras moléculas reactivas: peróxido de hidrógeno y singulete de oxígeno.

C.7.3 Describirá el efecto de estos radicales y moléculas reactivas sobre otras moléculas, células y organismos y su contribución en las siguientes condiciones: fagocitosis, inflamación, lipoperoxidación y perfusión postisquemia.

C.7.4 Describirá las condiciones en las que se genera el radical NO y su relevancia fisiológica.

C.7.5 Describirá los mecanismos protectores del organismo contra las especies reactivas de O2: superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, vitaminas E y C y β-carotenos.

Realización de la práctica 6 "El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación" (ver pág.149).

Lecturas recomendadas 1. Piña GE, Huberman A, Chávez R, Lascurain

R, Zenteno E, Frenk S. Los radicales libres. Beneficios y problemas. Gac Méd Méx 1996; 132 (2): 183-203.

2. Fernández AA, Abudara V, Morales FR. El óxido nítrico como neurotransmisor y

neuromodulador. Actas de Fisiología. 1999; 5: 39-77.

3. Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and aging. TIBS. 2000; 25 (10): 502-508.

Un gran número de enfermedades, como el Parkinson, aterosclerosis, enfisema pulmonar y cáncer, entre otras, tienen su origen en una producción excesiva o anormal de derivados del oxígeno, químicamente muy activos: los radicales libres. Un radical libre es cualquier especie química, molécula o átomo, portadora de uno o más electrones desapareados. Se llama electrón desapareado al electrón que se encuentra solo en un orbital. La presencia de un electrón desapareado hace que los radicales libres sean muy reactivos, pues buscan con avidez completar su par electrónico. No obstante, existen radicales libres relativamente estables, como las moléculas con estructuras resonantes (con múltiples enlaces dobles), que permiten la deslocalización del electrón desapareado. La colocación de un punto, generalmente al final de la fórmula química, indica el carácter de radical libre de una molécula (•). Los radicales libres son capaces de alterar reversible o irreversiblemente compuestos bioquímicos de todo tipo y pueden modificar en forma importante su estructura y, como consecuencia, alterar la capacidad funcional de las sustancias atacadas. El principal blanco de los radicales libres son las insaturaciones de los lípidos de membrana en los cuales provocan una peroxidación. La presencia de lípidos peroxidados en las membranas biológicas disminuye su fluidez, lo que se traduce en alteraciones de la permeabilidad a sustancias o, incluso, su integridad, lo que provoca la lisis celular. Los radicales libres también son capaces de inactivar o destruir enzimas y otras proteínas y atacar a los ácidos nucleicos. El daño al DNA puede causar mutaciones y dar origen a cánceres. La acción sobre los carbohidratos puede alterar su función como receptores (de hormonas o neurotransmisores). Es decir, los radicales libres influyen sobre actividades celulares tanto a nivel de la membrana como en las vías metabólicas y en la expresión genética.

57

Una de las características más importantes de las reacciones de los radicales libres es que se forman por reacciones en cadena; esto significa que un radical libre puede dar lugar a la formación de otro, de manera que este mecanismo permite que la actividad se propague y que el daño se generalice.

Los radicales derivados del oxígeno

Las especies reactivas del oxígeno son el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno, el hidroxilo y el singulete de oxígeno. Anión superóxido. La transformación del oxígeno en radical libre puede efectuarse cuando el oxígeno acepta un electrón que transforma este elemento en un radical con carga negativa, el anión superóxido: O2

•–. Probablemente la fuente más importante de producción de radicales superóxido sea el estallido respiratorio (aumento súbito del consumo de oxígeno) de los macrófagos y de los leucocitos polimorfonucleares en respuesta a una señal inmunitaria provocada por alguna infección. Peróxido de hidrógeno. El anión superóxido sufre espontáneamente, o bajo la acción de la enzima superóxido dismutasa (SOD), una reacción de dismutación: dos radicales libres reaccionan entre sí, uno de ellos perdiendo electrones y el otro ganándolos. Esta dismutación produce agua oxigenada, que no es realmente un radical libre, pero este compuesto por captación de un electrón y de un protón, puede dar lugar a la formación de especies oxigenadas muy activas, especialmente al radical hidroxilo. Radical hidroxilo. El •OH es un oxidante extremadamente reactivo que interactúa con casi todas las moléculas a velocidades sólo limitadas por su difusión. El radical hidroxilo es formado por la ruptura de una molécula de agua bajo el efecto de una radiación gamma o en el ciclo de Haber-Weiss: 1. 2 O2

•– + 2 H+ O2 + H2O2 2. H2O2 + Fe2+ Fe3+ + •OH + OH– 3. Fe3+ + O2

•– Fe2+ + O2 el ciclo global se expresa:

Fe2+/Fe3+

O2•– + H2O2 O2 + •OH + OH–

1. La dismutación del radical anión superóxido produce peróxido de hidrógeno.

2. El peróxido de hidrógeno se descompone en el radical hidroxilo con intervención del Fe2+ (reacción de Fenton).

3. La regeneración del Fe2+ por medio del radical anión superóxido.

Singulete de oxígeno. El singulete de oxígeno, representado gráficamente como 1O2*, se caracteriza por tener un par electrónico antiparalelo en su última órbita; no es realmente un radical, sin embargo, es incluido aquí por ser un derivado muy oxidante del oxígeno. Se forma principalmente en reacciones en las que los pigmentos biológicos, como el retinal, las flavinas o las porfirinas, son expuestos a la luz en presencia de oxígeno. Antioxidantes Para controlar los efectos devastadores de los radicales libres existen mecanismos protectores. Estos sistemas tienen la función de neutralizar el efecto de los radicales libres o evitar su aparición. El nivel primario de defensa lo constituyen tres enzimas especializadas. 1. Superóxido dismutasa. Existe en las mitocondrias

(SOD de Mn2+) y en el citosol (SOD de Cu2+ y de Zn2+). Cataliza la dismutación del radical anión superóxido para dar oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno:

2 O2

•– + 2 H+ O2 + H2O2

2. Glutatión peroxidasa. Existe principalmente en el

citosol y contiene selenio. Cataliza la siguiente reacción:

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O

(donde: GSH-glutatión reducido y GSSG-glutatión oxidado). 3. Catalasa. Existe principalmente en los

peroxisomas y su función es destruir el agua oxigenada por dismutación:

H2O2 + H2O2 2H2O + O2

58

Otro tipo de protección contra los radicales libres es la que prestan unas sustancias capaces de neutralizar a los radicales o limitar su reactividad, llamadas atrapadoras. Entre ellas cabe mencionar: Vitamina E (tocoferol) y beta caroteno. Reaccionan con los radicales peróxido y suspenden la cadena de reacciones radicalares. Son liposolubles y por eso pueden proteger las membranas. Vitamina C. Reacciona directamente con los superóxidos, con el singulete de oxígeno y con el radical hidroxilo; regenera la vitamina E al reaccionar con el radical tocoferilo y lo convierte en radical ascorbilo, también muy estable. Algunos minerales como el selenio, el cinc, el cobre y el manganeso, constituyentes de las enzimas antes mencionadas; proteínas y péptidos como el glutatión, la albúmina, la ceruloplasmina, la ferritina, la transferrina, etcétera y, por último, sustancias quelantes que evitan que el hierro, cobre y otros metales de transición catalicen reacciones de oxidación. D. Otras vías metabólicas de los

carbohidratos

Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá analizar en forma integral el metabolismo de los carbohidratos, identificar su papel como combustible celular y como generador de intermediarios de otras vías metabólicas y podrá explicar en forma integral la regulación de la glucemia. D.1 Gluconeogénesis.

D.1.1 Señalará en qué consiste la gluconeogénesis, los sustratos gluconeogénicos, los compartimentos celulares de la vía y los tejidos con mayor actividad gluconeogénica.

D.1.2 Comparará y analizará las reacciones de esta vía con las de la glucólisis desde el punto de vista energético y describirá los mecanismos empleados para evitar las barreras energéticas.

D.1.3 Indicará el destino metabólico del producto de la gluconeogénesis hepática.

D.1.4 Describirá el ciclo de Cori y el ciclo de la alanina y el significado fisiológico de ambos.

D.1.5 Elaborará el balance energético y explicará la regulación de la gluconeogénesis y hará énfasis en el papel de la fructosa 2,6 bisfosfato.

Es el proceso por el cual se sintetiza la glucosa a partir de diversos sustratos como son: a) Lactato o piruvato. b) Aminoácidos glucogénicos (Ala, Arg, Cys, Asp,

Glu, Gly, His, Met, Pro, Ser, Tre, Val). c) Cualquier otro intermediario que pueda ser

metabolizado vía piruvato (o que entre al ciclo de Krebs).

La gluconeogénesis no puede verse como la vía en sentido contrario de la glucólisis ya que algunas de las reacciones de esta última son muy exergónicas, lo que las hace irreversibles. Tal es el caso de las reacciones catalizadas por la piruvatocinasa (transforma al fosfoenolpiruvato en piruvato), la fosfofructocinasa (paso de fructosa 6 fosfato a fructosa 1,6 bisfosfato) y la hexocinasa (glucosa a glucosa 6 fosfato). Estas reacciones se evitan por medio de las siguientes alternativas: 1. La formación del fosfoenolpiruvato a partir de oxaloacetato. El oxaloacetato se forma en la mitocondria por carboxilación del piruvato con una enzima dependiente de biotina y ATP llamada carboxilasa del piruvato. También se puede obtener el oxaloacetato en el citoplasma por carboxilación del piruvato y reducción con NADPH para formar el malato, el cual se deshidrogena para producir el oxaloacetato. Estas reacciones son llevadas a cabo por la enzima málica. La fosforilación del oxaloacetato con GTP o ITP y su descarboxilación simultánea por la fosfoenolpiruvato carboxicinasa producen el fosfoenolpiruvato. 2. La degradación hidrolítica de la fructosa 1,6

bisfosfato a fructosa 6 fosfato catalizada por la fructosa 1,6 bisfosfatasa.

59

3. La degradación de la glucosa 6 fosfato a glucosa por la glucosa 6 fosfatasa.

La síntesis de una molécula de glucosa a partir de dos moléculas del piruvato requiere seis moléculas de ATP. La posibilidad de que la gluconeogénesis proceda completamente (es decir, que su producto final sea glucosa) depende de la presencia de todas las enzimas clave en un tejido determinado. Se lleva a cabo con facilidad en el hígado y en los riñones; no ocurre en el cerebro ni en el músculo esquelético ya que la glucosa 6 fosfatasa se encuentra ausente en estos tejidos. Es por esto que el producto de la degradación del glucógeno muscular (glucosa 6 fosfato) no puede servir como una fuente para mantener el nivel de la glucosa sanguínea. En el músculo, el glucógeno se degrada hasta lactato que sale a la circulación sanguínea y se transfiere al hígado donde se transforma en glucógeno hepático o en glucosa libre por la vía de la gluconeogénesis. Esta contribución indirecta del lactato del músculo a la glucosa sanguínea se conoce como el ciclo de Cori. El músculo también contribuye a mantener la glucemia, al transformar el piruvato en alanina, la que sale a la circulación y en el hígado se convierte otra vez en piruvato para entrar a la gluconeogénesis. D.2 Glucogenólisis y glucogénesis.

D.2.1 Conocerá la distribución tisular del glucógeno.

D.2.2 Describirá las reacciones de la glucogenólisis y de la glucogénesis e indicará los sustratos y los productos, así como la localización subcelular de las vías.

D.2.3 Discutirá el balance energético y la regulación de ambas vías por alosterismo (glucosa, glucosa 6 fosfato, AMP y Ca2+). Revisará el papel de las las hormonas epinefrina, glucagón e insulina en la regulación de estas vías.

D.2.4 Indicará las diferencias del metabolismo del glucógeno en el músculo y en el hígado.

D.2.5 Mencionará los defectos enzimáticos de las siguientes glucogenosis: von Gierke, McArdle y Andersen.

El glucógeno es un polisacárido de reserva localizado en forma de gránulos en el citoplasma de las células; es osmóticamente inactivo y facilita la rápida y reversible transformación de la glucosa en una molécula de reserva, según la situación energética de la célula. La degradación del glucógeno se conoce como glucogenólisis y su síntesis como glucogénesis (glucogenogénesis). La glucogenólisis se inicia por una ruptura fosforolítica del glucógeno por la fosforilasa. En presencia de fosfato, se separa una glucosa del glucógeno como glucosa 1 fosfato y ésta, por acción de una fosfoglucomutasa, se transforma en glucosa 6 fosfato, la que puede entrar entonces a la vía glucolítica. La energía invertida para la inclusión de una molécula de glucosa en el glucógeno y su regreso a glucosa 6 fosfato es de dos moléculas de ATP.

La síntesis de glucógeno se inicia con la fosforilación de la glucosa para formar glucosa 6 fosfato que se transforma posteriormente en glucosa 1 fosfato por acción de la fosfoglucomutasa. Esta molécula reacciona con UTP por acción de la UDP-glucosa pirofosforilasa y origina UDP-glucosa, que es el sustrato de la glucógeno sintetasa. Las numerosas ramificaciones presentes en el glucógeno son introducidas por la acción de una enzima ramificante. La degradación y la síntesis de glucógeno están finamente reguladas por el AMP cíclico a través de la actividad de la proteína cinasa. En una secuencia de reacciones, este compuesto se involucra en la conversión de la fosforilasa b (inactiva, no fosforilada) en fosforilasa a (activa, fosforilada).Inversamente, la glucógeno sintetasa que está en su forma activa (no fosforilada o forma I) cambia a su estado inactivo (fosforilado o forma D). La concentración intracelular de AMP cíclico (AMPc) es regulada por las hormonas epinefrina y glucagon, las que aumentan la concentración de AMPc, y por la insulina, que la disminuye. D.3 Vía del fosfogluconato (ciclo de las pentosas).

60

D.3.1 Indicará la distribución tisular de esta vía.

D.3.2 Señalará las reacciones de la fase oxidativa y de la no oxidativa e indicará sus productos y su destino metabólico.

D.3.3 Mencionará las relaciones de la vía del fosfogluconato con otras vías metabólicas como la glucólisis, la síntesis de nucleótidos, la síntesis de ácidos grasos, la síntesis de colesterol y los sistemas oxidantes de las células fagocíticas.

D.3.4 Discutirá la regulación de la actividad de la vía y hará énfasis en su importancia para las síntesis reductoras.

D.3.5 Mencionará la consecuencia de la deficiencia de la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa en eritrocitos.

El ciclo de las pentosas es una vía colateral a la glucólisis. Presenta dos fases: una oxidativa y una no oxidativa. En la fase oxidativa, una molécula de glucosa es gradualmente degradada y se forma el NADPH; en la fase no oxidativa, la ribosa 5-fosfato y la eritrosa 4 fosfato son formadas por una interconversión de ésteres fosfóricos de azúcares de 3C, 4C, 5C, 6C y 7C. En el sentido biosintético, las reacciones del ciclo de las pentosas sirven para la fijación de bióxido de carbono durante la fotosíntesis. Algunos de los intermediarios de esta vía están relacionados con la glucólisis como la glucosa 6 fosfato, la fructosa 6 fosfato y el gliceraldehído 3 fosfato. Las enzimas del ciclo de las pentosas, al igual que las de la glucólisis, son solubles en el citoplasma. El ciclo de las pentosas no es una vía principal para el metabolismo de la glucosa y sus relaciones con la glucólisis pueden variar de acuerdo con el tipo de tejido y sus funciones biológicas. Las reacciones de este ciclo no pueden ser utilizadas en la obtención de energía, ya que la oxidación del NADPH no forma ATP directamente. El ciclo de las pentosas es importante en todas las células ya que es la principal forma de

obtener el NADPH necesario en los procesos de síntesis (reductoras); asimismo, es la fuente de la ribosa 5-fosfato, la cual es precursora de la biosíntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos. D.4 Regulación de la glucemia.

D.4.1 Explicará el significado de los términos: glucemia, hipo e hiperglucemia.

D.4.2 Discutirá la importancia biológica de mantener una glucemia normal.

D.4.3 Discutirá el papel de las siguientes hormonas: epinefrina, glucagon, cortisol e insulina en la regulación de la glucemia normal indicando las vías metabólicas, los tejidos involucrados y las fuentes endógenas y exógenas de los carbohidratos.

D.4.4 Reconocerá la glucosilación no enzimática de las proteínas (hemoglobina glucosilada y fructosaminas) como consecuencia de una hiperglucemia prolongada.

Realización de la práctica 7 "Estudio general del metabolismo de los carbohidratos" (ver pág.150). Discusión del caso clínico no. 3 “Hipoglucemia secundaria a intoxicación alcohólica” (ver pág. 177).

Lecturas recomendadas 1. Beisswenger PJ, Szwergold BS, Yeo KT.

Glycated proteins in diabetes. Clin Lab Med. 2001; 21 (1): 53-78.

2. Cohen MP. Intervention strategies to prevent pathogenetic effects of glycated albumin. Arch Biochem Biophys. 2003; 419 (1): 25-30.

3. Desmond A. Glicosilación no enzimática de proteínas: su rol en las complicaciones crónicas de la diabetes y el envejecimiento. Acta Bioquím Clín Latinoamer. 1995; 29 (2): 173-190.

La concentración sanguínea de la glucosa o glucemia debe mantenerse dentro de límites muy estrechos debido a que algunas células como las nerviosas y los eritrocitos utilizan a la glucosa como única fuente de energía, lo que las hace especialmente sensibles

61

a la disminución de la glucemia. Por otro lado, el aumento de las concentraciones de glucosa en sangre se asocia a problemas de hiperosmolaridad y a la aparición de proteínas glucosiladas que se asocian a algunas patologías, como la diabetes y sus consecuencias. La concentración normal de glucosa en sangre en ayunas es de 80-100 mg/dl, y sus límites extremos son 65 y 120 mg/dl. Los niveles superiores a los valores normales se conocen como hiperglucemia, mientras que los inferiores se designan como hipoglucemia. La glucosa sanguínea puede provenir de dos fuentes: una exógena (la dieta) y una endógena (glucogenólisis y gluconeogénesis hepática). En el primer caso, después de una comida que contenga carbohidratos, la glucemia se incrementa para volver en unas dos horas a los niveles basales. Si por el contrario, el individuo está en ayunas la glucosa desciende pero nunca por debajo de 60 mg/dl. Esto hace un contraste notable con las grandes variaciones en la concentración de los ácidos grasos que pueden aumentar hasta 10 veces y en el caso de los cuerpos cetónicos hasta 100 veces. La principal regulación de la glucemia se realiza por hormonas. Las principales son: glucagon, insulina, epinefrina, gluco-corticoides y las hormonas tiroideas. Cuando la concentración de glucosa disminuye, como en el ayuno, el páncreas secreta glucagón El resultado neto es que en el hígado se detienen las vías de utilización de la glucosa (glucogénesis y glucólisis) y se activan las vías productoras de glucosa (glucogenólisis y gluconeogénesis). Por otra parte, la disminución en el consumo de glucosa por los tejidos insulino-dependientes (músculo y tejido adiposo), causada por la disminución en los niveles de esta hormona, contribuye a preservar la glucosa para que pueda ser utilizada por el cerebro, ya que la glicemia inferior a los 60 mg/dl, provoca que este órgano no reciba las cantidades de glucosa suficientes para obtener la energía necesaria para realizar adecuadamente sus funciones, por lo que, si esta situación se prolonga, pueden sobrevenir el coma y la muerte. Otras hormonas que intervienen para aumentar la glucemia en el caso de ayunos prolongados son los

glucocorticoides, quienes provocan la hidrólisis de proteínas musculares a fin de proveer de sustratos gluconeogénicos al hígado, mientras que las hormonas tiroideas estimulan la glucogenólisis hepática. Por otro lado, cuando la glucemia aumenta, como después de una dieta rica en carbohidratos, los islotes de Langerhans detectan este aumento y secretan insulina. Esta hormona produce un incremento en el transporte de glucosa al interior del músculo y del tejido adiposo, por los receptores GLUT 4 y, activa la glucógeno sintasa, tanto muscular como hepática. De esta manera, la glucemia disminuye y los depósitos de glucógeno hepático y muscular aumentan. El aumento de los valores de glucosa en sangre presenta algunos efectos fisiológicos que pueden explicarse por las propiedades osmóticas y químicas de la glucosa. Entre dichos efectos se encuentran la deshidratación de los tejidos y el envejecimiento de proteínas. En el primer caso, la salida del agua al torrente circulatorio causa que los tejidos pierdan, además del agua, algunos iones importantes, como el potasio. En el segundo caso, las concentraciones altas de glucosa sanguínea (superiores a 120 mg/dl) aceleran el envejecimiento proteínico por glucosilación no enzimática o glicación. La glucosa reacciona con los grupos amino expuestos de las proteínas y cambia las propiedades catalíticas y estructurales de las mismas. La hemoglobina, la colágena, las proteínas del cristalino y muchas más sufren glicación en proporción a la concentración de glucosa en la circulación. Este efecto permite comprender el origen de algunas de las complicaciones que aparecen en el caso de los diabéticos, como la aparición de cataratas por la glicación irreversible de las proteínas del cristalino, o los elevados niveles de hemoglobina glicada (hemoglobina A1c), que en los diabéticos llegan a ser de dos a tres veces mayores que en los individuos normales. El nivel de hemoglobina A1c revela la concentración de glucosa en sangre durante un período de varias semanas, por lo que su determinación puede ser muy útil para comprobar si los pacientes diabéticos han sido tratados adecuadamente.

62

E. Lípidos

Al finalizar esta subunidad, el alumno explicará las características principales de los lípidos, sus estructuras, el papel que desempeñan en los seres vivos, así como su digestión y absorción. E.1 Estructura.

E.1.1 Definirá qué son los lípidos, cuál es su importancia biológica.

E.1.2 Conocerá las propiedades fisicoquímicas de los lípidos: solubilidad, naturaleza química, apolaridad.

E.1.2 Reconocerá las fórmulas de los lípidos que emplea la célula: ácidos grasos, triacigliceroles, fosfoglicéridos y glicolípidos, terpenos y esteroides.

E.1.3 Clasificará a los lípidos con base en su composición, en su grado de complejidad y en su grado de polaridad.

E.1.4 Identificará a los lípidos como los componentes principales de las membranas celulares y relacionará el contenido y las características químicas de los lípidos con la impermeabilidad y fluidez de la membrana.

E.1.5 Mencionará las diferencias en cuanto a la asimetría y la composición de las membranas celulares (citoplasmática y mitocondrial).

E.2 Digestión, absorción y transporte.

E.2.1 Señalará la fuente dietética de los lípidos.

E.2.2 Conocerá el mecanismo por el cual el organismo realiza la digestión y absorción de los lípidos.

E.2.3 Conocerá el transporte de los lípidos de la dieta en el organismo (quilomicrones).

Los lípidos son sustancias biológicas solubles en solventes orgánicos, pero escasamente solubles en el agua. Pertenecen a este grupo moléculas tan diversas como las grasas, los aceites, algunas vitaminas y hormonas, así como todos los componentes no proteicos de las membranas. Los lípidos pueden clasificarse en dos grandes grupos: los saponificables y los no saponificables. Los primeros tienen la característica de que, en soluciones alcalinas, se hidrolizan produciendo ésteres de ácidos grasos, mientras que los segundos no son objeto de hidrólisis alcalina. A los lípidos saponificables pertenecen los acilgliceroles, los fosfoacilgliceroles, los esfin-golípidos y las ceras, mientras que en el grupo de los lípidos insaponificables encontramos los terpenos, los esteroides y las prostaglandinas, así como los compuestos relacionados con éstos. Asimismo, existen lípidos con un grupo extremo polar y otro grupo opuesto no polar. Este grupo se conoce como lípidos anfipáticos y son los responsables de estabilizar las emulsiones o forman parte de la bicapa lipídica de las membranas. Los ácidos grasos biológicamente importantes son ácidos monocarboxílicos con cadenas alifáticas de diverso tamaño, con un número par de átomos de carbono, que pueden ser saturados o insaturados. En el caso de los insaturados, los de origen natural son isómeros geométricos cis; pueden ser monoinsaturados o poliinsaturados y son líquidos a temperatura ambiente. Los ácidos grasos poliinsaturados no son sintetizados en el organismo por lo que se consideran esenciales. En soluciones fisiológicas se encuentran en forma ionizada formando sales o "jabones". Los ácidos grasos de cadena larga son insolubles en agua, pero los jabones forman micelas. Los ácidos grasos forman ésteres con alcoholes y tioésteres con la coenzima A. Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos son derivados de ácidos grasos poliinsaturados de 20 carbonos, especialmente del ácido araquidónico. Los acilgliceroles son compuestos en los que uno o más de los grupos hidroxilo del glicerol están esterificados. Pueden dividirse en monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles. En los triacilgliceroles los tres grupos hidroxilo están

63

esterificados con ácidos grasos, que pueden o no ser iguales. Las propiedades de los triacilgliceroles están determinadas por la naturaleza de sus ácidos grasos componentes y se dividen en aceites (líquidos) o grasas (sólidos) de acuerdo con la longitud de sus cadenas o con su grado de saturación. Los triacilgliceroles son hidrofóbicos y no forman micelas. Los fosfoacilgliceroles o fosfoglicéridos son derivados del ácido fosfatídico, es decir, del L-glicerolfosfato esterificado con dos ácidos grasos. El ácido fosfatídico se esterifica, a su vez, a través de su grupo fosfato, con un alcohol y forma las diversas familias de fosfoglicéridos, las cuales poseen un carácter anfipático. Los plasmalógenos son glicerofosfolípidos en los que la posición 1 del glicerol fosfato está combinado con un alcohol de cadena larga mediante una unión tipo éter. Los esfingolípidos son lípidos complejos derivados de un alcohol insaturado llamado esfingosina, el que se une con un ácido graso de cadena larga por medio de un enlace amida para formar una ceramida. Las esfingomielinas contienen una ceramida esterificada con fosforilcolina o fosforiletanolamina. Cuando la ceramida se combina con un azúcar forma los glucoesfingolípidos, que pueden subdividirse en cerebrósidos (si sólo contienen una unidad de azúcar), sulfátidos (contienen un sulfato esterificado en la unidad de azúcar) y gangliósidos (contienen oligosacáridos con uno o más ácidos N-acetilneuramínicos). Los esteroides son derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno. El núcleo esteroide es una estructura rígida, casi plana, no polar. Los esteroides más importantes son el colesterol y sus derivados (los ácidos biliares, las hormonas esteroidales –estrógenos, progestágenos, glucocorticoides, mineralcorticoides y andrógenos– y la vitamina D que, aunque no es propiamente un esteroide, deriva del colesterol). Los terpenos son polímeros de dos o más unidades de isopreno, que pueden ser lineales o cíclicos, con dobles enlaces trans en su mayoría. Las vitaminas A y K, así como el escualeno, pertenecen a este grupo. En la dieta, la grasa constituye cerca de 60 g, de los cuales 90% son triacilgliceroles. Es de todos

conocida la dificultad para digerir la grasa, que en mucho está determinada por su casi nula solubilidad en agua. Esto ocasiona que se aglomere la grasa y que forme vacuolas, lo que impide que sea atacada fácilmente por las enzimas digestivas. Para facilitar su hidrólisis, durante el proceso digestivo que se inicia en la boca la lipasa lingual hidroliza algunos triacilglicéridos y produce ácidos grasos libres y monoacilglicéridos que, junto con otros ácidos grasos libres, posibilitan que las vacuolas de grasa se hagan más pequeñas y formen gotitas. Tanto los monoacilglicéridos como los fosfolípidos funcionan como factores tensoactivos. La acción de esta lipasa lingual es muy breve ya que, al llegar al estómago, es inhibida por el pH ácido y es hasta llegar al duodeno donde se continúa el proceso de digestión. Puede considerarse que la dificultad de la digestión de los lípidos se supera si se aumenta el área entre la fase acuosa y la lipídica y se logra un aumento en la solubilización de los productos de hidrólisis con detergentes (sales biliares). El aumento del área y la solubilización suceden cuando en el duodeno, por efecto de la colecistocinina, que es una hormona secretada por la llegada de los lípidos al duodeno, se estimula la contracción de la vesícula biliar con la consecutiva salida de sales biliares y otros lípidos, que forman agregados que reciben el nombre de micelas mixtas; éstas son diferentes a las gotitas emulsionadas. La acción de las sales biliares es romper la tensión superficial de la gotita de grasa favoreciendo la interacción con el agua y su fragmentación; así se origina la micela. Este proceso también recibe el nombre de emulsificación. Al mismo tiempo, la lipasa pancreática, que es secretada como proenzima, hidroliza, al igual que la lingual, la unión alfa éster de los triacilglicéridos y deja libres dos ácidos grasos y un monoacilglicérido que también serán emulsificados por las sales biliares. Además de la lipasa, el jugo pancreático contiene otras esterasas que actúan sobre los ésteres de colesterol, monoacilglicéridos y los ésteres de vitamina A. Los fosfolípidos son hidrolizados por fosfolipasas específicas, pero la más abundante en el jugo pancreático es la fosfolipasa A2 que hidroliza la unión éster beta del ácido graso. La presencia de sales biliares es necesaria para la

64

absorción de otros lípidos, como el colesterol y las vitaminas A y K. Se ha calculado que una persona sana absorbe cerca de 70 a 90% de los lípidos, tanto exógenos como endógenos; otro de los productos derivados de la hidrólisis de los acilglicéridos, el glicerol, se absorbe por difusión facilitada. Las sales biliares son absorbidas en forma muy eficaz por el intestino y son llevadas por la vena porta nuevamente al hígado, de ahí a la bilis y una vez más al intestino; a esta circulación de las sales biliares se le llama circulación enterohepática. En la célula intestinal los lípidos son resintetizados formando triacilglicéridos por efecto de una enzima que activa a los ácidos grasos y los une a los monoacilglicéridos; también se forman fosfolípidos y ésteres de colesterol. La absorción de los lípidos y la actividad del retículo endoplásmico liso de la célula intestinal dan como resultado la formación de vesículas que se enriquecen con proteínas (apoproteínas), lo que genera los quilomicrones, partículas ricas en triacilglicéridos.

F. Metabolismo de los lípidos

Al finalizar esta subunidad, el alumno podrá definir en forma integral el metabolismo de los lípidos en relación con su función como combustibles. Analizará la regulación del metabolismo de los lípidos en algunos estados fisiológicos. F.1 Oxidación de los ácidos grasos (ß-oxidación).

F.1.1 Describirá la reacción de activación de los ácidos grasos en el citoplasma y el mecanismo de transporte al interior de la mitocondria.

F.1.2 Describirá las reacciones de la ß-oxidación e identificará sus sustratos y productos.

F.1.3 Conocerá las reacciones adicionales necesarias para la oxidación de los ácidos grasos insaturados y de cadena impar.

F.1.4 Calculará el número de moléculas de ATP generadas en la oxidación completa del ácido palmítico y

señalará los tejidos que dependen energéticamente de esta vía.

Los ácidos grasos almacenados en los tejidos son utilizados por la célula para la producción de energía en magnitudes que varían de tejido a tejido, así como del nivel metabólico del organismo. Son los músculos, principalmente el cardiaco y el esquelético, los que más dependen de los ácidos grasos como fuente de energía. La mayoría de los ácidos grasos que se oxidan en los tejidos provienen de los triacilglicéridos del tejido adiposo, desde donde son liberados por la acción de la enzima lipasa sensible a hormonas y transportados en la circulación como complejos albúmina-ácidos grasos. Al llegar al hígado y a las células de otros tejidos, el ácido graso es activado en el citosol mediante la acción de la acil coenzima A sintetasa (tiocinasa) con gasto de ATP, en esta reacción se produce un acil coenzima A (acil CoA) y AMP. El proceso de oxidación del ácido graso se realiza dentro de la mitocondria; sin embargo, su membrana es impermeable a los ácidos grasos y derivados del acil CoA, por lo que se requiere de un transportador: la molécula de carnitina es la encargada de llevar al ácido graso al interior de la mitocondria. Una vez dentro de la mitocondria, el acil CoA sufre una serie de cambios que permiten obtener un fragmento de dos carbonos, la acetil CoA. Los cambios preparan al acilo para quedar nuevamente activado y éstos son realizados por: a) Una deshidrogenasa que requiere de FAD y transforma al grupo acilo en uno enoilo (molécula con un doble enlace entre el carbono alfa y beta); b) Una hidratasa que elimina la doble ligadura y deja un hidroxilo en el carbono beta. Esta molécula se llama β-hidroxiacil-CoA; c) Otra deshidrogenasa específica, cuya coenzima es el NAD+, transforma el grupo hidroxilo de la posición beta en un grupo ceto; d) Una tiolasa que requiere de una coenzima A (HSCoA) para unirla al carbono que tiene la nueva función cetona y romper entre el carbono beta y alfa para producir una molécula de acetil-CoA. Estas cuatro enzimas siguen trabajando con el acil CoA que en cada vuelta pierde dos carbonos como acetil CoA. Al mismo tiempo, el FADH2 y el NADH obtenido en cada

65

ciclo de la oxidación generan 4 ATP en la cadena respiratoria y las acetil CoA entran al ciclo de Krebs para ser totalmente oxidadas con la ganancia de 10 ATP netos por cada acetil CoA que entra al ciclo. Así tenemos que, por ejemplo, un palmitato (16C) genera 108 ATP al oxidarse hasta CO2 y H2O. Si consideramos el gasto de la fase de activación del ácido graso, obtenemos una ganancia neta de 106 ATP. F.2 Síntesis y utilización de los cuerpos cetónicos.

F.2.1 Describirá la estructura de los cuerpos cetónicos: acetoacetato, ß-hidroxibutirato y acetona.

F.2.2 Conocerá las vías de síntesis y de utilización de los cuerpos cetónicos e indicará sus sustratos y sus productos.

F.2.3 Señalará los tejidos involucrados en la síntesis y utilización de los cuerpos cetónicos.

F.2.4 Analizará la importancia fisiológica de los cuerpos cetónicos en el ayuno, la diabetes y dietas deficientes en carbohidratos.

Cuando bajan los niveles de glucosa se estimula la gluconeogénesis a partir del oxaloacetato y se incrementa la vía de oxidación de los ácidos grasos, lo que provoca el aumento concomitante de los niveles de acetil CoA. En el hígado, el exceso de acetil CoA se transforma en un grupo de moléculas conocidas genéricamente como cuerpos cetónicos. La vía de síntesis de los cuerpos cetónicos (cetogénesis) se inicia con la condensación de dos moléculas de acetil coenzima A; al producto de la reacción, acetoacetil CoA, se le une una tercera molécula de acetil CoA para formar el ß-hidroxi-ß-metil glutaril CoA. Esta molécula, al romperse por una liasa (HMGCoA liasa), produce una acetil CoA y un ácido acetoacético o acetoacetato. Este producto se reduce con NAD+ y forma el ß-hidroxi-butirato; el acetoacetato, por una descarboxilación no enzimática, produce la acetona.

El acetoacetato es utilizado por otros órganos, como el músculo cardiaco y el cerebro, donde, por acción de una transferasa en presencia de succinil coenzima A, se transforma en acetoacetil-CoA, molécula que se rompe por una tiólisis, en presencia de otra CoA para formar dos acetil CoA; la enzima responsable de esta reacción es una tiolasa. Las dos acetil CoA resultantes son oxidadas para la obtención de energía en los órganos mencionados. Al incremento de acetoacetato en la sangre se le llama cetonemia. Puede deberse a una deficiencia en el metabolismo de los carbohidratos con el consiguiente aumento en el catabolismo de las grasas y la desviación de la acetil CoA a la síntesis de cuerpos cetónicos. Algunos ejemplos de situaciones en las que ocurre lo anterior son: la diabetes, el ayuno prolongado y la dieta deficiente en carbohidratos. F.3 Síntesis de ácidos grasos.

F.3.1 Indicará las fuentes de los alimentadores de la ß-reducción: acetil CoA y NADPH. Mencionará el papel del citrato y de las lanzaderas (malato-aspartato y citrato) como transportadores del acetil-CoA mitocondrial.

F.3.2 Describirá la síntesis de novo de un ácido graso e indicará las enzimas involucradas, sustratos, coenzimas y productos.

F.3.3 Describirá las reacciones necesarias para el alargamiento e insaturación de los ácidos grasos, así como la localización subcelular de los sistemas involucrados en este proceso.

F.3.4 Señalará la fuente de los carbonos del ácido palmítico y calculará el gasto energético de la síntesis de dicho ácido.

F.3.5 Conocerá la función de los ácidos grasos poliinsaturados como precursores de prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos y lipoximas e indicará la función de

66

estos eicosanoides en el organismo humano.

Cuando el requerimiento de energía en la célula ha sido satisfecho y existen suficientes sustratos oxidables, procede su almacenamiento bajo la forma de triacilglicéridos que constituyen la reserva de energía a largo plazo más importante de las células y del organismo. El primer paso de este proceso es la biosíntesis de los ácidos grasos, la cual se realiza en el citoplasma celular a partir de la acetil CoA, el ATP y el NADPH proveniente del ciclo de las pentosas y de otros sistemas generadores de poder reductor. La biosíntesis de los ácidos grasos se inicia con la salida de la acetil-CoA desde la mitocondria en forma de citrato y su transformación en malonil CoA mediante la fijación del CO2 por una sintetasa dependiente de biotina, que utiliza ATP. Tanto la acetil CoA como la malonil-CoA se unen a un complejo multienzimático llamado sintetasa de los ácidos grasos. Este complejo está formado por un conjunto de proteínas enzimáticas dispuestas alrededor de la proteína transportadora de acilos (PTA). En pasos sucesivos ocurre la condensación de la acetil y la malonil CoA con desprendimiento de CO2 y el resto del acetoacetilo de cuatro carbonos es llevado por el brazo central de la PTA a los sitios activos de las enzimas del complejo para transformarlo, sucesivamente, en hidroxiacilo, enoilo y acilo saturado, mediante el gasto de dos NADPH. El ciclo se repite al incorporar dos carbonos del malonil-CoA en cada vuelta, hasta que se completa el ácido palmítico, un ácido graso saturado de 16 C. El citrato desempeña un papel muy importante en la síntesis de los ácidos grasos ya que al salir al citoplasma se convierte en acetil CoA y oxaloacetato. Este proceso alimenta con carbonos a la síntesis de los ácidos grasos y aporta NADPH por la acción de la enzima málica sobre el sistema oxaloacetato-malato-piruvato. Por otra parte, el citrato es un modulador positivo de la malonil CoA sintetasa (también llamada acetil CoA carboxilasa), que es la principal enzima reguladora de la síntesis de los ácidos grasos. F.4 Síntesis y degradación de triacilgliceroles.

F.4.1 Conocerá la estructura química y la distribución tisular de los triacilglicéridos en función de su carácter de combustible con importancia fisiológica.

F.4.2 Describirá la vía de degradación de los tri-acilglicéridos (lipólisis) e identificará sus enzimas, sustratos, productos y función en el organismo.

F.4.3 Señalará las fuentes de sustratos para la síntesis de triacilglicéridos: acil CoA y glicerol fosfato.

F.4.4 Describirá la síntesis de los triacilglicéridos (lipogénesis) e identificará sus intermediarios y enzimas.

F.4.5 Explicará tanto la regulación hormonal como la metabólica de la lipólisis y de la lipogénesis e indicará el papel de la concentración de sustratos y productos de las vías, así como el estado energético celular.

Una vez formados los ácidos grasos procede la lipogénesis o síntesis de los triacilglicéridos: dos ácidos grasos activados como acil CoA reaccionan con una molécula del glicerol fosfato para formar el ácido fosfatídico. Esta última molécula es precursora de los triacilglicéridos y de los fosfolípidos. Para sintetizar los primeros se hidroliza el fosfato, con producción del diacilglicerol, el cual recibe enseguida otra molécula de acil CoA, con la cual se completa el triacilglicérido. La mayoría de las enzimas participantes en este proceso son aciltransferasas y tiocinasas. En el organismo humano la acción de la insulina estimula todo el proceso de la lipogénesis al favorecer la entrada de la glucosa a los adipocitos, el ciclo de las pentosas, la descarboxilación del piruvato, la biosíntesis de los ácidos grasos y la acumulación de los triacilglicéridos. La hidrólisis de los triacilglicéridos en el tejido adiposo, llamada también lipólisis, es estimulada a nivel de la triacilglicérido lipasa en una acción mediada a través de AMP cíclico, por numerosas hormonas entre las cuales se cuentan: la epinefrina, el glucagón, los glucocorticoides, la tiroxina y el

67

ACTH; mientras que es inhibida por la insulina y por el incremento de la concentración de ácidos grasos libres. La hidrólisis se completa por la acción de la diacilglicérido lipasa y la monoacilglicérido lipasa que en conjunto liberan un glicerol y tres ácidos grasos de cada triacilglicérido. F.5 Síntesis y degradación de fosfolípidos.

F.5.1 Describirá la síntesis de novo de los fosfoglicéridos y de los esfingolípidos, indicando los sustratos, intermediarios, enzimas y productos de las vías.

F.5.2 Describirá la degradación de los fosfoglicéridos y de los esfingolípidos.

La síntesis de los fosfoglicéridos es similar en los pasos iniciales a la síntesis de los TAG: el glicerol 3-fosfato se esterifica con dos acil CoA para formar ácido fosfatídico. Este compuesto es el precursor de todos los fosfoglicéridos. Existen dos estrategias para la obtención de los fosfolípidos que contienen glicerol, según la naturaleza de la cabeza polar. En la formación de fosfatidilinositoles y de cardiolipina, el ácido fosfatídico reacciona con CTP para formar CDP-diacilglicerol, el cuál reacciona con la cabeza polar (inositol o fosfatidilglicerol) para formar el fosfoglicérido correspondiente. El fosfatidilinositol puede ser fosforilado para formar la familia de los fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato. Estos compuestos son hidrolizados por la fosfolipasa C en respuesta al estímulo de algunas hormonas y producen dos segundos mensajeros muy potentes: IP3 y el diacilglicerol, los cuales causan movilización de Ca2+ del retículo endoplásmico y proveen de ácido araquidónico para la síntesis de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. En la síntesis de fosfadiletanolamina y de fosfatidilcolina, el ácido fosfatídico pierde su fosfato y el diacilglicerol resultante reacciona con CDP-colina o CDP-etanolamina. La fosfatidiletanolamina también puede obtenerse por descarboxilación de fosfatidilserina y la fosfatidilcolina por metilación de fosfatidiletanolamina, utilizando S-adenosil metionina como donador de metilos. La fosfatidilserina se obtiene por recambio

de la cabeza polar de la fosfatidiletanolamina por una serina. Las fosfatidilcolinas proporcionan ácidos grasos para la síntesis de los ésteres de colesterol de las HDL por la reacción de LCAT, mientras que la dipalmitoilfosfa-tidilcolina es el principal componente del surfactante pulmonar. Degradación de fosfoglicéridos. Los fosfoglicéridos son hidrolizados por diversos tipos de fosfolipasas que se clasifican según su sitio de acción: la fosfolipasa A1 libera los ácidos grasos de la posición de 1; la fosfolipasa A2 los libera de la posición 2. La fosfolipasa C libera la cabeza polar fosforilada que se encuentra en la posición 3 del glicerol, mientras que, la fosfolipasa D libera la cabeza polar. Síntesis de esfingolípidos Los esfingolípidos contienen una molécula de esfingosina en lugar del glicerol. Sus precursores son serina y palmitoil CoA. Los ácidos grasos activados (acil CoA) reaccionan con el grupo amino de la esfingosina para formar las ceramidas, quienes son las precursoras de esfingomielinas, cerebrósidos y gangliósidos. Las esfingomielinas se obtienen de la reacción de la ceramida con CDP-colina. Los cerebrósidos se obtienen por la unión directa de galactosa o glucosa a la ceramida. El donador del azúcar es UDP-galactosa o UDP-glucosa. Los gangliósidos se forman por la adición secuencial y ordenada de residuos de azúcar a la ceramida. Los donadores de estos azúcares son UDP-azúcares o el CMP-NeuAc (ácido N-acetilneuramínico o ácido siálico). Los esfingolípidos son degradados por enzimas lisosomales (hexosaminidasas, α-galactosidasa, la sialidasa o la esfingomielinasa) hasta dar ceramidas y los azúcares correspondientes. Existen una serie de defectos genéticos en los que faltan estas enzimas lo que conduce a una acumulación de gangliósidos que causan graves consecuencias a la salud. F.6 Metabolismo del colesterol.

68

F.6.1 Mencionará la importancia fisiológica del colesterol.

F.6.2 Describirá la vía de síntesis del colesterol e identificará sus sustratos, intermediarios y enzimas.

F.6.3 Conocerá la regulación de la colesterogénesis a nivel enzimático, a nivel de la síntesis de las enzimas, así como por modificación covalente inducida por hormonas (glucagon, insulina y ACTH).

F.6.4 Describirá las modificaciones que sufre el colesterol para la síntesis de sales biliares, hormonas esteroidales y vitamina D.

El colesterol es una molécula muy importante por su interés clínico y el gran número de compuestos que a partir de él se sintetizan, como las hormonas esteroidales, las sales biliares y la vitamina D. La síntesis del colesterol (colesterogénesis) es una vía citoplásmica que se inicia a partir de la unión de tres moléculas de acetil CoA, las que forman el ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA, precursor del mevalonato. La enzima que produce este último compuesto en la colesterogénesis es la ß-hidroxi-ß-metil glutaril-CoA reductasa, dependiente de NADPH. Después de tres fosforilaciones para activar la molécula, el mevalonato se descarboxila para formar el isopentenil pirofosfato, unidad isoprenoide de todos los terpenos. El isopentenil pirofosfato se une con uno de sus isómeros para formar el geranil pirofosfato, de 10 átomos de carbono que, por combinación con otra molécula de isopentenil pirofosfato, forma el farnesil pirofosfato, de 15 carbonos. Dos moléculas de farnesil pirofosfato se unen por un enlace especial (cabeza-cabeza) para formar el escualeno, de 30 carbonos. El escualeno se cicliza y, por cambios sucesivos de oxidación, descarboxilación y reacomodo de electrones y grupos químicos, forma el lanosterol, el zimosterol y finalmente el colesterol. La vía de la colesterogénesis se regula principalmente por colesterol endógeno o el que se obtiene a partir de la dieta a nivel de la enzima ß-hidroxi-ß-metilglutaril-CoA reductasa.

El colesterol puede seguir diversos caminos: a) Migra a la membrana, donde regula la fluidez de la misma; b) Se transforma químicamente para producir ácidos biliares por oxidación de su cadena lateral; c) Pierde una cadena de seis átomos de carbono para producir la pregnenolona, el precursor de todas las hormonas esteroidales, sean progestágenos (como la progesterona), mineralcorticoides (como la aldosterona), glucocorticoides (como el cortisol), andrógenos (testosterona) y estrógenos (estrona y estradiol); d) El colesterol también es precursor de la vitamina D, que se obtiene por la ruptura del anillo B. El colesterol se excreta principalmente como sales biliares, aunque una parte puede eliminarse en las heces como coprostanol, producto de la degradación bacteriana del colesterol en el intestino grueso. F.7 Estructura y metabolismo de las

lipoproteínas. F.7.1 Describirá los mecanismos de

transporte de los ácidos grasos provenientes de la lipólisis y el de los otros lípidos (TAG, ésteres de colesterol y fosfolípidos) en el organismo.

F.7.2 Conocerá la composición y la función de las lipoproteínas (quilomicrones, LDL, VLDL, HDL y Lp[a]).

F.7.3 Describirá el metabolismo de las diferentes lipoproteínas.

Los lípidos son compuestos prácticamente insolubles en agua que se transportan en el torrente circulatorio mediante las lipoproteínas. Las lipoproteínas son partículas globulares de alto peso molecular con un núcleo formado por lípidos hidrofóbicos –TAG y ésteres de colesterol–, los cuales aportan la mayor parte de la masa de la partícula, y por una sola capa superficial de moléculas de fosfolípidos, colesterol y proteínas o polipéptidos que rodean al núcleo y estabilizan la partícula para que permanezca en solución dentro del plasma. La fracción proteica de las lipoproteínas se conoce como apolipoproteína o apoproteína, de las que se han aislado y caracterizado seis clases

69

principales: A, B, C, D, E y (a). Algunas de éstas son integrales y no pueden ser removidas, en tanto que otras pueden ser transferidas a otras lipoproteínas. Las lipoproteínas principales que circulan en el plasma humano se clasifican con base en su densidad en quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD o –según la sigla inglesa– VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LBD o LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (LAD o HDL). La densidad de las lipoproteínas refleja la relación existente entre la cantidad de lípidos y de proteínas. Los quilomicrones transportan los lípidos de la dieta desde el enterocito al tejido adiposo, la glándula mamaria, el músculo y el hígado. Los lípidos endógenos, principalmente los triacilglicéridos y el colesterol se transportan desde el hígado a los tejidos mediante las lipoproteínas VLDL. Las apoproteínas características de las VLDL son la apo B-100, apo-C y apo-E, de las cuales las dos últimas son compartidas con los quilomicrones, los que tienen además la apo-B48 y la apo-A. Tanto los quilomicrones como las VLDL son llevados hasta los capilares de los tejidos en donde su apo-CII activa a la lipoproteína lipasa, quien hidroliza la mayor parte de los triacilgliceroles de estas lipoproteínas hasta glicerol y ácidos grasos, los que son tomados por los tejidos para ser oxidados o almacenados en el tejido adiposo. Los restos de VLDL, que han perdido la mayor parte de sus triacilgliceroles y algunas apoproteínas y fosfolípidos, se convierten en LDL. Las LDL contienen apo B-100 y transportan colesterol a los tejidos. Las lipoproteínas más pequeñas son las HDL; éstas son ricas en fosfolípidos y proteínas y dentro de sus funciones se cuenta el intercambio de apoproteínas A, C y E con las demás lipoproteínas y el transporte del colesterol extrahepático al hígado (transporte inverso del colesterol). El colesterol es transportado en la sangre por tres diferentes lipoproteínas: las LDL (60 a 75%), las HDL (15 a 35%) y las VLDL (10%). Las LDL y las HDL tienen una función combinada en la conservación del equilibrio del colesterol; las LDL llevan el colesterol hacia las células y regulan la síntesis de novo del colesterol en ellas; las HDL lo

eliminan de las células, es decir, captan el colesterol liberado en el plasma procedente del recambio de membranas y de células que mueren y lo llevan al hígado para su metabolismo o excreción. Además de las clases ya mencionadas de lipoproteínas existe la lipoproteína (a) [Lp(a)], la cual tiene una composición lipídica muy similar a la LDL, contiene apoB-100 y una glucoproteína llamada apo(a). La apo(a) es polimórfica (de longitud y secuencia) y tiene una gran homología con el plasminógeno. Esta homología es importante porque la Lp(a) se asocia con el bloqueo de la activación del plasminógeno y la consiguiente lisis de los coágulos de fibrina, así como con la estimulación de la proliferación de células musculares lisas, procesos que pueden estar en el origen de lesiones ateroscleróticas. Además, la apo(a) dificulta el catabolismo mediado por el receptor de LDL al que se fija e interfiere, de esta manera, con el metabolismo y transporte del colesterol. La concentración de Lp(a) en sujetos normales es de ~5 mg/dl; las cifras >30 mg/dl constituyen otro valor de predicción de un alto riesgo de aterosclerosis y trombosis. F.8 Regulación y alteraciones del metabolismo

de lípidos. F.8.1 Describirá el estado del metabolismo

lipídico y sus alteraciones en el estrés, obesidad, dislipoprotei-nemias, hígado graso e hipercolesterolemias, quienes son factores de riesgo de aterosclerosis.

F.8.2 Identificará el papel de la leptina en la regulación del peso corporal y del apetito.

Discusión de los casos clínicos 4 “Cetosis por inanición. Obesidad” y 5 “Hipercolesterolemia y aterosclerosis” ver pág. (178 y 179). Lecturas recomendadas 1. Libby P. Atherosclerosis the new view.

Scientific American. 2002; 286( 5): 28-37. 2. NIH (National Institutes of Health) consensus

conference. Triglyceride, HDL, and coronary heart disease. JAMA. 1993; 269 (4): 505-510.

70

3. Alba ZayasL, Pereira RG, Aguilar BA. Lipoproteína (a): estructura, metabolismo, genética y mecanismos patogénicos. Rev Cub Invest Biomed. 2003; 22(1): 32-40.

4. Martínez AE, González MO. La leptina, una hormona novedosa. Investigadores Médicos. 2003; IV (5):1097-1103.

5. Sabath EFS. Leptina. Rev Inv Clín. 2002; 54 (2): 161-165.

6. Villaseñor A. El papel de la leptina en el desarrollo de la obesidad. Rev Endocrin Nutr. 2002; 10 (3):135-139.

Los lípidos son compuestos que se han relacionado con varias patologías. La regulación del metabolismo lipídico se ejerce en respuesta a las diferentes necesidades energéticas y los estados de la dieta de un organismo (ayuno-alimentación). La síntesis y la degradación de los TAG y del colesterol son procesos que afectan a todo el organismo, con sus órganos y tejidos formando una red interdependiente conectada por la corriente sanguínea. La sangre transporta los TAG en forma de quilomicrones y VLDL, los ácidos grasos en forma de complejos con albúmina y el colesterol asociado a VLDL, LDL y HDL. Las células pancreáticas perciben los estados de la dieta del organismo y responden liberando hormonas (insulina o glucagon) que regulan la velocidad de las rutas opuestas del metabolismo de lípidos y controlan si se han de degradar o sintetizar los ácidos grasos, los TAG, los fosfolípidos o el colesterol. La regulación metabólica se puede ejercer a corto plazo (disponibilidad de sustratos, interacciones alostéricas y modificaciones covalentes) o a largo plazo (control de la síntesis y degradación de las enzimas). Otro nivel de regulación se relaciona con el transporte de los lípidos de un tejido a otro. Los lípidos más abundantes del organismo son los TAG almacenados en el tejido adiposo, los cuales se hidrolizan por la acción de una lipasa sensible a hormonas como el glucagon, la epinefrina y los glucocorticoides, obteniendo glicerol y ácidos grasos que salen a la circulación. Estos últimos se asocian a albúmina y se transportan al hígado, corazón y músculo para ser oxidados hasta CO2 y

H2O, con la producción consecuente de ATP. Las condiciones fisiológicas y metabólicas que determinan la movilización de grasas del tejido adiposo pueden ser alteradas por situaciones de estrés (dolor, fiebre, infecciones, miedo, hemorragia, hipoglucemia) en las que se estimula la adenohipófisis, que secreta ACTH, induciendo la secreción de glucocorticoides. La ACTH y los glucocorticoides aceleran la hidrólisis de los TAG. La concentración de los TAG almacenados en los adipocitos depende de la velocidad de su recambio (síntesis e hidrólisis). Cuando el almacenamiento de energía en forma de TAG en el tejido adiposo es excesivo, se establece una condición llamada obesidad, la cual correlaciona con un promedio de vida menor y con un aumento en problemas de salud, principalmente de tipo cardiovascular. Muchos factores conducen a ella, pero la causa básica es una ingesta calórica por encima de los requerimientos energéticos estándar. El apetito se regula por la presencia de compuestos antianoréxicos. La síntesis de estos compuestos se ve afectada por la presencia de una proteína pequeña que se libera por las células adiposas: la leptina. La ausencia de esta proteína o de su receptor en las células del hipotálamo implicadas en la regulación del apetito se asocia con la aparición de obesidad en ratones. Su papel está actualmente en estudio en humanos. Existen otras alteraciones de los lípidos asociadas al metabolismo de las lipoproteínas. Estas alteraciones se conocen en general como dislipoproteinemias, en las que hay modificaciones de los niveles de colesterol y/o TAG en sangre. En las hipercolesterolemias familiares, los receptores celulares para lipoproteínas de baja densidad (LDL) son deficientes. Por lo tanto las LDL no pueden ser captadas por las células y degradadas por las enzimas lisosomales. El consecuente incremento de LDL en sangre se asocia con xantomas (depósitos de lípidos, frecuentemente encontrados bajo la piel) y enfermedades de arterias coronarias. En las hipertriacilgliceridemias se encuentran bajos niveles de lipoproteína lipasa (LPL) o apo CII (el activador de LPL) y TAG aumentados. Estas deficiencias se asocian con xantomas característicos e intolerancia a comidas ricas en

71

grasas. El tratamiento involucra dietas bajas en ácidos grasos saturados y colesterol y el uso de agentes hipolipemiantes como las resinas secuestradoras de ácidos biliares, la niacina y los inhibidores de la 3-hidroxi-3 metilglutaril- CoA (HMG-CoA) reductasa. En condiciones de estrés metabólico, la capacidad para secretar VLDL no es suficiente para la síntesis aumentada de TAG. Esto ocasiona que el depósito de AG y TAG en el tejido hepático se vuelva excesivo estableciéndose una condición tóxica llamada hígado graso. Sin embargo, el hígado graso ocurre especialmente en condiciones tóxicas graves, cuando la síntesis de las apolipoproteínas, requeridas para la formación de VLDL, es inferior a la disponibilidad de ácidos grasos, ocasionando su acumulación. Esta situación se observa frecuentemente en las personas que ingieren constantemente grandes cantidades de etanol y una dieta hipoproteica. La oxidación del etanol proporciona la energía necesaria para mantener las funciones celulares, pero también favorece la síntesis de ácidos grasos debido a un aumento en la disponibilidad de NADH y al aumento en la actividad de la fosfatidato fosfohidrolasa. Finalmente la obesidad, sobre todo el patrón masculino de depósito centrípeto o visceral de la grasa, favorece una dislipidemia aterogénica que se caracteriza por el aumento de los TAG plasmáticos, la disminución de HDL y la intolerancia a la glucosa. La aterosclerosis involucra la formación de placas ricas en lípidos en la íntima de las arterias. Las placas empiezan como rayas grasas conteniendo células espumosas, las cuales son inicialmente macrófagos llenos de lípidos, particularmente ésteres de colesterol. Estas lesiones primarias desarrollan placas fibrosas que pueden ocluir la arteria y causar un infarto cerebral o al miocardio. La formación de estas placas está frecuentemente asociada como se mencionó anteriormente, con anormalidades en el metabolismo de lipoproteínas plasmáticas. En contraste con estas lipoproteínas, las lipoproteínas de alta densidad (HDL) tienen un efecto protector. Como parte de la estrategia general para limitar la aterosclerosis hay que controlar la hipertensión, si fuera necesario con farmacoterapia. La mayoría de los enfermos con diabetes mellitus fallece a

consecuencia de aterosclerosis o sus complicaciones. El control riguroso de la glucemia en estos enfermos disminuye las complicaciones microvasculares de la diabetes, por lo que se recomienda prestar atención al control de la glucemia. La leptina es una hormona de naturaleza proteica constituida por 167 aminoácidos que circula en el plasma sanguíneo y regula el peso corporal y los depósitos de grasa, a través de sus efectos en el metabolismo y el apetito. En general, induce una disminución en el apetito y un incremento en el gasto energético. La leptina es producida y liberada por el tejido adiposo blanco fundamentalmente como una señal de saciedad, aunque se ha visto también que se produce en tejido adiposo marrón, en la placenta y en algunos tejidos fetales, como el corazón, hueso y cartílago. La síntesis y la secreción de leptina están directamente relacionadas con la cantidad de grasa corporal y el tamaño del adipocito. Aunque factores como la edad, el sexo, el índice de masa corporal, la actividad física, el fumar, la hipertensión, el colesterol en HDL, la concentración plasmática en ayuno de triacilgliceroles, de glucosa y de insulina también afectan la secreción de leptina. Así por ejemplo, la concentración de la hormona es hasta cuatro veces mayor en mujeres que en hombres. El fumar puede traer cambios en el peso corporal, al modificar la sensibilidad de los receptores del hipotálamo a la leptina y en consecuencia modular la síntesis de hormona, reduciendo el peso corporal. El hipotálamo es el sitio de mayor acción de leptina. La acción más importante de la leptina en este órgano es la disminución en la producción del neuropéptido Y (NPY). Las implicaciones de estos cambios son las siguientes:

Incremento en el NPY

(disminución de leptina)

Incremento en la leptina

(diminución en el NPY)

Se presenta hiperfagia.

Aumento en la secreción de

insulina mayor respuesta a la

insulina en tejido adiposo.

Aumento de peso.

Hipofagia.

Incremento en el gasto

energético.

Pérdida de peso.

72

En general podemos decir que la concentración de la leptina aumenta después de la ingesta de alimento y disminuye durante el ayuno y la diabetes. La insulina y los glucocorticoides aumentan la síntesis de esta hormona, mientras que las catecolaminas, los andrógenos y los ácidos grasos de cadena larga la inhiben.

G. Metabolismo de los compuestos nitrogenados

Al finalizar esta subunidad, el alumno describirá los procesos más importantes del metabolismo de los compuestos nitrogenados. G.1 Aminoácidos y proteínas.

G.1.1 Conocerá de manera general cómo se realiza en el organismo la digestión de las proteínas y la absorción de los aminoácidos.

G.1.2 Identificará las fuentes nutricionales de los aminoácidos.

G.1.3 Describirá las reacciones de transaminación y desaminación e identificará la localización subcelular, sustratos, enzimas y productos de la actividad de estas enzimas.

G.1.4 Identificará el papel de la glutamina y del ácido glutámico en el metabolismo de los compuestos nitrogenados. Describirá el papel de la glutamino sintetasa, de la glutamato deshidrogenasa, de las transaminasas y de la glutaminasa en el metabolismo de los compuestos nitrogenados.

G.1.5 Señalará las causas de la toxicidad del ión amonio y los mecanismos del organismo para combatirla.

G.1.6 Describirá el proceso de síntesis de la urea e indicará la localización subcelular, sustratos, enzimas y productos de la vía. Describirá la regulación de la síntesis de urea, así como los defectos en el metabolismo que producen alteraciones en este

proceso; señalará sus consecuencias fisiológicas.

G.1.7 Identificará a los aminoácidos precursores de α-cetoglutarato, piruvato, acetoacetato, fumarato y oxaloacetato.

G.1.8 Identificará a los aminoácidos precursores de las siguientes aminas: acetilcolina, catecolaminas, serotonina, carnitina, poliaminas y creatinina.

G.1.9 Conocerá las bases metabólicas de las siguientes alteraciones congénitas del metabolismo: acidemia propiónica, acidemia metilmalónica, hipervalinemia, fenilcetonuria y alcaptonuria.

Realización de la práctica 8 "El efecto del tetracloruro de carbono sobre las transaminasas” (ver pág. 155). Los aminoácidos son el sustrato más importante del metabolismo nitrogenado en los organismos superiores pues de ellos derivan proteínas, purinas, pirimidinas, porfirinas, péptidos y hormonas, entre otros compuestos y, además, sus esqueletos carbonados se oxidan para liberar energía. Todos los aminoácidos de los sistemas vivos se encuentran como parte de un “pool” o poza (reserva) metabólica cuya magnitud se mantiene constante mediante un equilibrio entre la entrada y la salida de aminoácidos. Desde la poza, los aminoácidos son llamados hacia sus diferentes destinos metabólicos: 1. Participar en el proceso de la nutrición por medio

de la síntesis de nuevas proteínas. 2. La síntesis de compuestos nitrogenados no

proteicos. 3. Su entrada a la gluconeogénesis para sintetizar

glucosa. 4. Su degradación oxidativa para la producción de

energía.

1. Nutrición. Los aminoácidos son oxidados constantemente en los animales y el nitrógeno excretado tiene que ser repuesto para mantener un

73

balance nitrogenado que, en los adultos normales, se encuentra en equilibrio; en los jóvenes, las embarazadas y los convalecientes es positivo y en los ancianos, los enfermos y los desnutridos el balance nitrogenado es negativo.

Los aminoácidos ingresan al organismo humano formando parte de las proteínas de la dieta que, por lo general, aportan alrededor de 10% de las kilocalorías diarias; sin embargo, el valor principal de los aminoácidos recibidos reside en el aporte de las estructuras moleculares que el organismo humano no puede sintetizar por sí mismo y que son los aminoácidos indispensables o esenciales cuya presencia determina en gran parte la calidad de la dieta; ellos son: ARGinina, LISina, METionina, HIStidina, TREonina, VALina, FENilalanina, LEUcina, IsoLEucina y TRIptofano (ALM-HTV-FLIT).

2. Compuestos nitrogenados. Los aminoácidos participan en la síntesis de numerosos compuestos nitrogenados que no son proteínas, por ejemplo, los oligopéptidos glutatión y carnosina; las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos; las hormonas derivadas de aminoácidos como la epinefrina, tiroxina y serotonina; las hormonas peptídicas como el glucagón, la ACTH y la oxitocina; los neurotransmisores como la dopamina y el aminobutirato gamma; los neuropéptidos como las endorfinas y los factores liberadores; las porfirinas como el grupo hemo; los pigmentos como la melanina; las aminas como la histamina y varios compuestos más.

3. Gluconeogénesis. Una porción considerable de la síntesis diaria de glucosa que se realiza en el hígado se hace a partir de los aminoácidos que reciben, por esto, el nombre de aminoácidos glucogénicos. Con la excepción de la leucina y la lisina, todos los aminoácidos tienen la capacidad de aportar todo o parte de su esqueleto carbonado para que se incorpore a la síntesis de la glucosa y esto se logra, en un primer paso, mediante la pérdida del grupo amino por transaminación, lo cual deja libre la cadena carbonada bajo la forma de un cetoácido.

Los cetoácidos mitocondriales resultantes: alfa-cetoglutarato, succinil-CoA, fumarato, oxaloacetato y piruvato confluyen hacia la formación del oxaloacetato citoplásmico que ingresa al eje central del metabolismo y se transforman en fosfoenol piruvato que alimenta la gluconeogénesis. Dos moléculas de este último siguen el reverso de la vía glucolítica hasta su transformación en glucosa.

4. Oxidación. Para la oxidación de su esqueleto carbonado los aminoácidos pierden primero al grupo amino, lo cual se lleva comúnmente a cabo mediante la transaminación acoplada a la desaminación oxidativa (transdesaminación), proceso reversible en el cual un aminoácido transamina primero con el alfa-cetoglutarato y le transfiere su grupo amino para formar glutamato y éste es desaminado enseguida por la glutamato deshidrogenasa con producción de NADH y liberación de amonio. El metabolismo del esqueleto de carbono se aparta entonces de la ruta seguida por el grupo amino ya que, para el primer caso, los carbonos pueden ser llevados hacia la oxidación en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, o bien, incorporarse a la gluconeogénesis en el hígado para la síntesis de glucosa; en tanto que el ion amonio será transportado hasta el hígado en donde será tomado por la vía metabólica del ciclo de la urea.

La oxidación del esqueleto carbonado de los aminoácidos procede mediante su agrupación en “familias” o grupos de aminoácidos que, al transformarse en el metabolismo, confluyen hacia alguno de los intermediarios de la glucólisis, la descarboxilación del piruvato o del ciclo de Krebs. Los glucogénicos son de la familia del: Piruvato:Tre, Gli, Ser, Ala, Met, Cis y Tri Alfa-cetoglutarato: Pro, His, Arg, Gln y Glu Succinil-CoA: Ile, Val, Met Fumarato: Tir, Fen, Asp Oxaloacetato: Asn, Asp Y los cetogénicos son de la familia del: Acetoacetato: Leu, Tir, Fen Acetoacetil-CoA: Tri, Lis Acetil-CoA: Tre, Leu, Ile

74

El ciclo de la urea El mecanismo de la transdesaminación permite el acopio de los grupos amino de los diferentes aminoácidos en la molécula del glutamato, la cual, al ser desaminada oxidativamente por la deshidrogenasa del glutamato, libera el ion amonio. Dado que este compuesto es muy tóxico para el sistema nervioso central, se elimina mediante la síntesis de urea. Esta síntesis se lleva a cabo en el hígado mediante un proceso metabólico denominado el ciclo de la urea, la primera parte del cual se realiza en la mitocondria y el resto en el citoplasma de la célula hepática. El ciclo de la urea (fig. III.2) que permite mantener una muy baja concentración de amonio libre, se inicia con la síntesis del carbamil fosfato a partir del amonio y el CO2 con un gasto de 2 enlaces de alta energía. El carbamil fosfato entrega el grupo carbamino a la molécula de ornitina, la cual actúa como portadora de grupos en las cuatro reacciones del ciclo: 1. Transferencia del carbamino a la ornitina para

formar citrulina: ornitina transcarbamilasa. 2. Condensación de la citrulina con el aspartato. Se

forma el arginino-succinato con gasto de 2ATP: arginino-succinato sintetasa.

3. Ruptura del arginino-succinato. Se desprende fumarato y se produce arginina: arginino-succinato liasa.

4. Hidrólisis de la arginina para regenerar a la ornitina y liberar urea: arginasa.

En resumen, para formar una molécula de urea se requiere de un ion amonio, un CO2 y un aspartato. Se produce una molécula de fumarato y una de urea, con gasto de cuatro enlaces de alta energía provenientes del ATP. G.2 Nucleótidos.

G.2.1 Conocerá las características

generales de las bases nitrogenadas, los nucleósidos y nucleótidos: estructura química y funciones.

G.2.2 Con base en un esquema general de la síntesis de las bases púricas y pirimídicas describirá sus mecanismos de regulación.

G.2.3 Identificará los sustratos y productos de las vías de ahorro en la síntesis de purinas.

G.2.4 Identificará las causas y consecuencias fisiológicas de la sobreproducción de ácido úrico.

G.2.5 Describirá el efecto del alopurinol sobre la xantina oxidasa y el que ejercen algunas drogas anticancerígenas, como la mercaptopurina, el 5-fluorouracilo, el metotrexato y la tioguanosina sobre la síntesis de purinas y pirimidinas.

Discusión del caso clínico 6 "Gota" (ver pág. 181). Los nucleótidos están formados por ribosa o desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser una purina o una pirimidina, y una, dos o tres moléculas de ácido fosfórico. Dependiendo del

75

número de grupos de fosfato presentes, los nucleótidos pueden ser mono, di, o trifosforilados. Ácido fosfórico—Ribosa—Base nitrogenada

Los nucleósidos se diferencian de los nucleótidos en que no tienen ácido fosfórico.

Ribosa — Base nitrogenada

Las bases nitrogenadas pueden ser purinas o pirimidinas. Las purinas están formadas por dos anillos heterocíclicos (formados por diferentes tipos de átomos), uno con seis miembros y otro con cinco miembros, y son la adenina y la guanina. Las pirimidinas están formadas por un anillo heterocíclico de seis miembros y las más importantes son: uracilo, timina y citosina. Los nucleótidos y nucleósidos púricos tienen funciones muy variadas en los seres vivos; entre las más importantes están la de servir como sustratos acarreadores de energía, segundos mensajeros, neurotransmisores, coenzimas, etcétera. Los nucleótidos pirimídicos intervienen como acarreadores en la biosíntesis de polisacáridos y de fosfolípidos. Los nucleótidos púricos y pirimídicos forman parte de los ácidos nucleicos y desoxirribonucleicos.

La síntesis de purinas se lleva a cabo en el citoplasma celular y comprende las siguientes tres fases: 1. Activación, en la que la ribosa 5 fosfato adquiere

dos moléculas de fosfato que se asocian al carbono 1 de la molécula; esta reacción es llevada a cabo por la fosforribosil pirofosfato sintetasa, la cual es una de las enzimas reguladoras de la síntesis de purinas y de pirimidinas.

2. Formación de los anillos heterocíclicos, en donde varias enzimas intervienen añadiendo los diferentes átomos que componen al anillo purínico hasta formar inosina monofosfato.

La primera reacción, catalizada por la enzima fosforribosilglicinamida sintetasa, es reguladora de la síntesis de purinas y su velocidad depende de las concentraciones de sus sustratos. 3. A partir de la inosina monofosfato se sintetizan la

guanosina monofosfato y la adenosina monofosfato

por medio de dos vías metabólicas que se regulan mutuamente. Las altas concentraciones de GTP estimulan la síntesis de AMP y las altas concentraciones de ATP estimulan la síntesis de GMP.

La síntesis de pirimidinas también se lleva a cabo en el citoplasma y se inicia con la síntesis de carbamilfosfato a partir de glutamina, CO2 y ATP en una reacción catalizada por la enzima carbamilfosfato sintetasa citoplasmática que es una reacción parecida a la que ocurre en la mitocondria para la biosíntesis de la urea; posteriormente, se adiciona ácido aspártico para producir ácido orótico al cual se une una molécula de fosforribosilpirofosfato y se descarboxila para dar la uridina monofosfato. A partir de ésta se sintetizan la citidina monofosfato y la timidina monofosfato. Las purinas se catabolizan por dos caminos metabólicos: 1. En la vía del ahorro de las purinas, la adenina, la

hipoxantina o la guanina son reaprovechadas y, por medio de la enzima fosforribosiltransferasa correspondiente, se vuelve a formar el AMP, IMP o GMP.

2. En una secuencia de reacciones cuyo producto final es el ácido úrico, que es la forma en la que se excretan las bases púricas.

El catabolismo de las pirimidinas se lleva a cabo por una serie de reacciones cuyos productos finales son la malonil-CoA y la metilmalonil CoA; estos dos productos se catabolizan hasta CO2 y agua. El exceso en el catabolismo de purinas genera una sobreproducción de ácido úrico que tiende a acumularse en las articulaciones distales, lo que produce el síndrome de gota. Esto se debe a que el ácido úrico es insoluble en ambientes con un pH menor a 6.0, lo que hace que no se pueda eliminar por la orina. Este síndrome se produce cuando las concentraciones de purinas son altas, ya sea por aporte elevado o por exceso en el catabolismo de las mismas. Los análogos de los nucleótidos se han utilizado como inhibidores de algunas enzimas; por ejemplo, la azaserina y la acivicina, análogos de la glutamina, se usan como inhibidores de la enzima glutamina amino transferasa que interviene en la síntesis de purinas. El metotrexato y el 5-fluorouracilo

76

se usan como inhibidores de la síntesis de dTMP. La aplicación de estos inhibidores en pacientes con procesos neoplásicos da como resultado la disminución de la síntesis del DNA y del crecimiento celular. El alopurinol se usa en el tratamiento del síndrome de gota porque es un análogo de la hipoxantina y actúa como inhibidor de la enzima xantina oxidasa y de la producción de ácido úrico.

H. Regulación e integración metabólica

Al finalizar esta subunidad, el alumno será capaz de analizar los mecanismos de regulación del metabolismo y de su integración en algunas condiciones fisiológicas. H.1 Conocerá cómo se lleva a cabo la regulación

del metabolismo. H.2 Analizará los cambios adaptativos que

ocurren en las siguientes condiciones normales y patológicas: ejercicio intenso, embarazo-lactancia, vejez, ayuno, obesidad, desnutrición, diabetes mellitus y gota.

H.3 Conocerá los mecanismos de acción hormonal e identificará los receptores membranales y las cascadas de amplificación: la adenilato ciclasa (AMP cíclico), la fosfolipasa C (fosfoinosítidos, calcio) y la GMPc fosfodiesterasa (GMP cíclico).

Realización de la práctica 10 "Integración Metabólica” (ver pág. 168). Lecturas recomendadas 1. Scott JD, Pawson T. Cell communication the

inside story. Scientific American. 2000; 282 (6): 54-61.

2. Kholodenko BN, Westerhoff HU. The macroworld versus microworld of biochemical regulation and control. TIBS. 1995; 20: 52-54.

Las células y los organismos son sistemas relativamente aislados en un estado casi estacionario. Las funciones de los organismos vivos

como un todo o como sus partes están reguladas con el objetivo de asegurar un máximo de supervivencia. Ya que los sistemas vivos reaccionan en el espacio y el tiempo, se emplea tanto una regulación en el espacio y en el tiempo. La regulación espacial se expresa a través del grado de organización de las estructuras; el mantenimiento de la estabilidad estructural de las proteínas, en la asociación de las enzimas que cooperan en los complejos multienzimáticos, su localización en compartimentos definidos (mitocondria, retículo endoplásmico) y por la especialización de células y tejidos mediante procesos de diferenciación. El tiempo está involucrado en la regulación principalmente en términos de modificación de las velocidades de reacción (metabólica, de transporte y otras). En la práctica, se utilizan ambas dimensiones simultáneamente. En bioquímica una de las principales señales para regular los procesos metabólicos es la concentración de moléculas. Los mecanismos regulatorios son efectivos a diferentes niveles de organización pero sus bases son siempre moleculares. Las funciones de un organismo pueden regularse a través de reacciones que se realizan en las células (regulación metabólica) y a nivel de todo el organismo (control hormonal y nervioso). En una célula, los procesos metabólicos están controlados principalmente por regulación de la actividad de las enzimas individuales. Las enzimas pueden regularse de varias maneras: 1. Cambiando la concentración de los sustratos

(como una señal metabólica) lo que resulta en cambios en la actividad enzimática, permaneciendo constante la cantidad de enzima involucrada. Los cambios en la concentración de un compuesto señal se logran muchas veces a través de la compartimentalización, es decir, a través de membranas que separan la célula del medio extracelular y por los pequeños compartimentos en el interior de la célula, éstas siendo separadas espacialmente (por membranas) o funcionalmente (por acarreadores).

2. Cambiando la concentración de los efectores (activadores o inhibidores) en las enzimas

77

alostéricas. Al interactuar con el sitio alostérico de la enzima, estos efectores pueden aumentar o disminuir la actividad enzimática con base en los cambios cooperativos de la conformación de las subunidades que componen a la enzima. La cantidad de la enzima alostérica no cambia durante el proceso.

3. Por inducción o por represión cuando, en contraste con los dos mecanismos anteriores, la cantidad de enzima y, por tanto, su actividad total en el sistema cambian. La cantidad de enzima por célula depende de la presencia de una proteína represora que es codificada por un gen regulador y que, en su forma activa, se une a una región del DNA (operador) e impide la unión de la RNA polimerasa al promotor. De esta manera, inhibe la síntesis de algunas enzimas (represión). Algunos compuestos de bajo peso molecular (inductores) pueden interactuar con el represor y cambiarlo a una forma inactiva que no puede inhibir la síntesis de una enzima dada esto es la inducción de su síntesis Fundamentalmente, no se abren nuevas vías metabólicas, simplemente se liberan o se bloquean las ya existentes, principalmente por el principio de retroalimentación, en el que la regulación se ejerce sobre la actividad de la enzima en una forma prácticamente instantánea y reversible.

Los sistemas multienzimáticos son aquellos en los cuales las enzimas individuales están organizadas de tal manera que el producto de una reacción sirva como sustrato de la siguiente enzima. Aquí, la regulación por retroalimentación juega un papel importante, ya que el producto de una secuencia de reacciones controla la actividad de una de las enzimas precedentes, generalmente la primera de la secuencia. El control por retroalimentación generalmente es negativo, es decir, un aumento en la concentración del producto inhibe a la enzima regulatoria. En los sistemas multienzimáticos, una de las reacciones parece ser la reacción limitante de la velocidad, es decir, procede a su velocidad máxima posible. Otra manera de regular los procesos es a través de isoenzimas. La regulación al nivel de un organismo requiere la existencia de células y de estructuras diferenciadas especiales con una función de control

(células nerviosas, glándulas endócrinas). Se sabe que estas células producen ciertos compuestos que pueden ser considerados como portadores de información, señales que se transportan de una parte del organismo a otra. La regulación del metabolismo celular puede llevarse a cabo por las hormonas, moléculas de diversa naturaleza química que pueden alcanzar a algunas células del organismo quienes presentan receptores para ellas (tejidos blanco) y afectar su función, Para aumentar la eficiencia de la regulación, las hormonas se transportan a menudo de la célula que las origina hasta el tejido blanco en asociación con una proteína específica. Se ha asumido que el proceso básico de la regulación hormonal es la unión de la hormona a su receptor, el que puede encontrarse en la superficie celular o en el citoplasma. En el primer caso la hormona no penetra en la célula sino que, en algunos casos, reacciona con una proteína asociada a la adenilato ciclasa, que a su vez cataliza la formación de AMP cíclico a partir de ATP. Por eso el AMP cíclico se conoce a menudo como el "segundo mensajero" porque afecta a un gran número de reacciones intracelulares (por ejemplo, la activación de la proteína cinasa A). La fosforilación de proteínas produce cambios en la actividad de algunas enzimas claves en el metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos. Otras hormonas, al interactuar con su receptor extracelular activan a la fosfolipasa C, produciendo los «segundos mensajeros» Inositol trifosfato y diacilglicerol, los cuales regulan la concentración de calcio citoplásmico, quien es una nueva señal de regulación metabólica. Una tercera molécula que actúa como segundo mensajero intracelular es el GMP cíclico. Existe otro mecanismo por el que actúan las hormonas cuyo receptor se encuentra en la membrana. En este caso, la interacción de la hormona con el receptor, provoca que éste se autofosforile y una vez ocurrido este evento, el receptor fosforila a otras proteínas blanco. El proceso secuencial fosforilación de proteínas, se convierte en la manera en la que la señal se transmite a las moléculas implicadas en la regulación de algunas

78

vías. La hormona insulina actúa mediante este mecanismo. Otras hormonas –como las esteroidales y las tiroideas– cruzan la membrana celular y reaccionan con una proteína receptora en el citoplasma. El complejo viaja entonces hasta el núcleo donde, a

nivel del DNA, aumenta la producción del RNAm y del RNAr específicos. Éstos controlan entonces la síntesis de las enzimas que intervienen en la regulación de los procesos metabólicos.

79

CONTENIDO TEMÁTICO

Tercera Unidad Temática BIOLOGÍA MOLECULAR

80

IV Biología molecular

A. Organización del genoma

Al finalizar esta unidad el alumno conocerá la estructura de los ácidos nucleicos y sus diferentes niveles de organización.

A.1 Estructura de los ácidos nucleicos. A.1.1 Identificará los diversos

componentes de los ácidos nucleicos y señalará las diferencias que existen entre el DNA y los diversos tipos de RNA. Conocerá el significado de los patrones de metilación del DNA como mecanismo de identificación de su origen.

A.1.2 Reconocerá las diferentes conformaciones del DNA (A, B y Z).

A.1.3 Describirá las estructuras primaria, secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos y hará énfasis en lo dinámico de estas moléculas.

La información genética es el conjunto de datos que determinan la estructura y propiedades funcionales en las células. La información genética es almacenada en el núcleo de los eucariotos en estructuras llamadas cromosomas. En el caso de los procariotos, el cromosoma se encuentra disperso en el citosol. El núcleo es un orgánulo separado del citoplasma por la membrana nuclear, que de hecho, es una doble membrana que presenta poros con un diámetro de 30 a 100 nm, a través de los cuales las macromoléculas pueden intercambiarse entre el citoplasma y el núcleo. La membrana nuclear, además, participa directamente en la duplicación del

Al finalizar esta unidad, el alumno será capaz de identificar las diferentes moléculas informacionales de la célula y su organización; los mecanismos por los que fluye la información genética; los mecanismos por los que se regula la expresión genética en los diferentes estadios del ciclo celular, y el empleo de algunas técnicas de manipulación del DNA útiles en medicina. La unidad se divide en: A. Organización del genoma. B. Flujo de la información genética. C. Mutaciones y reparación del DNA. D. Niveles de regulación de la expresión genética. E. Virus, oncogenes y transformación. F. Técnicas de manipulación del DNA.

81

DNA y permite la comunicación directa del núcleo con el medio que lo rodea. La mayoría del material nuclear está formado por nucleoproteínas cuyo principal componente es el ácido desoxirribonucleico (DNA); en un núcleo en interfase las nucleoproteínas forman filamentos de grosor variable (30 nm en promedio). El grosor de estos filamentos depende de la presencia o la ausencia de proteínas que interactúan con la doble hélice del DNA, mientras que su longitud depende del peso molecular de las cadenas del DNA. Así, un cromosoma contiene oléculas del DNA de varios centímetros de longitud y tiene aproximadamente 10

10 de peso

molecular. Además del ácido desoxirribonucleico, existe otro tipo de ácido nucleico: el RNA. Se conocen tres tipos diferentes del RNA: los RNA mensajeros (RNAm), que llevan la información para una cadena polipeptídica; los RNA ribosomales (RNAr), que forman parte de la estructura de los ribosomas y que son de diferente tamaño (16S, 5S y 23S, en el caso de procariotos; 18S, 5S, 5.8S y 28S, en el caso de eucariotos; los RNA 16S y 18S se encuentran en la subunidad pequeña de los ribosomas, mientras que los otros se encuentran en la subunidad grande de los mismos) y los RNA de transferencia (RNAt), que sirven de adaptadores en el proceso de síntesis de proteínas porque traducen el mensaje codificado en nucleótidos a un lenguaje de aminoácidos. En los organismos eucariotos, los ácidos ribonucleicos (RNA) se sintetizan en el núcleo. Las moléculas del DNA son polinucleótidos, o sea, cadenas compuestas de mononucleótidos en las que la parte externa de la estructura está constituida por los esqueletos de desoxirribosa fosfato unidos entre sí por enlaces fosfodiéster, de tal manera que el grupo 5'-fosfato de la desoxirribosa de un nucleótido está esterificado con el grupo 3'-OH de la

desoxirribosa del nucleótido vecino. Las moléculas de DNA contienen dos tipos de bases nitrogenadas, dos bases pirimídicas (timina T y citosina C) y dos bases púricas (adenina A y guanina G). Estas bases se unen entre el C

1 de la desoxirribosa y el N

1

de las pirimidinas o el N9 de las purinas por

enlaces N-glucosídicos. La secuencia de bases es altamente específica para cada molécula del DNA. Las moléculas del DNA en solución presentan la estructura de una doble hélice que gira a la derecha alrededor de un eje común. Las dos cadenas son complementarias, corren de manera antiparalela entre ellas. Se conectan entre sí a través de puentes de hidrógeno que se forman entre bases yuxtapuestas A-T (dos puentes de hidrógeno) y C-G (tres puentes de hidrógeno); las bases se mantienen perpendicularmente al eje longitudinal de la molécula del DNA. Además, se estabilizan por interacciones hidrofóbicas entre bases vecinas de la misma hebra. Las bases son hidrofóbicas y están colocadas en forma muy empaquetada y prácticamente no entran en contacto con el agua. El agua interacciona con la parte hidrofílica de la molécula formada por residuos de azúcar y grupos fosfato cargados negativamente. Dependiendo del contenido de agua del medio, las moléculas de DNA pueden existir en tres formas: A, B y Z. Las diferentes formas difieren en el número de nucleótidos por vuelta y en sus características estructurales. Se supone que la forma B es la predominante de las moléculas del DNA in vivo. Aparte del DNA lineal, existen moléculas de DNA en forma de círculos cerrados que pueden arreglarse en estructuras similares a eslabones de una cadena (en mitocondrias, bacterias y virus).

A.2 Organización del DNA.

82

A.2.1 Identificará los distintos niveles

de organización del DNA;

reconocerá al nucleosoma, la

fibra de 30 nm (solenoide), el su-

perenrollamiento de 300 nm

(dominios estructurales en bucle)

y el cromosoma en metafase.

A.2.2 Reconocerá a las histonas y a

otras proteínas no histonas como

responsables del

empaquetamiento del DNA.

Reconocerá la importancia de los

siguientes dominios proteicos:

hélice-vuelta-hélice, cremalleras

de leucina, dedos de cinc, en su

interacción con el DNA y entre

proteínas que interactúan con el

DNA.

A.2.3 Relacionará los cambios en el

empaquetamiento del

cromosoma con la función del

DNA. Definirá el significado de

los siguientes conceptos:

cromatina, centrómero, telómero,

eucromatina y heterocromatina.

Lecturas recomendadas 1. Collins FS, Jegalian KG.

Deciphering the code of the life. Scientific American. 1999; 281(6): 86-91.

2. Kornberg RD, Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chomosome. Cell. 1999; 98: 285-294.

Dado que el tamaño del núcleo impediría la existencia de los cromosomas en forma extendida, el DNA se compacta formando estructuras superenrolladas que se asocian a proteínas básicas (histonas) para formar superestructuras cada vez más complejas como son: los nucleosomas, el solenoide o fibra de 30 nm, las fibras de 300, 700 y 1 400 nm y, finalmente, las macroestructuras

de los cromosomas mitóticos en donde se alcanza la máxima condensación posible, como se ve en el microscopio electrónico.

Las proteínas nucleares pueden dividirse, en general, en proteínas del tipo de las histonas y proteínas no histonas. Las histonas son proteínas de peso molecular entre 10 000 y 25 000 con un alto contenido de aminoácidos básicos como arginina y lisina, los cuales pueden representar de 23 a 30% de todos los aminoácidos que componen a la proteína. Las histonas pueden clasificarse en cinco diferentes grupos según su tamaño y su composición de aminoácidos. La función de las histonas consiste en organizar los largos filamentos de DNA en formas más compactas que permitan su empaquetamiento en el núcleo. Esto se lleva a cabo a través de las interacciones electrostáticas de las histonas con las cargas negativas de los grupos fosfato del DNA. Además de las histonas existen proteínas no histonas que interactúan con el DNA. Las no histonas son una gran variedad de proteínas que difieren en abundancia, tamaño y composición de aminoácidos. Algunas de ellas presentan dominios que son muy comunes como los dedos de cinc y los zippers o cremalleras de leucina. Estas proteínas son responsables de la selectividad e inhibición transitoria en la transcripción del RNA a través de su unión a ciertos segmentos de DNA implicados en su regulación o a través de la modificación de la organización del DNA. Además, regulan la transcripción de los genes de las mismas histonas. A.3 Organización del genoma.

A.3.1 Discutirá el concepto de gen y

señalará el número aproximado

de genes contenidos en el

genoma humano.

A.3.2 Señalará las características más

importantes de los genes únicos

83

y redundantes, de mantenimiento

y tejido específicos, estructurales

y reguladores, dominantes,

recesivos y ligados al sexo

(conocerá las Leyes de Mendel).

A.3.3 Señalará las regiones

hiperconservadas y las regiones

hipervariables del DNA (intrones

y exones).

A.3.4 Conocerá las diferentes clases

de DNA: genes que codifican

proteínas, genes que codifican

para RNA de transferencia y

ribosomales, seudogenes, DNA

repetitivo y DNA espaciador.

A.3.5 Señalará las características del

DNA mito-condrial y la

información contenida en él.

Realización de la práctica 11 “Huella génica” (ver pág. 168).

Cuando se analiza el contenido del DNA que se expresa como preRNAm, RNAr, RNAt y otros tipos de RNA, se observa que éste constituye sólo 10% del DNA total (este DNA se conoce como DNA informativo); el restante 90% contiene seudogenes, DNA espaciador y DNA repetitivo. Todo esto constituye el genoma. De todo el DNA, el repetitivo constituye 30 a 40% y está compuesto de secuencias de longitud variable que pueden estar repetidas diez, mil o más veces. Las secuencias repetidas pueden agruparse, como el caso del DNA satélite asociado al centrómero del cromosoma, o presentarse disperso, como la secuencia ALU, de la cual existen ± 500 000 copias dispersas en todos los cromosomas y que está posiblemente relacionada con los orígenes de la duplicación. Del DNA celular, 0.1% es mitocondrial. En él hay 13 genes que codifican para proteínas de gran importancia para la bioenergética

celular. Este DNA es de origen materno y constituye la llamada "herencia de Eva".

La mayoría de los genes para preRNA (RNAhn) son genes únicos, pero pueden ser transcritos miles de veces. Los RNAm resultantes de la maduración de estos preRNA pueden traducirse cientos de veces, lo que provoca la aparición de una gran cantidad de proteína codificada en dichos genes.

B. Flujo de la información genética

Al f inalizar esta subunidad el alumno conocerá los procesos involucrados en el f lujo de la información genética.

B.1. Flujo de la información genética.

B.1.1 Conocerá las funciones de los

ácidos nucleicos y los flujos de la

información genética (dogma

central de la Biología Molecular).

B.2 Síntesis del DNA (duplicación).

B.2.1 Describirá el ciclo celular con sus

fases y conocerá las diferentes

moléculas que se generan en

cada una de éstas.

B.2.2 Examinará qué es la duplicación

del DNA y en qué fase del ciclo

celular ocurre.

B.2.3 Identificará los sucesos más

importantes catalizados por el

“replicosoma”.

Lecturas recomendadas 1. Hübscher U. Eukaryotic DNA

polymerases a growing family. TIBS. 2000; 25 (3): 143-147.

2- Collins FS, Jegalian KG. Deciphering the code of the life. Scientific American. 1999; 281 (6): 86-91.

84

Las moléculas del DNA son sintetizadas a partir de desoxirribonucleótidos en presencia de un molde de DNA y de varios tipos de enzimas, entre las que se encuentran dos DNA polimerasas, con diferente función en el proceso: una RNA polimerasa (primasa), una topoisomerasa de tipo II denominada DNA girasa y una serie de proteínas que catalizan la separación de las dos hebras del DNA, entre las que destacan las helicasas. Las DNA polimerasas son enzimas que pueden unir desoxirribonucleótidos sólo en la dirección 5´ 3´, aunque también tienen actividad de exonucleasas en la dirección 5 ´ 3´y en la dirección 3´ 5´. Esta capacidad de polimerización sólo en la dirección 5´ 3´ se conoce como direccionalidad de la duplicación y es la responsable de algunas peculiaridades del proceso. Dado que las DNA polimerasas no pueden iniciar la síntesis del DNA a menos que posean un extremo 3´OH terminal al que puedan añadir el desoxirribonucleótido entrante, se hace necesaria la actividad de una RNA polimerasa (primasa) que genere dicho extremo 3´ OH terminal. Tomando como molde una de las hebras, la primasa cataliza la formación de un pequeño segmento (5-20 ribonucleótidos) de RNA que sirve como “cebador" para la síntesis de la nueva cadena de DNA por la DNA polimerasa III. Las cadenas formadas de novo son antiparalelas a la cadena que les sirve de molde. Después de la sustitución del "cebador" del RNA a cargo de la DNA polimerasa I, los segmentos de la cadena formada de DNA son unidos por la DNA ligasa. El papel de la DNA polimerasa I, además de la función de sustitución de los "cebadores" del RNA, se encarga de la reparación de las hebras del DNA. Diversos experimentos han demostrado que una de las cadenas del DNA resultante provienen del progenitor y la otra

es la que se sintetizó de novo, la cual indica que la duplicación del DNA es semiconservativa. Este mecanismo permite la transmisión de la información genética de una generación a la siguiente. A consecuencia de la direccionalidad de la actividad de la DNA polimerasa III se descubrió que hay una diferencia en la velocidad de síntesis entre las dos cadenas del DNA, encontrándose que hay una cadena líder y una retardada. Esto permitió determinar que la duplicación de la cadena retardada se realiza en forma discontinua, apareciendo una serie de secciones pequeñas de DNA (entre 100 y 1 000 pares de bases), conocidas como fragmentos de Okazaki, y que son posteriormente unidas por la DNA ligasa para formar la hebra completa. Durante su vida, las células realizan diversas funciones, a veces se dedican principalmente a crecer, otras a dividir su material genético, o a repartirlo en lo que serán, dos nuevas células hijas. Estas diferentes etapas constituyen lo que se conoce como el ciclo celular, integrado por 4 fases bien definidas: M (mitosis), G1 (unión 1), S (síntesis) y G2 (unión 2).

Morfológicamente sólo se han definido dos etapas de división e interfase, en esta última están incluidas G1, S y G2.

Durante la etapa G1, la célula crece, lo que implica un gran gasto energético y síntesis de sus componentes. El paso a la etapa S, requiere de señales precisas para que se inicie la síntesis del DNA, de tal forma que, al terminar esta etapa, la célula tiene ya un contenido equivalente al doble de DNA. Para poder distribuir este DNA entre dos células hijas y dividirse (fase M), la célula pasa por una etapa de preparación para la mitosis llamada G2. Numerosos genes se

prenden y apagan durante cada etapa del ciclo celular en forma específica y altamente precisa.

85

Cuando una célula se diferencia, como es el caso de las neuronas, al llegar a la etapa G1, la célula toma un camino

alternativo a S, dejando de dividirse para estacionarse en una etapa llamada G0.

Durante esta etapa, un gran número de genes tejido-específico se prenden dando a la célula la identidad de acuerdo a la estirpe a la cual pertenece. B.3 Transcripción.

B.3.1 Identificará en qué consiste, en qué compartimiento subcelular y en qué fase del ciclo celular se lleva a cabo la transcripción.

B.3.2 Identificará las enzimas, sustratos y los sucesos más importantes del proceso de transcripción.

B.3.3 Describirá en qué consisten los procesos de modificación postranscripcional que sufren el RNAm, el RNAt y el RNAr y hará énfasis en el papel de las ribozimas.

B.3.4 Revisará el efecto de la rifamicina, de la actinomicina D y de la α-amanitina sobre la transcripción.

Lectura recomendada 1- Proudfoot N. Connecting

transcription to messenger RNA processing. TIBS 2000; 25 (6): 290-293.

Todas las moléculas del RNA son sintetizadas en el núcleo mediante transcripción de la información genética codificada en la secuencia de las bases del DNA mediante la acción de una RNA polimerasa dependiente de DNA. La RNA polimerasa dependiente del DNA es una enzima que está compuesta de 6 subunidades: α2, ß, ß´, θ y una proteína

acídica designada como σ que se requiere

para la identificación y unión al promotor, es decir, el sitio donde debe iniciarse la transcripción. Esta enzima utiliza un molde de DNA para sintetizar una cadena de RNA, la cual crece en la dirección 5´ 3' hasta llegar a una señal de terminación en el DNA, lo que provoca la entrada de la proteína rho la cual separa la RNA polimerasa de la cadena molde del DNA. En el caso de los organismos eucariotos, sus RNA polimerasas son diferentes, aunque el proceso es básicamente el mismo. Una de las diferencias en la transcripción entre procariotos y eucariotos es que los RNAm de los procariotos suelen ser policistrónicos, es decir, llevan la información para más de una cadena polipeptídica, mientras que los de eucariotos son monocistrónicos. Los productos de la transcripción en eucariotos sufren, a su vez, una serie de modificaciones postranscripcionales. Los RNA mensajeros adquieren en su extremo 5´ terminal un "casquete", es decir, un nucleótido poco común con un enlace especial (7 metilguanosina unida por un enlace 5´ 5´) que lo protege de la acción de las nucleasas. Asimismo, adquieren una cola de poli A en el extremo 3´ terminal y pierden algunas secuencias que no llevan información para ninguna cadena polipeptídica (intrones). El producto de este proceso de edición es el que será leído en los ribosomas durante la traducción o síntesis de proteínas. Los RNA ribosomales se sintetizan principalmente en el nucleolo, se asocian a las proteínas ribosomales y las nucleoproteínas formadas son transportadas al citoplasma donde llevan a cabo su función. Los RNA de transferencia también son editados, es decir, se modifican hasta adquirir la estructura funcional. Pierden secuencias o algunas de sus bases sufren modificaciones (por ejemplo, se reducen para producir dihidrouridina, se metilan para

86

producir ribotimina, etcétera) lo que les confiere resistencia a las nucleasas.

B.4 Traducción.

B.4.1 Proceso de la traducción.

B.4.1.1 Describirá en qué consiste

y en qué compartimiento

subcelular se realiza la

traducción, tanto de

proteínas intracelulares,

como de proteínas de

secreción.

B.4.1.2 Conocerá el alfabeto del

código genético y el

concepto de codón y

anticodón.

B.4.1.3 Identificará las moléculas

que intervienen en el

proceso de traducción.

B.4.1.4 Conocerá las fases del

proceso y la función que

desempeña el ribosoma

en el mismo.

B.4.1.5 Conocerá el efecto de los

siguientes inhibidores

sobre la síntesis de

proteínas: tetraciclinas,

estreptomicina,

cloranfenicol, eritromicina,

puromicina,

dehidroemetina,

cicloheximida y la toxina

diftérica.

La síntesis de proteínas es un proceso

complejo en el que intervienen de manera

coordinada más de cien macromoléculas

para unir los residuos de los 20 aminoácidos

en una secuencia codificada en el RNA

mensajero. Asimismo, la síntesis de

proteínas requiere de grandes cantidades de

energía y se regula rigurosamente. En este

proceso participan los tres diferentes tipos de

RNA (el mensajero, el ribosomal y el de

transferencia); cada uno contribuye, de

manera específica, a la obtención de una

proteína funcional. El lenguaje codificado en nucleótidos en los ácidos nucleicos es traducido a un lenguaje de aminoácidos mediante una serie de RNAs de transferencia (RNAt) cargados cada uno con un aminoácido determinado, el que es especificado por el asa del anticodón, según un código de lectura: el código genético. Este código presenta cuatro características: 1. Está basado en tripletas, es decir, una

secuencia de 3 nucleótidos determina un aminoácido.

2. El código no se sobrepone y no tiene espacios, es decir, que la información se almacena en tripletas de bases seguidas.

3. El código es universal. Es el mismo para todos los organismos.

4. El código es degenerado. Esto significa que más de una tripleta puede codificar para un aminoácido. Sin embargo, los primeros dos nucleótidos de una tripleta son generalmente los mismos para un aminoácido determinado.

El proceso de la síntesis de proteínas puede dividirse en diferentes etapas: a) La activación de los aminoácidos, es

decir, la formación de los aminoacil RNAt por sintetasas específicas.

b) La iniciación es la primera fase del proceso; en ella se requiere la presencia de tres proteínas conocidas como factores de iniciación necesarios para disociar los ribosomas en sus subunidades y para acarrear el aminoacil RNAt inicial (generalmente metionil RNAt o su análogo formilado). Además, se necesita la asociación del RNA mensajero con la señal de inicio de la traducción (generalmente la tripleta AUG) a la subunidad pequeña del

87

ribosoma y del aminoacil RNAt inicial al sitio peptidilo (P) del ribosoma. Todo este complejo de proteínas, de RNAs y de la subunidad pequeña del ribosoma constituye el complejo de iniciación, al que se une la subunidad grande para formar el ribosoma activo.

c) El alargamiento de la cadena polipeptídica se realiza a partir de este momento por la llegada del siguiente aminoacil RNAt al sitio aminoacilo (A) del ribosoma con la ayuda de un factor de alargamiento asociado a GTP, que lo coloca en el sitio adecuado con gasto de un enlace de alta energía. Enseguida se forma el enlace peptídico por la acción de la peptidil transferasa que se encuentra asociada a la subunidad grande del ribosoma y el movimiento del ribosoma sobre la molécula de RNAm para colocar al nuevo peptidil RNAt en el sitio P y dejar libre el sitio A del ribosoma y continuar el alargamiento de la cadena. El movimiento del ribosoma se realiza por la acción de otro factor de alargamiento (factor G) con hidrólisis de una nueva molécula de GTP.

d) La terminación se realiza cuando los factores de terminación (factores R) encuentran una tripleta sin sentido (UAA, UGA, UAG), lo que provoca la activación de la peptidil transferasa que hidroliza el enlace peptidil RNAt y libera a la cadena polipeptídica. El RNAt y el RNAm se liberan al igual que el ribosoma, que ahora puede volver a disociarse para iniciar un nuevo ciclo de traducción. El polipéptido liberado adquiere sus estructuras secundaria y terciaria correspondientes.

Esta descripción de la síntesis de

proteínas corresponde a proteínas que

permanecerán intracelularmente. En el caso

de los organismos eucarióticos, las proteínas

que serán excretadas, o que forman parte de

la membrana plasmática, del retículo

endoplásmico, del aparato de Golgi o de los

lisosomas, se forman en ribosomas

firmemente unidos al retículo endoplásmico.

Conforme el polipéptido se va sintetizando,

entra en cisternas endoplásmicas y es

transportado al aparato de Golgi donde se

concentra y se modifica, por ejemplo, con

adición de azúcares. Más tarde estas

proteínas son englobadas en vesículas que

viajan a la superficie celular y se fusionan

con la membrana para verter su contenido al

espacio extracelular. Las proteínas cuyo

destino son los organelos intracelulares se

sintetizan en retículo endoplásmico y se

transportan a su destino mediante una señal

interna que es reconocida en dicho organelo.

B.4.2 Modificación postraduccional y

degradación de proteínas.

B.4.2.1 Mencionará en qué

consisten las

modificaciones

postraduccionales:

plegamiento,

modificaciones cova-

lentes reversibles

(fosforilación, acetilación y

ADP ribosilación) e

irreversibles

(glucosilación,

hidroxilación, proteólisis

controlada, unión a grupos

prostéticos) y cuál es su

posible función.

B.4.2.2 Comprenderá el concepto

de vida media de una

proteína.

B.4.2.3 Describirá cuáles son los

procesos lisosomal y no

lisosomal, mediante los

que se degradan las

proteínas.

88

Lectura recomendada 1. Goldberg AL. The cellular

chamber of pomm. Scientific American. 2001; 284 (1): 56-61.

Las modificaciones postraduccionales de las

proteínas pueden incluir desde el

plegamiento de los polipéptidos con la ayuda

de proteínas como las chaperonas y

chaperoninas, cambios en el extremo amino-

terminal y en aminoácidos específicos,

procesamiento proteolítico, formación de

puentes disulfuro y otras como la unión de

carbohidratos, metales, grupos prostéticos,

etcétera.

Una de las modificaciones más

comunes en el extremo amino terminal que

se da en las células eucarióticas es el de

remover los residuos de metionina, con las

que se inicia la síntesis de la misma; en las

células bacterianas se remueve la formilación

presente en la metionina y, en algunos

casos, ésta también es recortada. Además

de este tipo de modificaciones que ocurren

en la secuencia del extremo amino terminal

de una proteína, los aminoácidos presentes

en la proteína también se pueden modificar;

por ejemplo, los aminoácidos serina, treonina

y tirosina pueden unir grupos fosfatos a sus

cadenas laterales, es decir, son susceptibles

de ser fosforilados en sus cadenas laterales.

Este tipo de transformaciones se usa por la

célula para comunicar cambios en el medio

ambiente que tienen como respuesta

modificaciones en la regulación de vías

metabólicas. Algunos aminoácidos, como la

lisina, puede metilarse, otros como la

cisteína, añadir grupos isoprenílicos u otros

lípidos a su cadena lateral, lo cual facilita la

unión de la proteína con la membrana. Los

residuos de cisteína pueden formar de

manera específica puentes disulfuro.

Finalmente, muchas de las proteínas son

sintetizadas de tal forma que requieren que

se les realice un corte de tipo proteolítico

para que adquieran su forma activa, como es

el caso de los zimógenos y las prohormonas.

El corte de la preproteína hacia su forma

biológicamente activa se realiza por una

proteasa específica y se encuentra regulado

por los diferentes eventos celulares.

¿Qué determina la estabilidad de las

proteínas?

Todas las células contienen gran cantidad

de proteasas con diferente especificidad.

Estas las podemos dividir en tres grupos

generales: 1. Algunas proteasas cortan a la proteína en

sitios específicos dando origen a proteínas maduras que son de menor tamaño que su proteína precursora. Estas proteasas participan en diferentes procesos que incluyen el corte de la secuencia señal de una proteína de exportación y el procesamiento de proteínas citosólicas para dar origen a sus formas maduras.

2. La internalizacion de proteínas de membrana (algunos receptores) en respuesta a la unión del ligando genera como primer evento la unión de clatrina alrededor de la membrana; ésta se invagina al citoplasma y forma vesículas rodeadas de clatrina . El destino de estas vesículas son los endosomas temprano, tardío y finalmente el lisosoma que es el responsable de la degradación de macromoléculas por medio de enzimas hidrolíticas.

3. Finalmente, la vida media de las proteínas varía entre algunos segundos, días y excepcionalmente toda la vida (cristalino). Para ser degradadas, las proteínas son marcadas para ser reconocidas por el proteosoma, el cual es un complejo de alto peso molecular que se encarga de la degradación de proteínas citosólicas. Los sustratos de este sistema son principalmente proteínas que están alteradas en su plegamiento, por lo que el

89

proteosoma actúa como un sistema de control de calidad. También está involucrado en la degradación de proteínas como un mecanismo de regulación, por ejemplo en el caso de las ciclinas para que se complete el ciclo celular. El primer paso en este sistema es el marcar a la proteína alterada (proteína blanco) para que sea degradada. La marca es una pequeña proteína llamada ubiquitina, la cual se une covalentemente a la proteína blanco. Son tres los componentes del sistema de ubiquitinación:

a) E1 enzima activadora de la ubiquitina, dependiente de ATP

b) E2 enzima que conjuga a la ubiquitina con la proteína blanco

c) E3 ligasa de ubiquitina, selecciona a la proteína blanco

d) El complejo multiproteico del proteosoma (20S) degrada rápidamente a las proteínas unidas a la ubiquitina. Este complejo está formado por 14 subunidades apiladas una sobre otra y que son las responsables de la actividad proteolítica.

Para que la proteína sea degradada

necesita tener varias ubiquitinas unidas.

C. Mutaciones y reparación del dna

Al finalizar esta subunidad el alumno

conocerá los diferentes cambios que puede

sufrir el DNA y sus consecuencias. Conocerá

también los mecanismos de reparación del

DNA.

C.1 Conocerá los diferentes tipos de

mutaciones y la acción de algunos

agentes mutágenos: luz UV,

radiaciones, naranja de acridina,

bromuro de etidio, 5 bromouracilo.

C.2 Efecto de mutaciones en promotores,

operadores, genes reguladores,

intrones, exones y genes estructurales

y dará ejemplos: talasemias, anemia

de células falciformes, etcétera.

C.3 Identificará los mecanismos que

existen para la reparación del DNA:

uvr, fotoliasa, excinucleasa, sistema

SOS, entre otros.

Durante la duplicación puede ocurrir

espontáneamente un número pequeño de

errores en el orden o tipo de las bases

nitrogenadas. La probabilidad de uno de

estos errores puede incrementarse bajo la

influencia de diferentes agentes mutágenos

(químicos o físicos). Estos cambios en la

secuencia de bases nitrogenadas en el DNA

se conocen con el nombre de mutaciones.

Existen varios tipos de mutaciones:

las que cambian una base por otra

(sustitución) y pueden ser de una base púrica

por otra base púrica o de una pirimidina por

otra pirimidina; lo que se conoce como

transición. Si el cambio es de una purina por

una pirimidina, o viceversa, la mutación se

conoce como transversión. Existe otro tipo de

mutaciones en las que hay un cambio de

marco de lectura para la traducción. Hay dos

tipos de mutaciones de este tipo: la inserción,

en la que la entrada de uno o dos nucleótidos

modifica el marco en que se leerá el mensaje

por los ribosomas, y la supresión (deleción),

en la que la pérdida de uno o dos nucleótidos

provoca el mismo efecto.

En el caso de las mutaciones

puntuales, en las que sólo hay cambio de

una base, la información genética es

cambiada casi imperceptiblemente y las

mutantes pueden sobrevivir. Cuando cambia

un mayor número de bases, ocurren

alteraciones importantes en la secuencia de

un gen, lo que puede ser incompatible con la

existencia de esa mutante.

90

Con el fin de sobrevivir, la célula tiene

mecanismos para reparar el DNA dañado. En

ese sentido la actividad exonucleasa

3’ 5’ de las DNA polimerasas, la de los

productos de algunos genes, como los uvr

ABC, los de la fotoliasa y la de la uracilo-DNA

glucosidasa desempeñan un papel

importante.

D. Niveles de regulación de la

expresión genética

Al finalizar esta subunidad el alumno

conocerá los diferentes niveles de regulación

genética (en procariotos y en eucariotos), así

como los diversos mecanismos implicados en

ella.

D.1 Describirá los niveles de posible control

de la expresión de la información

genética (transcripcionales,

traduccionales, modificaciones

postranscripcionales y

postraduccionales).

D.2 Conocerá cómo la información que el

organismo recibe del medio exterior se

transforma en señales que se traducen

en diferentes acciones.

D.3 Conocerá los posibles mecanismos que operan en los diferentes niveles de regulación:

D.3.1 Cambios en la molécula del DNA: pérdida amplificación y rearreglo de genes.

D.3.2 Control de la transcripción en eucariotos (a nivel del rearreglo de la cromatina, de la iniciación y a nivel de los mecanismos de acción de los receptores intracelulares).

D.3.3 Control de modificaciones del transcrito primario.

D.3.4 Control de la traducción por la presencia del casquete, de

secuencias especiales, vida media del RNAm.

D.3.5 Regulación del proceso de síntesis proteica.

D.4 Revisará un modelo de regulación en

procariotos y otro en eucariotos (operón de lactosa y regulación de la expresión de los genes de las inmunoglobulinas).

D.5 Conocerá la relación que existe entre el ciclo celular, el tipo de célula y los procesos antes descritos, y el proceso de diferenciación celular.

Lecturas recomendadas 1. Etchergary P. Rhytmic histone

acetylation underlies transcription in the mammalian circadian clock. Nature. 2003; 421: 177-182.

2. Pombo A. Cellular genomics: which genes are transcribed, when and where? TIBS. 2003; 28 (1): 6-9.

3. Konberg RD. Eucaryotic transcriptional control. TIBS. Millenium Issue 1999; M46-M48.

4. Papin JA. Metabolic pathways in the post genome era. TIBS. 2003; 28(5): 250-258.

5. Le Hir H, Nott A, Moore M. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. TIBS. 2003; 28(4): 215-220.

Las bacterias son capaces de controlar la expresión de las enzimas necesarias para utilizar nutrientes del medio, o bien, aquellas enzimas requeridas para la síntesis de biomoléculas que intervienen en su funcionamiento y proliferación. Estos cambios de expresión ocurren con gran rapidez y precisión y fueron el primer ejemplo claro de la manera en que se regula la expresión génica. Cuando una enzima se expresa en respuesta a una necesidad bacteriana se habla de un proceso de

91

inducción génica, mientras que, cuando su expresión se apaga, se habla de represión génica. Los cambios en la expresión de un gen están controlados por la interacción de su región reguladora con diversas proteínas nucleares que favorecen o interfieren con la unión de la RNA polimerasa al sitio de iniciación de la transcripción. El ejemplo más sencillo de esta regulación es la manera como se controla la expresión de un conjunto de genes, llamado operón de lactosa, cuya expresión depende de la presencia de lactosa en el medio; normalmente, la expresión de este operón se encuentra reprimida. El gen regulador codifica para una proteína que se une con gran afinidad a la región del DNA que controla la expresión del operón y que previene que la RNA polimerasa pueda iniciar la transcripción. Por su función, a esta proteína se le denomina el represor del operón de lactosa. La presencia de lactosa, en ausencia de otros nutrientes, favorece que una pequeña porción de dicha lactosa sea transformada enzimáticamente a un metabolito que puede unirse al represor con gran afinidad; el resultado de esta unión es una inactivación alostérica del represor. A este metabolito de la lactosa se le denomina inductor del operón ya que, al disminuir la cantidad de represor funcional, favorece de manera indirecta la iniciación de la transcripción de los otros genes del operón. Un nivel más de control queda de manifiesto cuando las bacterias reprimen la expresión del operón de lactosa cuando en el medio aparecen otros nutrientes como la glucosa. A este efecto represor de la glucosa se le conoce como represión catabólica y ocurre gracias a que la presencia de glucosa reduce los niveles intracelulares de AMP cíclico (cAMP). Normalmente, el cAMP se une a una proteína denominada proteína receptora de cAMP (CRP, también denominada CAP) y forma un complejo que se une a la región reguladora de los operones y favorece su

transcripción. Por tanto, cuando la glucosa reduce los niveles de cAMP, la proteína CRP pierde su afinidad por la región reguladora del operón y se interrumpe la expresión. Una forma alternativa de regular la expresión génica es acoplar la transcripción a la traducción lo cual favorece la terminación temprana de la transcripción. Este proceso se conoce como atenuación y el operón de triptofano constituye un buen ejemplo. Cuando hay triptofano en el medio se favorece la terminación de la transcripción y el operón nunca logra expresarse; sin embargo, cuando el triptofano se agota, la transcripción continúa y se expresan las enzimas necesarias para su síntesis. La expresión de otros operones necesarios para la síntesis de aminoácidos, como histidina, fenilalanina, leucina, treonina e isoleucina, es controlada por atenuación. Mientras que en las bacterias cualquier individuo puede expresar todos sus genes, en las células animales esto no siempre es cierto. Por ejemplo, todas las células del cuerpo humano poseen la misma información genética codificada aproximadamente en 105 genes distintos; sin embargo, no hay ningún tipo celular que exprese todos estos genes simultáneamente. De hecho, cualquier célula expresa sólo un número reducido de estos genes, la gran mayoría de los cuales codifica para proteínas necesarias para las funciones generales de cualquier tipo celular. La expresión de estos genes es lo que hace similares a los distintos tipos celulares; un ejemplo claro de este tipo de genes lo constituye los que codifican para las enzimas glucolíticas, proteínas que se expresan de manera constitutiva como resultado de que las regiones reguladoras de estos genes responden a factores de transcripción presentes en todas las células. Los transcritos primarios son editados inmediatamente para dar origen al RNA mensajero maduro que es traducido por ribosomas libres para sintetizar un péptido

92

que, al adquirir su conformación nativa, posee actividad enzimática. Así como la expresión de los genes constitutivos confiere similitudes a los distintos tipos celulares, la expresión de genes tejido específico es la que le da a cada tipo celular sus características. Los hepatocitos, por ejemplo, expresan albúmina, pero no miosina, como lo hacen las células musculares, ni tampoco expresan las enzimas que permiten la síntesis de neurotransmisores como lo hacen las neuronas. La expresión de estos genes tejido-específico está controlada por sus regiones reguladoras las cuales requieren de factores de transcripción especiales que aparecen en dos etapas. En la primera, la expresión de estos factores ocurre en respuesta a estímulos hormonales o de factores de crecimiento durante la diferenciación celular. En la segunda, la presencia de estos factores de transcripción se hace independiente del estímulo hormonal y de factores de crecimiento o diferenciación y se convierte en proteínas que se expresan de manera permanente en la célula diferenciada. Muchas de las hormonas que activan este proceso requieren de receptores de membrana y sistemas de transducción que llevan la señal al núcleo a través del citoplasma. Otros, como las hormonas esteroides, se unen a receptores nucleares que sirven como factores de transcripción. En algunas ocasiones la regulación implica un cambio de la secuencia del DNA, como se ejemplifica a continuación. En el humano, como en todos los organismos diploides, la mayoría de los genes está presente en dos copias, una de origen paterno y una de origen materno. Algunas veces, el origen paterno o materno del gen determina que este gen pueda ser transcrito o no, fenómeno al que se le denomina “impronta genética”. El resultado de esta inactivación es que la expresión del gen se reduce a la mitad, ya que sólo una de las dos copias es activa, como es el caso de los

genes localizados en el cromosoma X. En contraposición, existen genes que pueden estar presentes en un mayor número de copias como resultado de una amplificación; tal es el caso de los genes que codifican para los RNA ribosomales, de los cuales las células requieren muchas copias. En genes que codifican para los anticuerpos en células B y los receptores de las células T ocurre un rearreglo de las secuencias primarias del DNA, lo que es responsable de la gran diversidad de antígenos naturales y artificiales que pueden ser reconocidos por el sistema inmune. Este proceso es controlado por los distintos factores que regulan la maduración de las células B y las células T. Además de la capacidad de transcribir o no ciertos genes con mayor o menor eficiencia, existen otros niveles en los que se puede regular la función del producto final por medio de la modulación tanto en cantidad como en calidad. El primer nivel de regulación se refiere al control de la vida media de los RNA mensajeros determinada por la existencia de secuencias en los extremos no codificantes que regulan su velocidad de degradación. Durante el proceso de maduración de los mensajeros, en el cual se eliminan intrones, también pueden eliminarse uno o varios exones y dar lugar a una mayor diversidad de proteínas; a este proceso se le denomina edición alternativa. Una vez que el mensajero ha madurado, existen varios mecanismos que pueden aumentar o disminuir la eficiencia con la que los ribosomas traducen la información a un péptido. En muchas ocasiones la proteína tiene un destino final diferente al citoplasma, el cual puede ser mitocondrial, lisosomal, de membrana celular o una proteína de secreción; esta información se encuentra codificada en el extremo amino terminal del péptido naciente y puede constituir un punto más de control. El último punto de regulación consiste en aumentar o disminuir la velocidad de degradación de las

93

proteínas por el sistema de la ubiquitina; este mecanismo nuevamente contribuye a controlar la cantidad del producto génico. A pesar de la diversidad de los niveles de regulación de la expresión génica, los mecanismos más comunes son los que modulan la eficiencia de la transcripción y los que modulan la actividad biológica por modificaciones postraduccionales, entre los que destacan la fosforilación y la desfosforilación. Hemos mencionado los rasgos más sobresalientes de la manera en que las células regulan la expresión génica, pero aún es poco lo que se sabe con respecto a cómo se integran e interaccionan. Por ejemplo, aún resulta difícil explicar cómo distintos factores de crecimiento, con diferentes receptores de membrana y sistemas de transducción, estimulan a los mismos factores de transcripción, pero conducen a respuestas celulares diversas. El gran número de niveles a los cuales se puede regular la expresión génica y las múltiples combinaciones y secuencias en las que pueden presentarse sugiere una gran complejidad. El resultado final de esta complejidad determina al tipo de genes que participan y la secuencia en la que se expresan para dar origen a los diferentes tipos celulares.

E. Virus, oncogenes y transformación

Al finalizar esta subunidad el alumno conocerá la estructura general de los virus, su clasificación y su posible implicación en la transformación celular. Conocerá la relación entre la función de los productos de los oncogenes y la transformación celular.

E.1 Describirá la estructura general de los virus.

E.2 Conocerá la clasificación de los virus con base en su ácido nucleico y dará ejemplos de cada uno.

E.3 Definirá los conceptos de oncogén y protooncogén.

E.4 Revisará algunos mecanismos por los cuales un protooncogén se transforma en oncogén, como:

E.4.1 Inserción de un promotor o de un intensificador (amplificador).

E.4.2 Mutación puntual. E.4.3 Traslocaciones cromosómicas. E.4.4 Amplificación.

E.5 Estudiará el producto de algunos oncogenes como son: src, sis, erb B, ras y myc y establecerá la relación entre la función de dichos productos y la transformación celular.

Los virus son partículas subcelulares constituidas por ácidos nucleicos en forma de DNA o de RNA de cadena doble o sencilla, proteínas y, en ocasiones, membranas lipídicas. Su genoma compacto está constituido por un reducido número de genes que codifican para proteínas estructurales de la cápside, enzimas de duplicación, así como enzimas y secuencias de DNA que permiten la inserción del genoma viral al genoma de la célula huésped, entre otros. Los virus son incapaces de multiplicarse de manera autónoma, pero pueden hacerlo cuando se encuentran en el interior de una célula. En la mayoría de los casos la infección viral conduce a la multiplicación viral a expensas de la célula infectada. El daño ocasionado al destruir las células es responsable de una gran variedad de enfermedades de menor gravedad, como la influenza, o enfermedades más serias, como la viruela, e incluso enfermedades mortales, como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. En algunos casos la infección viral se asocia a una mayor frecuencia en el desarrollo de tumores y cáncer, como es el caso del virus del papiloma y el cáncer cervicouterino. Es

94

interesante notar que un tipo de virus sólo puede infectar a un restringido tipo de células y a ninguna otra, por ejemplo, el virus del herpes infecta las células de los nervios periféricos. A este fenómeno de especificidad de infección se le denomina tropismo y se debe a que el virus y su célula blanco interactúan por la unión de una proteína de la envoltura viral con un antígeno presente en la membrana celular. Las enfermedades por virus son difíciles de tratar debido a que, fuera del momento en que las partículas virales viajan hasta sus células blanco y penetran en su interior, no pueden ser neutralizadas por anticuerpos. El problema del reconocimiento de antígenos virales por anticuerpos se dificulta si uno considera que en poco tiempo emerge un gran número de partículas virales de una célula infectada y que el tiempo en que se logran títulos protectores de anticuerpos es relativamente largo. A estas dificultades se suma una característica genética de los virus que les permite tolerar cambios de secuencias o incluso eliminar o adquirir nuevos genes a lo largo de su multiplicación, lo que les confiere una gran diversidad genética. Estos cambios en secuencias son particularmente nocivos cuando ocurren en regiones del DNA que codifican para los antígenos que son reconocidos por anticuerpos. Las proteínas virales que se seleccionan son aquellas que continúan teniendo la función requerida por el virus, pero que no pueden ser reconocidas por los anticuerpos. La velocidad con la que estos cambios se propagan a toda la población viral es sorprendentemente rápida y previenen el uso eficaz de vacunas contra varias enfermedades virales. Además de los anticuerpos, el organismo produce factores proteicos solubles llamados interferones que aceleran la muerte de la célula infectada e interrumpen la expresión de proteínas virales.

El que los virus se aíslen del sistema inmune, su ciclo de vida y su gran diversidad genética, son responsables de que no haya medidas eficaces para su eliminación y son la causa de su gran impacto, tanto en la salud pública, como en la economía agropecuaria y agrícola. En su mayoría, los virus son capaces de activar la maquinaria de síntesis del DNA de la célula infectada, evento ligado al ciclo celular y al control mismo de la proliferación; al interferir con este aspecto de la vida celular los virus aseguran su multiplicación. No es sorprendente entonces que en ocasiones los virus hayan incorporado a su reducido genoma versiones de genes celulares que controlan la proliferación celular. Un ejemplo de este tipo de genes es ras, que codifica para una proteína G monomérica que transduce la señal proliferativa de diversos factores de crecimiento. La versión celular de ras (c-ras) posee homólogos virales (v-ras), la mayoría de los cuales presenta alteraciones que dan lugar a una proteína permanentemente activa y que no está sujeta a la regulación celular. Así, mientras que c-ras sólo entra en función cuando los receptores o factores de crecimiento son activados, v-ras constantemente obliga a la célula a proliferar. Cuando los virus, en lugar de lisar a una célula, integran su genoma al material genético de ésta, los genes virales pueden expresarse de manera constitutiva; si esto ocurre con genes como v-ras, se favorece una proliferación celular descontrolada y se dice que la célula ha sido transformada. Hay proteínas virales que pueden interferir con la proliferación celular, como el antígeno grande T del adenovirus o las proteínas E7 del virus del papiloma. No sólo la integración viral puede dar origen a la expresión de genes que promueven la proliferación celular, también la aparición de mutaciones espontáneas puede dar origen a versiones de c-ras que al igual

95

que v-ras estimulan continuamente la proliferación. A estas versiones mutadas se les denomina oncogenes, ya que están asociadas al desarrollo de neoplasias, tumores y diversos tipos de cáncer. A los genes celulares que al ser mutados pueden dar origen a oncogenes se les denomina protooncogenes; a éstos pertenece una larga lista de receptores y proteínas de transducción de diferentes factores de crecimiento y proteínas que controlan el ciclo celular. Mientras que los protooncogenes son todos parte de las señales que activan la proliferación, también existen genes cuyos productos sirven para frenarla. A estos frenos de la proliferación se les denomina genes supresores de tumores o antioncogenes. Si un gen supresor de tumores se muta y pierde su función, el resultado puede compararse con la pérdida de un freno de la proliferación celular. Cuando esto ocurre también puede presentarse un crecimiento descontrolado, ahora como resultado de la falta de un mecanismo de freno. Las células transformadas poseen mutaciones, tanto en protooncogenes como en genes supresores de tumores, lo que da como resultado una señal permanente de proliferación, por un lado, y la falta de mecanismos de freno, por el otro. Esta combinación hace que estas células presenten una duplicación descontrolada y mucho más veloz que las células normales, lo que, en parte, es responsable del crecimiento desmesurado de las masas tumorales.

F. Técnicas de manipulación del DNA

Al finalizar esta subunidad el alumno conocerá las diferentes técnicas de manipulación del DNA y sus posibles aplicaciones.

F.1 Señalará la importancia de la tecnología del DNA recombinante en el campo de la medicina.

F.2 Definirá qué son las enzimas de restricción y conocerá cuál es su utilidad y función en el estudio y la manipulación del DNA.

F.3 Definirá qué es un vector de clonación y un vector de expresión; tomará como ejemplo los plásmidos.

F.4 Conocerá en qué consiste el procedimiento básico de la metodología de clonación y cuál es su utilidad, al tomar en cuenta:

F.4.1 Cómo se fragmenta el DNA. F.4.2 Cómo se unen los fragmentos de

DNA a los vectores. F.4.3 Cómo se introduce el DNA

recombinante en las células hospederas (transfección).

F.4.4 Cómo se seleccionan las células que contienen DNA recombinante.

F.4.5 Cuál es la utilidad del DNA recombinante.

F.5 Conocerá los mecanismos de recombinación in vitro (ingeniería genética).

F.6 Conocerá el significado de los téminos: transgen, sobreexpresión, knock out, huella digital del DNA y polimorfismo.

Las técnicas modernas de biología molecular han permitido un gran control sobre la caracterización y manipulación del material genético tanto de DNA como de los distintos tipos de RNA. Debido a su especificidad y gran capacidad de detección, estas técnicas han tenido un gran impacto en la medicina. Inicialmente, la biología molecular se ha aplicado al diagnóstico de entidades patológicas y para determinar la presencia de agentes infecciosos como microorganismos y

96

virus. En la actualidad se estudia con gran interés la posibilidad de una terapéutica génica que pueda corregir alteraciones fisiopatológicas derivadas de la pérdida de la función parcial o total de un gen; esto abre una nueva era en las aplicaciones de la biología molecular en la medicina. La biología molecular recibió un gran impulso con el descubrimiento de entidades circulares de DNA llamadas plásmidos que, además de poseer genes que confieren resistencia a los antimicrobianos, pueden contener y expresar muchos otros genes. Dos herramientas cruciales de la biología molecular son la posibilidad de cortar el DNA con enzimas de restricción, endonucleasas que sólo cortan secuencias específicas, y el uso de ligasas, que generan un enlace covalente entre los extremos obtenidos por la acción de las enzimas de restricción. Estos dos principios básicos permiten remover o insertar cualquier porción de DNA contenida entre dos sitios de restricción y se dice que se ha clonado esta secuencia de DNA. La clonación hace posible introducir en un plásmido, no sólo secuencias de DNA de otros plásmidos, sino también de cualquier origen: viral, bacteriano, animal o vegetal. La reciente aplicación de transcriptasas reversas de origen viral, enzimas que sintetizan DNA complementario mediante RNA como molde, y de polimerasas termostables que permiten “amplificar” un segmento de DNA, ha simplificado aún más el uso de técnicas de biología molecular. El tener secuencias de DNA o DNA complementario al RNA mensajero ha resultado de gran utilidad para el estudio de genes y RNA mensajeros. Los fragmentos de DNA obtenidos de la clonación en plásmidos, o por transcripción reversa y amplificación, pueden unirse a nucleótidos marcados con el isótopo radiactivo del fósforo 32P, o "derivatizados" con moléculas fluorescentes; la marca permite seguir a estas moléculas que sirven como sondas para localizar a sus

secuencias complementarias. La gran especificidad y elevada capacidad de detección de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria permite el análisis de DNA para detectar la presencia y número de copias de un gen (técnica denominada Southern); también se aplica en la identificación y la cuantificación de RNA mensajeros (técnica a la que se le denomina Northern). Los segmentos de DNA cuyo estudio ha resultado de mayor interés son aquellos que contienen toda la información de un gen o de las regiones reguladoras. Sin embargo, introducir un gen o un promotor a unas cuantas moléculas de plásmido sería problemático para estudios bioquímicos, genéticos y estructurales por la reducida cantidad de material. Esta limitación había sido resuelta previamente, ya que los plásmidos pueden ser introducidos a bacterias a través del proceso de transformación. Normalmente los plásmidos contienen secuencias que les permiten multiplicarse una vez que están dentro de una bacteria; a estas secuencias se les denomina origen de duplicación. Gracias a que los plásmidos contienen genes que confieren resistencia a los antimicrobianos, las bacterias que han sido transformadas con un plásmido pueden distinguirse de las que no lo han sido al hacerlas crecer en medio de cultivo que contiene al antimicrobiano en cuestión; los antimicrobianos más utilizados son la ampicilina y la kanamicina. Este simple proceso de selección logra dos resultados prácticos: por una parte, elimina a las bacterias no transformadas y, por otra, asegura la multiplicación masiva del plásmido que se duplica junto con el genoma bacteriano. El resultado es un cultivo de bacterias con un alto contenido de plásmidos y, por tanto, del segmento de DNA que se desea estudiar. La multiplicación del segmento de DNA por estudiar asegura

97

suficiente material para cualquier otro propósito. A los plásmidos que sirven para insertar DNA ajeno al plásmido y permiten su multiplicación se les denomina vectores de clonación, pero existen también plásmidos más complejos en los que el sitio en el que se puede insertar el DNA exógeno se encuentra frente a una región reguladora que permite la síntesis de RNA mensajero. A estos plásmidos se les llama vectores de expresión, ya que permiten que el DNA sea transcrito a RNA; estos plásmidos pueden presentar regiones reguladoras reconocidas por bacterias o por células de animales. Hemos dicho que la transformación consiste en introducir el DNA a una bacteria y expresarlo; cuando esto ocurre en una célula eucariótica: levadura, célula animal o vegetal, el proceso se denomina transfección. Una aplicación particularmente útil de la biología molecular se ha derivado del uso de vectores de expresión en bacterias y células animales. La expresión de proteínas exógenas por

bacterias y levaduras ha permitido obtener cantidades suficientes para estudios bioquímicos, estructurales e, incluso, ha sido la principal fuente para la cristalización. La transfección y la expresión de proteínas exógenas en células de mamíferos y en células vegetales ha permitido identificar versiones de genes que contienen alteraciones en sus secuencias que dan como resultado proteínas con una función alterada. Con esta aproximación se han identificado mutaciones responsables de enfermedades como el cáncer y la diabetes. Una aplicación sorprendente ha sido la de identificar la función de genes recién descubiertos que al ser insertados en vectores de expresión no sólo han permitido obtener proteínas puras en cantidades suficientes para su caracterización bioquímica, sino también han dado la oportunidad de conocer su función, al expresarlas en un ambiente celular normal.

98

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

I CONCEPTOS TEÓRICOS INICIALES

99

EL MÉTODO CIENTÍFICO La cultura no puede comprenderse sin hacer

referencia al método científico. La ciencia no

es un sector de la civilización que pueda

separarse del resto de ella, sino un esfuerzo

creativo con su propio sistema de valores

que, poco a poco, ha llegado a formar parte

de los valores generales en la sociedad

moderna.

La ciencia está basada en el método

científico; su capacidad y limitaciones están

definidas por él y dondequiera que el método

científico sea aplicable, puede haber ciencia.

El origen de la ciencia se pierde en

el más remoto pasado. Mucho antes de que

existieran los registros históricos de la

humanidad, la magia primitiva dio origen

también a la religión y, mucho antes, al arte.

Ciencia, religión y arte difieren en métodos,

pero coinciden en metas: comprender e

interpretar al universo y la interacción de sus

partes para promover el progreso material y

espiritual de la humanidad.

El objetivo de la ciencia es hacer

teorías. Las teorías científicas explican los

hechos y predicen con alto grado de

probabilidad la ocurrencia de hechos

similares.

La secuencia del método científico

es: observar, plantear problemas, hacer

hipótesis, experimentar y formular teorías.

Cada uno de los procesos del método

científico, tomado aisladamente, forma parte

de la actuación cotidiana de todos los seres

humanos, pero, en su conjunto, utilizados

sistemáticamente, constituyen la más

poderosa herramienta que ha diseñado la

humanidad para conocer y controlar a la

naturaleza.

Observación

El método científico se inicia con la

observación. Lo que no puede observarse,

directa o indirectamente por medio de

instrumentos o de modificaciones de la

conducta, no puede ser investigado por la

ciencia.

La observación debe ser repetida en

forma independiente por observadores

diversos. Las observaciones únicas, que no

se repiten ni actual ni potencialmente, no

pueden ser objeto de estudio científico.

Problema

Después de que una observación se hace y

se repite, el segundo tiempo del método

científico es plantear un problema; en otras

palabras, se hacen preguntas sobre la

observación: ¿Cómo es que los hechos

ocurren de esta manera? ¿Qué es lo que

determina su desarrollo, evolución y término?

Es en este punto donde el científico difiere

100

del hombre común; ambos hacen

observaciones pero sólo el primero muestra

curiosidad científica sobre ellas.

Plantear un problema es hacer

preguntas, pero, hacer “buenas preguntas” al

igual que hacer “buenas observaciones” es

un arte muy preciado. Para que tengan valor

científico los problemas deben ser

significativos y tener respuestas

comprobables por técnicas apropiadas.

Las preguntas que se inician por

¿cómo? o ¿qué? se resuelven mejor,

científicamente, que las que comienzan con

¿por qué?, pero los investigadores pueden

formular los problemas para que adopten la

forma adecuada.

Hipótesis

Una vez planteado un problema adecuado, el

científico procede al tercer tiempo del

método: formular una explicación o hipótesis.

Por supuesto que un problema puede tener

varias explicaciones posibles, pero sólo una

de ellas es la verdadera. Las respuestas

casuales a un problema son generalmente

erróneas; pero el científico con su intuición,

su experiencia y, a veces por incidentes

afortunados, acierta en la hipótesis. Esto se

sabe al emplear el cuarto tiempo del método

científico.

Experimentación

El objetivo de la experimentación es

comprobar la validez de la hipótesis. Si los

experimentos demuestran que la hipótesis es

errónea, se hace una nueva y se la sujeta a

comprobación. El procedimiento puede

prolongarse por mucho tiempo al formular

nuevas hipótesis y tratar de comprobarlas

experimentalmente.

La situación ideal en la

experimentación consiste en reducir el

problema a dos alternativas posibles que

puedan contestarse con claridad, afirmativa o

negativamente; pero en muchas ocasiones

los resultados del experimento sólo conducen

a soluciones parciales.

La experimentación es la parte más

ardua del método científico. Cada

experimento es un caso en sí mismo; el

conocimiento anterior y la experiencia

ayudan técnicamente para decidir la forma en

que una hipótesis puede ser comprobada

experimentalmente. La elección correcta del

experimento y su interpretación es lo que

separa al genio del aficionado a la

investigación.

Teoría

Las pruebas experimentales son la base del

quinto peldaño, final del método científico: la

formulación de una teoría. Cuando una

hipótesis se ha sostenido por pruebas

convincentes, obtenidas por muchos

laboratorios e investigadores independientes,

se propone una teoría que consiste en una

afirmación con límites mucho más amplios

que los experimentos en que se basa y que

expresa la creencia o probabilidad de que

sea valedera en cualquier combinación de

sujeto, tiempo y lugar en donde se reúnan

condiciones similares.

Desde este punto de vista una buena

teoría permite hacer “predicciones.” Las

predicciones científicas tienen siempre un

soporte experimental muy sólido y aun

cuando no afirman que un hecho ocurrirá con

certidumbre, sí plantean que tiene una gran

probabilidad de ocurrir.

Unas pocas teorías han probado su

validez tan universalmente, y expresan tan

alto grado de probabilidad, que se las conoce

con el nombre de leyes naturales. Por

ejemplo, ninguna excepción se conoce al

hecho de que una manzana desprendida de

101

su árbol caerá al suelo si no es sostenida de

alguna manera. La ley de gravitación se basa

en esta observación.

Las leyes naturales orientan la

investigación científica. Si en el análisis de un

hecho se elimina lo imposible, aquello que es

contrario a las leyes naturales, lo que resta,

aunque sea muy raro y poco probable, debe

ser la verdad. La verdad son los hechos que

nos rodean. Aunque acontecen sin cesar a

nuestro alrededor, muy pocas personas y

muy pocas veces se hace un análisis

científico de ellas.

Si se emplean las leyes naturales

para marcar lo imposible, con el resto posible

se hacen nuevas hipótesis, se comprueban

por experimentos, se formulan nuevas

teorías y se acumula el conocimiento

científico que ha permitido al hombre situarse

en un Universo observable que tiene un radio

(r) de millares de millones de años luz y que

incluye un microcosmos tan pequeño que se

expresa en órdenes de magnitud menores de

10–20

m y adquirir un dominio incuestionable

sobre su ambiente.

SISTEMA INTERNACIONAL DE UNIDADES

(SI)

Los resultados de todos los experimentos en

que se basan las teorías científicas y las

leyes naturales derivan de las mediciones de

objetos o de sus propiedades.

Medir es comparar magnitudes; toda

medición comprende un número y una

unidad. La unidad identifica la clase de

dimensión y el número expresa las veces que

la unidad está contenida en el objeto o la

propiedad medida. La medición es un arte

muy refinado; en la actualidad emplea

instrumentos muy complejos y alcanza una

precisión extraordinaria.

Un sistema de medidas preciso

requiere unidades bien definidas. La Oficina

Internacional de Pesas y Medidas revisa

periódicamente el sistema para incorporar los

adelantos tecnológicos y mejorar la exactitud

y precisión de las medidas.

Se han hecho muchos esfuerzos

para desarrollar un sistema de unidades

universalmente aceptable. El producto de

estos esfuerzos es el Sistema Internacional

de Unidades (cuya abreviatura es SI en todos

los idiomas). A partir del creciente

intercambio de información científica este

sistema ha sido aceptado por toda la

comunidad y en especial en medicina. El SI

es esencialmente una versión ampliada del

sistema métrico decimal.

El SI comprende tres tipos de

unidades: las unidades de base, las unidades

derivadas, las unidades suplementarias y una

serie de prefijos que permiten tomar múltiplos

y submúltiplos decimales de las unidades

utilizadas.

Unidades de base

El SI consta de siete unidades básicas que

son dimensionalmente independientes. Las

unidades básicas están anotadas en el

cuadro I.1, junto con los símbolos que hay

que utilizar para indicar estas cantidades.

Unidades SI derivadas

Al multiplicar una unidad de base por sí

misma o al asociar dos o más unidades de

base por una simple multiplicación o división,

se puede formar un amplio grupo de

unidades llamadas SI derivadas (cuadro I.2).

Ejemplo: la unidad derivada de volumen es el

metro elevado al cubo, o metro cúbico.

La combinación de unidades de base

para formar las unidades derivadas es una

102

de las grandes ventajas del SI. En el SI no es

preciso memorizar factores de conversión; el

factor a que se recurre para formar las

unidades derivadas es 1 (unidad), cualidad

que hace al SI coherente.

Cuadro I.1. Unidades básicas del SI. Magnitud Nombre Símbolo

Longitud metro m Masa kilogramo kg

Tiempo segundo s Cantidad de

sustancia mol mol

Temperatura

termodinámica kelvin K

Intensidad luminosa candela cd

Intensidad de corriente eléctrica

ampere A

Cuadro I.2. Algunas unidades derivadas simples Magnitud Nombre Símbolo Superficie metro

cuadrado m

2

Volumen metro

cúbico m

3

Concentración de sustancia

mol/metro cúbico

mol/m3

Velocidad metro por segundo

m/s

A cierto número de unidades SI derivadas se

les ha dado nombres especiales, en su

mayor parte tomados de los hombres de

ciencia que han hecho contribuciones

notables al conocimiento del tema de estudio

correspondiente (cuadro I.3).

Prefijos SI

Cuando las unidades SI derivadas resultan

demasiado grandes o demasiado pequeñas

para determinados fines (sería

desproporcionado, por ejemplo, utilizar el

metro cúbico para expresar el volumen de

sangre del cuerpo humano), el SI contiene

una serie de prefijos que permiten formar

múltiplos y submúltiplos decimales de las

unidades SI (cuadro I.4).

Los prefijos SI se anteponen

directamente al nombre de la unidad, sin

signo de puntuación alguno (ejemplo:

nanómetro y no nano-metro).

El símbolo del prefijo se antepone

también directamente al símbolo de la

unidad, sin espacios intermedios ni signos de

puntuación (ejemplo: mm, milímetros; nmol,

nanomol que equivale 10–9

moles).

Cuadro I.3. Unidades SI derivadas con

nombres especiales

Magnitud Nombre Símbolo Definición

Fuerza Newton Nm. kgm/s2

Presión Pascal Pa N/m2

Trabajo;

energía;

cantidad de

calor

Joule J Nm

Carga

eléctrica;

cantidad de

electricidad

Coulomb C A.s

Potencia;

flujo

energético

Watt W J/s

Tensión

eléctrica;

potencial

eléctrico

Volt V W/A

Temperatura

Celsius

Grado

Celsius

°C

K–273,16

103

Cuadro I.4. Prefijos SI.

Factor Prefijo Símbolo

1018

exa E

1015

Peta P

1012

Tera T

109 Giga G

106 Mega M

103 Kilo k

10–3

Mili m

10–6

Micro µ

10–9

Nano n

10–12

Pico p

10–15

Femo F

10–18

ato q

Unidades no pertenecientes al SI

Ciertas unidades ajenas al SI son de uso tan

frecuente que en cierto modo forman parte

de nuestra vida cotidiana y se acordó

utilizarlas juntamente con el SI (cuadro I.5).

Algunas de estas unidades, en

especial el litro y las unidades de tiempo, son

de gran importancia en las profesiones de la

salud. Conviene señalar que el litro es un

nombre especial que se da al submúltiplo,

decímetro cúbico, de la unidad SI de

volumen.

Cuadro I.5. Algunas unidades no

pertenecientes al SI.

Magnitud Unidad Símbolo Valor en

SI

Tiempo minuto min 60 s

hora H 3 600 s

Día D 86 400 s

Volumen Litro l o L 10-3 m3

Energía caloría cal 4.185J

Reglas de escritura de símbolos y cifras.

Los símbolos de las unidades no toman la

terminación del plural (ejemplo: dos mililitros

se escribe 2 ml, y no 2 mls).

Los símbolos de las unidades jamás

van seguidos de un punto, salvo si están al

final de una frase (ejemplo: 5 ml y no 5 ml.).

Cuando se escriben cifras, la coma

sólo se puede utilizar para indicar los

decimales; las cifras deben agruparse en

tríos, dispuestos a la derecha y a la izquierda

de la coma, y separados entre sí por un

pequeño espacio. Ejemplo:

forma correcta: 1 000 000

0,003 278

0.003 278

forma incorrecta: 1,000,000

0.003,278

La multiplicación de las unidades se

indica con un punto a nivel o elevado

(newton.metro=N.m) o un espacio (N m). La

división se puede indicar mediante una barra

oblicua o por exponentes negativos:

1/s = s–1

mol por metro cúbico puede expresarse por:

mol/m3 o mol.m

–3

El SI tiene muchas ventajas y

algunas desventajas, pero se reconoce la

realidad del esfuerzo para implantarlo como

una forma de expresar los datos científicos,

comprensible para todos. Se recomienda

desechar las unidades que no pertenecen al

SI a la mayor brevedad posible, pero la

realidad del uso de otras unidades en textos

y comunicaciones científicas no se puede

negar. En este Manual las unidades SI se

anotarán entre paréntesis cuando se juzgue

conveniente.

104

Algunas recomendaciones para utilizar

el SI en bioquímica

PARA EXPRESAR CONCENTRACIONES

La concentración de sustancias cuya masa

molecular se conoce se expresa en forma de

cantidad de sustancia, es decir, en moles (o

en submúltiplos como el milimol o el

nanomol) por litro. Ejemplo:

Ácido úrico en el suero o plasma:

Varones: 0.18 a 0.53 mmol/l.

Mujeres: 0.15 a 0.45 mmol/l.

Colesterol en el suero o plasma: 3.9 a 7.2

mmol/l.

Glucosa en el suero o plasma: 3.6 a 6.1

mmol/l.

Vitamina A en el suero: 0.53 a 2.1 µmol/l.

La concentración en forma de

cantidad de sustancia no debe ser

denominada “concentración molar” o

molaridad, ni utilizar el símbolo M en vez de

mol/l (como tampoco mM, nM, etcétera, en

vez de mmol/l, nmol/l, etcétera).

La concentración de sustancias cuya

masa molecular se desconoce o es dudosa

se expresa en kg/l, g/l, mg/l, etcétera.

Ejemplo:

Proteína sérica total: 60 a 80 g/l.

Albúmina sérica: 33 a 55 g/l.

Globulina sérica: 20 a 36 g/l.

Fibrinógeno en el plasma: 2 a 6 g/l.

Hormona antidiurética en plasma: 2 a 12

pg/ml

Concentración de sustancias en tejidos.

Se expresa en unidades de masa (si no se

conoce la masa molecular) o en moles (si se

conoce la masa molecular) por kilogramo de

tejido seco o húmedo. Ejemplo:

g/kg, mg/kg o mol/kg, mmol/kg, etcétera.

No se recomienda expresarla en unidades

de volumen, es decir en mg/ml, g/l, etcétera.

Concentración de iones hidrógeno.

La concentración de hidrogeniones en los

líquidos biológicos se expresa en nmol/l, así

como en unidades de pH. El valor del pH se

define como el logaritmo negativo de la

actividad de los iones hidrógeno (pH = -log

H+), esta actividad puede determinarse

potenciométricamente con la ayuda de un

pH-metro.

Actividad enzimática. La unidad SI de

actividad catalítica es mol por segundo: mol/s

(también llamado katal, símbolo: kat) y

corresponde a la cantidad de sustrato

transformado por segundo como resultado de

la catálisis. La velocidad medida es

proporcional a la cantidad de enzima

presente.

La actividad también puede ser

expresada en términos de unidades (símbolo:

U). Por definición, una unidad es igual a la

concentración de enzima necesaria para la

formación de un micromol de producto por

minuto (µmol/min). La actividad específica de

una enzima se define como la concentración

de producto que se forma por 1 miligramo de

enzima por minuto.

MATEMÁTICAS PARA EL LABORATORIO

Notación científica o exponencial.

Cuando se expresan cantidades muy

grandes o muy pequeñas, como es el caso

frecuente en bioquímica, la dificultad de

escribir y manipular muchos ceros se evita

con el uso de la notación exponencial o

científica.

En la notación exponencial todo

número puede expresarse como una

potencia entera de 10, o como un producto

de dos números, uno de los cuales es una

potencia entera de 10. Ejemplo: el número de

Avogadro seiscientos dos sextillones se

escribe:

105

602 000 000 000 000 000 000 000

y en la notación exponencial como una

cantidad decimal multiplicada por 10 elevada

a la potencia apropiada = 6.02 x 1023

. Como

ejercicio, examine las cantidades siguientes:

200 = 2 x 10 x 10 = 2 x 102

205 = 2.05 x 102

205 000 = 2.05 x 105

0.205 = 2.05 x 10–1

0.000 205 = 2.05 x 10–4

0.000 000 1= 1/10 000 000 = 1 x 10–7

El exponente de la base 10 para

números mayores de la unidad es el número

de lugares desde la coma o punto decimal

separada de la primera cifra significativa:

205 = 2.05 x 102 = 2 lugares

Para fracciones decimales menores

de la unidad se separa la primera cifra

distinta de cero después de la coma decimal

y se cuentan los lugares hacia la izquierda

hasta la coma decimal, incluso la cifra

separada y el número es el exponente

negativo:

0.000 205 = 0.000 “2”05

del 2 a la coma decimal son 4 lugares; por lo

tanto, es 2.05 x 10–4.

Las operaciones de multiplicar y

dividir, elevar a potencias o extraer raíces se

facilitan manipulando los exponentes según

reglas muy sencillas. La porción decimal no

exponencial se opera en forma ordinaria, lo

que reduce el manejo a tres cifras

significativas como máximo; los exponentes

se suman algebraicamente para multiplicar,

se restan para dividir, se multiplican por una

potencia deseada para tener el exponente de

la misma y para encontrar raíces se divide el

exponente entre el índice de la raíz.

Ejemplos:

6 x 106 por 3 x 10

3 = 18 x 10

9 = 1.8 x 10

10

ya que 6 x 3 = 18 y 106+3 = 10

9

6 x 106 entre 3 x 10

3 = 2 x 10

3

ya que 6/3 = 2 y 106–3

= 103

Para la adición y la sustracción usando

notación científica, primero se escribe cada

cantidad con el mismo exponente n. Luego

se realiza la operación deseada entre los valores N1 y N2, donde N1 y N2 son los

números obtenidos con el mismo exponente;

estos últimos permanecen iguales. Ejemplo:

(5.1 x 102) + (3.4 x 10

3) = (0.51 x 10

3) + (3.4 x

103) = 3.91 x 10

3

El método del factor unitario en los

Cálculos.

El procedimiento que se utilizará para

resolver problemas que incluyan conversión

de unidades se denomina método del factor

unitario. Esta técnica se basa en las

propiedades del número 1, es decir:

• Cualquier número al ser multiplicado por

uno, sigue siendo el mismo número (1 x 5 =

5).

• El número 1 puede ser escrito como el

cociente de cualquier número dividido por si

mismo (3/3 ó 6/6).

• Se puede tomar cualquier ecuación y

dividirla por uno de los miembros para

obtener una razón igual al número 1.

Por ejemplo, dada la ecuación:

1 minuto = 60 segundos, obtener la razón

igual al número 1.

1 minuto = 60 segundos

1 minuto 1 minuto

1= 60 segundos ó 1= 1 minuto

1 minuto 60 segundos

106

Estas razones o factores que son

equivalentes al número 1 se conocen como

factores unitarios, factores de conversión o

coeficientes de conversión.

El recíproco de cualquier factor

unitario es también un factor unitario.

En ambos casos el numerador y el

denominador describen la misma cantidad,

por lo que se puede efectuar conversiones

entre diferentes unidades que miden la

misma cantidad.

El método del factor unitario consiste en:

1. Tomar una relación entre unidades y

expresarla en forma de una ecuación,

2. Luego expresar la relación en forma de

una fracción (llamada factor de

conversión) y, por último;

3. Multiplicar la cantidad dada por ese factor.

En esta multiplicación, las unidades

idénticas se multiplican o cancelan como

si fueran números.

Ejemplo: ¿Cuántos µl hay en 0.00005 L (5 x

10-5 L)?

1) 1 µl = 10-6

L ó 1 L = 106 µl

2) 106 µl

1 L

3) 5 x 10-5 L x= 5 x 10

[-5+ 6] = 5 x 10

1 µl =

50µl.

En este método las unidades se

acarrean en todo el proceso del cálculo, por

lo tanto si la ecuación se establece en forma

correcta, todas las unidades se cancelan

excepto la deseada.

Logaritmos

El logaritmo de un número es el exponente o

potencia de una base determinada que se

requiere para obtener el número. Si el

número “a” elevado a la potencia “n” (an) es

igual al número “N”, entonces “n” es el

logaritmo de base “a” del número “N.” Es

decir:

si an = N entonces n = loga de N

La base “a” puede ser cualquier

número; en la práctica médica se usa como

base el número 10 y los logaritmos

resultantes se conocen como logaritmos

“comunes” o de Briggs. Su símbolo es: log o log.10

Los logaritmos son indispensables

para manejar los datos bioquímicos; constan

de dos partes que se separan por una coma

o punto decimal; a la izquierda, la

característica corresponde al orden de

magnitud y puede ser positiva o negativa

según sea la cantidad mayor o menor de la

unidad. El exponente de la base 10 para

números mayores de la unidad es siempre

positivo. Cuando es negativo se indica con el

signo menos arriba del número que la

representa:

0.001 = 10 -3 característica 3

1 000 = 10 -3 característica 3

A la derecha, la mantisa es la

fracción decimal de exponente que

corresponde a los dígitos que ocupan el

orden de magnitud; se obtiene de tablas o de

calculadoras electrónicas y siempre tiene

valor positivo:

log 2 = 0,3010 esto es 100.3010

= 2

Cuando la característica y la mantisa

son de diferente signo (+ o –) se opera con el

cologaritmo que se obtiene por la suma

algebraica de la mantisa positiva con la

característica negativa es un número todo

negativo, ver el siguiente ejemplo:

107

Log 0.002 = 3.3010 = -2.6990

3.000

+0.3010

-2.6990 cologaritmo

La característica indica la posición del punto

decimal en la cifra representada por la

mantisa y se determina por inspección del

número.

Para un número mayor que 1, la

característica es uno menos que el número

de cifras antes del punto decimal; así: la

característica de 100 es 2 porque el número

cien tiene 3 dígitos a la izquierda del punto

decimal. Para un número menor que 1, la

característica es numéricamente uno más

que el número de ceros que siguen al punto

decimal; así: la característica de 0.000 000 1

es 7 con signo negativo.

Para encontrar el logaritmo de un

número, por ejemplo: 0.000 809, se busca en

la tabla las dos primeras cifras distintas de

cero de izquierda a derecha (80) en la

primera columna vertical de las tablas se

sigue la horizontal correspondiente hasta la

columna 9, que es el otro número, en donde

se lee 9 079, que es la mantisa requerida. La

mantisa para 809, 8.09, 0.0809, etcétera; es

la misma (9 079), pero difiere la

característica. Así:

Log 0.000 809 = 4.9079 = -3.0921

Si el número del cual se requiere el

logaritmo tiene cuatro cifras, la cuarta se

busca en la misma columna horizontal en la

parte de la tabla que dice “partes

proporcionales” y debe agregarse a la

mantisa como diez milésimos.

Por ejemplo, para el número 8 091:

Mantisa para 809 = 9 079

parte proporcional para 1 = 1

0.9079

+ 0.0001

0.9080; log 8091 = 3.9080

El antilogaritmo es el número que

corresponde a un logaritmo dado. Para

encontrarlo se busca la mantisa en la tabla

de antilogaritmos, se determina el número a

que corresponde y se fija la posición del

punto decimal según la característica. Por

ejemplo el antilogaritmo de 1.6747 es 47.29:

la característica es 1 (hay dos dígitos a la

izquierda del punto decimal) y la mantisa es

0.6747, que se buscaría en la tabla de

logaritmos donde se hallaría que

corresponde a 4 729.

Los estudiantes deben familiarizarse

con el uso de logaritmos en las operaciones

comunes.

El logaritmo del producto de dos

números es igual a la suma de sus

logaritmos:

log a x b = log a + log b

El logaritmo del cociente de dos números es igual al logaritmo del dividendo menos el logaritmo del divisor:

log a/b = log a – log b

El logaritmo de la potencia “n” de un número es igual a "n" veces el logaritmo del número:

log a3 = 3 x log a

Gráficas

"Una figura equivale a mil datos en una tabla

numérica" y así como se construye un

modelo para visualizar un conjunto complejo

de hechos, se utiliza una gráfica para

presentar los datos experimentales en tal

forma que fácilmente se asimilen y aprecien

sus relaciones cuantitativas.

Se llama gráfica a la representación

esquemática de las variaciones que sufren

108

las distintas magnitudes que intervienen en

los fenómenos físicos, químicos, biológicos,

sociales o de cualquier otra índole. Tiene por

objeto mostrar rápida e intuitivamente la

relación que guardan las magnitudes

comparadas.

Entre las diferentes clases de

gráficas que existen las más importantes son:

Gráfica poligonal. Consiste en

expresar las variaciones de un fenómeno

continuo por medio de puntos y de

representar la marcha de dicho fenómeno por

medio de una línea que une esos puntos.

Para elaborar una gráfica poligonal

se trazan en un papel, de preferencia

milimétrico, dos rectas perpendiculares entre

sí que se corten en cero. En cada una de

ellas se representará una de las magnitudes

que se van a relacionar. El punto cero (0) se

llama origen y la rectas son los ejes; 0X es el

eje X y 0Y es el eje Y. Para referirse al eje X

generalmente se dice: eje horizontal o eje de

las abscisas (variable independiente) y para

el eje Y: eje vertical o eje de las ordenadas

(variable dependiente).

Los ejes dividen su propio plano en

cuatro regiones llamadas cuadrantes que se

numeran I, II, III y IV. En el laboratorio

utilizamos habitualmente sólo el primer

cuadrante (figura I.1).

Las distancias a la derecha de 0, a lo

largo del eje X, se consideran como positivas

y las de la izquierda como negativas.

Similarmente, hacia arriba de 0, a lo largo del

eje Y, se miden las distancias positivas y

hacia abajo de 0 las negativas.

Después se trazan los puntos cuyas

distancias a uno de los ejes sean

proporcionales a la magnitud que se va a

representar y, finalmente, al unir estos puntos

por medio de segmentos de recta, se tiene la

gráfica poligonal.

Nota: por lo general, es mejor que la

curva llene una parte considerable de la

página. Muy bien puede usarse la misma

unidad de medida sobre los dos ejes, pero a

menudo los valores tienen un campo de

variabilidad muy amplio, lo cual hace

necesario usar diferente escala para cada

uno de los ejes.

Diagrama en barras. Cuando se

quieren expresar simples comparaciones de

medidas entre sí o para representar un

fenómeno discontinuo se emplean las barras,

que pueden ser horizontales o verticales.

Barras verticales. Las magnitudes se

representan por medio de rectángulos, barras

de base igual que descansan en el eje de las

abscisas y cuya altura es proporcional a la

intensidad del fenómeno y se mide en el eje

de las ordenadas.

Barras horizontales. Las barras

descansan sus bases en el eje de las

ordenadas y el fenómeno se mide en el eje

de las abscisas.

Gráfica de sectores circulares. Para

hacer una gráfica de este tipo hay que tener

en cuenta que el círculo debe tener el total de

las magnitudes que se van a representar.

Los sectores circulares son

proporcionales a las magnitudes que

representan; magnitud que se mide en

grados de circunferencia. Para determinar el

número de grados que deben tener dichas

partes se plantearán una serie de reglas de

tres para cada una de ellas en las cuales se

consideran:

como 100% a la suma total de las

magnitudes que se quieren graficar, para

obtener en cada caso el porcentaje

correspon diente; una vez obtenido

109

éste, se pasará a grados, considerando

360o como 100% y procediendo entonces a

hacer la gráfica.

ALGUNOS MÉTODOS UTILIZADOS EN

BIOQUÍMICA

Centrifugación

Un método muy útil en el laboratorio para

separar sustancias de diferente densidad

suspendidas en un líquido es la

centrifugación; en ella, la acción de la fuerza

centrífuga (fuerza necesaria para desplazar

hacia afuera un determinado peso en

dirección radial) da como resultado que las

partículas más pesadas se sedimenten más

rápido que las partículas ligeras.

La fuerza centrífuga depende de la

cantidad de materia (m) que se desplaza

hacia afuera cuando está rotando a una

velocidad por minuto de (n) veces a una

distancia radial (r) y se expresa por la

fórmula:

f (en dinas) = 0.01096 n2 m r

En el sistema métrico decimal, la unidad de f

es la dina, la de m es el gramo y la de r es el

centímetro. Ejemplo: si se coloca un gramo

de agua en un tubo de centrífuga y se rota a

2 000 rpm (revoluciones por minuto) a una

distancia radial de 16 cm, la fuerza es:

f = 0.01096 x 20002 x 1 x 16 = 701 440 dinas

Si transformamos las dinas a peso,

entonces el gramo de agua tiene peso

porque es atraído al centro de la Tierra de

acuerdo con la ley de la gravitación y es

atraído en estado normal, con 980 dinas de

fuerza. Si usamos, por lo tanto, peso en vez

de dinas como la unidad de nuestro problema

tendremos:

f = 0.01096 x n2mr = 717 g

980

o sea, interpretando la fórmula, la fuerza de

contención para sostener la unidad masa (el

gramo) e impedir que se vaya del centro de

rotación es la fuerza que la gravedad ejercía

sobre 716 g o, dicho de otra manera, el

gramo a esa velocidad pesa en el fondo del

tubo de la centrífuga 716 gramos comparado

con el tubo en reposo o 716 veces la fuerza

de la gravedad (g).

La centrifugación y

ultracentrifugación son operaciones que se

basan en el principio anterior y que permiten

separar los componentes de una mezcla.

Las centrífugas ordinarias operan a

rotaciones menores de 10 000 revoluciones

por minuto (rpm). Las condiciones que limitan

esta velocidad son la resistencia de la parte

de la centrífuga que sostiene el rotor (brazo),

la fricción con el aire y el calentamiento.

Las ultracentrífugas operan en

cámaras refrigeradas, evacuadas de aire, y el

rotor no gira sostenido por un “brazo” sino

impulsado por chorros de aceite o aire

comprimido que se aplica a una porción

externa del rotor sostenido por una pared

muy gruesa de una cámara cilíndrica de

110

rotación. Se alcanzan velocidades de 20 000

a 70 000 rpm.

La sedimentación en la

ultracentrífuga se expresa en unidades

Svedberg (símbolo: S) y se aplica a la

comparación práctica de tamaños

moleculares que no sólo dependen de la

masa de las moléculas implicadas sino

también de su forma. Es importante

considerar que los valores de Svedberg no

son aditivos, es decir, dos partículas 5S no

crean una partícula 10S. Sin embargo, hay

una correspondencia tosca que para las

proteínas esféricas es de:

2 S = 10 kdal 4 S = 50 kdal 8 S = 160 kdal 16 S = 400 kdal

La unidad Svedberg es igual a 10–13

segundos; no pertenece al SI y puede

suplirse por 0,1 picosegundo (ps) o 100

femtosegundo (fs). En las moléculas menos

densas que el medio de suspensión, como

las lipoproteínas, el desplazamiento es hacia

la superficie y se expresa en Svedberg de

flotación (Sf) y permite la clasificación en:

LDL, HDL y VHDL (low density, high density

y very high density) con Sf de 0 a 10, 10 a

400 y las muy densas que no flotan y tienen

una densidad mayor de 1.

El peligro del mal uso de la centrífuga deriva

de la enorme fuerza que alcanza en el radio

de rotación y el “peso” de las sustancias

colocadas en el campo gravitacional del

aparato.

Se debe tener cuidado con los

siguientes puntos:

1. Los tubos en las centrífugas deberán

colocarse por pares para que no haya

diferencia de peso en un lado de la

centrífuga. Enfrente de un tubo de un

peso determinado debe estar otro, en la

misma posición, con el mismo peso. El

descuido de esta regla implica un desnivel

que, a las velocidades y fuerzas

señaladas, puede romper los tubos y

dañar el aparato. Para balancear por

pares los tubos lo mejor es usar una

balanza de dos brazos y ajustar el peso

hasta que sea idéntico.

2. Para no forzar el motor arránquese

gradualmente la centrífuga hasta alcanzar

la velocidad requerida.

3. Nunca se frene una centrífuga; déjese

parar por su propia inercia; el no hacer

esto conduce a que se agite el contenido

de los tubos y se eche a perder el trabajo.

4. No alzar las tapas de la centrífuga cuando

está en movimiento.

5. Ante cualquier dificultad o duda consulte

al profesor.

Potenciometría

Muchas de las reacciones que se realizan en

las células son reacciones de oxidación y de

reducción, es decir, en las que se transfieren

electrones.

La electroquímica estudia las

reacciones químicas en las que hay

transferencia de uno o más electrones.

La oxidación es la pérdida o liberación de

electrones y la molécula que los cede se

denomina agente reductor.

La reducción es la ganancia de electrones y

la molécula que los acepta se denomina

agente oxidante.

Cuando se oxida un agente reductor,

se transforma en su forma oxidada y como la

reacción es reversible las formas oxidada y

reducida del compuesto constituyen un par

conjugado llamado par redox o par de

oxidorreducción.

El proceso de oxidación siempre va

acompañado del proceso de reducción ya

111

que los electrones que cede una molécula

reductora son aceptados por una molécula

oxidante, lo cual constituye las reacciones de

oxidorreducción o reacciones redox.

La determinación cuantitativa de la

concentración de las moléculas oxidantes y

reductoras en una solución es el objeto de

estudio de la potenciometría. En esta técnica

se determina el potencial eléctrico generado

por la transferencia de electrones en una

reacción redox en la cual estén involucradas

las moléculas a estudiar. Este potencial se

mide en una celda electroquímica. La celda

más común es la de Daniell (Fig. I.2), en la

que en dos compartimientos separados que contienen ZnSO4 y CuSO4 se colocan cinc y

cobre metálico, respectivamente; las dos

soluciones se conectan por un puente salino

(un tubo que contiene agar embebido en una

solución de un electrolito como el KCl).

Cuando los dos electrolitos se conectan por

un alambre metálico, ocurre un flujo de

electrones del electrodo de cinc al electrodo

de cobre, el cual puede ser medido por

medio de un voltímetro. Cuando el cinc cede

los electrones se convierte en ion soluble,

mientras que el cobre disuelto, al aceptar los

electrones, se convierte en cobre metálico

que se deposita en el electrodo. El puente

salino cierra el circuito eléctrico entre las dos

soluciones.

El hecho de que fluya una corriente

eléctrica del polo positivo (ánodo, que en

este caso es el electrodo de cinc) al polo

negativo (cátodo, que en este caso es el

electrodo de cobre), significa que hay una

diferencia de potencial entre los electrodos

denominada fuerza electromotriz (fem) de la

celda. Dado que el potencial de un electrodo

está relacionado con la magnitud de cargas

positivas existentes, la diferencia de potencial

compara las cargas relativas existentes en

dos puntos. Se denomina potencial de

electrodo (E) a la diferencia de potencial

respecto a un electrodo de referencia

arbitrario y depende de la concentración de

las moléculas en la solución y de la

temperatura.

En general, el potencial de los

electrodos se mide con referencia al

electrodo de hidrógeno al que se le ha

asignado.

En general, el potencial de los electrodos se

mide con referencia al electrodo de

hidrógeno al que se le ha asignado

arbitrariamente un potencial de cero a 25o C

a una concentración de 1 mmol/L y una

presión del gas de una atmósfera. Sin

embargo, en la práctica es inconveniente

porque se trata de un electrodo gaseoso.

Fig. 1.2 Celda de Daniell

Es por ello, que se usan otros

electrodos de referencia, como el de calomel,

en el cual el sistema de medición es mercurio

y cloruro mercuroso. En el caso de este

electrodo, como sucede con todos los pares

redox, debe calibrarse con respecto al

electrodo de hidrógeno.

Los pares redox de interés para el

bioquímico incluyen a menudo al ion

hidrógeno como reactivo o como producto,

por lo que tales sistemas están en función del

pH del medio.

112

Hay diferentes tipos de electrodos:

los metálicos (como los de la celda de

Daniell), los metálicos-sal insoluble (como el

de plata/cloruro de plata), los gaseosos

(como el de hidrógeno, que se adsorbe sobre

platino), los electrodos selectivos de iones

(que pueden ser para aniones o para

cationes) y los de vidrio (que son electrodos

selectivos de iones, especiales para

determinar H+). Estos últimos son los más

utilizados ya que una de las aplicaciones

prácticas más importantes de la

potenciometría es la determinación del pH.

Dentro del electrodo de vidrio hay un

alambre de plata con un extremo sumergido

en una solución de HCl 0.1M. El bulbo de la

parte inferior es de un vidrio especial,

permeable a los iones H+. La superficie

interior de esta membrana de vidrio está en

contacto con la solución de HCl y la exterior

con la solución cuyo pH se quiere determinar.

En las dos superficies la membrana de vidrio

absorbe agua y forma una capa de gel a

través de la cual difunden los iones

hidrógeno y desplazan a otros iones de la

estructura del vidrio (como sodio) y esto

provoca el establecimiento de un potencial.

En una solución amortiguadora que contenga

Cl– se sumerge un electrodo de Ag/AgCl.

Cuando el electrodo se coloca en una

solución cuyo pH es diferente al de la

solución amortiguadora, aparece una

diferencia de potencial entre los dos

extremos, lo cual es una medida de la

diferencia de los dos valores de pH.

La determinación más precisa del pH

se realiza en un pH-metro que consiste,

fundamentalmente, en un potenciómetro

diseñado para emplearse con un sistema de

electrodo de vidrio. Como una unidad de pH

corresponde a 59 milivoltios a 25º C, el

mismo medidor se puede usar con dos

escalas para hacer lecturas en mv o en pH.

El electrodo de vidrio consiste en una

membrana de vidrio situada al final de un

tubo de vidrio o plástico de paredes más

gruesas. En el tubo se encuentra ácido

clorhídrico diluido saturado de cloruro de

plata y un hilo de plata que conecta a la

terminal del voltímetro con un electrodo de

referencia. El pH se determina midiendo la

diferencia de potencial a través de la

membrana de vidrio que separa la solución a

la cual se quiere determinar el pH, de la

solución de referencia cuya concentración de

hidrogeniones se conoce.

El esquema del circuito de un

potenciómetro típico se encuentra en la figura

I.3. La sensibilidad del medidor se puede

ajustar para cambios de acuerdo a la

temperatura (botón de control de

temperatura). Con el botón de calibración a

cero se introduce un voltaje lateral en el

circuito que permite que la lectura

corresponda al pH de la solución reguladora

tipo. Los medidores de pH se construyen de

tal manera que el cero de la escala del

potenciómetro corresponda a un pH de 7. El

medidor se calibra antes de usarlo, primero

con una solución reguladora de pH 7,

ajustando el cero para que dé la lectura

exacta; se lava el electrodo con agua

113

destilada o desionizada y se calibra con una

segunda solución reguladora de pH 4 ó 10;

se ajusta nuevamente el medidor, ahora con

el control de temperatura, para que dé la

lectura exacta; luego se determina el pH de

la solución problema.

Electroforesis

Una partícula coloidal o un ion provistos de

carga eléctrica emigran hacia el ánodo o el

cátodo bajo la influencia de un campo

eléctrico externo. Si las partículas de una

mezcla tienen diferentes velocidades de

desplazamiento, puede aprovecharse esta

propiedad para separarlas. El empleo de

fuerzas eléctricas para lograr esta separación

se llama electroforesis y depende

fundamentalmente de la carga y no de la

masa molar de las partículas cargadas. Esta

técnica se ha empleado en la

separación de proteínas, péptidos,

nucleótidos, ácidos orgánicos y porfirinas,

entre otros compuestos. Es importante

considerar que en el caso de una proteína su

carga depende del pH del medio, por lo que

es posible emplear la técnica para determinar

el punto isoeléctrico de la misma.

Si se aplica un campo eléctrico a

través de una solución, la fuerza que actúa

sobre las moléculas cargadas de soluto

depende de la carga eléctrica (e); del número

de cargas en la molécula (z), y de la fuerza

del campo eléctrico (E). Inmediatamente

después de poner a funcionar el campo, las

partículas cargadas se aceleran hasta que

alcanzan un equilibrio, o sea, cuando la

carga electrostática queda equilibrada por la

fuerza de fricción que ejerce el medio

disolvente; entonces, se mueven a una

velocidad constante. La velocidad por unidad

de campo eléctrico se denomina movilidad

electroforética. Dado que la fricción depende

del tamaño de la partícula y de la viscosidad

del medio en que se mueve, la facilidad con

la que se mueve una partícula cargada

depende directamente de su carga e

inversamente de su tamaño y de la

viscosidad del medio.

Existen dos tipos de electroforesis: la

frontal y la zonal.

Electroforesis frontal o en medio

líquido. Es el método clásico de Tiselius en el

que la separación de los componentes de

una mezcla se realiza en varios frentes o

límites que se traslapan a lo largo del

procedimiento. El movimiento de los frentes

se realiza en un canal vertical y la densidad

de la solución por debajo del frente debe ser

mayor que la de arriba, ya que en caso

contrario el sistema de frentes se destruiría.

En el método, la solución a separar se coloca

encima del medio amortiguador conductor.

La técnica es difícil y costosa, aunque puede

presentar la ventaja de que se evitan las

interacciones de los solutos con cualquier

superficie y se eliminan así los efectos

adsorbentes y desnaturalizantes. Además,

puede operarse en medios acuosos, a baja

temperatura y bajo condiciones favorables de

pH y fuerza iónica.

Electroforesis zonal. Uno de los

problemas que presenta la técnica anterior es

la necesidad de estabilizar las zonas de

soluto contra la convección gravitacional y la

difusión. Esto originó el empleo de otra

técnica de electroforesis: la electroforesis

zonal. En ella, el empleo de gradientes de

densidad, sólidos porosos o fibrosos y geles

permite resolver el problema de la difusión y

de la convección gravitacional.

En este tipo de electroforesis la

mezcla de solutos a separar se aplica como

una mancha o una banda delgada en un

punto del canal electroforético. Los solutos

migran con distintas velocidades (de acuerdo

a su movilidad) y se separan en zonas

discretas. La distancia de migración es

114

directamente proporcional al voltaje aplicado

y al tiempo. Los solutos migran a través del

solvente que baña un soporte sólido. Este

soporte puede ser de diversa naturaleza y

cada uno presenta algunas ventajas y

desventajas en su uso. Los soportes más

comunes son papel, acetato de celulosa,

almidón, agar, agarosa y poliacrilamida.

Dado que en el caso de los geles es posible

un manejo del tamaño del tamizado para

lograr una máxima eficiencia en la

separación, este método es el más usado en

bioquímica.

En la técnica hay que cuidar algunos

aspectos que pueden afectar la separación

como: la selección adecuada del soporte, del

amortiguador, vigilar la temperatura de la

cámara, la intensidad del campo eléctrico, el

tiempo, etcétera.

Electroforesis en papel y en acetato

de celulosa. La electroforesis en papel fue el

primer método de separación en zonas en un

campo eléctrico. Es una técnica sencilla y

rápida, que requiere pequeñas cantidades de

muestra y que es especialmente útil en las

electroforesis de alto voltaje para separar

moléculas de bajo peso molecular como

aminoácidos, péptidos, oligonucleótidos y

otros compuestos orgánicos con grupos

cargados. Ha sido muy utilizada en el mapeo

bidimensional de proteínas (huella génica),

para identificar diferencias entre proteínas

similares, probar que una proteína es

producto de otra de mayor tamaño, etcétera.

Dado que el papel tiene una alta

actividad endosmótica*, lo que causa algunos

problemas en la electroforesis, ha sido

sustituido por el acetato de celulosa, que

tiene una estructura microporosa uniforme,

actividad endosmótica baja y en el que la

adsorción de las proteínas ha sido eliminada.

En los aparatos en que se realizan

estas técnicas el soporte se humedece al

sumergirlo en el amortiguador y colocarlo de

tal manera que se establezca el contacto con

las soluciones en que están los electrodos.

Los aparatos se tapan para evitar la

evaporación y para mantener una atmósfera

húmeda dentro del aparato.

Electroforesis en geles de agar y

agarosa. El agar es una mezcla de

polisacáridos que se obtiene de ciertas

especies de algas marinas. Está constituido

de dos componentes principales: uno lineal o

agarosa y uno ramificado y muy ácido

llamado agar o pectina. El agar y la agarosa

son solubles en soluciones acuosas a 100oC

y solidifican a temperatura ambiente; forman

geles de buena firmeza cuando se usan a

una concentración de 0.5 a 2%. Su estructura

se mantiene por numerosos puentes de

hidrógeno entre cadenas adyacentes de

polisacáridos. El gel de agarosa ofrece

ciertas ventajas sobre otros soportes; posee

una porosidad elevada y uniforme, lo que

favorece la migración regular de las

sustancias cargadas, lo cual se traduce en

una mayor resolución.

Para realizar la electroforesis en

estos medios se prepara el gel sobre una

superficie de vidrio. Una vez solidificado el

gel, se hacen pocillos en él para aplicar en

ellos la muestra. Se lleva a cabo, o se

"corre", la electroforesis y, al final, se fija la

preparación, se tiñe y se seca. La técnica se

ha usado en combinación con la

inmunodifusión en el análisis inmunológico

de proteínas y en la cuantificación de

proteínas inmunoprecipitables.

La electroforesis en agarosa ha

permitido el estudio de las moléculas del

DNA, cuyo tamaño impide que puedan

penetrar en los geles de poliacrilamida, pero

que penetran fácilmente en geles de agarosa

a 0.2%, si tienen un peso hasta de 150 x 106,

o a 0.8% si pesan hasta 50 x 106.

115

Es posible separar moléculas de

DNA que difieren sólo 1% de peso molecular

según sea la concentración de la agarosa.

Para detectar las bandas, se sumerge el gel

en una solución de bromuro de etidio el cual

se pega al DNA y fluoresce cuando se excita

con luz ultravioleta. El peso molecular se

determina por la distancia de migración.

También se han usado estos geles de

agarosa para la obtención de mapas de

restricción, los que permiten ver diferencias

entre dos moléculas de DNA, localizar

mutaciones, detectar recombinaciones de

fagos, aislar fragmentos de DNA deseados,

distinguir entre el DNA lineal, circular o

superenrollado.

Electroforesis en geles de

poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida

son geles totalmente sintéticos que han

sustituido a los geles de almidón en el

estudio rutinario de proteínas por métodos

electroforéticos. Esto ha sido posible gracias

a la gran facilidad con que puede variarse

según el contenido total del monómero y su

grado de entrecruzamiento. Dada su

capacidad de filtrador molecular, se ha

empleado para separar compuestos con

base en su peso molecular para lo que se

usa lauril sulfato de sodio (SDS) con el objeto

de evitar las diferencias individuales en las

cargas de las proteínas.

Los amortiguadores que se usan pueden ser

continuos (en los que se utiliza el mismo

amortiguador en los tanques de los

electrodos y los sistemas electroforéticos) y

discontinuos, en los que hay dos tipos de

geles: el de separación, o de poro cerrado,

en el cual se resuelven los componentes de

una mezcla (aquí es importante el uso del

amortiguador adecuado) y el gel

concentrador, o de poro abierto, que sirve

para concentrar la muestra. A los geles se les

puede incorporar sustancias disociantes

como la urea y el SDS sin que sean

afectados. También pueden emplearse

agentes reductores como el 2

mercaptoetanol o ditiotreitol para romper los

puentes disulfuro de las proteínas.

Las dos aplicaciones principales de

la electroforesis discontinua son la

determinación de la pureza de proteínas y el

análisis de los componentes de una mezcla.

La electroforesis en gel de poliacrilamida en

presencia de SDS también se ha empleado

en la determinación de los pesos moleculares

de proteínas.

Electroenfoque. Si se coloca una proteína en

un gradiente de pH sujeto a un campo

eléctrico, se moverá hasta alcanzar su punto

isoeléctrico, donde permanecerá sin

moverse. Esta técnica es lo que se conoce

como electroenfoque. Para formar un

gradiente estable y continuo de pH se usan

anfolitos sintéticos de una gran variedad de

pesos moleculares y rangos de pH. Cuando

se establece el campo eléctrico, los anfolitos

migran y generan el gradiente de pH según

sus propios puntos isoeléctricos. Esta técnica

ha sido utilizada en combinación con la

separación por pesos moleculares en la

electroforesis bidimensional como método de

análisis de proteínas.

*Nota: Cuando se aplica un potencial

eléctrico a un líquido contenido en un soporte

no conductor el líquido se moverá hacia uno

u otro electrodo, en favor o en contra del

movimiento electroforético, alterando la

movilidad electroforética de las partículas

cargadas. Este fenómeno se conoce como

endosmosis. Si el soporte está cargado,

induce la orientación de las cargas con signo

opuesto en el líquido, lo que ocasionará al

aplicar la corriente eléctrica que ocurra un

flujo del líquido dentro del canal

electroforético. Este fenómeno es lo que se

conoce como actividad endosmótica y puede

116

causar problemas en las separaciones

electroforéticas.

SOLUCIONES

Una solución es una mezcla homogénea de

por lo menos dos componentes: una fase

dispersa, que es el soluto (sustancia que se

disuelve), y una dispersora que constituye el

solvente o disolvente (la sustancia que

disuelve al soluto) y que, generalmente, se

encuentra en mayor proporción. Las

soluciones más utilizadas en bioquímica son

las que tienen agua como solvente.

La solubilidad de un soluto en un

solvente depende de la naturaleza de éstos,

de la temperatura y, en el caso de un gas, de

la presión. La solubilidad generalmente está

dada en gramos de soluto por 100 g de

solvente.

Se llaman soluciones diluidas las que

contienen una proporción relativamente

pequeña de soluto; se llaman soluciones

concentradas las que contienen una gran

cantidad de soluto. Sólo son posibles

soluciones concentradas cuando el soluto es

muy soluble.

Una solución saturada contiene la

cantidad de soluto disuelto necesaria para la

existencia de un equilibrio entre las

moléculas disueltas y las moléculas en

exceso que no están disueltas. Esta solución

se forma por medio de una vigorosa agitación

con exceso de soluto. Existe una solución

sobresaturada cuando en la solución hay

presente más soluto que en una solución

saturada. Para prepararla se forma una

solución saturada a temperatura elevada y se

enfría cuidadosamente para evitar la

cristalización. Las soluciones sobresaturadas

son inestables y con facilidad se convierten

en soluciones saturadas.

Las mencionadas soluciones son

poco precisas y no indican, de manera

cuantitativa, el soluto ni el solvente; los

métodos cuantitativos más comunes, que

sirven para expresar la concentración (la

medida numérica de la cantidad relativa de

soluto en la solución) de las soluciones, son

las porcentuales, las molares y las normales.

Soluciones porcentuales

En las soluciones porcentuales no se toma

en cuenta el peso fórmula del soluto. En este

tipo de soluciones se debe especificar si la

relación es peso a peso (p/p), peso a

volumen (p/v) o volumen a volumen (v/v).

Ejemplos:

Solución porcentual p/p. Solución al

10% de NaCl contiene 10 g de la sal por 100

g de solución. El peso/peso porcentual

expresa el número de gramos del soluto en

100 gramos de la solución final.

%p/p = g de soluto x 100

100 g de solución

Solución porcentual p/v. Solución de NaCl

a 10% p/v: 10 g de NaCl en 100 ml de

solución. Esto expresa el número de gramos

de soluto en 100 ml de la solución final. En

bioquímica, si no se especifica otra situación,

las soluciones porcentuales deben

entenderse como p/v.

%p/p = g de soluto x 100

100 ml de solución

Solución porcentual v/v. Se utiliza

cuando el soluto y el solvente son líquidos. El

v/v indica el número de volúmenes de soluto

por 100 volúmenes de solución. Solución de

etanol a 30% v/v: 30 ml de éste en 100 ml de

solución. Esto quiere decir que por cada 100

ml de solución, 30 ml corresponden al soluto

y el resto, hasta completar 100 ml, al agua

destilada o al solvente empleado.

117

%v/v = volumen de soluto x 100

100 volúmenes de solución

Es importante insistir que los

términos porcentuales expresan siempre una

relación, es decir, podemos variar los

volúmenes siempre y cuando no perdamos

dicha relación. Por ejemplo, si nos pidieran

preparar 50 ml de una solución de alcohol

etílico a 20%, seguiríamos el siguiente

planteamiento:

100 ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro

50 ml de sol. tienen x ml de alcohol puro

X = 20 x 50 x 10

100

Resultado: necesitamos 10 ml de

alcohol puro y completar un volumen de 50

ml.

El alcohol etílico común es de 96%

de pureza (v/v). Por lo tanto, si no contamos

con alcohol puro y quisiéramos preparar una

solución de alcohol a 20%, seguiríamos el

siguiente planteamiento:

100 ml de sol. tienen 96 ml de alcohol puro

X ml de sol. tienen 20 ml de alcohol puro

X= 20 x 100 = ml de solución

96

Resultado: necesitamos 20.83 ml de

solución de alcohol a 96% y completar un

volumen de 100 ml.

Si tan sólo queremos 50 ml de esta

nueva solución, entonces:

100 ml de sol. de alcohol a 20% tienen

20.83 ml de alcohol a 96%

50 ml de sol. de alcohol a 20% tienen X ml

de alcohol a 96%

X= 50 x 20.83 = 10.41ml

100

Resultado: necesitamos 10.41 ml de

alcohol de 96% y completar con agua

destilada hasta un volumen final de 50 ml.

Soluciones molares

Una solución molar se define como el

número de moles de soluto en un litro de

solución:

M= No. de moles

litro de solución

donde un mol es igual al peso atómico o

molecular expresado en gramos (átomo

gramo o molécula gramo). Un mol contiene el

número de Avogadro (6.023x1023

) de

partículas, átomos o moléculas.

Si un mol de una sustancia se

disuelve en agua hasta un volumen de un

litro, se obtiene una solución 1 molar (1M).

Por ejemplo, si quisiéramos preparar

una solución 1 molar de NaCl, tendríamos

que considerar, primero, su peso molecular

(Na: 23 + Cl: 35.5 = 58.5) y este valor en

gramos disolverlo en agua, hasta completar

un litro.

Ahora bien, si nos piden preparar 400

ml de una solución 0.5 M de NaCl: ¿cuántos

gramos de NaCl deben pesarse?

1. Sabemos que un mol de NaCl es de 58.5

g.

2. Haremos el siguiente planteamiento:

Una sol. 1M tiene 58.5g de NaCl.

Una sol. 0.5M tiene X g de NaCl.

X= 0.5 x 58.5 = 29.25 g de NaCl

100

3. De acuerdo con la definición de solución

molar, los 29.25 g de NaCl los

consideramos en un litro de solución, pero

118

como nos piden preparar 400 ml haremos

el siguiente planteamiento:

En 1000 ml de sol. hay: 29.25g de NaCl

En 400 ml de sol. hay: X g de NaCl

X= 400 x 29.25 = 11.7 g de NaCl

1000

Resultado: necesitamos 11.7 g de

NaCl y disolverlo hasta completar un

volumen de 400 ml.

En este ejemplo, como podemos ver,

hemos multiplicado la molaridad del

problema (0.5 mol/L) por el peso molecular

de NaCl (58.5 g) y por el volumen del pro-

blema (400 ml). Posteriormente dividiremos

entre 1 litro (1 000 ml). Para simplificar el

procedimiento podemos aplicar la siguiente

fórmula:

V x PM x M = gramos de la sustancia

1000

En donde:

V = Volumen del problema en ml.

PM = Peso molecular de la sustancia en g.

M = Molaridad del problema.

Soluciones normales

Son las que contienen el peso equivalente de

una sustancia en gramos por litro de

solución:

N = peso equivalente

litro de solución

donde el peso equivalente de una sustancia

es el número de unidades de esta sustancia

que puede combinarse con una unidad de

hidrógeno:

Peso equivalente = peso molecular

n

n = número de hidrógenos sustituibles.

Ejemplo: el peso equivalente de un

ácido se calcula dividiendo el peso molecular

entre el número de átomos de hidrógeno

sustituibles en la molécula. El ácido sulfúrico (H2SO4), de peso molecular 98, tiene dos

átomos de hidrógeno sustituibles en cada

molécula; por lo tanto, su peso equivalente

es: 98/2 = 49.

El peso equivalente de un hidróxido

se calcula dividiendo el peso molecular entre

el número de grupos hidroxilo (OH–) de la

molécula. El hidróxido de aluminio Al (OH)3

contiene tres grupos OH– por molécula; su

peso molecular es de 78; por lo tanto, su

peso equivalente es 78/3 = 26.

El peso equivalente de una sal se

calcula dividiendo el peso molecular entre la

valencia total de los cationes (cargas

positivas) que contenga la fórmula. La

valencia del sodio es 1, y el sulfato de sodio Na2SO4 (peso mo-lecular 144) tiene dos

iones de sodio en cada molécula; por lo

tanto, el peso equivalente del sulfato de sodio

será 144/2 = 72.

El peso equivalente de un oxidante

(reductor) se calcula dividiendo el peso

molecular entre el número de electrones

ganados (o perdidos) que puedan aportar por

molécula.

Recordemos la fórmula utilizada para

calcular la cantidad de sustancia necesaria

para preparar cualquier cantidad de una

solución determinada:

Para calcular la cantidad de una sustancia

que se necesita pesar para preparar un

volumen determinado de una solución de

cualquier normalidad, se aplica una fórmula

semejante:

V x Eq x N = gramos de la sustancia

1000

119

Ejemplo: preparar una solución 0.1 N de cloruro de calcio (CaCl2) para obtener un

volumen de 300 ml:

V = 300 ml

N = 0.1 Eq = peso molecular del CaCl2

111/2 = 55.5

Sustituyendo=300 ml x 55.5 g x 0.01 N= 1.67 1000

Resultado: necesitamos 1.67 g de CaCl2 para preparar 300 ml de una solución

0.1 N.

Soluciones osmolares

El fenómeno de la ósmosis se presenta

cuando una solución está separada de su

solvente por una membrana semipermeable.

La ósmosis es la difusión de solvente a

través de la membrana desde la parte de

menor a la de mayor concentración. La

presión osmótica es la presión que debe

aplicarse sobre la solución de mayor

concentración a fin de impedir el paso del

solvente (ósmosis) a través de la membrana.

Las membranas biológicas tienen

permeabilidades dis-tintas y se dice que son

semipermeables, es decir, que son

permeables de forma selectiva para las

moléculas del solvente o pequeñas

moléculas, pero no permiten el paso libre de

todas las moléculas disueltas.

Las mediciones cuantitativas

demuestran que la presión osmótica es

proporcional a la concentración molar (para

sustancias no disociables) del soluto, por lo

que una solución osmolar es aquella que

contiene un mol de la sustancia en gramos

en un litro de solución; el osmol es una

medida del número total de partículas en

solución. La concentración expresada en

osmol por litro se llama osmolaridad; el osmol

por kilogramo de disolvente se denomina

osmolalidad; en las soluciones muy diluidas,

como son las del cuerpo humano, las dos

medidas son tan cercanas que con gran

frecuencia se utilizan indistintamente.

La presión osmótica depende del

número de partículas y no de su carga, ni de

su masa; la misma fuerza osmótica es

ejercida por una molécula grande, como una

proteína, con peso molecular de varios miles

y muchas cargas, como por una molécula de

glucosa o un ion de Na+ o de Cl

–. Así para

determinar el efecto osmótico de una

solución hay que sumar los efectos de todas

las partículas incapaces de atravesar la

membrana independientemente de su peso

molecular.

Por ejemplo: el cloruro de sodio en

solución acuosa se disocia casi

completamente en iones sodio (Na+) y cloruro

(Cl–). Por lo tanto, cada molécula da origen a

dos partículas osmóticamente activas, y una

solución osmolar contiene media molécula

gramo (peso molecular expresado en

gramos) por litro, o sea:

1 osm/l = 58.5/2 = 29.25 g/l ó también

1 mol de NaCl = 2 osm/l

En cambio, la glucosa en solución no

se disocia y para esta sustancia la solución

osmolar contiene un mol en gramos por litro:

1 mol de glucosa = 180 g/l = 1 osm/l

La mayoría de los líquidos corporales

tiene una presión osmótica que concuerda

con la de una solución de cloruro de sodio a

0.9 % y se dice que esta solución es

isosmótica con los líquidos fisiológicos.

Soluciones isotónicas

Las soluciones isotónicas con respecto unas

a otras ejercen la misma presión osmótica;

es decir, contienen la misma concentración

de partículas osmóticamente activas. Cuando

se habla de soluciones isotónicas en

120

el laboratorio, suele tratarse de las que

tienen la misma presión osmótica que el

plasma sanguíneo, que es apro-

ximadamente de 0.3 osmolar (300

miliosmoles). Las soluciones fisiológicas de

concentración menor a 300 mosm/l se llaman

hipotónicas; cuando su concentración es

mayor de 300 mosm/l se denominan

hipertónicas.

Una solución es isotónica con

respecto a una célula viva cuando no ocurre

ganancia ni pérdida neta de agua en la

célula, ni se produce ningún otro cambio en

ésta cuando entra en contacto con la

solución.

El término isotónico, que significa:

igualdad de tono, se emplea en medicina

como sinónimo de isosmótico; pero los

términos isotónico y tonicidad sólo deben

emplearse en relación con un líquido

fisiológico. Por ejemplo, una solución de

ácido bórico que es isosmótica con la sangre

y el líquido lagrimal, sólo es isotónica con el

líquido lagrimal, ya que esta solución

ocasiona hemólisis de los eritrocitos porque

las moléculas de ácido bórico atraviesan

libremente la membrana eritrocitaria a

cualquier concentración. En consecuencia,

isotonicidad connota compatibilidad

fisiológica, mientras que isoosmoticidad, no

necesariamente. En otras palabras, la

tonicidad es una fracción de la presión

osmótica total de la solución; por tanto, la

tonicidad de una solución no se puede

predecir únicamente por su composición ya

que intervienen también las propiedades

distintivas de la membrana limitante.

Cálculo y expresión de diluciones

La dilución consiste en preparar una solución

menos concentrada a partir de una solución

inicial más concentrada. Las diluciones se

expresan usualmente como una razón

matemática, como 1:10. Esto significa una

unidad de solución original diluida a un

volumen final de 10, esto es, 1 volumen de

solución original con 9 volúmenes de

solvente (volumen final = 10).

Para calcular la concentración de la

solución diluida se multiplica la concentración

de la solución original por la dilución

expresada como fracción.

Ejemplo: una solución de 300 mg/100

ml se diluye en la razón 1:10. La

concentración de la solución final es:

300 x 1/10 = 30 mg /100 ml.

Si se hace más de una dilución, a

partir de una misma solución, la

concentración de la solución final se obtiene

al multiplicar la concentración original por el

producto de las diluciones. Ejemplo: la

solución anterior se diluye a su vez en la

razón 1:100. La concentración de la solución

será: 300 x 1/10 x 1/100 = 0.3 mg/100 ml.

La dilución y redilución sistemáticas

de una solución se llaman diluciones

seriadas. Para encontrar la concentración en

un tubo dado de la serie, se multiplica la

dilución en ese tubo por cada una de las

diluciones precedentes, incluida la del tubo

original.

Ejemplo: hacer una dilución seriada

1:2, 1:4, 1:8, etcétera, a un volumen final de

1 ml.

Paso 1: a 0.5 ml de la solución a

diluir, añadirle 0.5 ml del diluyente y

etiquetarlo como tubo 1 (dilución 1:2,

volumen 1 ml).

Paso 2: transferir a otro tubo 0.5 ml

de la dilución anterior y agregarle 0.5 ml de

diluyente (dilución 1:2). La dilución final

obtenida se calcula al multiplicar la dilución

del tubo 1 (o anterior) con la nueva dilución

(1/2 x 1/2), igual a 1:4. Los pasos siguientes

se hacen igual que para el paso 2. En el

siguiente cuadro se muestra un resumen de

lo anterior.

121

Tubo Dilución

1. 0.5 ml(1) = 0.5 ml (1) = 1:2(4)

0.5 ml (1) + 0.5 ml (2) 1 ml (3)

2. 0.5 ml(1) = 0.5 ml (1) = 1:4 (4)

0.5 ml (1) + 0.5 ml (2) 1 ml (3)

es decir: 1/2 x 1/2 = 1:4

3. 1/4 x 1/2 = 1:8

4. 1/8 x 1/2 = 1:16

5. 1/16 x 1/2 = 1:32 (1) Volumen de la solución original a diluir. (2) Volumen del agua necesaria para la

dilución. (3) Volumen final. (4) Dilución obtenida. (5) Volumen de la solución diluida 1:2 (o anterior).

MANEJO DE MATERIAL BIOLÓGICO

Se le llama material biológico al conjunto de

seres vivos o sus productos utilizado en el

desarrollo del trabajo en el laboratorio. La

utilidad e importancia de este material es

muy grande ya que muchos fenómenos de

los seres vivos sólo pueden estudiarse en

ellos mismos, por ejemplo, la

experimentación de nuevos fármacos o los

mecanismos que se presentan en entidades

patológicas y la producción de las mismas en

forma experimental. Del correcto manejo

dependerá en gran parte el éxito de la

experimentación y la veracidad de los

resultados obtenidos. A continuación se

darán algunas generalidades sobre el manejo

del material biológico utilizado en las

prácticas de este Manual.

Animales

El animal utilizado más comúnmente en el

laboratorio de bioquímica es la rata. Para su

correcto manejo es importante la forma cómo

se sujeta, lo cual se hará con firmeza, pero a

la vez, en forma suave para no lesionarla; no

debe demostrársele miedo o repugnancia

para evitar que se ponga nerviosa e

intranquila, lo que puede ocasionar que

muerda.

La palma de la mano se coloca sobre

el dorso del animal; la cabeza de éste entre

el dedo pulgar y el dedo índice; de esta

manera se logra su inmovilidad y es posible

levantar el animal y moverlo de lugar.

Muchas veces es necesaria la

inyección intraperitoneal de alguna sustancia,

para lo cual se sostendrá al animal con una

mano, como se indicó antes, mientras con la

otra se introduce la aguja de la jeringa

formando un ángulo de 10º con la pared

abdominal en el cuadrante inferior izquierdo,

ligeramente a la izquierda de la línea media;

es importante mantener el ángulo de la aguja

porque, si éste se abre, la aguja puede llegar

a la vejiga o al intestino. Para tener la

seguridad de estar en la cavidad peritoneal,

hay que jalar el émbolo de la jeringa para que

se haga el vacío; si el vacío no se hace y, por

el contrario, se extrae líquido, es probable

que se haya puncionado la vejiga.

Para la extracción de vísceras, como el

hígado, es necesario sacrificar al animal, lo

cual se logra fácilmente y con menor

sufrimiento para la rata anestesiándola o

descerebrándola, o sea, seccionando la

médula espinal a nivel del cuello mediante un

golpe certero en este lugar contra el borde de

una mesa. Después se prosigue a la

extracción de la víscera y se abre la pared

abdominal con unas tijeras o bisturí.

Extracción de sangre para análisis

El profesor a cargo del grupo deberá estar

presente en el momento de la extracción; de

lo contrario, por ningún motivo, el alumno

podrá hacerla por su cuenta.

Procedimiento para obtener una muestra

de sangre venosa:

122

1. Para que un alumno sea considerado

como voluntario deberán tomarse en

cuenta algunos antecedentes como: no

padecer o haber padecido hepatitis o

alguna otra enfermedad

infectocontagiosa; no tener problemas de

coagulación y no ser muy aprensivo. El

donador (de preferencia con las venas

visibles), estará sentado con el brazo

sobre la mesa.

2. Con una ligadura elástica, aplicar un

torniquete en el brazo por encima del sitio

de la punción (esto causa congestión

venosa y evita el retorno de la sangre). El

uso prolongado del torniquete causa

estasis de la sangre y

hemoconcentración. Si las venas no se

hacen prominentes, pedir al donador que

cierre y abra la mano varias veces.

Escoger una vena fija y de buen calibre,

localizarla y palparla con el dedo para

sentir su consistencia y trayectoria; antes

de puncionar, asegurarse de que la

jeringa no contenga aire y que el émbolo

se deslice suavemente. Las dimensiones

de la aguja y la jeringa dependen de la

cantidad de sangre que se necesita así

como del tamaño e integridad de la vena

que se usa. También se puede usar el

sistema Vacutainer que consiste en un

tubo al vacío, un mango y una aguja

recolectora de muestras múltiples.

3. Limpiar minuciosamente la zona con una

torunda humedecida con alcohol de 70º y

dejar secar espontáneamente. Sujetar la

piel con el pulgar izquierdo; puncionar

primero la piel y luego penetrar la vena

con el bisel de la aguja hacia arriba

siguiendo el trayecto de la vena.

4. Después que se ha entrado a la vena, la

sangre llenará los tubos vacíos del

sistema vacutainer. Si se usa jeringa, se

necesita una ligera succión con ésta para

obtener la muestra (por lo general,

aparece una gota de sangre en la base de

la aguja). Una succión excesiva puede

causar colapso de la vena. Tirar del

émbolo de la jeringa hasta que se haya

extraído la cantidad de sangre deseada.

5. Soltar la ligadura antes de extraer la aguja

con un movimiento rápido y uniforme

mientras que se ejerce una presión sobre

la herida con una torunda.

6. Mantener la presión por un momento o

hasta que se haya detenido el sangrado.

Cubrir la punción con una cinta adhesiva.

7. Retirar la aguja de la jeringa en el

contenedor de punzocortantes y vaciar lo

más pronto posible la muestra de sangre

en un tubo de centrífuga procurando

deslizar la sangre suavemente por la

pared del tubo (si es que no se utilizó el

sistema Vacutainer).

Alerta clínica

Si es difícil detener el sangrado de la

punción, elevar la zona y aplicar una cubierta

que presione. Los hematomas se pueden

evitar:

• Usando una buena técnica.

• Aflojando el torniquete antes de retirar la

aguja.

• Aplicando la presión suficiente sobre el

sitio de punción después de completar el

procedimiento.

La sangre obtenida puede tratarse de

diferentes maneras según el empleo que se

le vaya a dar.

Para obtener suero. La sangre se

recibe en un tubo de ensayo o de centrífuga

seco y se deja coagular a temperatura

ambiente o en una estufa o baño de agua a

37º C. Si se va a trabajar inmediatamente

con el suero, separar con un aplicador de

madera el coágulo y centrifugar el resto del

tubo. Si se desea la separación espontánea

del suero, se deja a temperatura ambiente

123

por unas horas para que el coágulo se

retraiga. Debe evitarse que el suero se

mezcle con porciones de coágulo; si esto

sucede, es necesario centrifugar y volver a

separar el suero con una pipeta Pasteur.

Para obtener plasma. Hay que evitar

la coagulación por medio de un

anticoagulante (heparina, citrato de sodio o

EDTA) en el tubo que recibe la sangre.

Mezclar suavemente por inversión.

Centrifugar a 2 500 rpm durante 5 minutos y

extraer enseguida el plasma sobrenadante

con una pipeta Pasteur; pasarlo a otro tubo.

La sangre, el plasma o el suero y

todos los recipientes que los contengan

deben considerarse como material

potencialmente infectante, por lo que

(torundas, agujas, tubos, etcétera) deberán

depositarse, de acuerdo a su clasificación,

en envases que tengan impreso el símbolo

de riesgo biológico y entregarse a la

coordinación del laboratorio para su

desinfección y desecho.

MEDIDAS DE SEGURIDAD

Durante el desarrollo del curso de

bioquímica, en el laboratorio se pueden llegar

a utilizar sustancias o muestras biológicas

que, en ocasiones representan riesgos

potenciales a la salud, debido a que pueden

ser: corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas,

inflamables o biológico infecciosas.

Aunque los laboratorios se

consideran en general lugares de trabajo

seguros, esto es así sólo cuando conocemos

y seguimos las normas de seguridad

existentes en la materia acerca de la

clasificación, manejo y disposición final de

estas sustancias, lo cual nos permite

identificar los peligros y disminuir los riesgos.

Manejo de materiales peligrosos y/o

biológico infecciosos

Precauciones generales: Se refieren a las

medidas para minimizar la difusión de

enfermedades transmisibles, especialmente

hepatitis B o SIDA y para evitar incendios,

cortaduras o exposiciones simples, de corta

duración o accidentales a sustancias

químicas peligrosas.

1. Manejar cualquier líquido corporal,

sangre, plasma, suero, orina, tejido,

cadáver o cultivo como potencialmente

infeccioso. Todas las sustancias químicas

proporcionadas, equipos y materiales del

laboratorio deberán ser utilizados con el

máximo cuidado, atendiendo a las

indicaciones de peligrosidad y cuidados

específicos, según el caso.

2. Se debe conocer los símbolos y los

códigos de color sobre las precauciones y

los peligros en el laboratorio. Asegurarse

de conocer la localización de

extinguidores, del botiquín y de las salidas

de emergencia.

3. Usar bata en el laboratorio, la cual deberá

estar cerrada durante todo el tiempo que

se permanezca en el laboratorio.

4. Lavar las manos y usar guantes. Los

guantes deben usarse para efectuar

punciones vasculares y para manipular

sangre, líquidos corporales, cultivos de

microorganismos, sustancias o superficies

contaminadas. Después del uso de

cualquier material biológico, se procede al

lavado de manos con los guantes

puestos. Después de quitarse los guantes

debemos lavarnos nuevamente las

manos.

5. Todos los materiales desechables y no

desechables se deben descontaminar en

una solución 1:10 de hipoclorito de sodio

de 4 a 7 % de concentración, durante más

de 20 minutos antes de ser desechados.

124

6. Los elementos punzocortantes deben

desecharse en recipientes especiales

destinados para ello, los cuales deben

estar etiquetados con la leyenda que

indique "Peligro, residuos punzocortantes

biológico-infecciosos" y marcados con el

símbolo universal de riesgo biológico.

Nunca reencapuchar las agujas

7. Limpiar las superficies potencialmente

contaminadas con hipoclorito de sodio al

1%, con alcohol al 70% o con agua

oxigenada.

8. Todas las sustancias químicas son

potencialmente tóxicas y peligrosas, por

lo que se deberá:

a) Conocer las propiedades (venenosas,

cáusticas o corrosivas) y el uso correcto

de las mismas.

b) Nunca probar, así como tampoco inhalar,

directamente las sustancias. Para

determinar el olor se acerca la tapa del

frasco cuidadosamente a la nariz, o bien,

si se trata de sustancias volátiles o

vapores acercar éstos con la mano a la

nariz.

c) Evitar el contacto de sustancias con la

piel, especialmente la cara; usar bata y

guantes para proteger la ropa y el cuerpo;

nunca dirigir un tubo de ensayo o la boca

de un matraz con líquidos en ebullición o

material de reacción hacia el vecino, o a

sí mismo, ya que puede proyectarse el

contenido; para las sustancias que no

tienen un efecto pronunciado sobre la

piel, pero cuya ingestión es peligrosa,

evitar la contaminación de alimentos,

cigarros o manos que después se llevarán

a la boca o con las que se tocarán

alimentos (nunca ingerir alimentos en el

laboratorio). Por último, nunca pipetear

con la boca, especialmente los ácidos

fuertes, productos cáusticos, oxidantes

fuertes y compuestos venenosos.

9. Seguir las indicaciones del profesor y del

personal a cargo del área de prácticas. Es

una regla de laboratorio que todos los

accidentes personales, por triviales que

sean, se comuniquen inmediatamente al

profesor. Nunca realizar actividades

experimentales sin la supervisión del

responsable del grupo.

10. Manejar adecuadamente los residuos

peligrosos derivados de las prácticas,

identifique su nivel de riesgo y el

mecanismo para su desecho. Queda

prohibido desechar sustancias a la tarja o

por cualquier otro medio, sin autorización

del responsable del grupo. Las hojas de

seguridad correspondientes incluyen qué

hacer en caso de accidentes y la forma

correcta de desechar los residuos.

11. Indicaciones generales para evitar

incendios o explosiones al utilizar

solventes inflama-

bles. Los solventes inflamables (alcohol,

éter, cloroformo, acetona, tolueno, xilol,

etcétera) se utilizan en todos los

laboratorios, por lo que se recomiendan

las siguientes precauciones:

a) No fumar en el interior del laboratorio.

b) No utilizar la llama del mechero sin

cerciorarse de que no hay cerca líquidos

inflamables. No mantener el mechero

encendido cuando esté fuera de uso.

c) Si se vierten accidentalmente sobre las

mesas, secar de inmediato con un trapo

húmedo y enjuagar éste en el chorro de

agua, exprimiéndolo.

d) Nunca calentar un líquido orgánico sobre

una flama. Para calentar, usar baño de

agua o parrilla eléctrica.

125

En caso de incendio debe hacerse lo

siguiente: para un incendio pequeño en un

vaso, un matraz, etcétera, éste se cubrirá con

un recipiente mayor o se ahogará el fuego

con un trapo mojado o se combatirá con un

extinguidor.

Cuando el fuego sea de un solvente

derramado sobre la mesa o el piso, se

utilizará un extinguidor de bióxido de

carbono. Si el fuego no puede vencerse de

inmediato, se evacuará el laboratorio y se

avisará al departamento contra incendios de

la institución.

12. Los accidentes más frecuentes que

ocurren en el laboratorio son las lesiones

debidas a cortes, laceraciones, etcétera,

por cristalería rota.

En caso de heridas pequeñas dejar

que sangre unos segundos; tener cuidado de

no dejar partículas de vidrio en la herida y

aplicar un desinfectante.

Las heridas de mayor importancia

deben ser atendidas por un médico. Mientras

tanto, evitar el sangrado aplicando presión en

un punto más arriba la herida o antes de ella

(no mantener la presión por más de 5

minutos).

10. Casi siempre, los choques eléctricos en

el laboratorio son de poca importancia;

las precauciones de seguridad se

deducen de la naturaleza del peligro.

Nunca tocar un aparato eléctrico con las

manos húmedas o cuando se esté

parado sobre un piso húmedo. Siempre

apagar y desconectar los aparatos antes

de cualquier manipulación.

Pictogramas de seguridad

En las etiquetas de productos químicos de

uso en el laboratorio además de la

identificación del contenido, calidad y límite

de pureza de lo que contiene, podemos

encontrar pictogramas (símbolos

internacionalmente aceptados y reconocidos)

que indican los riesgos principales. Los

pictogramas de seguridad son:

RIESGO BIOLÓGICO

Todo aquello que pueda contener

bacterias, virus u otros microorganismos con

capacidad de infección o cuando contiene

toxinas producidas por microorganismos que

causen efectos nocivos a los seres vivos.

Ejemplo: jeringas, sangre.

Medidas de prevención: evitar el

contacto con los ojos, la piel y las vías

respiratorias. Utilizar elementos de protección

personal.

E = EXPLOSIVO

Es toda sustancia sólida o líquida o

mezcla de sustancias que pueden

desprender gases a una temperatura, presión

y velocidad tales que pueden detonar,

producir violentas deflagraciones, o explotar

al exponerse al calor cuando están

parcialmente confinadas. Ejemplo: azida de

plomo, fluoruro de carbono.

Medidas de prevención:

almacenarlas alejadas de otros productos,

evitar todo choque, fricción y mantener

alejadas de fuentes de calor, chispas o

fuego.

126

O = OXIDANTE

Sustancias capaces de aportar

oxígeno cuando reaccionan con otra

sustancia, por lo que cuando entran en

contacto con combustibles o inflamables

avivan la reacción pudiendo desarrollar

reacciones violentas. Ejemplo: nitrito de

sodio, hiposulfito de sodio.

Medidas de prevención: mantener

alejadas de las sustancias combustibles o

inflamables, ya que pueden favorecer los

incendios y dificultar su extinción.

Xn = NOCIVO

Sustancias de menor toxicidad pero

pueden causar daños a la salud. También se

incluyen aquellas mezclas o preparados que

tienen alguna sustancia que puede ser tóxica

pero que se encuentra a una baja

concentración en la mezcla.

Xi = IRRITANTE

Sustancias que pueden causar

irritación a la piel, mucosas, o los ojos, por

contacto inmediato, prolongado o repetido,

pudiendo también provocar inflamación.

Ejemplo: cloroformo, SDS, hipoclorito de

sodio, aminoantipirina.

Medidas de prevención: evitar el

contacto con los ojos, la piel y las vías

respiratorias. Utilizar elementos de protección

personal.

F+ = EXTREMADAMENTE INFLAMABLE

Sustancias cuyo punto de ignición es menor

de 0°C y su punto de ebullición máximo de

35°C.

F = INFLAMABLE

Sustancias líquidas cuyo punto de ignición es

menor a 40°C. Ejemplo: etanol, tolueno, éter

dietílico.

Medidas de prevención: mantener

alejado de fuentes de calor, de ignición o

eventuales chispas, de materiales

combustibles y oxidantes.

N = NOCIVO PARA EL MEDIO

AMBIENTE

Aquellas sustancias o preparados que

cuando son liberados al medio ambiente

pueden presentar un efecto inmediato o

diferido, poniendo en peligro a alguna

especie. Ejemplo: tiourea, o-toluidina.

Medidas de prevención: evitar que

los derrames alcancen los desagües, tratar

los residuos en condiciones ambientalmente

adecuadas.

T+ = ALTAMENTE TÓXICO, T TÓXICO

Sustancias que pueden causar daño en

forma aguda o crónica a la salud o causar la

127

muerte si son inhaladas, ingeridas o se

absorben por la piel, aún en pequeñas

cantidades. Ejemplo: azida de sodio,

dinitrofenol, bromuro de etidio.

Medidas de prevención: evitar todo

contacto directo. Utilizar elementos de

protección personal. Emplear estrictas

medidas de higiene personal y del ambiente

del laboratorio.

C = CORROSIVO

Sustancias capaces de atacar y destruir los

tejidos orgánicos si entran en contacto con

ellos o bien atacar ciertos metales o

materiales. Ejemplo: hidróxido de sodio,

ácido clorhídrico, ácido acético.

Medidas de prevención: evitar el

contacto con los ojos, la piel y las vías

respiratorias. Utilizar elementos de protección

personal.

Identificación sobre los riesgos

específicos y los consejos de prudencia

Frases "R" éstas advierten acerca del riesgo

más común asignado a esa sustancia

química, por medio de la enumeración de

riesgos específicos en frases cortas que son

adaptables a las distintas sustancias.

Las frases "S" brindan los consejos

de prudencia o las medidas de prevención

más importantes relacionadas con el riesgo

asignado a esa sustancia química y que

permitirán su manipulación y

almacenamiento en forma segura. En

algunos casos se mencionan combinaciones

de frases R o de frases S, cuando dos o más

riesgos tienen relación entre sí (cuadro I.6).

El símbolo de la N.F.P.A. (National Fire

Protection Association)

El símbolo de la N.F.P.A. es un sistema de

identificación de riesgos de un producto

químico, en tres categorías principales:

"salud", "inflamabilidad" y "reactividad"

indicando el grado de severidad por medio de

una escala numérica desde (4) que indica el

riesgo mayor, (3) riesgo severo, (2) riesgo

moderado, (1) riesgo menor, hasta (0) que

representa ausencia de riesgo.

Este símbolo es útil para alertar

acerca del riesgo de ese producto y, a su

vez, puede ayudar a determinar los cuidados

a tener en cuenta en el almacenamiento y en

caso de emergencias, de derrames o

salpicaduras.

La información se presenta por

medio de una estructura espacial en forma

de rombo principal, dividido a su vez en otros

cuatro.

El rombo azul a la izquierda identifica

el riesgo para la salud. El rombo rojo en la

parte superior indica el riesgo por

inflamabilidad. El rombo amarillo a la derecha

señala el riesgo por reactividad o

inestabilidad. El rombo blanco en la parte

inferior indica riesgos especiales tales como:

W reactivo al agua, COR corrosivo, AIR

reactivo al aire, OXY oxidante. Ejemplo:

Ácido clorhídrico

b Con

128

Hojas de seguridad

Cada práctica cuenta con las hojas de

seguridad para cada reactivo o sustancia que

se utilice en el laboratorio.

Las hojas de seguridad proveen

información sobre (cuadro I.7, pág. 100):

• Los componentes de un producto, su

reactividad, las medidas precautorias

principales o las advertencias más

importantes.

• Los elementos de protección personal que

se recomienda emplear en la manipulación.

• Las vías de ingreso y los órganos blanco.

• Las medidas por derrame accidental y de

primeros auxilios.

• La información toxicológica.

• Las recomendaciones para su

almacenamiento.

• Las condiciones para la disposición de los

residuos.

Clasificación de los residuos

Los residuos que se generan en laboratorios

de instituciones de enseñanza o

investigación así como en hospitales y

clínicas contienen residuos no peligrosos o

municipales, residuos biológico infecciosos y

residuos especiales.

Residuos peligrosos biológico

infecciosos (RPBI): es todo aquello que ha

entrado en contacto con pacientes o

animales, sus muestras biológicas y/o cepas

de microorganismos, se clasifican en: sangre,

cultivos, patológicos (tejidos, órganos, partes

y fluidos corporales, etcétera), no anatómicos

(gasas, algodones, jeringas, etcétera) y

punzocortantes (lancetas, agujas, pipetas

Pasteur, etcétera).

Residuos municipales: son aquellos

que no representan peligro para la salud y

sus características son similares a los

residuos domésticos comunes.

Residuos especiales CRETI: son

aquellos residuos que constituyen un peligro

para la salud por sus características

agresivas tales como: Corrosividad,

Reactividad, Explosividad, Toxicidad e

Inflamabilidad Es importante no olvidar que,

la mezcla de residuos municipales con

residuos biológico infecciosos hace que se

consideren en su totalidad como biológico

infecciosos, mientras que la mezcla de

residuos biológico infecciosos con peligrosos

CRETI se deben consideran como peligrosos

CRETI.

Envasado y etiquetado de RPBI para su

desecho.

Los residuos RPBI deben ser envasados de

acuerdo con sus características físicas y

biológico infecciosas conforme la norma

oficial mexicana 087-ECOL-95 (cuadro I.8).

Es importante destacar que todos los

envases tengan impreso el símbolo universal

de riesgo biológico y leyendas que indiquen

la peligrosidad de los residuos y el tipo de

residuos que contienen.

Los contenedores para

punzocortantes deben de ser: • De color rojo.

• De paredes rígidas.

• De polipropileno.

• Resistentes a fracturas y pérdida del

contenido al caerse.

• Destruibles por métodos fisicoquímicos.

• Esterilizables y con tapa, la que puede tener

o no separador de agujas.

Precauciones: depositar los RPBI, de

acuerdo a su clasificación, inmediatamente

después de su generación.

No compactar los residuos durante el

envasado y no mezclar residuos de diferente

clasificación.

Una vez identificados, separados y

envasados correctamente los residuos

peligrosos, el personal responsable del

129

laboratorio se encargará de su recolección,

tratamiento y disposición final así como de

las medidas necesarias para la desinfección,

esterilización y limpieza del material y equipo

utilizado en el laboratorio.

Cuadro I.6 Ejemplos de frases S y R

Manejo de residuos CRETI

El manejo, consistente en la separación,

envasado y almacenamiento de cada uno de

los reactivos peligrosos CRETI utilizados en

las prácticas deberá realizarse de acuerdo a

cada reactivo en cuestión según lo indicado

en las hojas de seguridad.

El manejo de accidentes, tales como

derrames, ingestión o salpicaduras, así como

la aplicación de primeros auxilios deberán de

realizarse de acuerdo al reactivo en cuestión

según lo indicado en la hoja de seguridad.

Las hojas de seguridad serán proporcionadas

para cada práctica en el laboratorio. De manera general, los envases destinados a los residuos CRETI deben ser de cristal de color ámbar, con capacidad de uno a cuatro litros, latas de aluminio para solventes (capacidad máxima de 20 litros) y, en algunos casos recipientes de plástico, siempre y cuando las características fisicoquímicas de la sustancia a envasar lo permita. Cada residuo debe envasarse en forma individual y colocar en el frasco respectivo el pictograma de seguridad correspondiente.

Frases R Frases S Combinación de frases

R 7 Puede provocar incendios S 3 Conservar en sitio fresco R 20/21 Nocivo por inhalación y contacto por la piel

R 23 Tóxico por inhalación S 20 No comer ni beberdurante la manipulación R 39/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles graves por

ingestión

R 36 Irrita los ojos S 29No tirar los residuos por los desagües

S 3/7Mantenga el contenedor bien cerrado y en un lugar fresco

R 45 Puede ser cancerígeno S 37Llevar guantes deprotección adecuados

S 36/37/39Utilice ropa protectora adecuada, guantes yprotección facial o gafas

130

Ácido clorhídrico

Identificación Fórmula química: HCl Apariencia y olor: solución de color ligeramente amarillo o incolora con olor característico muy penetrante. Marcaje liquído corrosivo

Sinónimos: ácido muriático, cloruro de hidrógeno.

Generalidades Está presente en el sistema digestivo de muchos mamiferos y una deficiencia de éste provoca problemas en la digestión; un exceso provoca úlceras gastricas. La disolución acuosa grado reactivo contiene aproximadamente 38% de HCl.

Propiedades física y químicas PM: 36.46 Solubilidad: soluble en agua pH de disoluciones acuosas: 0.1 (1.0N), 4.0(0.001N). Reacciona con la mayorÍa de los metales desprendiendo hidrógeno. Con agentes oxidantes como peróxido de hidrogeno genera cloro, el cual es muy peligroso. Niveles de toxicidad. DL50 (oral en conejos): 900 mg/Kg, inhalación en ratas): 3124 ppm/1 h.

CLMo (concentración letal minima publicada):

(inhalación en humanos) 1300 ppm/30 min;

3000ppm/5 min.

Riesgos Produce gas inflamable cuando se encuentra en contacto con metales. Se generan v apores tóxicos e irritantes de cloruro de hidrógeno cuando se calienta. Inhalación: elgas causa dificultad para respirar, tos, inflamación y ulceración de nariz, tráquea y laringe. Exposiciones severas causan espasmo de la laringe y edema en los pulmones. Contaco con los ojos y piel: es un irritante severo de ojos y piel, puede causar quemaduras serias, dermatitis, reducir la visión o, incluso, la pérdida total de ésta.

Ingestión: produce corrosión de las membranas

mucosas de la boca, esófago y estómago, causa

náusea, vómito, disfagia, sed intensa y diarrea

Primeros auxilios Ojos: lavar inmediatamente con agua corriente durante 15 mi nutos. Piel: quitar ropa y zapatos contaminados, lavar inmediatamente la zona dañada con abundante agua. Inhalación: mover a la persona al aire fresco; si se dificulta la respiración proporcionar oxigeno y mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir nada. Ingestión: no provocar vómito y dar a beber agua continuamente, por ejemplo, una cucharada cada 10 minutos o dar a beber leche de magnesia. En todos los casos de exposición, el afectado debe ser transportado al hospital tan pronto como sea posible. Manejo y almacenamiento Peligro: corrosivo y venenoManténgase en envase de vidrio, en lugares secos, bien ventilados, alejados de materiales oxidantes y fuentes de ignición o calor. Tratamiento en caso de accidente Control de fuego: en caso de accidente utilizar CO2, polvo químico seco o arena seca. Los extinguidotes de fuego se eligen dependiendo de los alrededores, ya que el HCl no arde. Fugas y derrames: ventilar el área y protegerse con el equipo de seguridad necesario. Cubrir el derrame con bicarbonato de sodio o una mezcla de 50:50 de hidroxido de calcio y cal sodada, mezclar cuidadosamente. Mantener el materil lejos de fuentes de agua y drenajes hasta no ser neutralizado como se indicó anteriormente. Desechos Neutralizar las soluciones concentradas de ácido clorhídrico con carbonato de calcio o cal y diluir con agua cuidadosamente. La disolución resultante puede verterse al drenaje, con abundante agua. En caso de soluciones diluidas,

Cuadro I.7. Hoja de seguridad para el ácido Clorhídrico.

131

Cuadro I.8 Envasado y etiquetado de RPBI para su desecho.

TIPO DE RESIDUO ESTADO FÍSICO ENVASADO COLOR

Sangre

Sólido Líquido

Bolsa de plástico

Recipiente hermético

Rojo

Cultivos y cepas de agentes infecciosos

Sólidos Líquidos

Bolsa de plástico

Recipiente hermético

Rojo

Residuos no anatómicos

Sólidos Líquidos

Bolsa de plástico

Recipiente hermético

Rojo

Patológicos

Sólidos Líquidos

Bolsa de plástico

Recipiente hermético

Amarillo

Objetos punzocortantes usados y sin usar

Sólidos

Recipientes rígidos

Rojo

132

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

II EXPERIMENTOS

133

Práctica 1

Soluciones Tiempo de la práctica 3 horas Objetivos Que el alumno: 1. Identifique la existencia de soluciones en los sistemas biológicos. 2. Explique los cálculos y procedimientos para preparar soluciones porcentuales, molares y normales, así como las diferentes diluciones de éstas. 3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas en medicina (solución isotónica, Ringer, Darrow y Hartman). Responda a las siguientes preguntas: 1.¿Qué es una solución? 2.¿Cuántas clases de soluciones existen? 3.¿Qué significan los siguientes términos: mol, solución molar y solución normal? 4.¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm? 5.¿Cuál es la composición de las siguientes soluciones: solución isotónica de cloruro de sodio, suero glucosado al 5%, Ringer-lactato? 6.¿Cuáles son los tipos de soluciones que existen in vivo? Mencionar ejemplos. 7.¿Qué es una solución isotónica? 8.¿Qué es una solución osmolar? 9.¿Cómo se calcula la osmolaridad de una solución? 10.¿Qué les pasa a los eritrocitos cuando se ponen en contacto con soluciones salinas de diferente osmolaridad? 11.¿Qué se entiende por dilución y dilución seriada de las soluciones? Material Por equipo: • 3 vasos de precipitado de 10 ml • 3 pipetas de 1.0 ml • 3 pipetas de 5.0 ml • 3 pipetas de 10.0 ml • Gradilla con 6 tubos de ensayo •Eritrocitos humanos lavados en solución • Salina isotónica • Solución de azul de metileno al 1.0% • Cloruro de sodio en cristales (NaCl) • Balanza granataria Por grupo: • 1 Microscopio marca Leica. Procedimiento 1. Hacer los cálculos correspondientes para comprobar que la solución a 0.9% de NaCl es isotónica con respecto al plasma (ver pag. 121). Considerar que:

134

a) El cloruro de sodio se disocia en solución acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo que la concentración iónica se duplica (1 mmol/l = 2 mosm/l). b) La presión osmótica normal del plasma es de 290-310 mosm/l. 2. Preparar 20 ml de una solución de NaCl a 4.5% (etiquetar como solución 1). 3. A partir de la solución anterior, preparar 25 ml a 0.9% (solución 2) y 50 ml a 0.045% (solución 3). 4. Colocar en tres tubos de ensayo las diferentes soluciones de cloruro de sodio preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda de un gotero (dejando caer lentamente por las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos lavados. Mezclar con cuidado y dejar reposar a temperatura ambiente unos minutos. Valorar el grado de hemólisis que sufren los eritrocitos cuando se ponen en contacto con las diferentes soluciones. 5. De las 3 soluciones prepradas tomar una gota de cada una y por separado colocarlas en un porta-objetos, colocar un cubre-objetos y observarlas al microscopio, para valorar el efecto de los eritrocitos. Ver las intrucciones para el uso del microscopio 6. Hacer la dilución y redilución (dilución seriada) de la solución de azul de metileno como se muestra en el siguiente cuadro: DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE METILENO

Tubo H2O (ml) Sol de azul de metileno

Volumen de transferencia

1 2 0.5 ml* - 2 2 - 0.5 ml 3 2 - 0.5 ml 4 2 - 0.5 ml 5 2 - 0.5 ml 6 2 - 0.5 ml

*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en cada tubo varias veces antes de transferir la dilución al siguiente tubo. Resultados 1. Expresar en forma ordenada los cálculos efectuados para cada uno de los ejercicios. 2. Deducir el movimiento o no del solvente cuando se ponen en contacto eritrocitos con soluciones hipo, hiper e isoosmóticas. 3. Calcular la dilución y la concentración de azul de metileno en cada uno de los seis tubos de la dilución seriada (ver pág. 93). Asegúrese que la coloración obtenida disminuya gradualmente conforme avanza la dilución. Problemas 1. Hacer los cálculos para preparar una solución de KCl al 3%. 2. Hacer los cálculos para prepara una solución de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml.

135

3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere para preparar una solución 3N 40 ml volumen final. 4.- Prepare 500 ml de una solución 0.125 M de NaHC03

5.- 250 ml de H2SO4 0.1 M 6.-100 ml de glucosa 0.5 M 7.-Cuantos mililitros de HCl 0.1M contiene 0.025 mol de HCl 8.-Cuantos gramos de soluto se requieren para preparar las siguientes soluciones: 125 ml de NaCl al 10% 50 ml de Ca(NO3) al 3.35 % 750 ml de CaCl2 al1.5% 9.-Cual presenta la osmolaridad más alta NaCl 0.1M o Na2SO4 0.08 M 10.-¿Cuánta agua habrá que añadirles para que resulte un suero 0.4 osmolar? 11.- Calcular la osmolaridad a partir de la composición de algunas soluciones como Dextrosa a 10 % en solución salina a 0.45%. 12.-Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2 %. Hartman, Ringer y Darrow Referencias 1. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón DO, Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH Editores; 2000. 2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA, Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial Limusa; 2004. 3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna. 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2002: p. 41-56. 4. Holum JR. Fundamentos de química general, orgánica y bioquímica para ciencias de la salud. México: Editorial Limusa Wiley; 2001. 5. Farias GM. Química clínica. Décima edición México: Editorial El Manual Moderno; 1999. 6. Bloomfield MM.Química de los organismos vivos. México: Editorial Limusa; 1997.

136

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO MARCA LEI CA 1. Nunca use un adaptador entre el cable y la fuente de alimentación. 2. Use siempre el microscopio sobre una superficie dura y estable. 3. Conecte el cable de alimentación del microscopio a una toma de corriente con conexión a tierra. Se suministra un cable de tres terminales con toma a tierra. 4. Encienda el microscopio girando el interruptor de control de la iluminación situado en la parte inferior izquierda del instrumento. 5. Coloque el interruptor de control de la iluminación en el nivel más bajo. El control de iluminación le permite ajustar la intensidad de luz. 6. Abra completamente el diafragma de apertura del condensador girando el anillo hacia el extremo derecho. 7. Usando el botón de enfoque del condensador, suba el condensador hasta el extremo superior de su desplazamiento. Iluminación critica únicamente: si el desplazamiento del condensador es excesivo, limítelo con el tornillo situado debajo de la platina hasta que la lente superior del condensador se encuentre debajo de la superficie de la platina. 8. Coloque la preparación de la muestra con la muestra en la platina. 9. Gire el revólver hasta situar el objetivo 4X en la posición de trabajo. (pag X) 10. Suba la platina girando el mando de enfoque macrométrico hasta que observe la preparación y, finalmente, enfoque la muestra con precisión

utilizando el mando de enfoque micrométrico. 11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de los ojos. 12. Al término del uso del microscopio retirar la muestra de la platina. 13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla a su posición original si es necesario. 14. Colocar el revolver de los objetivos de manera que el objetivo de 4X sea el que quede en dirección de la lámpara. 15. Desconectar el equipo y enrollar el cable. 16. Limpiar la platina y oculares con un paño humedecido con metanol o con un limpia cristal comercial. 17. Colocar al microscopio la funda contra el polvo para mantenerlo en buenas condiciones físicas y mecánicas. Partes del microscopio: 1) Oculares. 2) Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y 100X. 3) Platina. 4) Diafragma. 5) Lámpara. Tornillo de la platina para desplazar la muestra. Interruptor de control de la iluminación. Tornillo macrométrico. Tornillo micrométrico.

1

3

4

5

6

7

9

8

137

Práctica 2

Regulación del equilibrio ácido-base después del ejercicio muscular intenso

y de la ingestión de bicarbonato de sodio Tiempo de práctica: 3 horas Objetivos 1. Al finalizar la práctica, el alumno constatará las actividades reguladoras del pulmón y el riñón para mantener el equilibrio ácido-base en condiciones que tienden a romperlo. 2. Mediante la determinación del pH observará la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha realizado ejercicio muscular intenso. 3. Relacionará los resultados obtenidos con los cambios metabólicos originados por el ejercicio muscular intenso. Conteste las siguientes preguntas: 1. ¿Por qué es importante que se mantenga constante, dentro de ciertos límites, el pH en el organismo? 2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H

+

en el organismo? 3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que facilitan la eliminación del H

+

producido en el organismo con el fin de mantener constante el pH sanguíneo? 4. ¿Cuáles son las reacciones de formación del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y H2O, y de su disociación para formar el ion bicarbonato? Escríbalas. 5. ¿Qué sistemas amortiguadores participan directamente en la regulación del pH sanguíneo? 6. ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos que tienden a mantener el pH extracelular?

Escriba la ecuación de Henderson y Hasselbalch aplicada al sistema HCO3

–

/H2CO3 y, con base en ella, conteste la siguiente pregunta: a).¿Cómo participan el aparato respiratorio y el riñón en el control del pH sanguíneo? INTRODUCCIÓN Dentro de los mecanismos de regulación de que dispone el organismo para mantener la integridad fisiológica, aquellos involucrados en la homeostasis del pH en los fluidos extracelulares desempeñan un papel crucial para la supervivencia del individuo. En este sentido cabe señalar que, como resultado de la oxidación de los alimentos, un humano adulto promedio produce alrededor de 20 moles de CO2 al día, Al difundir a la sangre, gran parte de dicho gas se combina con al agua en el interior de los eritrocitos, produciendo ácido carbónico (H2CO3), reacción que es seguida por la disociación del H2CO3

para producir el anión bicarbonato HCO3-

y un ión hidrógeno (H+). Dado el carácter de ácido débil del H2CO3, la fracción disociada del mismo es pequeña; sin embargo, considerando la gran cantidad de CO2 que produce el organismo, la acidificación de los fluidos extracelulares sería importante en ausencia de mecanismos reguladores. En el hombre, la intervención de los pulmones y los riñones evita que ocurra tal acidificación manteniendo en un nivel constante la

138

concentración de H+ y, por consiguiente, del pH. Para entender el papel que juegan ambos órganos en la homeostasis del equilibrio ácido-base, debe tenerse presente que el sistema del ácido carbónico implica la participación de un componente gaseoso o volátil (el CO2) y dos componentes no volátiles (el HCO3

- y el H+). En la sangre, el equilibrio entre dichos componentes determina el valor del pH sanguíneo, que puede evaluarse mediante la bien conocida ecuación de Henderson-Hasselbach. En el individuo normal, dicho valor fluctua en un promedio 7.4, siendo la sangre venosa –enriquecida en CO2 ligeramente más ácida en relación con la sangre arterial. Ahora bien, ya que a temperatura ambiente el CO2 existe en estado gaseoso, la cantidad de CO2

disuelto en la sangre dependerá de la presión parcial (PCO2) ejercida por el mismo a nivel de los alvéolos pulmonares. En el mundo, la magnitud de dicha PCO2 es de aproximadamente 40 mmHg , lo que se traduce en una concentración de CO2 sanguíneo de aproximadamente 25 mM; este último valor incluye no solo el CO2 como tal, sino también el bicarbonato y el ácido carbónico. Considerando el pH sanguíneo normal y el pKa del sistema bicarbonato-ácido carbónico, la relación [HCO3

-] / [H2CO3 + CO2] es de aproximadamente 20. Es precisamente la PCO2 la que es controlada por los pulmones, ya que durante el proceso de la exhalación se elimina CO2,

manteniendo constante la PCO2 en los alvéolos y evitando así que que aumente el nivel de CO2, disuelto en la sangre. Todo proceso o patología que se Por lo que respecta a los riñones, su participación en el mantenimiento de un pH extracelular constante se da a través de dos mecanismos: la excreción de equivalentes ácidos (H+) hacia la orina y la regulación de la cantidad de HCO3

- reabsorbido hacia la sangre desde el filtrado glomerular. A diferencia del

intercambio gaseoso en los pulmones, los mecanismos de regulación renal son de situaciones patológicas donde se altera el intercambio de gases pulmonar (es decir, en la acidosis y alcalosis respiratorias), en cuyo caso es necesario aumentar o disminuir la tasa de reabsorción del HCO3

- , o bien en estados fisiológicos que producen cantidades importantes de ácidos orgánicos (por ejemplo, en la diabetes no controlada o durante el ejercicio intenso) donde se incrementa la excreción de H+ Gran parte de este último aparece en la orina acomplejado con el amoniaco en forma de ión amonio (NH4

+) o asociado con el fosfato en forma de fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4), representando este último la llamada acidez titulable. En general, el pH de la orina será un reflejo de la producción de ácidos no volátiles por el organismo. El resultado final de los mecanismos fisiológicos que participan en el mantenimiento del equilibrio ácido-base es el de mantener el pH extracelular en un rango compatible con el funcionamiento adecuado del organismo manifieste en una alteración en la frecuencia y/o profundidad del proceso de inhalación-exhalación, dará como resultado una alteración de la PCO2

alveolar – aumentandola o disminuyéndole -con la siguiente modificación del del nivel de CO2] Material • Diez probetas o vasos de precipitado. • Orina. • Solución de bicarbonato de sodio a 3%. • Potenciómetro. Método Un alumno por equipo desayunará o comerá normalmente (evitar ingestión de jugos ácidos); después hará lo que se indica a continuación. 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina.

139

2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Orinar en un vaso de precipitado de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua. 5. Realizar ejercicio muscular intenso, como subir y bajar varias veces las escaleras de tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido por el profesor. 6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, como en el inciso 3, hasta completar por lo menos cinco muestras. 7. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a aumentar debido a la pérdida de dióxido de carbono y a que el crecimiento bacteriano produce amoniaco a partir de la urea. Análisis de resultados Análisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las 5 muestras de orina, trazar una gráfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. Objetivos (Segunda parte) 1. El alumno constatará el papel del riñón en el mantenimiento del equilibrio ácido-base en una situación de alcalosis metabólica provocada por la ingestión de bicarbonato de sodio. 2. Mediante la medición del pH, observar la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha ingerido una carga de bicarbonato de sodio. Hipótesis Elabore la hipótesis apropiada. Material

Orina Solución de bicarbonato de sodi al 3% Potenciómetro Método 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el volumen de la muestra. 4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio. 5. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, hasta completar por lo menos 5 muestras. 6. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida. Análisis de resultados Una vez obtenido el valor del pH para cada una de las cinco muestras de orina, trazar una gráfica de pH contra tiempo; interpretar los resultados y discutirlos en grupo. Referencias 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverte; 2004. 2. Montgomery R. Bioquímica: casos y texto. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4. 3. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón.

140

Práctica 3

Cinética enzimática. Efecto de la concentración del sustrato

sobre la velocidad de reacción enzimática

Tiempo de práctica: 2 horas Objetivo

El alumno:

1. Explicará el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática. 2. Calculará por métodos gráficos la velocidad máxima y la constante de Michaelis de una reacción enzimática. 3. Conocerá los diferentes tipos de inhibidores que existen y estudiará su efecto sobre la Km y V máx. 4. Conocerá aspectos básicos de fotocolorimetría (ver pág, 115).

Para lograr los objetivos de esta práctica contestar las siguientes preguntas:

1. ¿Qué es la velocidad de una reacción enzimática? 2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis (Km) de una reacción enzimática? 3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V máx) de una reacción? 4. ¿Para qué le sirve a un médico la determinación de la actividad de algunas enzimas? 5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación tiene valor diagnóstico? Hipótesis

Si la velocidad de una reacción enzimática es proporcional a la concentración del sustrato; cuando la concentración del

sustrato es muy alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza su velocidad máxima. La enzima que sirve de modelo en esta práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.

INTRODUCCIÓN Las enzimas son las proteínas más

notables de la naturaleza; sin ellas, la vida como la conocemos no sería posible. Las enzimas son catalizadores, esto es, aceleran la velocidad de las reacciones sobre las que actúan sin consumirse en el proceso. El poder catalítico de las enzimas es mucho mayor que el de los catalizadores inorgánicos, algunas de ellas están limitadas solo por la velocidad con que colisionan con sus sustratos; son catalizadores perfectos.

Aunque las reacciones que ocurren en la célula son termodinámicamente favorables, la velocidad a la cual transcurren la mayoría de ellas es extremadamente lenta; sin la presencia de las enzimas, las reacciones necesarias para sostener la vida ocurrirían a una velocidad incompatible con ésta. Además de su enorme poder catalítico, las enzimas son altamente específicas por sus sustratos y tienen la capacidad de regular su velocidad en respuesta a las concentraciones de sustrato y la presencia de inhibidores, activadores, reguladores alostéricos, etc. Así pues, las enzimas desempeñan un papel central en los procesos biológicos, son las responsables de degradar y sintetizar las moléculas que nos forman y de extraer,

141

transformar y utilizar toda la energía relacionada con estos procesos. Por último, las enzimas son las responsables de regular y coordinar todas las reacciones que ocurren en un organismo para lograr el delicado balance que representa la vida.

El primer modelo matemático que explicó de manera general la cinética de las enzimas no alostéricas, donde la velocidad de la reacción se incrementa hiperbólicamente conforme aumenta la concentración de sustrato, fue propuesto en 1913 por Leonor Michaelis y Maud Menten a partir de los trabajos previos de Victor Henri y Archibald Hill. Este modelo postula la idea central de que la enzima y el sustrato libres establecen un equilibrio rápido con el complejo enzima-sustrato; en un segundo paso más lento, este complejo se rompe liberando el producto y regenerando la enzima libre. La ecuación de Michelis-Menten explica la relación entre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima y la concentración de sustrato a través de los dos parámetros de la ecuación, Vmax y Km. La ecuación de Michaelis-Menten puede ser re-arreglada matemáticamente para obtener su forma lineal, permitiendo determinar de manera sencilla los parámetros cinéticos de una enzima a través del grafico de Lineweaver-Burk. Este mismo gráfico permite inspeccionar rápida y visualmente las diferentes formas de inhibición enzimática.

El estudio de las enzimas es de suma importancia dentro de las ciencias médicas; las enzimas están implicadas en el origen, diagnostico y tratamiento de una gran cantidad de patologías y es claro que en el futuro, su preponderancia será cada vez mayor. Por ejemplo, la deficiencia de algunas enzimas, como las proteasas de la coagulación en la hemofilia, es causa de enfermedades hereditarias. La presencia anormal de algunas enzimas en el torrente sanguíneo ayuda a diagnosticar el daño específico de tejidos, este es el caso de la amilasa y lipasa en las patologías pancreáticas y las transaminasas en las enfermedades hepáticas. Las enzimas son también el blanco de varios fármacos: la

aspirina inhibe a la ciclooxigenasa, el omeprazol a la ATPasa de protones y el captopril a la enzima convertidora de angiotensina; estas inhibiciones redundan en un efecto terapéutico. La capacidad de producir enzimas recombinantes abrió la posibilidad de utilizarlas rutinariamente con fines terapéuticos, tal es el caso de la estreptocinasa para la terapia fibrinolítica en el infarto agudo al miocardio. Es claro que todas estas aplicaciones no serian posibles sin la previa y profunda comprensión de la estructura y función de estas fascinantes moléculas.

Fundamento

El método se basa en el hecho de que la glucosa, en presencia del oxígeno del aire y con la participación de la glucosa oxidasa, se oxida hasta ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno que se forma en el curso del proceso se descompone mediante la peroxidasa. El oxígeno atómico que se desprende en esta última reacción se combina con un cromógeno que se colorea al oxidarse. La intensidad de la coloración del cromógeno oxidado es proporcional a la concentración de glucosa. La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso molecular de 160 000. Existe en forma dimérica y contiene dos moles de FAD como grupo prostético por mol de enzima. La glucosa oxidasa es altamente específica, hecho que ha permitido su empleo para el análisis cuantitativo de glucosa. La reacción consiste de dos pasos:

1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD δ-gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH

2

2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O

2 glucosa oxidasa-FAD + H

2O

2

La δ4-gluconolactona se hidrata espontáneamente dando ácido glucónico. La reacción global se expresa: Glucosa oxidasa

142

Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2 La peroxidasa cataliza la transferencia de oxígeno del peróxido a un aceptor que es cromógeno como la ortotoluidina, la ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3-etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-amino-antipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse. La reacción se expresa: E + S ES E + P Material y reactivos • 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una. • 1 Pipeta de 5 ml. • 2 Pipetas de 5 ml. • 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml. • Fotocolorímetro con filtro azul. • Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3 y 4. • 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml–1 de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de peroxidasa, ortodianisidina 0.21 mmol/l. • Solución de azida de sodio 400 mmol/l como inhibidor. • Gotero con HCl.

Método I (con azida de sodio)

1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml preincubar 20 minutos la solución de enzimas con 0.3 ml del inhibidor. 2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).

3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para cada tubo al agregar la enzima. 4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos temperatura ambiente y de inmediato detener la reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado. Considerar un intervalo de

30 segundos para cada tubo al agregar el HCl. Método II (sin inhibidor) 1.- Preparar nuevamente una serie de tubos como lo indica la tabla 1. 2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I Leer ambas series de tubos en el fotocolorímetro; utilizar como blanco el tubo 1

Resultados (cuadro 5.2)

1. Cálculo de la concentración inicial de sustrato en cada tubo; tomar en cuenta que la solución de glucosa contiene 40 µmolas ml–1. 2. La velocidad será igual a las unidades Klett por .5 min-1 de incubación. 3. Con los datos obtenidos completar el cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en papel milimétrico. 4. Hacer una segunda gráfica con los valores de 1/v vs 1/[S]. 5. Calcular el valor de la velocidad máxima (Vmáx) y de la constante de Michaelis (Km) con y sin inhibidor. 6. Determinar el tipo de inhibidor de acuerdo con las gráficas del punto anterior. 7. Analizar si los resultados obtenidos están de acuerdo con la hipótesis planteada.

Tubo No.

Solución de glucosa (ml)

H2O (ml)

Soución de enzimas (ml)

1 0.0 1.0 3 2 dil 1:10 0.1 0.9 3 3 dil 1:10 0.25 0.75 3 4 dil 1:10 0.5 0.5 3 5 0.1 0.9 3 6 0.25 0.75 3 7 05. 0.5 3 8 1.0 0.0 3

143

Instrucciones para la operación del fotocolorímetro Klett-Summerson 1. Antes de encender el fotocolorímetro

cerciórese que el filtro (F) está en su sitio. La luz sin el filtro puede dañar la fotocelda.

2. Asegúrese que la aguja indicadora (C) está en cero. En caso contrario, ajústese a cero con la perilla (D) que sólo debe usarse cuando la lámpara del colorímetro esté apagada.

3. Encienda el foco con el interruptor de la derecha y deje que el instrumento se caliente hasta que se equilibre su operación. Cinco minutos son suficientes.

4. Ajuste la escala del potenciómetro (B) a cero usando la perilla (A).

5. Ponga una cubeta limpia llena con el blanco de reactivos en el hueco del instrumento en tal forma que la marca del tubo (ej. Pyrex) se sitúe directamente al frente. Es una buena práctica limpiar la superficie externa de la cubeta con un pañuelo desechable antes de cada lectura. Sólo deben usarse tubos seleccionados como "cubetas" para las determinaciones.

6. Por medio de la perilla (G) ajuste la lectura del galvanómetro a cero; esto es, la aguja (C) debe coincidir con el trazo central y, al mismo tiempo, con la escala (B) en cero.

7. Para leer las soluciones problema retire el “blanco” y ponga en el hueco del instrumento la cubeta con la solución problema. La aguja (C) se desviará de su posición en la línea de cero; por medio de la perilla (A) gírese la escala (B) hasta que la aguja (C) sea llevada exactamente a cero. La lectura de la escala (B) se anota y corresponde a la lectura del problema; léase únicamente hasta la marca más próxima. Cualquier intento de apreciar mayor exactitud es innecesario, pues la construcción del

instrumento no proporciona una precisión mayor.

8. Continúe con la lectura de otros problemas y, de vez en cuando, compruebe el cero con el “blanco.”

Referencias

1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005. 3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003. 4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

144

Cuadro 5.2 Resultados

Cuadro 5.3 Resultados (inverso)

Tubo No.

Concentración de sustrato µmolas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (X)

Velocidad de la reacción unidades Klett 5 min-1 1/V ORDENADAS (Y)

Velocidad de la reacción con INHIBIDOR 1/V Unidades Klett 5 min–1 (Y)

1 2 3 4 5 6 7 8

Tubo No.

Concentración de sustrato µmolas de glucosa inicial ml-1 ABCISAS (1/X)

Velocidad de la reacción unidades Klett 5 min-1 ORDENADAS (1/Y)

Velocidad de la reacción con INHIBIDOR Unidades Klett 5 min -1

1 2 3 4 5 6 7 8

145

Práctica 4

Efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata Tiempo de Práctica: 2 Horas Esta práctica es una simulación compuratizada de un fenómeno bioquímico; tiene el propósito de que los alumnos se ejerciten en el manejo de los datos obtenidos por medio de experimentación simulada estrictamente controlada. Objetivos 1. Que el alumno compruebe el efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata. 2. Relacione sus conocimientos sobre el metabolismo de la glucosa y los mecanismos del control de la glucemia y los mecanismos del control de la glucemia en un modelo experimental sencillo. Conteste a las siguientes preguntas: 1. ¿Qué es la insulina y cuál es su función? 2. ¿Dónde se sintetiza y cuántas cadenas tiene? 3. ¿Qué se sabe del mecanismo por medio del cual actúa? 4. ¿Por qué la insulina se tiene que inyectar y no se debe administrar por vía bucal? Hipótesis Si la glucemia en la rata se modifica por la acción de la insulina, la rata control mostrará una glucemia diferente a la experimental. Analizar la hipótesis apropiada. Método 1. Encender la computadora y localizar el icono del programa. El efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata. Hacer doble clic sobre este icono. 2. Hacer clic sobre los botones que indican cada de las partes de la práctica; empezar por leer las

instrucciones, los objetivos y el fundamento de la práctica para continuar con la parte experimental. 3. Seguir todos los pasos de la práctica; poner especial atención en la obtención de los datos experimentales que dberán ser anotados en papel como cualquier práctica convencional. 4. Repetir el experimento las veces que el usuario quiera, o las veces que sean necesario, hasta obtener los datos completos del experimento. Se sugiere repetirlo por lo menos dos veces y hacer un promedio de los datos obtenidos. 5. Hacer una tabla con dichos datos, graficarlo, analizar el significado de los mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o rechazar la hipótesis del experimento. Análisis de resultados 1. Analizar si los resultados obtenidos están de acuerdo con la hipótesis planteada. 2. Plantear cuál sería el resultado esperado si se hubiera trabajado con ratas diabéticas. 3. Relacionar los datos con el control hormonal de la glucemia. 4. Hacer el informe de la práctica con los resultados y las conclusiones que de éstos se deriven. Referencias 1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2003. 2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2001. 3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.

146

Práctica 5

Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transporte de electrones y de los desacoplantes

Tiempo de práctica: 2 horas Objetivos

1. Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras. 2. Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH. 3. Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de protones. Responda a las siguientes preguntas:

1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura? 2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos? 3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa? 4. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras? 5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. 6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan la fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación. En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleoen donde reside la

información genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior. A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Esta proteína es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+ de las células animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula. Además de esta ATPasa de H

+ de la

membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones

147

a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. Así, se puede proponer uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H

+ lo hidroliza

para bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana.

Hipótesis

Si las levaduras consumen glucosa, se observará una disminución progresiva de su concentración en el medio de cultivo con el tiempo y cambios en el pH extracelular.

Material

• Tres vasos de precipitado de 100 ml. • Pipetas de 5 y 10 ml. • Potenciómetro. • Piceta para enjuagar el electrodo del potenciómetro. • Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml. • Solución de glucosa (10%) para una concentración final de 1%. • Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol. • Solución de azida de sodio 400 mmol/l. • Agua destilada. Método Experimento 1 (control)

1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.

2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH. 4. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.

EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)

1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l, concentración final de 200 µmol/l. 3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

EXPERIMENTO 3 (AZIDA)

1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400 mmol/l, concentración final de 5 mmol/l. Agitar con cuidado. 3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control. 6. Registrar sus datos en la siguiente tabla.

148

pH Tiempo (min)

Glucosa Dinitrofenol

Azida de sodio

0 5 10 15 20 30 40

Análisis de resultados

1. Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizar los valores de las lecturas de pH contra tiempo.

2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio.

3. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de Na

+/K

+ en las células de los

mamíferos (ver fig. 7.1).

Referencias 1. Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem Biophys. 1975; 167:397-409. 2. Pardo JP. La ATPasa de H

+ de la membrana plasmática de los hongos. Mensaje Bioquímico. 1990; 13: 119-172.

Glucosa

Glucosa

ATP ADP

NAD NADH

Acetaldehído

H+ H+ H+

Etanol

ADP + Pi

ATP

H+

ADP

ATP

ADP + Pi

H+ H+

Mitocondria

ADP

149

Práctica 6

El efecto del etanol sobre la lipoperoxidación

Tiempo de Práctica: 2 Horas Esta práctica es una simulación compuratizada de un fenómeno bioquímica; tiene el propósito de que los alumnos se ejerciten en el manejo de los datos obtenidos por medio de experimentación simulada estrictamente controlada. Método 1. Encender la computadora y localizar el icono del programa. El efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata. Hacer doble clic sobre este icono. 2. Hacer clic sobre los botones que indican cada de las partes de la práctica; empezar por leer las instrucciones, los objetivos y el fundamento de la práctica para continuar con la parte experimental. 3. Seguir todos los pasos de la práctica; poner especial atención en la obtención de los datos experimentales que deberán ser anotados en papel como cualquier práctica convencional.

4. Repetir el experimento las veces que el usuario quiera, o las veces que sean necesario, hasta obtener los datos completos del experimento. Se sugiere repetirlo por lo menos dos veces y hacer un promedio de los datos obtenidos. 5. Hacer una tabla con dichos datos, graficarlo, analizar el significado de los mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o rechazar la hipótesis del experimento.

Referencias 1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2003. 2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2001. 3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005.

150

Práctica 7

Estudio general del metabolismo de los carbohidratos

Tiempo de práctica: 3 horas Objetivos

1. Aplicar los conocimientos generales sobre los carbohidratos a su estudio en los tejidos o líquidos corporales. 2. Conocer el metabolismo de la glucosa. 3. Conocer las alteraciones más frecuentes del metabolismo de los carbohidratos. 4. Conocer los aspectos básicos de las determinaciones del laboratorio clínico para valorar el funcionamiento del metabolismo de los carbohidratos. 5. Describir los principios analíticos para la determinación de glucosa y fructosaminas, llevar a cabo sus determinaciones y correlacionar los valores obtenidos con los valores normales de glucosa y fructosaminas en suero o plasma. Conteste las siguientes preguntas:

1. ¿Qué son los carbohidratos y cómo se clasifican? 2. ¿Cuáles son las funciones que desempeñan los carbohidratos en el organismo humano?

3. ¿Cómo se lleva a cabo la digestión y absorción de los carbohidratos?

4. ¿Cuáles son las vías metabólicas en las que participan los carbohidratos?

5. ¿Qué es la glucemia y cómo se regula? 6. ¿Cuáles son las principales alteraciones de la digestión, absorción y metabolismo de los carbohidratos (déficit de glucosidasas intestinales, malabsorción intestinal de azúcares, enfermedades del metabolismo de la fructosa y de la

galactosa, diabetes mellitus, secuelas de la diabetes, glucogenosis, etcétera)?

7. ¿Cuál es el mecanismo por el cual la glucosa puede causar daño a los tejidos (glucosilación proteica: formación de bases de Schiff, puentes glucosídicos AGE).

8. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio más utilizadas para el estudio de los carbohidratos corporales?

INTRODUCCIÓN

La glucosa es cuantitativamente el carbohidrato más importante del que dispone el cuerpo, ya sea por absorción de la dieta o por síntesis interna. Por consiguiente, la mayoría de las pruebas clínicas están basadas en el estudio del metabolismo de la glucosa. Se conocen varias alteraciones de este metabolismo, clasificándolas como:

•Primarias, alteraciones en el metabolismo de carbohidratos (diabetes mellitus, hiperinsulinismo, entre otras). •Secundarias, manifestaciones que acompañan a otras enfermedades (síndrome de Cushing, afecciones hepáticas, hipofisiarias o tiroideas, entre otras).

Entre los procedimientos diagnósticos para valorar el funcionamiento del metabolismo de los carbohidratos los más importantes son los siguientes:

• Glucosa plasmática en ayunas. • Glucosa en orina. • Cuerpos cetónicos en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria).

151

• Prueba oral de tolerancia a la glucosa.

• Hemoglobina glucosilada. • Fructosaminas. • Determinación de hormonas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos (insulina, péptido "C" y glucagón). • Determinaciones de enzimas y sustratos hidrocarbonados en células y tejidos. • Otras determinaciones (microalbuminuria, determinaciones inmunológicas y determinación de receptores).

Para llevar a cabo la determinación de glucosa plasmática en ayunas (basal) utilizaremos un método enzimático colorimétrico y para la determinación de glucosa y cuerpos cetónicos en orina utilizaremos tiras reactivas. Material • Gradilla con 3 tubos de ensayo. • Pipetas de 0.1 y 1 ml. • Solución reactiva para glucosa: TRIS 92 mmol/l, pH 7.4; fenol 0.3 mmol/l, glucosa oxidasa 15 000 U/l, peroxidasa 1000 U/l y 4-aminofenazona 2.6 mmol/l. • Solución reactiva para determinación de fructosaminas 1: proteinasa K 786 U/ml, peroxidasa 60 U/ml, amortiguador de pH y diversos estabilizadores. • Solución reactiva para determinación de fructosaminas 2: cetoamina oxidasa 9 U/ml, 4-aminoantipirina 10.5 mmol/l, EDTA 50 mmol/l, amortiguador de pH y estabilizadores. •Solución estándar de glucosa 100 mg/dl. •Solución estándar de fructosamina 150 µmol/l. •Curva patrón de fructosaminas (DA contra concentración) 50, 100, 200, 400 µmol/l. Gráfica proporcionada por la coordinación. •Suero o plasma problema (estable 3 días a 2-8°C). • Espectrofotómetro a 505 y 620 nm.

Método DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA BASAL POR GOD-POD/TRINDER

El método más utilizado en el laboratorio clínico es el de la glucosa oxidasa (GOD). Esta enzima cataliza la reacción de la glucosa presente en la muestra. GOD Glucosa + O2 + H2O H2O2 + Gluconato

La cuantificación de los resultados puede llevarse a cabo de la siguiente manera:

Mediante polarografía, determinación del consumo de oxígeno con la ayuda de un electrodo de oxígeno. La cantidad de glucosa en la muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxígeno consumido. Método muy utilizado en sistemas automatizados de análisis clínico. Enzimático colorimétrico, por determinación de la quinona producida por la acción de la peroxidasa (POD), en donde un cromógeno pasa de su forma reducida (incolora) a su forma oxidada (coloreada). El método utilizado para esta determinación es el de Trinder. En él la intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

2H2O + Fenol + 4-AF Quinona + H2O Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de tubo 1. Blanco 2. Estándar 3. Suero

problema

Estándar - 10 µl

-

Suero

problema

- - 10 µl

Solución

reactiva para

glucosa

1 ml

1 ml

1 ml

Mezclar e incubar 15 minutos a temperatura ambiente.

POD

152

La coloración es estable 30 minutos. Medir la absorbencia (A) frente a blanco de reactivos a 505 nm. Cálculo:

]/.cos[]/.[ dlgaGludlgEstándarXAEstándar

ASuero =

El resultado se obtiene en mg/dl (x 0.0555 = mmol/l). El método es lineal hasta valores de 500 mg/dl. Diluir el suero 1:2, si la concentración de glucosa es mayor a 500 mg/dl con solución salina. La hemólisis hasta 0.3 g/dl de hemoglobina no interfiere. Los anticoagulantes como el EDTA, oxalato, heparina o fluoruro no afectan a los resultados. La glucosa en suero o plasma es estable tres días a 2-8°C. A temperatura ambiente, la glucosa presente en una muestra de sangre entera puede desaparecer por completo al cabo de 6 horas debido a la glucólisis en los eritrocitos. Además, la contaminación bacteriana y la presencia de cantidades elevadas de leucocitos, pueden también aumentar dicho proceso, por consiguiente: Siempre que la muestra sea sangre total, la determinación de la glucosa debe realizarse durante la media hora siguiente a su recolección. De lo contrario, añadir un conservador que inhiba la glucólisis (fluoruro sódico). GLICACIÓN NO ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS. FRUCTOSAMINAS Y HEMOGLOBINA GLICADA

El término glicosilación no enzimático de las proteínas se refiere a la reacción entre los azúcares reductores con los grupos amino

libres de las proteínas, por un mecanismo diferente al empleado en la reacción catalizada por las enzimas glucosiltransferasas, por lo que la unión que se establece entre el azúcar y la proteína no es de naturaleza glucosídica. Se prefiere el uso del término glicación en lugar de glicosilación o glucosilación (para el caso de la unión de glucosa con la proteína) para este tipo de reacción. La glicación es una reacción de condensación entre la función aldehído o cetona de un azúcar reductor y un grupo amino libre de una proteína (residuo amino terminal o épsilon amino de una lisina) en la que se genera una base de Schiff, que se transforma en una cetoamina estable llamada producto de Amadori o fructosamina. Los productos de Amadori pueden sufrir una serie de modificaciones como la condensación entre dos de ellos para formar productos complejos de estructura química no del todo aclarada llamados AGE (Advanced Glycation End products, o productos de glicación avanzada) ver la figura 10.1. La glicación depende exclusivamente de los niveles de glucosa en los líquidos corporales y del tiempo de contacto entre ésta y las proteínas. De ahí que, la determinación de los productos de glicación puede emplearse como medida del nivel promedio de la glucosa sanguínea durante un cierto período de tiempo, el cual dependerá de la vida media de la proteína que se analice.

153

Proteína

NH H

H-C-OH

OC

H

HO-C-HH-C-OHH-C-OH

CH2-OHGlucosa Base de Schiff

CH2-OHH-C-OHH-C-OH

HO-C-H

H-CH-C-OH

N

Proteína Proteína

N-HH-C-H

HO-C-HH-C-OHH-C-OH

CH2-OHProducto de Amadori (Cetoamina )

O

Proteína

N

N OO

O

Proteína

Productos de glicación avanzada (AGE )

H-C-

Fig. 10.1. Productos de la glicación avanzada La hemoglobina glicada y las proteínas séricas glicadas (fructosaminas) se utilizan como parámetros de medida a largo plazo de la evaluación del estado del metabolismo de los carbohidratos en el diagnóstico, control y tratamiento de la diabetes (una enfermedad caracterizada por los niveles de glucosa circulante elevados). Hay un consenso general en que las complicaciones crónicas de la diabetes como las retinopatías, nefropatías, neuropatías y la aterosclerosis acelerada, entre otras, son consecuencia de los niveles altos de glucosa en la sangre, los que pueden ser determinados midiendo la concentración de proteínas glicadas. El primer indicador retrospectivo del curso de la glicemia en el tiempo, que se puso al alcance de los laboratorios clínicos fue la hemoglobina glicada (HbA1 ó HbA1c). Ésta refleja el promedio de la glucemia de las 6 a 8 semanas previas a la toma de la muestra. La hemoglobina tiene una velocidad de recambio menor que las proteínas plasmáticas, por lo que, la determinación de fructosaminas puede emplearse como índice del control de la glucemia en un periodo más corto, de alrededor de dos semanas previas a la toma de sangre. Es decir, que cubre un periodo de tiempo intermedio

entre la determinación instantánea de la glucemia y la valoración a largo plazo dada por la HbA1. La determinación de la Hb glicada puede diferenciar un proceso agudo que cursa con hiperglucemia, una hiperglucemia transitoria secundaria al estrés y una diabetes mellitus. La determinación del nivel de glicación de la albúmina plasmática (glicoAlb), que tiene una vida media de 14 a 20 días, refleja el promedio de la glucemia (y por tanto, el grado de control del paciente) en un periodo que va desde 1 a 3 semanas previas a la extracción de sangre. Aunque la albúmina es el componente sérico glicado cuantitativamente más importante, otras proteínas séricas también sufren glicación. La vida media de estas proteínas circulantes es de sólo unos pocos días, por lo cual la determinación de las proteínas séricas glicadas totales (PSG) refleja la glucemia promedio de los 15 días previos a la toma de muestra. La determinación de estos productos glicados se lleva a cabo mediante las siguientes reacciones: La proteinasa K digiere las proteínas glucosiladas para dar fragmentos de proteínas, los cuales por medio de la cetoamida oxidasa, oxidan sus enlaces cetoamida, dando como resultado aminoácidos y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza la transferencia de oxígeno del peróxido a un aceptor que es un cromógeno, que se colorea al oxidarse. La absorbencia del cromógeno oxidado a 620 nm es proporcional a la concentración de proteína glicada. La reacción completa es la siguiente:

Proteinasa K

Proteína glicada Fragmentos de proteína

glicada

154

Cetoamina oxidasa Fragmentos de proteína Aminoácidos + H2O2 Peroxidasa H2O2 + Cromógeno Cromógeno oxidado + H2O

Procedimiento para la determinación de fructosaminas:

1. Vaciar en un tubo de ensayo 0.5 ml (500 µl) de reactivo 1 para fructosaminas.

2. Agregar 0.02 ml (20 µl) de suero o plasma problema.

3. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 4. Agregar 0.1 ml (100 µl) de reactivo 2 para fructosaminas.

5. Mezclar, leer la absorbencia inicial al cabo de 30 segundos a 620 nm. 6. Leer nuevamente la absorbencia al cabo de 1 minuto.

Cálculo:

Anotar la ∆A del tubo e interpolar en la gráfica de ∆A contra concentración de fructosamina en µmol/l que será proporcionada en la coordinación de prácticas.

Valores esperados 122 - 236 µmol/l. El método es lineal hasta 1734 µmol/l. Determinación de glucosa y de cuerpos cetónicos en orina con tiras reactivas

Aunque los cuerpos cetónicos son productos intermedios del metabolismo de los ácidos grasos, la variación de sus niveles en sangre y en orina informa indirectamente acerca del metabolismo de los carbohidratos. Recolectar una muestra de orina en un recipiente de plástico o de vidrio limpios (si la muestra no se procesa durante la primera hora después de su obtención, deberá refrigerarse). Sumergir la tira reactiva en la orina y retirarla inmediatamente.

Colocar la tira reactiva horizontalmente sobre un papel absorbente, en el transcurso de 30 segundos a 2 minutos interpretar los resultados para ello: Comparar la tira reactiva con los bloques de colores que aparecen en la caja de las tiras reactivas (cambios en la coloración después de 2 minutos no tienen importancia clínica). Composición de las tiras reactivas es la siguiente:

Glucosa, 10.54% de glucosa oxidasa (Aspergillus, 250 UI), 0.2% de peroxidasa (rábano, 2500 UI) y 5% yoduro de potasio. Cetonas, 4.5% de nitroprusiato de sodio.

Referencias 1.González de Buitrago JM. Bioquímica clínica. McGraw-Hill Interamericana Editores; 1999. 2.D’Ocon, C. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico. Editorial Paraninfo; 1998. 3.Chernecky CC. Pruebas de Laboratorio y Procedimientos Diagnósticos. 2a. ed. McGraw-Hill Interamericana Editores; 1999. 4.Gaw, A. Bioquímica clínica. 2a. ed. Editorial Harcourt; 2001. 5.Anderson SC, Cockayne S. Química clínica. México: McGraw-Hill Interamericana Editores; 1995. 6.Actis SM, Rebolledo O. Avances en la valoración de fructosamina: ventajas de un nuevo equipo diagnóstico aplicado a estudios poblacionales. Acta Bioquím Clín Latinoamer. 1991; 25 (4): 391-402.

155

Práctica 8

El efecto del tetracloruro de carbono sobre las transaminasas

Tiempo de Práctica: 2 Horas Esta práctica es una simulación compuratizada de un fenómeno bioquímica; tiene el propósito de que los alumnos se ejerciten en el manejo de los datos obtenidos por medio de experimentación simulada estrictamente controlada. Método 1. Encender la computadora y localizar el icono del programa. El efecto de la insulina sobre la glucemia de la rata. Hacer doble clic sobre este icono. 2. Hacer clic sobre los botones que indican cada de las partes de la práctica; empezar por leer las instrucciones, los objetivos y el fundamento de la práctica para continuar con la parte experimental. 3. Seguir todos los pasos de la práctica; poner especial atención en la obtención de los datos experimentales que deberán ser anotados en papel como cualquier práctica convencional.

4. Repetir el experimento las veces que el usuario quiera, o las veces que sean necesario, hasta obtener los datos completos del experimento. Se sugiere repetirlo por lo menos dos veces y hacer un promedio de los datos obtenidos. 5. Hacer una tabla con dichos datos, graficarlo, analizar el significado de los mismos y, de acuerdo a lo anterior, validar o rechazar la hipótesis del experimento.

Referencias 1. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2003. 2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2001. 3. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones

156

Práctica 9

Determinación de glucosa en sangre total

Objetivos 1. Que el estudiante comprenda el metabolismo de la glucosa en sujetos sanos en diferentes condiciones metabólicas. 2. Que el estudiante corrobore los cambios de glucosa que ocurren después de la ingesta de alimentos. 4. Que el alumno sea capaz de analizar e interpretar los resultados obtenidos a partir de la determinación de glucosa en sangre total. INTRODUCCIÓN La glucosa es el proveedor de energía más importante del organismo junto con los ácidos grasos y los cuerpos cetónicos. El principal aporte proviene del intestino (glucosa alimentaria), el hígado y los riñones. En los animales superiores el metabolismo de los carbohidratos está sujeto a mecanismos de regulación complejos en los que participan las hormonas, los metabolitos y las coenzimas. El cerebro, la médula suprarrenal y los eritrocitos son los que más dependen del suministro continuo de glucosa, por que no disponen de ninguna reserva importante de la misma1. El sistema nervioso requiere de aproximadamente 150 gr de glucosa al día para realizar sus funciones normales2. La principal función bioquímica de la glucosa es la de proporcionar energía para los procesos de la vida. El adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente de energía universal para las reacciones biológicas. La oxidación de la glucosa por las vías glucolítica y del

ácido cítrico es la fuente principal de energía para la biosíntesis del ATP. El exceso de glucosa es almacenado en las células como el polímero glucógeno para demandas posteriores de energía. El papel de la insulina es desviar la glucosa extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular en la forma de macromoléculas (como el glucógeno, lípidos y proteínas). Es así que la glucosa es almacenada en tiempos de abundancia para los momentos de necesidad. Algunos minutos después de la ingesta de una comida, los niveles de insulina sanguínea aumentan. La glucosa y los aminoácidos de la dieta tales como la leucina, isoleucina y lisina, son estimulantes potentes de las células beta del páncreas haciendo que éstas segreguen insulina. La mayor parte de las células periféricas responden al aumento de la glucosa sanguínea con un aumento rápido del transporte de la glucosa dentro de las células. De esta manera, los niveles de glucosa sanguínea aumentan solamente de un 20% a un 40% en los individuos no-diabéticos. Sin embargo, aproximadamente el 80% de la entrada de glucosa no es insulino dependiente, ya que el cerebro, los glóbulos rojos, el hígado y los intestinos no requieren de insulina para la entrada creciente de glucosa cuando está presente glucosa sanguínea elevada. El músculo es el tejido dependiente de insulina más importante. Los niveles crecientes de insulina y glucosa sanguíneas inhiben la lipólisis así como a aproximadamente el 60% de la liberación normal de glucosa hepática3. Se han realizado estudios del comportamiento de la glucosa en sangre en sujetos normales en la cual se puede observar que a los 30 a 60 minutos posteriores a la ingesta de alimentos la concentración de glucosa alcanza su concentración máxima y a las dos horas vuelve a su estado basal6. Algunos minutos después de la ingesta de una comida, los niveles de insulina sanguínea aumentan6. Las concentraciones de glucosa en el suero son aproximadamente 15% más altas que las

157

concentraciones de glucosa en la sangre total esto es debido a que la glucólisis continúa en los eritrocitos. El uso del glucómetro es de mucha utilidad en el autocontrol de pacientes diabéticos, lo que ayuda a medir una glucosa en sangre casual. El valor calórico total diario de los alimentos deberá ser entre 25 y 30 Kcal/Kg/día, para las personas sedentarias y de 30 a 40 Kcal/Kg/día para una persona físicamente activa o que realiza ejercicio de manera regular4,5.

Referencias 1.-Koolman J, Roehm KH (2004). Bioquímica Texto y Atlas: 3ª Edición, Ed. Médica Panamericana, pp.: 158, 308-310 2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M. (2005). Marks’ Basic Madical Biochemestry. 2a Edición. Ed. Lippincott Williams & Wilkins. Pag. 24-26 3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones, Capítulo: 32. 4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-015-SSA2-1994, “Para la prevención, tratamiento y control de la diabetes mellitus en la atención primaria”. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la Secretaría de Salud. 5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial Mexicana NOM-015-SSA2-1994, Para la prevención, tratamiento y control de la diabetes. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la Secretaría de Salud.

6.- Manual para el manejo de las insulinas 2001. 2ª Edición. Subsecretaría de Prevención y Protección de la Salud. Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica. SSA. Mexico.

Material • Dietas: a).-Rica en carbohidratos (X gr. spaghetti). b).- Dieta rica en lípidos (hamburguesa).

• Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas mínimas de ayuno.

• Dos sujetos con actividad física constante y dos horas mínimas de ayuno.

• Glucómetros One Touch Ultra. • Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa

oxidasa (Aspergillus níger)]. • Dispositivo de punción. • Lancetas estériles con discos protectores

One Touch UltraSoft. • Recipiente para material punzo cortante. • Recipiente para material biológico-infeccioso. • Jabón para manos. • Torundas de algodón con alcohol. Método 1.- Dos sujetos sedentarios, uno de los cuales consumirá una dieta rica en carbohidratos y el otro una dieta rica en proteínas. 2.- Dos sujetos con actividad física constante, uno de los cuales consumirá una dieta rica en carbohidratos y el otro una dieta rica en lípidos. 3.- A cada uno de los sujetos en cualquiera de las condiciones y consumo de dietas se les determinará la concentración de glucosa en sangre total por medio de un glucómetro en los siguientes tiempos:

0 minutos (antes de ingerir los alimentos). 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, después de ingerir los alimentos Para realizar la determinación de glucosa en sangre total seguir los siguientes pasos: 4.-Para Insertar la lanceta a) Gire la tapa One Touch UltraSoft hacia la izquierda para quitarla b) Inserte una lanceta en el portalancetas y empújela firmemente hasta que quede bien asentada

5.- Cargue el dispositivo de punción. Deslice el botón cargador hacia atrás hasta que haga clic. El dispositivo de punción ya esta preparado para su uso.

158

6.- Lave sus manos y limpie con una torunda de algodón con alcohol la zona donde se realizará la punción. 7.- Coloque el dispositivo de punción en posición. Sostenga el dispositivo firmemente contra el costado de su dedo. Presione el botón de liberación

8.- Aplique masaje a la punta de su dedo. Un suave masaje en la punta del dedo le ayudará a obtener una gota de sangre adecuada. No exprima en exceso el área de punción.

P´’9.- Inserte la tira reactiva en el puerto de análisis, con el extremo de las barras de contacto de primero y mirando hacia arriba. Empújela hasta que no avance más

10.-Acerque y mantenga la gota de sangre en el canal estrecho del borde superior de la tira reactiva

11.- Hasta que la ventana de confirmación este completamente llena de sangre, antes que el medidor comience la cuenta regresiva.

a) Muestra adecuada

b) Muestra insuficiente

12.- Inserte la tira reactiva en el puerto de análisis, con el extremo de las barras e contacto de primero y mirando hacia arriba. Empújela hasta que no

avance más. 13.-Lectura. El resultado de la prueba de glucosa de su sangre aparecerá después de que el medidor cuente en forma regresiva de 5 a 1.

Anotar el resultado en la tabla correspondiente Tabla 14.1.

14.-Es importante desechar con mucho cuidado la lanceta usada luego de cada uso, con el fin de evitar que se produzcan lesiones accidentales con las

puntas de la lancetas. Para el desecho de las lancetas siga los siguientes pasos: 15.- Gire la tapa One Touch Ultra Soft en dirección contraria a las manecillas del reloj. 16.- Apunte el dispositivo de punción hacia a hacia usted. Presione el botón de liberación para asegurarse que el dispositivo de punción no esté en posición de cargado. Deslice el botón cargador hacia delante y deposite la lanceta en un recipiente para material punzo cortante 17.- Desechar las tiras reactivas en una bolsa para material biológico-infeccioso junto con las torundas de algodón empleadas en la práctica. 18.-Con los datos obtenidos completar el cuadro 14.1 y hacer una gráfica de todas las variantes en papel milimétrico.

3 a

b

159

Tabla 14.1 Resultados

Fecha:_________________

Nombre: Edad: Sexo: Sedentario: Actividad física constante:

Tipo de dieta

Tiempo (min.)

[Glucosa mg/dl]

0 30 60 120

160

Práctica 10

Integración Metabólica

Objetivos 1.-Que el alumno pueda integrar las vías metabólicas de los carbohidratos, de los lípidos y proteínas en (condiciones normales) en un paciente sano. 2.-Que el alumno reconozca los sitios denominados encrucijadas metabólicas y las enzimas de las vías reguladoras. 3.-Que el alumno pueda correlacionar el papel que tienen las hormonas en la regulación de las vías. 4.-Que el alumno sea capaz de analizar los datos de las pruebas clínicas en un sujeto normal. 5.-Que el alumno relacione que vías se encuentran alteradas en un paciente diabético. Los alimentos que ingerimos deben estar constituidos por los 6 componentes básicos que son proteínas, carbohidratos, lípidos, vitaminas, minerales y agua, la cantidad que se requiere ingerir de cada uno de los componentes varía de acuerdo a la constitución y la actividad física que se realiza, tanto la falta como en el exceso de consumo de alguno de los componentes básicos conlleva a diversos trastornos metabólicos. Aproximadamente del 40 al 45% de nuestra ingesta calórica proviene del consumo diario de carbohidratos complejos los cuales al ser digeridos dan lugar a los diferentes monosacáridos entre los que se encuentra la glucosa, la cuál se distribuye por la sangre a las células para poder captar la glucosa, siendo la principal fuente de energía. Algunos tipos celulares son dependientes de la liberación de insulina por el páncreas como es el caso de las células musculares. Si la insulina no

funciona adecuadamente, la glucosa se queda en el flujo sanguíneo causando elevación de los niveles de glucosa en la sangre y a esto se le denomina hiperglucemia; una de las enfermedades que se caracteriza por la hiperglucemia en sus primeras etapas es la diabetes mellitus. La diabetes mellitus esta caracterizada por una hiperglucemia resultante de defectos en la secreción de insulina, en la acción de la insulina o en ambas. La hiperglucemia crónica de la diabetes está asociada a lesiones, disfunción y fallo de varios órganos, especialmente de los ojos, los riñones, el corazón y los vasos sanguíneos. Varios procesos patogénicos están implicados en el desarrollo de la diabetes. Estos van desde una destrucción autoinmunológica de las células β del páncreas, con la consiguiente deficiencia de insulina, hasta anormalidades, en las que el páncreas no produce suficiente insulina o la que produce no es eficiente. La acción deficiente de la insulina en los tejidos diana es la responsable del metabolismo anómalo de los carbohidratos de carbono, grasas y proteínas en la diabetes. La acción deficiente de la insulina ocasiona una respuesta inadecuada en uno o más puntos de la compleja trama metabólica en la que esta hormona tiene papel regulatorio. Frecuentemente coexisten en el mismo paciente una inadecuada secreción de insulina así como defectos de la acción de ésta, en la actualidad no se sabe si una de estas anormalidades es la consecuencia o

161

la causa de la otra. En cualquier caso, el resultado es la hiperglucemia. La gran mayoría de los casos de diabetes pueden incluirse en dos amplias categorías etiopatogénicas. En el primer caso (diabetes de tipo I) la causa es una deficiencia absoluta en la secreción de insulina. Los individuos con alto riesgo de desarrollar este tipo de diabetes pueden ser a menudo identificados mediante evidencias serológicas de un proceso autoinmune que se produce en los islotes pancreáticos y también mediante marcadores genéticos. En la segunda categoría (diabetes de tipo II), mucho más prevalente, la causa es una combinación de una resistencia a la acción de la insulina y de una inadecuada respuesta secretora compensadora. La diabetes tipo II se caracteriza por estar presente muchos años antes de ser detectada una hiperglucemia sin síntomas clínicos (sed, perdida de peso), pero suficiente para ocasionar cambios patológicos y funcionales sobre los órganos blanco. Durante este período asintomático, es posible demostrar trastornos en el metabolismo de los carbohidratos midiendo la glucosa plasmática en ayunas o después de una sobrecarga de glucosa por vía oral. El exceso en la ingesta de carbohidratos no solamente mantiene la reserva de energía en forma de glucógeno sino que también el exceso de carbohidratos es convertido en triacilgliceroles. En el hígado los triacilgliceroles se sintetizan a partir de acil CoA y glicerol 3-fosfato siendo empaquetados con apoproteínas y en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), secretados al torrente sanguíneo siendo almacenados en tejido adiposo. Para su consumo los triacilgliceroles son hidrolizados a glicerol y ácidos grasos. En la dieta es importante la presencia de lípidos ya que son precursores de

diferentes componentes de la célula como los fosfolipidos, uno de los lípidos que tiene una gran importancia en la célula es el colesterol, ya que proporciona rigidez a las membranas celulares y es precursor de las sales biliares así como de hormonas esteroideas. El colesterol se puede obtener por la alimentación y por síntesis del propio organismo, siendo las células hepáticas y las suprarrenales las de mayor síntesis. Para llevar a cabo la síntesis de colesterol se requiere la presencia de acetil-CoA el cual proviene de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por lo cual se denomina a la acetil-CoA la encrucijada metabólica. El colesterol es insoluble en agua por lo que transportado en la sangre por tres lipoproteínas que son de muy baja densidad (VLDL), de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL). Los niveles normales de colesterol total en sangre en un adulto son de < 200 mg/dl y cuando estos valores se ven aumentados se asocian a la formación de placas ateroscleroticas que pueden ocluir los vasos sanguíneos y como consecuencia provocar infarto al miocardio y alteraciones cardiovasculares. La cuantificación de las LDL representa un papel clave en la esclerosis coronaria ya que concentraciones elevadas indican desarrollo de la aterosclerosis. En el caso de las HDL al dismunuir su concentración aumenta el riesgo de desarrollar aterosclerosis. Las proteínas constituyen la fuente primaria del metabolismo del nitrógeno en el organismo, Los aminoácidos producto de la digestión de las proteínas que se consumen en los alimentos, son utilizados para la síntesis de proteínas y de compuestos nitrogenados o se puede oxidar para producir energía.

162

El hígado es el órgano principal en donde se realiza la oxidación de los aminoácidos. El nitrógeno de los aminoácidos forma amoniaco el cual es toxico para el organismo. El amoniaco y los grupos amino se convierten en urea en el hígado, que no es toxica y se elimina fácilmente por la orina ya que es hidrosoluble. Otro de los componentes del metabolismo nitrogenado son los nucleotidos. Las purinas y las pirimidinas, que son esenciales para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos. Los nucleótidos son precursores del DNA y el RNA, así como también forman parte de la estructura de muchas coenzimas además de ser componentes del metabolismo energético. La degradación de las purinas no genera energía y el producto de la degradación del anillo purínico es el ácido úrico, que se elimina por la orina, tiene una solubilidad limitada por lo que su exceso da como resultado la formación de cristales en regiones del organismo como pueden ser los dedos gordos del pie, trastorno que se conoce como gota. Los valores elevados de ácido úrico se presentan en: ingestión de alimentos ricos en nucleoproteínas, insuficiencia renal, azoemias prerrenales. Otro de los componentes del metabolismo nitrogenado es la creatinina que en el músculo en su forma fosorilada sirve como almacén de alta energía y se transforma con facilidad en ATP por la enzima creatina fosfocinasa. La creatina fosfato es inestable y se cicla espontáneamente forma la creatinina que se elimina en la orina. La producción de creatinina es proporcional a la masa muscular corporal. La cantidad de creatinina que se elimina diariamente puede utilizarse como indicador de la normalidad de la función renal

Material. Dietas: Dos sujetos sanos sedentarios y dos horas mínimas de ayuno. Dos sujetos con actividad física constante y dos horas mínimas de ayuno. a).-Dieta rica en carbohidratos (g spaghetti). b).-Dieta rica en proteínas. Determinación de glucosa Glucómetros One Touch Ultra. Tiras reactivas One Touch Ultra [Glucosa oxidasa (Aspergillus níger)]. Dispositivo de punción. Lancetas estériles con discos protectores One Touch UltraSoft. Recipiente para material punzo cortante. Recipiente para material biológico-infeccioso. Jabón para manos. Torundas de algodón con alcohol. Glucómetros. Determinación de colesterol y triacilgliceroles Accutrend Roche para determinación de colesterol y triacilgliceroles. Tiras reactivas para determinación de colesterol. Tiras reactivas para determinación de triacilgliceroles. Lancetas estériles. Determinación de hemoglobina glicosilada. Micromat HbA1c BIO-RAD para determinación de hemoglobina glicosilada en sangre total. Lancetas estériles. Las determinaciones de urea, creatinina y ácido úrico, se realizaran en orina. La muestra de orina deberá ser del alumno a quien se le haya determinado glucosa, colesterol y triacilgliceroles para poder discutir todos los valores en conjunto y

163

poder enlazar en un mismo individuo el efecto que tiene la dieta sobre el metabolismo. Determinación de urea Pipetas automáticas (10 a 200µl) Puntas para micropipetas Propipetas. Reactivo para urea. Estándar de urea (50 mg/dl). Espectrofotómetro. Celdas. Agua destilada. Pipetas Pasteur de plástico. Determinación de creatinina Reactivo para creatinina. Estándar de creatinina (2 mg/dl). Determinación de ácido úrico Pipetas de 5 ml. Gradilla con 2 tubos de ensaye. Reactivo para ácido úrico. Estándar de ácido úrico (6 mg/dl). Método Determinación de glucosa 1.-Dos sujetos sedentarios, uno de los cuales consumirá una dieta rica en carbohidratos y el otro una dieta rica en lípidos. 2.-Dos sujetos con actividad física constante, uno de los cuales consumirá una dieta rica en carbohidratos y el otro una dieta rica en lípidos. 3.-A cada uno de los sujetos en cualquiera de las condiciones y consumo de dietas se les determinará la concentración de glucosa en sangre total por medio de un glucómetro en los siguientes tiempos: 0 minutos (antes de ingerir los alimentos). 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, después de ingerir los alimentos. Para realizar la determinación de glucosa en sangre total seguir los siguientes pasos: 4.-Para Insertar la lanceta a) Gire la tapa One Touch

UltraSoft hacia la izquierda para quitarla. b) Inserte una lanceta en el portalancetas y empújela firmemente hasta que quede bien asentada. 5.- Cargue el dispositivo de punción. Deslice el botón cargador hacia atrás hasta que haga clic. El dispositivo de punción ya esta preparado para su uso. 6.- Lave sus manos y limpie con una torunda de algodón con alcohol la zona donde se realizará la punción. 7.- Coloque el dispositivo de punción en posición. Sostenga el dispositivo firmemente contra el costado de su dedo. Presione el botón de liberación. 8.- Aplique un suave masaje a la punta de su dedo que le ayudará a obtener una gota de sangre adecuada No exprima en exceso el área de punción. 9.-Acerque y mantenga la gota de sangre en el canal estrecho del borde superior de la tira reactiva 10 a) Muestra adecuada b) Muestra insuficiente

a b

164

11.- Inserte la tira reactiva en el puerto de análisis, con el extremo de las barras de contacto de primero y mirando hacia arriba. Empújela hasta que no avance más. 12.- Hasta que la ventana de confirmación este completamente llena de sangre, antes que el medidor comience la cuenta regresiva. 13.-Lectura el resultado de la prueba de glucosa de su sangre aparecerá después de que el medidor cuente en forma regresiva de 5 a 1. Anotar el resultado en la tabla correspondiente Tabla 15.1 14.-Es importante desechar con mucho cuidado la lanceta usada luego de cada uso, con el fin de evitar que se produzcan lesiones accidentales con las puntas de la lancetas. Para el desecho de las lancetas siga los siguientes pasos: 15.- Gire la tapa One Touch Ultra Sofá en dirección contraria a las manecillas del reloj. 16.- Apunte el dispositivo de punción hacia el recipiente para el material punzo cortante Presione el botón de liberación para asegurarse que el dispositivo de punción no esté en posición de cargado.

Deslice el botón cargador hacia delante y deposite la lanceta en un recipiente para material punzo cortante. 17.- Desechar las tiras reactivas en una bolsa para material biológico-infeccioso junto con las torundas de algodón empleadas en la práctica. 18.-Con los datos obtenidos completar el cuadro 15.1 y hacer una gráfica de todas las variantes en papel milimétrico. Cuadro 15.1 Resultados

Fecha:_________________

Nombre: Edad: Sexo: Sedentario: Actividad física constante: Tipo de dieta

Tiempo (min.)

[Glucosa mg/dl]

0 30 60

120 Determinación de colesterol y triacilgliceroles Accutrend®GCT. 1.-Lavarse las manos cuidadosamente esto es con la finalidad de retirar residuos de crema o grasa en las manos para evitar determinaciones erróneas

principalmente cuando se realiza la determinación de triacilgliceroles. 2.- Con la ayuda de unas pinzas extraer una tira reactiva del envase y taparlo inmediatamente para evitar que las tiras se sequen. 3.-Con la tapa cerrada D inserte en la ranura F, en la dirección indicada por la

165

flecha, la tira reactiva con el cuadrado amarillo hacia arriba hasta que encaje y deje verse la marca TG o CHOL impresa en la tira reactiva. 4.-Frote y masajee la yema del dedo para facilitar la extracción y aplicación de la sangre. 5.-Con la lanceta introduzca para hacer la punción y realice la toma de muestra. 6.-Aplicar directamente la gota de sangre a la tira reactiva y proceder a la lectura de la concentración de colesterol y triacilgliceroles según sea el caso, si no se llena completamente el equipo le marca R-5. 7.-Realice la lectura. 8.-Anote la lectura. 9.-Si esto llegara a suceder volver a tomar otra tira reactiva para proceder a iniciar completamente desde el paso uno. Determinación de hemoglobina glicosilada Guía rápida Micromat II. (Detección de hemoglobina glicosilada). 1.-Insertar el cartucho de análisis. 2.-Girar el cartucho a la posición 1. 3.-Extracción de muestra capilar o venosa. 4.-Comenzar la incubación, presionar enter 5.-Invertir 3 veces. 6.-Dispensar la muestra en el embudo central. 7.-Girar el cartucho a la posición 2, sacar

el tubo de la solución de lavado (tapón azul). 8.-Verter la solución de lavado al embudo central.

9.-Girar el cartucho a la posición 3, sacar el tubo de la solución eluyente (tapón transparente). 10.-Verter el eluyente al embudo central. 11.-Girar el cartucho a la posición de partida. 12.-Extraer el cartucho de análisis, el resultado se observará en la pantalla. 13.-Presionar enter para un nuevo análisis. Determinación de urea en orina La urea presente en la muestra reacciona con el o-ftaldehído en medio ácido originando un complejo coloreado puede

identificarse

espectrofotométric

amente. Urea + o-ftaldehído

Isoindolina La urea es estable 5 días a 2-8 °C. 1.-Diluir la muestra 1:50 con agua destilada mezclar y multiplicar el resultado por el factor de dilución (50). 2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la orina con la pipeta Pasteur de plástico hasta la marca (lo que corresponde a 0.5 ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya contiene 24.5 ml de agua, con ello se tendrá una dilución 1:50, de ahí tomar la muestra como se esquematiza en el cuadro. La determinación se realiza directamente en las celdas con la finalidad de tomar la lectura de las absorbancias exactamente al minuto (A1) y a los dos minutos (A2). Mezclar y poner en marcha el cronómetro, anotar las absorbancias a los 60 (A1) y 120 (A2) segundos.

Celda 1 2 Orina 100

µl -

Estándar - 100 µl

Solución reactiva

de creatinina

1 ml 1 ml

Celda 1 2 Muestra 25 µl -- Estándar -- 25 µl

Solución reactiva para urea

1 ml 1 ml

166

Leer frente blanco de reactivos en el espectrofotómetro a 520 nm. Calcular el incremento de la absorbencia ∆A = A2 – A1. Con las diferencias de absorbancias anotadas ∆A, aplicar la siguiente ecuación: ∆A Muestra X [Estándar] = [Urea] ∆A Estándar El resultado se obtiene en mg/dl. Determinación de creatinina en orina 1.-Diluir la muestra 1:50 con agua destilada mezclar y multiplicar el resultado por el factor de dilución (50). 2.-Para realizar la dilución 1:50 recupere la orina con la pipeta Pasteur de plástico hasta la marca (lo que corresponde a 0.5 ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya contiene 24.5 ml de agua, con ello se tendrá una dilución 1:50, de ahí tomar la muestra como se esquematiza en el cuadro. La determinación se realiza directamente en las celdas con la finalidad de tomar la lectura de las absorbancias exactamente a los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos. Mezclar y poner en marcha el cronómetro, anotar las absorbancias a los 30 (A1) y a los 90 (A2) segundos. Leer frente blanco de reactivos en el espectrofotómetro a 492 nm. Calcular el incremento de la absorbencia ∆A = A2 – A1. Con las diferencias de absorbancias anotadas ∆A, aplicar la siguiente ecuación: ∆A Muestra X [Estándar] = [Creatinina] ∆A Estándar El resultado se obtiene en mg/dl. Determinación de ácido úrico en orina. 1.-Diluir la muestra 1:10 con agua destilada, mezclar y multiplicar el resultado por el factor de dilución (10).

2.-Para realizar la dilución 1:10 recupere la orina con la pipeta Pasteur de plástico hasta la marca (lo que corresponde a 0.5 ml) y colóquelo en un tubo Falcón que ya contiene 9.5 ml de agua, con ello agregue agua hasta la marca de 5 ml con ello tendrá una dilución 1:10 de ahí tomar la muestra como se esquematiza en el cuadro. La determinación se realiza en tubos de ensaye. Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia (A) en el espectrofotómetro frente a blanco de reactivos a 520 mn. Cálculo de la concentración de ácido úrico. A Muestra X [Estándar] = [Ácido úrico] A Estándar El resultado se obtiene en mg/dl. Referencias 1.-Koolman J, Roehm KH (2004). Bioquímica Texto y Atlas: 3ª Edición, Ed. Médica Panamericana, pp.: 158, 308-310 2.-Smith, C; Marks, A. D. & Lieberman, M. (2005). Marks’ Basic Madical Biochemestry. 2a Edición. Ed. Lippincott Williams & Wilkins. Pag. 24-26 3.-Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones, Capítulo: 32. 4.- NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-015-SSA2-1994, “Para la prevención, tratamiento y control de la diabetes mellitus en la atención primaria”. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la

Tubo 1 2 Orina 100 µl -

Estándar - 100 µl Solución reactiva

de ácido úrico 1 ml 1 ml

167

Secretaría de Salud. 5.-MODIFICACIÓN a la Norma Oficial Mexicana NOM-015-SSA2-1994, Para la prevención, tratamiento y control de la diabetes. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la Secretaría de Salud. 6.- Manual para el manejo de las insulinas 2001. 2ª Edición. Subsecretaría de Prevención y Protección de la Salud. Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica. SSA. México.

7.- NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-030-SSA2-1999, Para la prevención, tratamiento y control de la hipertensión arterial. Listado de Normas Oficiales Mexicanas de la Secretaría de Salud.

168

Práctica 11

Huella génica Objetivos 1. Que el estudiante conozca la aplicación de las técnicas de DNA recombinante. 2. Que el estudiante sea capaz de analizar e interpretar los datos generados a partir de una prueba de huella génica. 3. El alumno adquirirá la capacidad de manejar muestras para análisis de ácidos nucleicos. 4. El alumno desarrollará destreza en la interpretación de resultados de metodologías básicas de análisis molecular. FUNDAMENTO

El DNA es un polímero lineal formado por desoxirribonucleótidos que contienen a las bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina, timidina. La interacción de las bases nitrogenadas por puentes de hidrógeno permite la formación de la doble cadena de DNA. Cada grupo fosfato está unido al carbono 5´ de una subunidad de azúcar y al carbono 3´ de la subunidad de azúcar del nucleótido contiguo.

Las cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno entre las bases. Las cuales son completamente lineales.

En la molécula de DNA que reside la información genética de un organismo, específicamente en la secuencia de los nucleótidos, de tal manera que cada tres bases forman un codón que corresponde a su vez a uno de los 20 aminoácidos, teniendo un total de 64 codones posibles, los cuales conforman el código genético. En el DNA se encuentran dos tipos de secuencia, la que es capaz de ser leída para dar origen a una proteína lo que permite que una célula u organismo crezca desarrolle también la no codificante una que codifica para las funciones celulares y otra no codificante, que participa en la regulación de su expresión. Algunas de las secuencias de nucleótidos no codificantes se caracterizan por ser cortas, están alineadas en tándem y se repiten miles de veces de manera constante a lo largo del

DNA. Un ejemplo de esta secuencia puede ser la siguiente. ATTCGGTATTCGGTATTCGGT. A estas secuencias se les denomina STR por sus siglas en inglés (Short Tandem Repeat). El genoma eucariótico contiene muchas de estas secuencias de DNA, y se ha visto que el número de unidades repetidas presenta diferencias de individuo a individuo que con las huellas digitales. En el caso de gemelos idénticos estas secuencias son idénticas. Estas regiones pueden ser aisladas del DNA con enzimas de restricción apropiadas y separadas de acuerdo a su longitud mediante electroforesis en gel. Cuando se completa el proceso de separación el resultado se parece a un código de barras de un envase de supermercado. Este código de barras de DNA ha permitido esclarecer algunos hechos criminales y pruebas de paternidad, a la cual se denomina técnica de “Huella génica”

Es muy frecuente que en la escena de un crimen se encuentren, en pequeñas cantidades muestras de naturaleza biológica a partir de las cuales se puede extraer el DNA como son la sangre, la saliva, la piel, el músculo, el cabello, el semen, los dientes y el hueso, entre otros.

Un método que permite tomar una pequeña cantidad de DNA y en pocas horas sintetizar millones de copias de una porción, es el método de amplificación conocido como PCR (reacción en cadena de la polimerasa), el cual se desarrollo por K. Mullis (1990), En este método se requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se desea amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar desoxioligonucleótidos sintéticos de DNA complementarios a cada uno de estos extremos de la cadena de la doble hélice. La muestra de DNA se coloca en una solución que contiene una DNA polimerasa, grandes cantidades de desoxinucleótidos y los desoxioligonucleótidos sintetizados previamente. El método se basa en la repetición cíclica de tres reacciones

169

sucesivas: en la primera reacción, la solución se calienta para que el molde de DNA se separe en sus dos cadenas. En la segunda reacción, la temperatura se reduce para permitir que los desoxioligonucleótidos se apareen por complementariedad de bases con el DNA molde y en la tercera reacción, la DNA polimerasa cataliza la síntesis simultánea de las dos cadenas a partir de cada desoxioligonucleótido que actúa como cebador. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones, el fragmento de DNA elegido se ha duplicado y por lo tanto, la cantidad de DNA molde disponible para el segundo ciclo es doble, lo mismo ocurre cada ciclo de duplicación. La obtención de múltiples copias requiere 20 a 40 veces la repetición de los ciclos. El éxito de esta técnica radica en el uso de una DNA polimerasa termoestable, que no se desnaturaliza por los repetidos ciclos de calentamiento. Esta enzima se aisló originalmente de la bacteria termófila Thermus aquaticus.

La base de la técnica conocida como huella génica se basa en las diferencias individuales de estas secuencias. Esto, generalmente se trata de cambios en un solo par de bases pertenecientes a diferentes individuos, que se presentan una vez cada 500 a 1,000 pares de bases, como promedio. Referencias Curtis, H; Barnes, N; Biología. Sexta edición. Editorial Médica Panamericana. Lewin, B; Genes VI. Editorial Oxford. Nelson, D; Cox, M; Lehninger. Principios de Bioquímica. Tercera edición. Ediciones Omega. Yuri Sivolap, Ph.D., G. Krivda, Ph.D., N. Kozhuhova., S. Chebotar., and Mark Benecke, PH.D. A Homicide in the Ukraine. DNA-based identification of a Boiled, Skeletozined, and Varnished Human Skull, and of Bone Fragments Found in a Fireplace. The American journal of Forensic Medicine and Pathology. 22 (4): 412-414 ,2001. Lennie Pineda Bernal. El análisis de DNA para pruebas de paternidad e identificación

forense. Acta Científica Venezolana. 50: 24-28, 1999. Andréa Carla de Souza Góes, Dayse Aparecida da Silva, Cristiane Santana Domingues, Joáo Marreiro Sobrinho, Elizeu Fagundes de Carvalho. Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil. Sáo Paulo Medical Journal. Revista Paulista de Medicina. 120 (3): 77-80, 2002. Centre for Genetics Education. Genetic Testing and Screening II –Forensic and Other Applications. Directory of Genetics Support Groups, Services and Information. Genetics. 235-239, 2004-2005. Jeffreys Alec Genetic Fingerprinting Naure Medicine Vol 11(10).1035-1039. 2005. Mullis K.B the Unusual Origen of the Polymerase Chain Reaction Science Am. 262 (4) 56-65. 1990.

170

SESIÓN 1 DE LABORATORIO PARA LA PRÁCTICA DE HUELLA GÉNICA ESCENA DEL CRIMEN El crimen se lleva a cabo en la calle Lago Manitoba No. 520, Col. Ampliación Granada, Delegación Miguel Hidalgo, en el sofá de la sala se encuentra el cuerpo de la dueña de la casa, una mujer de 42 años de edad. El cadáver presenta signos de estrangulamiento pero sin marcas de sogas o cinturones; tampoco se encuentran huellas digitales en su cuello. La víctima presenta una lesión defensiva en el brazo derecho con arma punzo cortante. En el sofá se observan varias manchas de sangre, algunas de ellas secas. Las más abundantes todavía están frescas. Se ignora si la sangre pertenece a la víctima o a sus agresores. El laboratorio forense se encarga de recopilar la información de la escena dando a conocer los siguientes aspectos: el cuerpo de la víctima se descubrió 20 minutos después del asesinato. Presentaba con un golpe en la cabeza, presenta señales de forcejeo en su brazo y debajo de las uñas se encuentran depositados restos de piel, sangre, y de cabellos. Algunos de ellos presentan folículos. Todo señala que la víctima forcejeó con su o sus agresores. En el lugar también se halló un florero con restos de sangre, la cual no se sabe si corresponde a la de la víctima o a los agresores. En un extremo del sofá se encuentra una pieza dental y, debido a que la víctima conserva su dentadura completa, es probable que el diente sea del victimario. En el brazo izquierdo, la victima presenta varias mordidas, algunas con sangre coagulada y otras con restos de saliva mezclados con sangre. En el interior de la casa faltan algunas piezas de valor, lo que sugiere que el móvil fué el robo.

La policía cuenta con varios sospechosos, entre los que se encuentra el esposo, con el cual la víctima tuvo una discusión la noche anterior. Se desconoce el tema de la discusión y el paradero el esposo. Otros sospechosos son los dos repartidores del gas que una hora antes habían proporcionado el servicio. Uno de ellos tiene problemas con la dentadura y aclara que se encuentra en tratamiento dental, ya que ha presentado sangrado y pérdida de algunas piezas dentales. Los otros sospechosos son los dos empleados de la casa, el jardinero que tiene una antigüedad de 4 años y presenta una lesión en el brazo que confiesa se hizo arreglando el jardín y la cocinera quien tiene sólo 3 meses laborando en la casa. Con esta evidencia se compara el DNA de cada sospechoso para encontrar al culpable o culpables del crimen, por lo que debe determinar si las muestras de sangre, cabellos, pieza dental y saliva sirven para estudiar el DNA y establecer las características que permiten utilizar alguna o todas las muestras para el estudio. Cada equipo debe escoger alguna de las evidencias previamente descritas y justificar su elección. Para realizar la comparación entre el DNA encontrado en la escena con el DNA de los sospechosos deben contarse con muestras proporcionadas por los mismos. Mencione de dónde obtendría dicho material. En el caso del esposo debe tenerse en cuenta que no se conoce su paradero, por lo cual la muestra debe ser extraída de algún objeto de uso personal; defina cuál sería éste y justifique la elección del mismo.

171

SESION 2 DE LABORATORIO PARA LA PRÁCTICA FINGERPRINTING MATERIAL - DNA de la escena del crimen con amortiguador. - DNA del sospechoso 1 con amortiguador. - DNA del sospechoso 2 con amortiguador. - DNA del sospechoso 3 con amortiguador. - DNA del sospechoso 4 con Amortiguador. - DNA del sospechoso 5 con amortiguador. - Mezcla de enzimas de restricción EcoRI/Pstl, 1800 U. - Agua estéril, 2.5 ml. - Marcador de DNA de fago lambda digerido con Hind III 0.2µg /µl, 100 µl. 1.- 23,130 pb 2.- 9,416 pb 3.- 6,557 pb 4.- 4,361 pb 5.- 2,322 pb 6.- 2,027 pb - Colorante de DNA (Biorad biosafe). - Microtubos de colores. - Microtubos blancos. - Geles de agarosa al 1.0%. - Amortiguador de electroforesis TAE (Tris-Acetato-EDTA). Tris-base 39 mM, ácido acético glacial 18 mM, EDTA 10 mM. - Gradillas para microtubos. - Recipiente para teñir geles. - Pipeta automática de 10-100 µl. - Puntas para pipetas automáticas. - Marcador indeleble. - Fuente de poder. - Cámara horizontal de electroforesis. - Parrilla para baño maría. - Vaso de precipitado de 300 ml. - Recipiente con hielo. - Microfuga. PROCEDIMIENTO 1.-Marcar los microtubos de la siguiente forma: a) Tubo verde (muestra de la escena) b) Tubo azul (sospechoso 1) c) Tubo naranja (sospechoso 2) d) Tubo violeta (sospechoso 3) e) Tubo rojo (sospechoso 4) f) Tubo amarillo (sospechoso 5)

2.-Colocar los tubos marcados en la gradilla.

3.-A cada tubo adicionar 10 µl de la muestra correspondiente; utilizar una punta nueva para cada muestra. 4.-Adicionar 10 µl de la mezcla de enzimas de restricción a cada uno de los tubos que contienen la muestra de DNA. Se debe tener cuidado de no contaminar la mezcla de enzimas, por lo cual se sugiere el empleo de una punta nueva por cada tubo.

5.-Cierre los microtubos y mezcle la muestra golpeando suavemente los tubos con los dedos. Si se cuenta con una microfuga aplique un pulso de 2 segundos para asegurarse que toda la muestra se quede en el fondo del microtubo, permitiendo que se mezcle adecuadamente y se lleve a cabo la reacción. 6.-Coloque los tubos en la gradilla e incúbelos a 37ºC por 45 minutos. 7.-Transcurrido el tiempo de incubación, adicione 10 µl del amortiguador de carga a cada tubo tápelos y agítelos suavemente con los dedos. 8.-Coloque en la cámara de electroforesis el gel de agarosa, teniendo cuidado que los pozos se encuentren orientados hacia el cátodo [polo negativo (terminal negra)]. 9.-Adicione 275 ml del amortiguador de corrida o lo que se requiera para que se cubran los pozos.

Muestras de DNA

Enzimas de restricción EcoRI y

PstI

Volumen total de la

reacción

Muestra de la escena

10 µl 10 µl 20 µl

Sospechoso 1 azul

10 µl 10 µl 20 µl

Sospechoso 2 naranja

10 µl 10 µl 20 µl

Sospechoso 3 violeta

10 µl 10 µl 20 µl

Sospechoso 4 rojo

10 µl 10 µl 20 µl

Sospechoso 5 amarillo

10 µl 10 µl 20 µl

172

10.-Coloque las muestras en el gel empleando una punta nueva para cada muestra, las cuales se depositan de izquierda a derecha amortiguador en el siguiente orden:

a) Carril 1: marcador de peso

molecular, HindIII,10 µl b) Carril 2: escena del crimen verde,

10 µl c) Carril 3: sospechoso 1 azul, 10 µl d) Carril 4: sospechoso 2 naranja, 10

µl e) Carril 5: sospechoso 3 violeta, 20

µl f) Carril 6: sospechoso 4 rojo, 10 µl g) Carril 7: sospechoso 5 amarillo,

10 µl 11-Cierre la cámara de electroforesis y asegúrese que concuerden las terminales rojo con rojo y negro con negro. Conecte la cámara a la fuente de poder, manteniendo la orientación de las terminales. 12.-Encienda la fuente de poder. Ajuste el voltaje a 100 V y realice la electroforesis por 40– 60 minutos. 13.-Detenga la electroforesis cuando la muestra llegue a una distancia aproximada de 2 cm del final del gel. Apague la fuente de poder, remueva la tapa y retire cuidadosamente el gel. 14.-Coloque en una charola 120 ml de la solución teñidora 100X y el gel, asegurándose que se encuentre sumergido en la solución. Tiña los geles por 2 minutos. 15.- Después se deben colocar los geles en una charola que contenga 500 – 700 ml de agua limpia y caliente (40-55ºC), agite suavemente el gel por aproximadamente 10 segundos y retire el agua, realizar los lavados que sean necesarios con agua limpia hasta la aparición de las bandas de DNA y hacer la comparación de las muestras.

Referencias 1.-Biotechnology Explorer DNA Fingerprinting Kit Instruction Manual BIORAD

Cortar en pequeñas piezas con enzimas de restricción

DNA total de una persona

Fragmentos de DNA en el gel

Fragmentos separados y transferidos a membrana de nylon

-ve

+ve

Más grandes

Más pequeñas

173

III

Casos de correlación bioquímica y práctica médica

174

Caso 1 Cólera

Un hombre de 38 años de edad con peso de 71 kg relata que su padecimiento actual se inició con anorexia, dolor abdominal y diarrea. Un día después siguió con náusea intensa, vómito y diarrea muy abundante y líquida. Ingresó al hospital con hipotensión postural y deshidratación. Se pudo aislar Vibrio cholerae toxígeno de sus heces. El paciente mejoró rápidamente al reponerle agua, electrólitos y administrarle tetraciclina por vía oral.

Preguntas de bioquímica 1. ¿Qué procesos de la membrana

resultan afectados por Vibrio cholerae en un caso de cólera?

2. ¿Qué valores de laboratorio clínico podrían estar alterados en este paciente?

3. ¿Cuáles serían los datos de laboratorio que permitirían precisar el tratamiento hidroelectrolítico?

4. ¿Por qué en este caso hay que añadir glucosa al tratamiento hidroelectrolítico por vía oral?

5. ¿Cuáles son los signos de deshidratación?

6. ¿Cuál fue la situación ácido-base del paciente al momento de su ingreso al hospital?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Describir la composición, las

propiedades y las funciones de las membranas biológicas.

2. Estudiar la base bioquímica de algunos trastornos que afectan la función de las membranas.

3. Modelos de transporte transepitelial. 4. Describir los mecanismos por los cuales

los organismos enteropatógenos ocasionan pérdida intestinal de agua y electrolitos.

5. Control del agua y de la osmolaridad. 6. Equilibrio ácido-base. 7. Deshidratación y tratamiento de

reposición hidroelectrolítica. REFERENCIAS 1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,

Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH Editores; 2000.

2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap. 4 y 12.

175

Caso 2

Oclusión intestinal. Acidosis metabólica. Deshidratación grave.

Se trata de un paciente masculino de 35 años de edad quien acude al servicio de urgencias de un hospital por presentar dolor abdominal intenso acompañado de vómitos frecuentes y abundantes de contenido intestinal. El paciente presenta un cuadro de deshidratación importante. A la exploración física se obtuvieron los siguientes datos: Tensión arterial (TA): 80/50 mmHg Frecuencia cardiaca (Fc): 120/min Frecuencia respiratoria (Fr): 32/min

Temperatura (T): 36o C

Los estudios de laboratorio mostraron lo siguiente:

Electrolitos séricos:

Na+ = 128 mEq/l

K+ = 2.8 mEq/l

Cl– = 100 mEq/l

Gasometría arterial: CO2t = 12

pH = 7.29 pCO

2 = 24 mmHg

pO2 = 95 mmHg

HCO3- = 11.2 mmol/l

EB (exceso de base) = 20

Química sanguínea: Glucosa = 5.2 mmol/l (95 mg/dl) BUN = 15 mmol/l

El tratamiento consistió, primero, en el restablecimiento del balance de líquidos con solución salina a 0.9%, electrólitos

(reposición de K+) y cirugía.

Preguntas de bioquímica 1. Evaluar el estado ácido-base del

paciente; tomar en cuenta los valores de pH y presión parcial de bióxido de carbono (pCO

2), el valor de bicarbonato

plasmático (HCO3

–), etcétera.

2. ¿Es normal el estado ácido-base del paciente? ¿Qué tipo de desequilibrio presenta? ¿Cuál podría ser la causa de ese desequilibrio?

3. ¿Qué relación existe entre el metabolismo de los electrolitos y el agua y entre los trastornos ácido-base y los electrolitos?

4. ¿Qué tipos de alteraciones de líquidos y electrolitos corporales existen?

5. Calcule la osmolaridad sérica (tome en cuenta la concentración de las sustancias que mayormente contribuyen a establecerla) como aparecen en las pags. 98 y 113.

6. ¿Cuáles son los signos de deshidratación?

7. ¿Qué terapéutica recomendaría a este paciente para equilibrar sus líquidos y electrolitos?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Propiedades fisicoquímicas del agua. 2. Concepto de pH. 3. Explicar el significado de las variaciones

de los valores normales de pH y de la composición electrolítica de la sangre.

176

4. Sistemas amortiguadores del plasma, líquido intersticial y células. La aplicación de la ecuación de Henderson y Hasselbalch al cálculo del pH y de la concentración de bióxido de carbono y bicarbonato.

5. Equilibrio ácido-base y su mantenimiento.

6. Equilibrio hidroelectrolítico y su mantenimiento.

REFERENCIAS 1. Harrison. Principios de medicina interna.

15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001; cap: Líquidos y electrólitos y Obstrucción intestinal aguda. p. 184.

2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace, 1998; cap. 4.

4. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna. 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2002: 41-76.

5. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón DO, Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH Editores; 2000.

177

Caso 3

Hipoglucemia secundaria

a intoxicación alcohólica Se trata de un paciente de 58 años, alcohólico crónico, cuyos familiares relatan que ha ingerido una gran cantidad de alcohol en los dos últimos días con un consumo muy escaso de alimentos. Inició su padecimiento con náusea, vómito, mareo, sudación, cefalea, visión borrosa y confusión; presentó, en una sola ocasión, una convulsión, por lo que es llevado al servicio de urgencias. A la exploración se encuentra semiconsciente con aliento alcohólico e hipotermia. Se procede a un lavado gástrico para remover el alcohol aún no absorbido; se mantienen permeables las vías respiratorias; se instala oxígenoterapia y se le administra solución glucosada por vía endovenosa. Los resultados de laboratorio muestran: Alcohol 300 mg/dl Glucosa 2.0 mmol/l Lactato 9.0 mmol/l pH 7.2

Preguntas de bioquímica 1. ¿Cuáles son los síntomas de la

hipoglucemia? 2. ¿De qué forma el etanol produce acidosis

láctica e hipoglucemia? ¿Cómo se encuentra la relación intracelular de NADH/NAD+? ¿Qué procesos metabólicos se favorecen con los niveles altos de NADH?

3. El alcoholismo es la base de muchas

deficiencias vitamínicas. ¿Qué implicaciones metabólicas tienen estas deficiencias (complejo B)?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Hipoglucemia. Regulación de la glucemia. 2. Acidosis láctica. 3. Metabolismo de carbohidratos. 4. Trastornos del metabolismo de vitaminas. 5. Metabolismo del etanol.

REFERENCIAS 1. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,

Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2004. p. 980-981

2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

3. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001. Capítulos: Acidosis láctica, hipoglucemia, alcohol y alcoholismo, deficiencia y exceso de vitaminas.

4. Academia Nacional de Medicina. Tratado de medicina interna. 2a. ed. México: Editorial El Manual Moderno; 1994. Capítulos: Acidosis láctica e intoxicación aguda por alcohol etílico.

178

Caso 4

Cetosis por inanición. Obesidad

Una mujer de 27 años llega al servicio de urgencias médicas después de haber sufrido un desmayo. Al interrogarla, relata que lleva 15 días a dieta de agua, té y verduras cocidas para bajar de peso, sin ningún control médico. Se detectó aliento con olor a manzana, cetonuria, cetonemia, ácidos grasos libres elevados, triacilgliceroles elevados, hipoglucemia y presión arterial baja; su peso al iniciar la dieta era de 78 kg y su estatura de 1.59 m. Se diagnostica cetoacidosis por inanición y obesidad exógena. El estudio de su dieta mostró que gran parte de su ingesta calórica era en forma de carbohidratos (galletas, chocolates, pasteles, refrescos, dulces, etcétera). El tratamiento consistió en administrar parenteralmente solución glucosada y continuar con una dieta normocalórica.

Preguntas de bioquímica 1. En esta mujer de 27 años: ¿corresponde

el peso a su talla? Determinar su índice de masa corporal, grado de obesidad y el porcentaje de sobrepeso.

2. ¿Cómo es posible que se formen grandes almacenes de energía en forma de grasas, si la dieta contiene predominantemente carbohidratos?

3. ¿Cuáles son las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos (hígado, tejido adiposo,

cerebro, músculo, etcétera) en la obesidad?

4. ¿Cuáles son las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos en

el estado de ayuno temprano y en la inanición?

5. ¿Cuál es el papel de los cuerpos cetónicos en el metabolismo?

6. ¿Qué régimen dietético recomendaría a esta persona para bajar de peso?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Describir las principales rutas de

biosíntesis, catabolismo y almacenamiento de lípidos.

2. Conocer la estructura y función de los triacilgliceroles, ácidos grasos y cuerpos cetónicos.

3. Establecer las bases bioquímicas de la cetosis y obesidad producidas por anomalías en el metabolismo de los lípidos.

4. Describir las alteraciones del equilibrio ácido-base que se producen en la cetosis.

5. Conocer las interrelaciones metabólicas de los principales tejidos corporales en los estados de buena nutrición, de ayuno temprano, de inanición, de renutrición, de homeostasis calórica, etcétera.

REFERENCIAS 1. Harrison. Principios de medicina interna.

15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001.

2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Harcourt-Brace; 1998.

4. Casanova E. Nutriología médica. Editorial Médica Panamericana; 1995.

179

Caso 5

Hipercolesterolemia y aterosclerosis Un hombre de 56 años acudió al médico por presentar dolor precordial en reposo que se incrementaba con el esfuerzo. Se le detectó hipercolesterolemia que, al análisis de los lípidos plasmáticos, mostró que la mayoría del colesterol plasmático elevado se encontraba en la fracción de lipoproteína de baja densidad (LDL). Se le realizó una arteriografía coronaria la cual mostró un estrechamiento de las arterias. La evaluación de la dieta indicó que consumía gran cantidad de alimentos ricos en colesterol, aunque en los últimos meses había seguido una dieta baja en grasas. Fue diagnosticado de aterosclerosis en las arterias coronarias. El tratamiento consistió en una dieta sin colesterol y en administrar preparados de lovastatina, un inhibidor de la HMGCoA reductasa. Fue tratado también con colestiramina, una resina que capta las sales biliares. La resina no se absorbe y permanece en la luz intestinal donde se une a las sales y aumenta la cantidad de las mismas que se excreta con las heces. Preguntas de bioquímica

1. ¿Cuáles son algunos alimentos ricos en colesterol?

2. ¿Cuál es el destino del colesterol de la dieta? 3. ¿Cuál es la función de la bilis en la digestión? 4. ¿Qué conexión metabólica existe entre el

colesterol y las sales biliares? 5. ¿Cómo disminuye la resina de colestiramina

la concentración plasmática de colesterol? 6. ¿Por qué se le ha llamado al colesterol-LDL:

“colesterol malo” y al colesterol-HDL: “colesterol bueno”?

7. ¿Cómo puede la hipercolesterolemia producir aterosclerosis, infarto del miocardio, xantomatosis, etcétera?

8. ¿Por qué el hecho de disminuir la concentración plasmática de colesterol puede ser útil para la salud de este paciente?

9. ¿Qué papel desempeña la HMG-CoA reductasa en la biosíntesis del colesterol?

10. ¿Cuál es la razón del uso de la lovastatina para el tratamiento del paciente?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Estructura del colesterol y otros esteroles

importantes. 2. Biosíntesis, metabolismo y excreción del

colesterol y de los ácidos biliares. 3. Describir la función de la bilis y su relación

con el colesterol. 4. Considerar el papel del colesterol en el

desarrollo de la aterosclerosis y de la relación entre hipercolesterolemia e ingesta dietética de lípidos en esta enfermedad.

5. Comentar los principios del transporte de lípidos en el sistema circulatorio.

6. Describir la composición, estructura, metabolismo y función de los principales tipos de lipoproteínas plasmáticas.

7. Describir los defectos del metabolismo lipídico que tienen relevancia clínica en relación con la hipercolesterolemia.

REFERENCIAS 1. PLM. Diccionario de especialidades

farmacológicas. 49 ed. 2004. 2. Montgomery R. Bioquímica. Casos y texto.

6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace, 1998: cap. 10 y 11.

3. Harrison. Principios de medicina interna. 15a. ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001: Capítulos: Aterosclerosis y

180

otras formas de arteriosclerosis e hiperlipoproteinemias y otros trastornos del metabolismo lipídico.

4. Pennachio D. Lineamientos para la detección de hipercolesterolemia. Atención Médica 1997;10/2:30-43.

5. Vogel RA. Coronary risk factors, endothelial function, and atherosclerosis. Clin Cardiol 1997; 20:426-432.

6. Goodman & Gilman’s. The pharmacological basis of therapeutics. 10th ed. McGraw-Hill Interamericana Editores; 2002.

7. Mecanismo de acción de los hipercolesterolemiantes. Rev Médico General. 1997; 2(7): 71-74.

181

Caso 6

GOTA

Un hombre de 53 años relata que su padecimiento actual se inició con una inflamación aguda del ortejo mayor del pie derecho e intenso dolor, el cual se intensificaba con el frío y el movimiento. Además, asegura que poco antes de presentar este episodio agudo el paciente había incrementado el consumo de carne, vísceras, leguminosas y vino de mesa en abundancia. Fue tratado con fenilbutazona, pero presentó daño gástrico, por lo que se cambió el medicamento por alopurinol y naproxén.

Preguntas de bioquímica 1. ¿Qué alteraciones metabólicas pueden traer

como consecuencia un aumento en los niveles séricos de ácido úrico?

2. ¿Son necesarias las purinas y las pirimidinas en la dieta?

3. ¿Qué alimentos son ricos en purinas y pirimidinas?

4. ¿Qué valores de laboratorio podrían estar alterados en este paciente?

5. ¿Son importantes los antecedentes familiares de este paciente?

6. ¿Cuál es la base bioquímica para sospechar que una dieta rica en proteínas puede provocar ataques de gota en pacientes susceptibles?

7. ¿Cómo se relaciona la ingestión de etanol con el incremento de la concentración plasmática de ácido úrico?

8. ¿Qué régimen dietético le recomendaría a

esta persona para mejorar sus niveles de ácido úrico?

9. ¿Cuál es la base bioquímica para la acción de los medicamentos utilizados en la gota?

Conceptos y áreas de aprendizaje 1. Características estructurales de los ácidos

nucleicos. 2. Biosíntesis y catabolismo de purinas y

pirimidinas. 3. Explicar cómo interfieren algunos

medicamentos utilizados en el tratamiento de la gota con el metabolismo de los nucleótidos.

REFERENCIAS 1. Harrison. Principios de medicina interna. 15a.

ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana Editores; 2001.

2. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2004.

3. Montgomery R. Bioquímica: Casos y texto. 6a. ed. Barcelona: Editorial Harcourt-Brace; 1998: Cap. 13.

4. Rodríguez Carranza R y col. Vademécum académico de medicamentos. 4a. ed. México: Facultad de Medicina, UNAM y McGraw-Hill Interamericana Editores; 2004.