2. SIMBIOSIS MICORRZICA2.1. DefinicinLa simbiosis se define como la relacin de dos o ms organismos que viven juntos, con base en esto se pueden encontrar dos principales tipos de simbiosis: 1) parastica, en la que un organismo toma de otro los compuestos necesarios para vivir, pudiendo producir daos severos y muerte del otro organismo y, 2) mutualista, en la que los organismos involucrados obtienen beneficios mutuos. Por otra parte, el trmino micorriza (Mykes= Hongo y Rhiza= Raz) se define como una estructura especializada que se forma por la asociacin de un grupo especfico de hongos con las races de las plantas y cuya funcin repercute en beneficios nutrimentales y fisiolgicos para ambos organismos. De esta forma se constituye una simbiosis mutualista entre ambos componentes. recubren las races laterales (manto fngico) y que al penetrar la epidermis, entre las clulas corticales, el micelio crece de tal forma que forma una extensa red de hifas denominada red de Hartig (Figura 17). As, el micelio que esta fuera de la raz contribuye en la absorcin de agua y nutrimentos a partir del suelo, los cuales son dirigidos hacia el interior de la raz, de forma que la planta los aprovecha en forma ms eficiente(FerreraCerrato, 1993). A su vez, los hongos ectomicorrzicos, a travs de su micelio externo, pueden llegar a generar cuerpos fructferos (Figura 18), tanto en la superficie del suelo como subterrneos (Figura 19 y 20), que contienen esporas microscpicas responsables de la propagacin de los hongos. Estos cuerpos fructferos llamados tambin carpforos pueden ser utilizados para la identificacin de las diversas especies de hongos ectomicorrzicos que se pueden encontrar en un sistema forestal, adems de servir como fuente de inculo para aplicar a plantas o para aislar los hongos mediante tcnicas de cultivo in vitro en laboratorio. La ectomicorriza es una simbiosis obligada, es decir, la planta de pino o cualquier confera, no es capaz de crecer si no es colonizada por los hongos formadores de esta estructura. A pesar de encontrarse en la naturaleza ms de 1500 especies de hongos formadores de ectomicorriza que estn incluidos en diferentes grupos. En el cuadro 5 se aprecian las principales Clases taxonmicas, Familias y Gneros en los que se encuentran los hongos ectomicorrzicos. stos hongos presentan cierta especificidad hacia rboles tanto de clima templado como tropicales. En los cuadros 6 y 7 se muestran los gneros tpicos de micobiontes y fitobiontes tanto de clima templado como tropical que establecen simbiosis ectomicorrzica.

2.2. Tipos de micorrizaEn la naturaleza existen seis tipos bien diferenciados de micorriza y su distribucin esta influenciada por aspectos ecolgicos relacionados con el clima, disponibilidad nutrimental y especificidad hacia algunas familias de plantas. En si, los dos tipos de micorriza ms importantes desde el punto vista forestal, agrcola, frutcola y hortcola son: 1) la ectomicorriza y 2) la endomicorriza arbuscular( Ferrera-Cerrato y Alarcn 2001).

2.3. Caractersticas morfolgicas de la ectomicorrizaLa ectomicorriza que se forma en las races, es posible observarla a simple vista y se pueden encontrar diferentes formas que van desde una estructura simple, bifurcada, coraloide hasta pinnada (Figura 16), mismas que se pueden caracterizar por el color que presentan. En la ectomicorriza, el micelio de los hongos formadores de esta estructura,

33

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 16.

Estructuras ectomicorrzicas macroscpicas: a) Digitiforme (Cenoccocum geophylum); b) Bifurcada (Pisolithus tinctorius-Pinus radiata); c) Policotmica (Pseudotsuga sp.); d) Bifurcada con presencia de rizomorfas (Flecha, Pisolithus tinctorius-Pinus radiata); e) Morfologa tpica microscpica de las hifas de P. tinctorius mostrando fbulas; f) Formacin incipiente de cuerpos fructferos de P. tinctorius en el cepelln de P. radiata.

34

a)

Manto Fngico

Red de Hartig Clulas corticales

b)

Figura 17.

Caractersticas macromorfolgicas de las estructuras internas y externas de la simbiosis ectomicorrzica en el sistema radical de pinaceas y conferas. a) Diagrama esquemtico de la colonizacin y b) estructuras fngicas internas de la raz

35

a)

c)

b)

Figura 18.

Caractersticas morfolgicas externas de la simbiosis ectomicorrzica establecida en el sistema radical de pinceas. a) Colonizacin del sistema radical con estructuras ectomicorrzicas (Flechas) dicotmicas (bifurcadas); b) Cuerpo fructfero (Flechas) de Telephora terrestris en Pinus hartwegii; c) Cuerpo fructfero (Flechas) de Laccaria sp. en Pinus hartwegii.

a)

b)

c)

d)

Figura 19. Morfologa de algunos cuerpos fructferos (carpforos) epigeos de hongos formadores de ectomicorriza del bosque del Cofre de Perote, Mxico. a) Laccaria laccata, b) Amanita cesarea, c) Russula sp. y d) Boletus sp.

36

Cuadro 5. Taxas de hongos ectomicorrzicos y ectendomicorrizicos. H= Hongos Hipogeos, E= Hongos epigeos, G =Globosos (Puffballs), Gneros con un asterisco indican que tienen muchas especies no micorrzicas (Brundrett et al., 1996).CLASE/FAMILIA HYPHOMYCETES ZYGOMYCETES Endogonaceae ASCOMYCETES Ascobolaceae Balsamiaceae Elaphomycetaceae Geneaceae Geoglossaceae Helvellaceae Pezizaceae Pyronemataceae GNERO Cenococcum,etc Endogone, Sclerogone Sphaerosoma Balsamia, Picoa Elaphomyces Genea,Geneaba Geoglossum*, Leotia*,Trichoglossum Gyromitra, Helvella Barssia, Fischerula, Gymnohydnotrya, Mycoclelandia Aleuria*, Peziza*, Phillipsa*, Pulvinia, Sarcosphaera Amylascus, Hydnotryopsis, Muciturbo, Pachyphloeus, Peziza, Ruhlandiella Geopora, Humaria, jafneadelphus*, Lamprospora* Sphaerosporella, Trichophaea, Wilcoxina Choiromyces, Dingleya, Elderia, Geopora, Hydnobolites, Hydnocystis, Labyrinthomyces, Paurocotys Reddellomyces, Sphaerosporella, Stephensia Plectania*,Pseudoplectania*, Sarcocypha* Choiromyces, Terfezia Mukagomyces, Paradoxa, Tuber Amanita, Limacella Torrendia Astraeus Pyrenogaster, Radiigera Astroboletus, Boletellus*, Boletochaete, Boletus, Buchwaldoboletus*, Chalciporus, Fistulinella, Gyrodon, Gyroporus, heimiella, Leccinum, Phlebopus, Pulveroboletus, Rubinoboletus, Suillus, Tylopilus, Xanthoconium Alpova Boughera, Chamonixia, gastroboletus, Rhizopogon, Royoungia Truncocolumella Cantharellus, Craterellus Chondrogaster Apelara, Clavaria, Clavariadelphus, Clavicorona, Clavulina, Clavulinopsis, Ramaria, Ramariopsis Amphinema, Byssocorticium, Byssosporia, Piloderma, etc. Astroporina, Cortinarius, Cuphocybe, dermocybe*, Descolea, Hebeloma, Inocybe, Leucocortinarius, Rozites, Stephanopus, etc. Cortinarius, Cortinomyces, Descomyces, Destuntzia, Hymenogaster Quadrispora, Setchelliogaster, Thaxterogaster, Timgrovea Cribbea, Mycolevis Clitopilus, Entoloma, Leptonia, Rhodocybe* Rhodogaster, Richoniella Elasmomyces, Gymnomyces, Martellia, Zelleromyces Gelopellis Gomphus Chroogomphus, Cystogomphus, Gomphidius Bankera, Dentinum, Hydnellum, Hydnum, Phellodon Bertrandia* Camarophyllus, Gliphorus, Humidicutis*, Hygrocybe, Hygrophorus*, etc. Hysterangium, Pseudohysterangium, Trappea Leucogaster, Leucophleps Lycoperdon* Melanogaster Castoreum, Diploderma, Gummiglobus, Malajczukia, Mesophellia, Nothocastoreum Octavianina, Sclerogaster Paxillus Pisolithus Albatrellus Lactarius, Russula Archangeliella, Cystangium, Macowanites Scleroderma Horakiella, Scleroderma Sedecula Stephanospora Strobilomyces Austrogautieria, Chamonixia, Gautieria, Wakefieldia Boletopsis, Thelephora Clitocybe*, Cystoderma*, Cantharellula, Catathelasma, laccaria, Lepista Leucopaxillus, tricholoma, Tricholomopsis* Gigasperma, Hydnangium, Podohydnangium TIPO Conidial H H H H H E E H E H E H E H H E H E H E H H E H E E E H H E H H H E E E E H H G H H E G E E H G H H H E H E E H

Sarcoscyphaceae Terfeziaceae Tuberaceae BASIDOMYCETES Amanitaceae Astraeaceae Boletaceae

Cantharellaceae Chondrogastraceae Clavariaceae Corticiaceae Cortinariaceae

Cribbiaceae Entolomataceae Elasmomycetaceae Gelopellidaceae Gomphaceae Gomphidiaceae Hydnaceae Hygrophoraceae Hysterangiaceae Leucogastraceae Lycoperdaceae Melanogastraceae Mesophelliaceae Octavianinaceae Paxillaceae Pisolithaceae Polyporaceae Russulaceae Sclerodermataceae Sedeculaceae Stephanosporaceae Strobilomycetaceae Thelephoraceae Tricholomataceae

37

Cuadro 6. Gneros tpicos de hongos (micobiontes) y plantas (fitobiontes) de zonas templadas que establecen simbiosis del tipo ectomicorrzica (Tomado de Prez-Moreno, 1998).

Divisin taxonmica y MicobiontesBasiodiomycotina Alpova, Amanita, Astraeus, Boletus, Cantharellus, Cortinarius, Entoloma, Gastroboletus, Gautieria, Gomphidius, Hebeloma, Hygrophorus, Hymenogaster, Hysterangium, Inocybe, Laccaria, Lactarius, Leccinum, Lycoperdon, Martellia, Paxillus, Pisolithus, Rhizopogon, Rozites, Russula, Scleroderma, Suillus, Tylopilus, Tricholoma, Xerocomus

Fitobiontes

Abies, Alnus, Betula, Corylus, Eucalyptus, Fagus, Larix, Picea, Pinus, Populus, Pseudotsuga, Quercus, Salix y Tsuga

Ascomycotina Balsamia, Elaphomyces, Genea, Geopora, Helvella, Hydnotria, Sphaerosporela, Tuber Abies, Alnus, Betula, Corylus, Eucalyptus, Fagus, Larix, Picea, Pinus, Populus, Pseudotsuga, Quercus, Salix y Tsuga

Zygomycotina Endogone Eucalyptus, Pinus, Pseudotsuga

Deuteromycotina Cenococcum Abies, Larix, Pinus, Polygonum, Pseudotsuga

38

Cuadro 7. Gneros tpicos de hongos (micobiontes) y plantas (fitobiontes) de zonas tropicales que establecen simbiosis del tipo ectomicorrzica (Tomado de Prez-Moreno, 1998).

MicobiontesAmanita, Cantharellus, Gyrodon, Gyroporus, Inocybe, Lactarius, Porphyrellus, Russulla, Scleroderma, Sclerogaster, Strobilomyces, Xerocomus

Familias y gneros de fitobiontesLeguminoseae (Fabaceae) Acacia, Afzelia, Aldinia, Anthonota, Aphanocalyx, Berlinia, Brachystegia, Didolotia, Inga, Instia, Isoberlinia, Julbernarlia, Macrolobium, Microberlinia, Monopetalanthus, Pericopsis, Tetraberlinia Casuarinaceae Casuarina, Allocasuarina Dipterocarpaceae Anisoptera, Dipeterocarpus, Dryobalanoptus, Hopea, Marquesia, Monotes, Sghorea, Vateria Euphorbiaceae Uapaca

Amanita, Elaphomyces, Hysterangium, Laccaria, Paxilus, Pisolithus, Scleroderma, Telephora Agaricus, Telephora, Amanita, Boletus, Cantharelus, Geastrum, Lactarius, Russula, Scleroderma Amanita, Austrogauteria, Cantharelus, Coltricia, Elasmomyces, Lactarius, Pulveroboletus, Russula, Scleroderma, Tubosaeta, Xerocomus Nr

Fabaceae Castaneopsis, Pasania Gnetaceae Gnetum

Quercus,

Lithocarpus,

Nr Cenoccocum, Pisolithus, Scleroderma

Myrtaceae Campomanesia, Eucalyptus, Eugenia, Melaleuca, Tristania Nyctaginaceae Neea, Pisonia, Torrubia Polygonaceae Coccoloba Pinaceae Pinus

Nr Cantharellus Amanita, Boletus, Coltricia, Gyroporus, Hebeloma, Lycoperdon, Pisolithus, Rhizopogon, Scleroderma, Suillus, Telephora, Tylopirus Nr Nr NrNr= Hongos no reportados para estos gneros de plantas

Proteaceae Faurea Sapotaceae Glycoxylon Sapindaceae Allophylhis, Nephelium

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Pileo(sombrero) Margen

Lminas conteniendo esporas Estpite

Volva

Micelio

Figura 20.

Partes tpicas que integran al cuerpo fructfero (carpforo) de Amanita muscaria que forma ectomicorriza con: Abies alba. A. procera, Larix decidua, L. occidentalis, Picea abies, P. sitchensis, P. banksiana, P. cembra, P. ponderosa, P. radiata, Pseudotsuga menziesii, Tsuga heterophylla, Arbutus menziesii, Betula alba, Eucalyptus camaldulensis, Fagus sylvatica, Populus tremula x tremuliodes, Quercus sp., Tilia europaea, entre otros (Yang et al., 1999).

2.4. Caractersticas morfolgicas de la micorriza arbuscularA diferencia de la ectomicorriza, los hongos micorrzicos arbusculares no producen cambios visibles en la morfologa de la raz de sus hospedantes. Su presencia puede ser detectada mediante observaciones al microscopio ptico. En el suelo, los hongos formadores de esta simbiosis presentan una extensa red de hifas que favorecen la absorcin de nutrimentos y agua (Bago et al., 1998, 2000a), permitiendo que la raz posea un mecanismo alterno que explore mayor volumen de suelo. Este micelio puede formar estructuras microscpicas que favorecen la

propagacin de los hongos, stas son las esporas que pueden estar libres o agrupadas (Declerck et al., 2000). Una vez que alguna hifa del hongo penetra la raz, sta crece a lo largo del tejido radical y llega a formar estructuras tpicas de esta simbiosis (Figura 21b y c): 1) Hifas inter e intrarcelulares, 2) Arbsculos que facilitan en intercambio bidireccional de nutrimentos entre hongoplanta (Bago et al., 2000b), 3) Vesculas, que almacenan reservas para el hongo, 4) Enrrollamientos hifales y, 5) Esporas simples o esporocrpicas en el suelo, pero algunas especies pueden esporular dentro de la raz (Figura 21d).

40

a)

b)

c)

d)

Figura 21.

Morfologa de la colonizacin de hongos micorrzicos arbusculares en el sistema radical de las plantas: a) raz no colonizada, b) raz colonizada con hifas intrarradicales y arbsculos (flechas), c) vesculas y micelio intrarradical y d) formacin de esporas dentro de la raz (en algunos gneros).

En contraste con los hongos ectomicorrzicos, los hongos formadores de micorriza arbuscular conocidos hasta la fecha no sobrepasan las 150 especies (Walker y Trappe, 1993) y estn agrupados dentro del orden de los Glomales, el cual esta conformado por siete gneros (Morton y Redecker, 2001). Sin embargo, estos hongos pueden establecerse en el sistema radical de aproximadamente 85% de las especies vegetales que han sido identificadas y se cree que stos fueron determinantes en la capacidad de adaptacin de las plantas en el ecosistema terrestre ( Malloch et al., 1980., Taylor et al., 1995). Los hongos micorrzicos arbusculares se consideran como simbiontes obligados y requieren nutrirse de una raz viva (biotrofos41

obligados) (Bago et al., 2000b), por lo que para propagarlos con xito, se requiere del uso de plantas trampa (Morton 1990; Gonzlez-Chvez, 1993. El reto del uso de estos hongos en la agricultura o en la dasonoma como inoculante, implica la creacin de sistemas de produccin de inculo eficientes que satisfagan los requerimientos de los viveros (Alarcn y Ferrera-Cerrato 1999; Ferrera-Cerrato y

Alarcn 2001).

2.5. Definicin de inoculanteComo inoculante debe entenderse a aquel producto biolgico que facilita la introduccin de microorganismos con diversa actividad fisiolgica que favorece el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este inoculante puede presentar diferentes aspectos fsicos, ya sea lquidos o slidos en los que se utilizan acarreadores como la turba, el carbn activado, aceites, alginatos y otros soportes orgnicos e inorgnicos. De este modo, el inoculante puede ser manejado con el fin de establecer los microorganismos en las hojas, tallo o races para establecerlos en los diversos sistemas de produccin agrcola, hortcola, frutcola y forestal. En el caso de los hongos micorrzicos el inoculantes puede consistir de esporas, hifas, fragmentos de cuerpos fructferos, races colonizadas y en su caso suelo rizosfrico donde se detecte una abundancia de hifas de hongos micorrzicos provenientes de un sistema de raz sano (Alarcn y Ferrera-Cerrato,1999).

Este procedimiento permite obtener cepas puras que sern ensayadas en los diferentes hospedantes, para conocer su grado de micorrizacin y efecto en el desarrollo de las plantas. Otra fuente de inculo importante, son las esporas contenidas en los cuerpos fructferos, mismas que pueden ser inoculadas directamente en el sustrato como se ha hecho con las esporas de hongos como Pisolithus, Scleroderma, Rhizopogon y Tuber. Una forma tradicional de fuente de inoculo muy utilizada, aunque no muy adecuada, se basa en la colecta de suelo de monte, el cual debe ser colectado de la rizsfera de plantas sanas. Otra fuente de inoculo poco frecuente, se refiere al uso de los cuerpos fructferos o mezclas de ellos finamente fragmentados e introducirlos como inoculo en el sustrato de crecimiento de las plantas con fines de inducir la micorrizacin. A partir de las diferentes fuentes de inoculantes, independientemente del tipo de simbionte micorrzico, se procede al seguimiento de la ruta biotecnolgica que se presenta en la figura 22 y que a continuacin se describe de manera general: Con base en un muestreo en campo y extraccin de los diferentes propgulos micorrzicos, se procede a su propagacin y purificacin en plantas trampa o en laboratorio a travs de medio de cultivo Una vez purificadas las cepas micorrzicas, se procede a su identificacin taxonmica. Paralelamente a la identificacin, se realizan ensayos de seleccin basndose en su capacidad de colonizacin y promocin del crecimiento en los hospedantes. Una vez cumplidos los puntos anteriores, se procede a una propagacin inicial para estudios a nivel de invernadero y en pequeas parcelas. Con los resultados de vivero y pequeas parcelas, se procede a realizar una propagacin a nivel piloto, que consiste en incrementar el volumen del inoculante seleccionado en forma escalada.

2.6. Fuentes de inoculanteEn el caso de los hongos micorrzicos arbusculares, la fuente inoculante proviene del conjunto de hongos que estn asociados a las races o que se encuentran en el suelo rizosfrico de las plantas, ya sea en ecosistemas y agroecosistemas. Los propgulos conocidos como esporas, son separados y propagados en plantas trampa mantenidas en invernadero, utilizando sustratos estriles. Estos propgulos son separados del suelo empleando la tcnica de Gerdermann y Nicolson (1963), con el fin de seleccionar aquellas cepas que tengan mayor capacidad de micorrizacin a la vez de favorecer el crecimiento de las plantas. Estas esporas tambin sirven para realizar los estudios taxonmicos correspondientes a los hongos involucrados en las cepas( Morton,1990). Para los hongos ectomicorrzicos, una de las fuentes de inoculo pueden ser los cuerpos fructferos colectados en ecosistemas forestales, de los cuales se procede al aislamiento del hongo en el laboratorio (Ferrera-Cerrato,1993; Brundrett et al.,1996).42

El inoculante producido en esta fase, antes de ser empleado, tiene que cumplir con controles de calidad, que consisten en la ausencia de patgenos, mantener la capacidad de colonizacin y promocin de crecimiento, supervivencia y vida de anaquel. Un inoculante con estas caractersticas puede ser empleado en diferentes sistemas de propagacin de plantas horto-frutcolas, forestales y ornamentales, para evaluar su tolerancia a ambientes adversos, as como utilizarlos en diferentes sistemas de produccin, en suelos marginales con diferentes grados de perturbacin y contaminacin.

Muestreo de Campo

Estudios ecolgicos

Ensayos en suelos marginales Evaluacin de colonizacin y aislamiento de esporas

Ensayos en plantas hortofrutcolas

Uso en viveros

Purificacin de esporas

Cultivo in vitro Cultivos trampa

Propagacin piloto (4 toneladas)

Control de calidad de inoculante producido: Micorrizacin Patologa

Sistemas de propagacin de plantas

Identificacin taxonmica

Pruebas de seleccin: Infectividad versus efectividad

Ensayos especiales: Componentes de rendimiento, Tolerancia a agentes contaminantes, etc. Propagacin inicial

Vivero de plantas forestales

Figura 22.

Proceso biotecnolgico de la produccin de inoculantes a base de hongos micorrzicos para uso en viveros hortcolas, frutcolas y forestales (Modificado de Alarcn, 2001).

43

2.7. Tipos de inoculanteIndependientemente del sustrato en el que se produzcan los inoculantes, stos pueden ser producidos a partir de diversas estructuras que son tpicas de los microorganismos; en el caso de hongos micorrzicos se pueden utilizar el micelio que se encuentra en el suelo, races colonizadas por hifas y esporas. Para el caso especfico de hongos micorrzicos arbusculares, las estructuras mencionadas no son susceptibles de ser propagadas en medios de cultivo convencionales (caldos nutritivos, fermentadores, etc.). Para este fin se requieren de condiciones especficas que permitan su proliferacin tales como sustratos orgnicos y/o inertes y presencia de plantas vivas, as como la adicin de soluciones nutritivas de modo que la fisiologa tanto de la planta como del microorganismo sean beneficiadas (Sylvia, 1999; Manjarrez et al., 2000) y poder as obtener un inoculante de excelente calidad en funcin de los propgulos que contiene. Los inoculantes pueden ser elaborados mediante el uso de diversos acarreadores los cuales se clasifican en tres principales categoras: 1) sustratos orgnicos: turba,

carbn activado, arcillas y suelo; 2) compostas y vermicompostas obtenidas a partir de estircoles de animales, aceites de soya y cacahuate, fibra de trigo y otros desechos vegetales; 3) materiales inertes: vermiculita, zeolita, agrolita, roca fosfrica, sulfato de calcio y alginatos. 2.7.1. Propgulos infectivos Se considera como propgulo infectivo a aqul que permita el crecimiento y proliferacin de los microorganismos an y cuando se presenten condiciones adversas tanto al momento de la aplicacin como en los procesos de elaboracin de los inoculantes y almacenamiento de los mismos. En el caso particular de los hongos micorrzicos, los propgulos que deben ser considerados en la evaluacin del control de calidad de los inoculantes son la cuantificacin del micelio externo (Figura 23a) que se presenta en el suelo as como aquel que se encuentra colonizando la regin cortical de la raz (Figura 23b). Otros propgulos de gran importancia por ser estructuras de dispersin y supervivencia de los hongos, son las esporas. En la figura 24, se puede apreciar la diversidad morfolgica de las esporas algunos gneros de hongos micorrzicos arbusculares.

a)

b)

Figura 23. Propgulos infectivos de hongos micorrzicos arbusculares consistentes en: a) hifas externas que se encuentran en el suelo y, b) hifas internas colonizando el sistema radical.

44

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 24.

Esporas tpicas de hongos micorrzicos arbusculares: a y b) Glomus sp.; c) Sclerocystis sp.; d) Entrophospora infrequens, e) Gigaspora margarita y f) Acaulospora delicata.

45

2.8. Mtodos de inoculantes

aplicacin

de

Dependiendo del tipo de inoculante, los hongos micorrzicos, se pueden ser inoculados en las diversas fases que involucra la propagacin de plantas (semillas, estacas, acodos e incluso micropropagacin) tanto en almcigos hortcolas, como en viveros de especies frutales y forestales (Gonzlez-Chvez et al., 1998; Alarcn y Ferrera-Cerrato, 1999). A continuacin se mencionan las principales formas de aplicacin de inoculantes elaborados a partir de hongos micorrzicos: 2.8.1. Inoculacin en semilleros Con base a que la preparacin de almcigos y semilleros requiere de la manipulacin de poco sustrato, solo para el llenado de los semilleros, la aplicacin de inoculante micorrzico es factible de utilizarse en estos sistemas. Es posible mezclar inoculantes peletizados en turba o en cualquier material utilizado como sustrato antes de efectuar la siembra de las semillas. Sin embargo, el uso de inoculantes en semilleros debe considerar el tipo de semilla a sembrar ya que semillas de corto perodo de germinacin (especies consideradas como hortalizas) con pocas reservas en los cotiledones, permite que la simbiosis se establezca en corto tiempo y con ello su efecto benfico. Cuando se utilizan semillas de largo tiempo de germinacin, la viabilidad de los propgulos de los hongos micorrzicos puede ser alterada por el exceso de humedad que se requiere para la germinacin. Por otra parte, la mayora de las plntulas obtenidas por semillas (de plantas de corte arbustivo o leoso), mantienen por tiempo prolongado sus cotiledones cuyas reservas propician en mayor grado, el crecimiento de las plantas. Esta caracterstica hace que los beneficios

de los hongos micorrzicos no se expresen o se retarden ya que stos requieren de fuentes carbonadas procedentes de hojas fotosintticamente activas. 2.8.2. Inoculacin crecimiento al sustrato de

Este mtodo representa facilidad de manejo para el viverista. Sin embargo, se debe de cuidar la proporcin inoculo sustrato y que al menos debe de ser de un 50%, esto es fcil lograrlo cuando empleamos esporas de los hongos del grupo de los gasteromicetos (como P. tinctorius). Las proporciones de inoculo deben de mantenerse y vigilarse ya que este tipo de aplicacin al romperse las proporciones se expresara como baja micorrizacin o ausencia. Es importante mencionar que en el caso de los hongos endomicorrzicos es difcil lograr grandes volmenes de inoculo conteniendo un numero adecuado de esporas y que un inoculo compuesto por pedazos de races, hifas y esporas es el mas recomendable debido a que en la mezcla del inoculo, el sistema radical de la planta encontrara alguno de estos elementos infectivos. 2.8.3. Inoculacin al transplante Sin duda, este es el mtodo ms recomendado para aplicar los hongos micorrzicos (arbusculares y ectomicorrzicos). En el caso de hongos micorrzicos arbusculares, la aplicacin directa del inoculante en el sustrato, en el agujero donde se transplantaran las plntulas (Figura 25b y c) y sobre su sistema radical, permite a los hongos mayor probabilidad de establecerse y expresar sus beneficios (Figura 25d y e) en corto tiempo (de uno a cuatro meses, dependiendo de la especie forestal o frutal de que se trate). En funcin de la calidad del inoculante (cantidad de propgulos contenidos) se puede aplicar desde 1 a 15 g de inculo por planta.

46

a)

b)

c)

d)

Plantas inoculadas Figura 25.

Testigo

Forma de inoculacin de hongos micorrzicos arbusculares al momento del transplante. a) semillero conteniendo las plntulas a inocular, b) inoculacin previa al transplante, c) transplante de la plntula al agujero inoculado, d) expresin benfica en las plantas inoculadas con HMA en portainjertos de ctricos injertados a los 310 das. Obsrvese el escaso crecimiento de las plantas testigo (Flecha), a la misma edad.

Para el caso de hongos ectomicorrzicos, la inoculacin al momento del transplante es factible mediante una suspensin de esporas y en ella remojar las races de las plntulas (Figura 26). A continuacin se describen los pasos de este proceso: Se toma un recipiente limpio, previamente desinfectado con alcohol, donde se vierte una suspensin densa de esporas, la cual se agita vigorosamente para tener una mejor distribucin de las esporas (Figura 26a y b). De un semillero, se toman plntulas de aproximadamente 12-15 cm de altura, segn la especie, y se procede a podar la raz con el fin de evitar la deformacin llamada cola de cochino (Figura 26c y d). Las plntulas una vez podadas, se sumergen en la suspensin de esporas,47

obtenidas en el paso 1, con el fin de que las races queden impregnadas con las esporas del hongo ectomicorrzico a inocular (Figura 26e y f). Despus de este paso, las plntulas son transplantadas en recipientes nuevos conteniendo el sustrato previamente fumigado con productos qumicos o vaporizado con vapor de agua (Figura 26g y h). Tambin es posible generar inoculante a partir de esporas, obtenidas directamente del carpforo de algunos hongos altamente productores de esporas como Scleroderma, Rhizopogon o Pisolithus. Este proceso consiste en liberar las esporas de los carpforos y colectarlas en bolsas de plstico desinfectadas y hacer observaciones al microscopio para conocer el tipo de esporas que se estn inoculando (Figura 27 a, b y c). Una alternativa para inocular estas esporas

consiste en mezclarlas homogneamente, en diferente proporcin, con el sustrato previamente fumigado (Figura 26 d). Una vez inoculado el sustrato, se coloca en los diferentes recipientes utilizados en el vivero y se procede al transplante. Otra alternativa prctica de inoculacin, consiste en tener las esporas de los hongos micorrzicos en bolsas pequeas. Con una estaca, clavo o lpiz, con el extremo humedecido con agua, se introduce en el interior de la bolsa para que se adhieran las esporas (Figura 27e, f y g). El extremo cargado con esporas (Figura 26g), se introduce en el sustrato quedando un agujero impregnado de stas, el cual recibir posteriormente, las plntulas que quedarn de esta forma inoculadas (Figura 27h). Las tres metodologas de inoculacin mencionadas, aseguran que las plntulas crecern con el simbionte previamente inoculado, propiciando con ello, los beneficios de la simbiosis.

48

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

Figura 26.

Mtodo de inoculacin de plntulas de pino producidas en vivero con esporas de hongos ectomicorrzicos (P. tinctorius) en suspensin. a y b) preparacin de la suspensin del inoculante en agua; c, d, e y f) extraccin de la plntula, poda e impregnacin con el inoculante; g y h) cama de transplante y transplante de plantas micorrizadas).

49

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

Figura 27. Inoculacin de plntulas de pinceas con esporas de hongos ectomicorrzicos. a) Esporocarpos de Pisolithus tinctorius (Pt); b y c) esporas del hongo vistas al microscopio de campo claro; d) mezcla de esporas con el sustrato; e) esporas de Pt ; f) impregnacin de esporas de Pt mediante estacas (lpiz) antes del transplante; g) inoculacin de las esporas en el sustrato; h) transplante en el sustrato inoculado. En cada caso obsrvese el color caf de las esporas.

50

2.8.4. Otras tcnicas de inoculacin 2.8.4.1. Inoculacin por riego Es posible inocular hongos ectomicorrzicos por sistemas de riego por aspersin o con bomba de mochila. Una de las consideraciones ms importantes es que los soportes del inoculo sean completamente solubles en el agua, ya que de no ser as, el sistema de riego por aspersin podra obstruirse, por lo se debe tener cuidado en la seleccin del inoculante a aplicar. Para aplicar el inoculante en sistemas de aspersin, se requiere que el producto se homogenice con agua hasta obtener una suspensin, lo ms uniformemente posible a) b)

(Figura 28a y b). La suspensin y el proceso de su dilucin en agua se calcula en 3,8 kg en 10,000 litros de agua, la cual se hace pasar por un inyector calibrado (Figura 28c) que permita que se suspenda la solucin inoculante hasta obtener una proporcin 1:200 y proceder a asperjar las plantas (Figura 28d). Con esta solucin inoculante es posible inocular 1,600,000 plantas. Con el fin de garantizar que el inoculo salga correctamente por el sistema de riego, se colocan vasos de poliestireno en los que se captura la solucin inoculante, la cual debe tener la coloracin tpica de las esporas que conforman al inoculante (Figura 28e).

c)

d)

e)

Figura 28.

Inoculacin con hongos ectomicorrzicos a plntulas de Abies mediante sistemas de riego por aspersin: a y b) suspensin del inculo esporal de Pisolitus tinctorius en agua, c) dilucin del inculo en bomba de agua calibrada, d) aspersin de la solucin inoculante en las plantas y e) suspensin del inculo esporal recibida por el sistema de riego por aspersin.

51

2.8.4.2. Inyeccin al suelo La inyeccin al suelo de inoculantes de hongos MA es factible mediante bombas de aspersin especial (Tipo Confidor) y que se pueda graduar. Esta bomba tiene un estilete perforado en la punta, la cual se introduce en el suelo (10-15 cm de profundidad). En cada inyeccin es posible aplicar de 800 a 2000 esporas y se debe realizar varias inyecciones alrededor del rbol. Este mismo procedimiento puede ser utilizado para inocular hongos ectomicorrzicos en campo. No obstante, la inyeccin de inoculante micorrzico en campo puede tener como desventaja la escasa competitividad de los hongos micorrzicos al enfrentarse con otros microorganismos presentes en ese suelo. Adems, se debe de asegurar que las esporas estn viables, aunque esto no garantiza que la germinacin de ellas se lleve a cabo, ni que la simbiosis se establezca en las races. Bajo estas condiciones de inoculacin, las esporas pueden ser parasitadas muy rpidamente y con esto evitar que la simbiosis se establezca y sea funcional.

80% de las plantas conocidas, tambin es cierto que algunas de ellas responden de manera diferencial a la inoculacin de hongos micorrzicos. Con base a lo anterior, es importante realizar la caracterizacin de plantas considerando la susceptibilidad a ser colonizadas por estos hongos (plantas micorrzicas) y el grado de respuesta a la inoculacin (micotrofismo). Estos aspectos, permiten predecir la posible respuesta de las plantas a la inoculacin de hongos micorrzicos. Gran parte de su respuesta positiva se debe a la presencia de sistemas radicales con limitacin para absorber y aprovechar los nutrimentos contenidos en un suelo o sustrato. Plantas con races con escasos pelos radicales y del tipo magnoloide (la mayora de los frutales, algunas leguminosas, especies forestales, principalmente) son altamente dependientes a la actividad de los hongos. Por otra parte las plantas con denso sistema radical y abundantes races laterales y pelos radicales (tipo graminoide) como maz, sorgo, trigo, etc., por lo que dependen menos de la simbiosis micorrzica. 2.9.1.1. Micotrofa Por micotrofa se debe entender el grado de dependencia de las plantas en su crecimiento y nutricin por la presencia de los hongos micorrzicos establecidos en el sistema radical. La micotrofa puede clasificarse en tres tipos: (a) plantas no micotrficas, cuya su nutricin no depende del establecimiento de los hongos (crucferas, amarantceas, quenopodiaceas, ciperceas, Lupinus albus) aunque si pueden establecer una simbiosis efmera; (b) plantas micotrficas facultativas, aquellas que tienen mayor dependencia hacia los hongos de acuerdo con la presencia (disponibilidad) o limitacin de nutrimentos en el sustrato. Es decir, existen plantas que si se encuentran establecidas en sustratos con alta disponibilidad de nutrimentos, stas son capaces de aprovechar los nutrimentos an cuando se hayan establecido los hongos micorrzicos en la raz, pero si estas mismas plantas se establecen en sustratos con limitacin de nutrimentos, entonces la respuesta y la dependencia hacia los hongos52

2.9.

Factores que afectan la efectividad de los inoculantes

La efectividad de un inoculante se refiere a la capacidad de estimular el beneficio en la planta inoculada, el cual se puede medir con base a la promocin en altura, dimetro de tallo y crecimiento, as como por la calidad de planta producida(Lovato et al., 1996; Davies et al., 2000a y b). Sin embargo, existen diversos factores que estn directamente involucrados en la mayor expresin de la efectividad de los inoculante en el vivero (Alarcn y FerreraCerrato 1999), los cuales se mencionarn a continuacin. 2.9.1. Planta El conocimiento de la especie vegetal que se pretenda propagar es un aspecto importante a considerar. Si bien la simbiosis micorrzica se puede establecer en ms del

son significativamente mayores. Las plantas micotrficas obligadas (c) son aquellas que requieren forzosamente del establecimiento de la simbiosis micorrzica para poder as satisfacer sus requerimientos nutrimentales y presentar mayor capacidad de crecimiento y mayor vigor, caso de pinceas, Abies, Tsuga y Pseudotsuga, principalmente para los hongos ectomicorrzicos y la mayora de las especies frutales arbreas y algunas forestales latifoliadas, para los hongos micorrzicos arbusculares. Con base en lo anterior, es necesario saber qu tipo de micotrofismo presenta la planta en propagacin en el vivero, de tal forma que se plantee la inoculacin de hongos micorrzicos arbusculares y se asegure el xito de su aplicacin, la cual es afectada por las practicas realizadas en el vivero. 2.9.1.2. Relacin infectividad efectividad versus

grado de colonizacin que estos hongos presenten en el sistema radical. Con ello, es posible determinar la dependencia micorrzica de las plantas de un vivero, entendindose sta como el grado de respuesta en crecimiento o nutricin de las plantas por efecto de la inoculacin de hongos micorrzicos (expresado en porcentaje), en funcin de las caractersticas de fertilidad de los sustratos en los que se establezcan las plantas. 2.9.2. Sustrato Como se mencion en el captulo de viverismo, el sustrato de crecimiento para las plantas tiene relevante importancia en funcin del contenido nutrimental y caractersticas fsicas y biolgicas. De esta misma forma, el sustrato es fundamental en el establecimiento y funcionalidad de la simbiosis micorrzica y para que el efecto benfico de la simbiosis se exprese, se requiere de la esterilizacin y/o desinfeccin (solarizacin, fumigacin, vaporizacin) del sustrato con el fin de evitar posibles daos por la presencia de microorganismos fitopatgenos que adems de ser una fuente de diseminacin de enfermedades tambin pueden influir en la capacidad de los hongos micorrzicos de colonizar el sistema radical. Mediante esta sencilla prctica no solo se asegura que la simbiosis se establezca y sea funcional sino tambin se evita la proliferacin de enfermedades de hbito radical que afectan la sanidad, crecimiento y vigor de las plantas. 2.9.2.1. Caractersticas qumicas Sin lugar a dudas, las caractersticas qumicas de los sustratos utilizados en viveros son fundamentales para abastecer de nutrimentos a las plantas. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que sustratos altamente ricos en materia orgnica y particularmente fsforo, pueden inhibir la simbiosis micorrzica. Con esto se trata de puntualizar que no precisamente se requiere utilizar sustratos ricos en nutrimentos (tanto orgnicos como inorgnicos) como el suelo de monte (el uso de este tipo de sustrato contribuye al proceso de degradacin de sustratos de bosques por lo que es necesario utilizar otras fuentes de sustratos alternos), sino que es posible utilizar53

Otros conceptos que deben ser bien comprendidos por el viverista que incluya la inoculacin con hongos micorrzicos, son la capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes. Como infectividad se entiende la capacidad de los hongos de un inoculante para establecerse en el sistema radical de las plantas. La efectividad, por su parte, se relaciona con la capacidad de los hongos de un inoculante en promover el crecimiento, sanidad y vigor de las plantas ( Ferrera-Cerrato y Gonzlez-Chvez 1998, Sylvia, 1999; Alarcn y Ferrera-Cerrato, 1999) Cabe aclarar que estos dos conceptos no estn correlacionados, es decir, no necesariamente los hongos que se establezcan abundantemente (80-90% de colonizacin), en el sistema radical de las plantas, pueden inducir mayores efectos, ya que se pueden encontrar hongos que colonicen la raz en menor proporcin (1540%) y muestren excelentes efectos en la nutricin y crecimiento de las plantas. Con esto se denota la importancia de utilizar hongos cuya caracterstica principal sea propiciar el mayor beneficio a la planta, en cualquiera de las variables que se tengan como objetivo, independientemente del

sustratos con limitacin nutrimental de modo que la simbiosis establecida funcione adecuadamente en el aprovechamiento de los nutrimentos existentes y que deben de reflejarse en el buen desarrollo de las plantas. No obstante, es importante conocer algunos aspectos considerados como adecuados en la literatura como el pH que debe de ser 5.87.5, contenido de fsforo disponible menor de 20 g g-1 de sustrato, materia orgnica menor al 2.0% y tener una conductividad elctrica o contenido de sales menor a 1.0 dS m-1, que no slo afectan la simbiosis, sino tambin a las plantas del vivero. 2.9.2.2. Composicin de mezclas El sustrato debe tener caractersticas adecuadas para el crecimiento de las plantas (aireacin, retencin de humedad y disponibilidad de nutrimentos). Con base a esto, el uso de diversos materiales tanto orgnicos como inorgnicos debe de considerar la elaboracin de mezclas en proporciones tales, que permitan a las plantas crecer sin problemas. Como materiales orgnicos que pueden ser utilizados se tienen los productos derivados del composteo y vermicomposteo, cachaza, bonote de coco, etc. Sin embargo, estos materiales son muy ricos en materia orgnica y para tener un efecto benfico por la simbiosis, se recomienda utilizar estos productos en dosis menores al 12%. Adems, es posible utilizar otros tipos de sustratos, como los mencionados en el captulo de viverismo, y con ello favorecer la efectividad de la simbiosis micorrzica. 2.9.3. Manejo de vivero

2.9.3.1. Fertilizacin La aplicacin de fertilizantes, particularmente fosfatados, puede ser reducida cuando se utilizan los inoculantes de hongos micorrzicos, ya que los hongos favorecen el aprovechamiento ms eficiente de los nutrimentos inorgnicos contenidos en el sustrato. Adems, este beneficio de los hongos permite utilizar en forma ms racionada los fertilizantes y con ello reducir los costos de produccin de plantas. Es posible utilizar fertilizantes de liberacin lenta, de modo que las plantas en simbiosis puedan aprovechar los nutrimentos durante sus diferentes etapas fenolgicas.

2.9.3.2. Aplicacin de biocidas En la actualidad es posible encontrar diversos productos de biocidas (plaguicidas) que se venden comercialmente; de acuerdo a su accin sobre organismos especficos se pueden clasifican en insecticidas, nematicidas, fungicidas y herbicidas. Todos ellos pueden afectar diferencialmente a la simbiosis micorrzica, de acuerdo con la susceptibilidad de los hongos al ingrediente activo as como por su modo de accin (sistmico o de contacto). Aun cuando el uso de estos productos es un aspecto importante de manejo en el vivero, es mejor utilizarlos en menor proporcin y en dosis adecuadas de modo que con ello, se eviten problemas relacionados con la disminucin de la efectividad de los hongos micorrzicos as como evitar problemas de contaminacin ambiental que se generan por su aplicacin. 2.9.3.2.1. Insecticidas

Uno de los aspectos importantes que repercuten en la efectividad de los inoculantes con base en hongos micorrzicos en el incremento de la calidad de las plantas, es la aplicacin de productos qumicos como los fertilizantes y plaguicidas, en el vivero.

En el caso de los insecticidas, al parecer su efecto no es perjudicial para el establecimiento y efectividad de los hongos micorrzicos en el sistema radical de las plantas, an cuando se apliquen productos sistmicos. Como ejemplo de ellos, se tiene el insecticida sistmico Marathon 1% granular (ingrediente activo: imidacloropird, 1-[(6-cloro 3-pirinidil) metil]nNitro-2-imidalidimina) y otros insecticidas organofosforados cuya formulacin y forma de54

aplicacin no produce dao para la simbiosis (Dr. Frederick T. Davies Jr., comunicacin personal). Incluso se ha evaluado la aplicacin de insecticidas de origen orgnico, como el caso de extractos vegetales (Azadirachta indica L., nim; Calotropis gigantea L., Catharanthus roseus (L.) G. Don. y Eucalyptus sp., Parthenium hysterophorus L y Pongamia pinnata (L.). Pierre)(Bhatnagar y McCormick, 1988; Shetty, et al., 1989; Sarvamangala et al., 1993) y algunos de ellos no tienen efectos perjudiciales en la efectividad de los hongos ( Manjarez-Martinez y FerreraCerrato, 2000) 2.9.3.2.2. Nematicidas En el caso de los nematicidas, stos aparentemente no afectan la actividad de los hongos micorrzicos y se pueden aplicar sin contrarrestar la actividad benfica de la simbiosis. Como ejemplo de estos productos se tienen al Temik, Carbaryl y Diazinon. Por otra parte, no se tienen reportes sobre el efecto que tienen las aplicaciones de productos orgnicos (extractos vegetales, etc.) en la colonizacin y efectividad de los hongos micorrzicos. 2.9.3.2.3. Fungicidas Uno de los principales productos utilizados en el control de enfermedades, particularmente de hbito radical, son los fungicidas. En muchos de los casos, es preferible utilizar aquellos funguicidas cuyo modo de accin sea de contacto, mientras que se tenga la necesidad de usar fungicidas sistmicos, estos deben ser Selectivos (especficos) a ciertos grupos de hongos fitopatgenos como el Previcur en dosis de 0.15% para el control de Oomycetos como Pythium y que no afecta a la micorriza. Se debe tener cuidado de utilizar productos como Captan, Captafol, Thiabendazol, Maneb, Clorotalonil, Benomyl, Bayleton y Cercobin, principalmente, cuyos efectos han sido reportados como negativos para la simbiosis. En muchos de los casos es posible aplicar fungicidas en dosis ms

bajas (50%) a las recomendadas para cada producto, e incluso combinarse con productos de origen natural.

2.10. Evaluacin de la efectividad de los inoculantesLa efectividad de los inoculantes puede ser evaluada con base en los efectos benficos que tienen en las plantas a las cuales se realiz la aplicacin. Para este caso, se toman en consideracin aspectos morfolgicos de crecimiento y fisiolgicos, e incluso calidad de planta y sanidad, as como su capacidad de adaptacin a condiciones extremas. 2.10.1. Efecto en crecimiento la morfologa y

Como aspectos morfolgicos y de crecimiento se tienen aquellos relacionados con la induccin de mayor altura, dimetro de tallo, expansin foliar, rea foliar especfica, asignacin de crecimiento a determinada parte de la planta (relacin raz:parte area) y acumulacin de materia seca. Todas estas variables son modificadas por la aplicacin de hongos micorrzicos, de modo que el beneficio de esta simbiosis sea evaluado con base en estas variables (Lovato et al., 1996; Sylvia, 1989; Martins et al., 1997; Kahiluoto y Vestverg, 2000; Kahiluoto et al., 2000). No obstante, estos efectos son diferenciales de acuerdo al tipo de planta propagada y la combinacin del hongo micorrzico (arbuscular o ectomicorrzico) que se inocule. La inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares ha propiciado efectos significativos en la promocin del crecimiento de plantas como Casuarina equisetifolia (Alarcn y Ferrera-Cerrato 1995,1996) y Acacia cyanophylla (Gardezi et al., 1988) (Figura 29). De este modo, la expresin benfica de los hongos puede ser diferencialmente modificada de acuerdo con la composicin del sustrato, particularmente por la proporcin de materia orgnica utilizada. En la figura 28a se observa que la adicin de 12.5% de vermicomposta en combinacin con los hongos micorrzicos, el desarrollo de la planta se ve potenciado en comparacin con el testigo no inoculado. Cuando se vara la concentracin de55

vermicomposta al 25%, se sigue observando el efecto de la micorriza arbuscular comparado con el testigo, pero tambin se observa respuesta del tratamiento no inoculado a la aplicacin de vermicomposta (Figura 29b). En el caso de leguminosas arbreas, la inoculacin con hongos arbusculares incrementa la altura y la biomasa de Acacia cyanophylla. En la figura 29c se observa el efecto de la inoculacin de los endfitos micorrzicos comparado con la respuesta del testigo y con el tratamiento en el que se inocul la bacteria fijadora de nitrgeno del grupo Rhizobium. La respuesta a inoculacin con hongos arbusculares es superior a los 50 y 100 mg de P kg-1 e igual a lo observado con 150 mg de P kg-1 (Figura 29d). Efectos benficos de la inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares, se han encontrado en otras plantas de importancia forestal como Leucaena leucocephala, Eysendhartia polystachia, Cedrella odorata, Tabebuia donell-smithii, Fraxinus pensylvanica, Lyquidambar styraciflua, Eucalyptus camaldulensis, E. globulus, etc. (Brown et al., 1981; Sidhu y Behl, 1991; Rios, 1995; Zulueta et al., 2000, Plascencia et al., 1995; Garca, 2001) En el caso de hongos ectomicorrzicos, su efectividad no slo se expresa en la induccin de mayor altura, sino que tambin en el vigor y estado nutricional de pinceas como Pinus michoacana (Figura 30a). Por otra parte, las respuestas a la inoculacin con estos hongos, pueden ser diferentes de acuerdo con el hospedante al que se inoculan. As, la inoculacin con Pisolithus tinctorius puede ser efectivo en Pinus michoacana y presentar poca efectividad en el crecimiento y desarrollo de Pinus pseudostrobus (Figura 30a y b). Para corregir el bajo desarrollo de algunas pinceas inoculadas con hongos ectomicorrzicos, se recomienda el uso de picomdulos (fertilizante de liberacin lenta) considerados compatibles con los hongos simbiontes utilizados en plantas de inters forestal (Figura 29b).

2.10.2.

Induccin de crecimiento

velocidad

de

Las plantas inoculadas con los endfitos micorrzicos presentan mayor tasa de crecimiento (Figura 28b), ya sea con base a la evaluacin de altura, materia seca acumulada o dimetro de tallo. Mediante este beneficio aportado por la simbiosis micorrzica, el viverista tiene ventajas ya que por un lado, se acorta el tiempo de estancia de las plantas en el vivero y por ello, es posible injertar variedades comerciales (en algunos casos) e incluso, liberarla para uso en los programas de reforestacin. Por otra parte, la produccin de planta micorrizada puede tener menor costo de produccin, al disminuir el uso y frecuencia de aplicacin de fertilizantes. Para definir bien este ultimo beneficio, se requiere el anlisis del costo-beneficio econmico de las plantas producidas tanto con simbiosis micorrzica como por aquella obtenida con fertilizantes. 2.10.3. Calidad de planta producida El concepto de calidad de planta ha tenido en la actualidad gran inters, ya que se trata de predecir el xito de una plantacin con base al establecimiento de ndices de calidad de planta producida en vivero. La calidad de planta involucra aspectos genticos, morfolgicos y fisiolgicos; sin embargo, este concepto es relativo ya que se pueden presentar variaciones de acuerdo con la especie propagada, sitio donde se va a plantar definitivamente y objetivos de la produccin de las plantas (Mohedano, 1999; Cruz, 2001). Existen criterios para definir la calidad de planta, los cuales se pueden basar en aspectos morfolgicos: altura, dimetro del cuello del tallo, cociente altura/dimetro, arquitectura de la parte area y arquitectura de la raz, as con aspectos fisiolgicos como relacin aguaplanta, nutricin, potencial de regeneracin radical, fotosntesis, transpiracin y cantidad de carbohidratos en cuello del tallo y raz.

56

a)

b)

Glomus intrarradices

Glomus Zac-19

Testigo Glomus intrarradices Glomus Zac-19 50:25:25 Suelo: vermicomposta:arena Testigo

12.5:12.5:75 Suelo:vermicomposta:arena

c)

d)

Testigo

Rhizobium

Glomus Zac-8 + Rhizobium

Glomus Zac-8

Testigo

50 ppm P2O5

100 ppm P2O5

150 ppm P2O5

Figura 29.

Efectividad de hongos micorrzicos arbusculares en la altura de plantas de Casuarina equisetifolia L. establecidas en dos condiciones de aplicacin de vermicomposta (a y b) y en plantas de Acacia cyanophylla con y sin la doble inoculacin HMA-Rhizobium (c) y su comparacin con el efecto de la aplicacin de tres niveles de fertilizacin fosfatada (P2O5) (d).

57

a)

Testigo

Inoculado con esporas de Pisolithus tinctorius

Testigo

b)

Inoculado con esporas de Pisolithus tinctorius

Testigo

Inoculado con Pisolithus tinctorius + Picomdulo

Figura 30.

Promocin del crecimiento y vigor de plntulas de (a) Pinus michoacana y (b) Pinus pseudostrobus inoculados con esporas de Pisolithus tinctorius. Picomudulos-fertilizante de liberacin lenta, en forma de pastilla (Garca y Ferrera-Cerrato, 1982).

Uno de los ndices de calidad que es fcilmente calculado y utilizado en pinceas, es el de Dickson et al. (1960) que expresa la combinacin entre la relacin raz:parte area-raz (peso seco) y el ndice de robustez que relaciona la altura (cm) y el dimetro del tallo (mm) de la planta:ndice de calidad = Peso seco total de la planta (g) Altura (cm) Dimetro de tallo (mm) + Peso seco parte area (g) Peso seco de raz (g)

plantas (podas areas, fertilizaciones, inoculacin de hongos micorrzicos, etc.), de tal forma que tambin se puede proceder el tiempo de liberacin de la planta a condiciones de campo e incluso, por ejemplo, se puede utilizar para establecer el ndice adecuado para efectuar la injertacin de variedades comerciales en portainjertos. 2.10.4. Adaptacin a condiciones limitantes Una de las ventajas que presentan las plantas que fueron previamente inoculadas con hongos micorrzicos (arbusculares o ectomicorrzicos) cuando son liberadas a condiciones de campo, es el aumento de su capacidad de adaptacin y tolerancia al estrs que implica su establecimiento en el campo. En el cuadro 8, se hace mencin de algunos efectos benficos58

Entre ms cercano sea el valor obtenido de la ecuacin a la unidad, denotar mayor calidad de las plntulas producidas en el vivero. De este modo, se pueden establecer diversos ndices con base en las diferentes prcticas utilizadas en la produccin de

que la simbiosis micorrzica aporta a las plantas establecidas en diversas condiciones de estrs comunes en el campo. 2.10.4.1. Salinidad La condicin salina de un suelo produce efectos negativos en el crecimiento de la mayora de las plantas que comnmente se producen en el vivero. Sin embargo, el uso de especies forestales con mayor grado de adaptacin a esta condicin adversa favorece el xito de la plantacin. De este modo, se deben utilizar preferentemente, especies que ecolgicamente estn adaptadas a este problema edfico como pinos pioneros (Pinus cembroides) Salix bonplandiana, Salix sp., Casuarina sp., entre otras. Por otra parte, la inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares, confiere a estas plantas mayor capacidad de adaptacin y tolerancia a sales mediante la modificacin de su fisiologa en funcin de la sntesis de compuestos orgnicos internos de la planta que propician mayor capacidad de aprovechamiento del agua (prolina, otros solutos y trehalosa producida por los hongos), as como favorecer la relacin nutrimental que posibilita a las plantas adaptarse a estos ambientes. Un aspecto importante a considerar es la produccin de planta con menor porte en altura y mayor volumen radical. Estas caractersticas contribuyen en la reduccin del dao por la condicin salina del suelo y que se propicie la adaptacin de la planta. 2.10.4.2. Sequa En buena parte, la sequa representa problemas semejantes a los que se presentan en plantas expuestas a condiciones salinas, solo que en este caso, la prolongada exposicin de estrs hdrico representa una limitante para el establecimiento de plantaciones forestales con fines de rehabilitacin de zonas con este tipo de problema. En este caso, el uso de especies con tolerancia a estrs hdrico como algunas leguminosas arbreas (Prosopis, Mimosa, Leucaena, Eysendhartia, etc., especies micotrficas

obligadas), puede representar un excelente potencial para este tipo de zonas, no solo en la reforestacin sino que tambin en su aprovechamiento por el hombre. Dada la condicin micorrzica y micotrfica de estas plantas (Carrillo-Garca et al., 1999), su produccin en el vivero debe incluir la inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares para favorecer su crecimiento, sanidad, nutricin y vigor, as como su capacidad de adaptacin y desarrollo en el sitio. No obstante, tambin se pueden producir en el vivero, plantas nativas del sitio y a la vez, inocular con hongos micorrzicos arbusculares ecolgicamente adaptados a las zonas ridas, de modo a que se favorezca el crecimiento y desarrollo de las plantas propagadas en el vivero. 2.10.4.3. Tolerancia a condiciones acidez y alcalinidad de

En diversos suelos de Mxico, se presentan condiciones de acidez o alcalinidad que redundan en el pobre y limitado crecimiento de las plantas que en ellos se establecen. Con base en lo anterior, es posible realizar diferentes prcticas de manejo (aplicacin de mejoradores de suelo tanto orgnicos como inorgnicos) con el fin de propiciar cambios en el grado de acidez o alcalinidad y con ello favorecer el crecimiento de plantas con la capacidad de tolerar dichas condiciones, por ejemplo, Casuarina obesa (Sidhu y Behl, 1992). Al propagar estas plantas en el vivero, es posible proceder a la inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares o ectomicorrzicos, segn el hospedante, con el fin de obtener plantas ms vigorosas y con mayor capacidad de adaptacin a las condiciones edficas mencionadas.

59

Cuadro 8. Especies arbreas con uso potencial en la recuperacin de suelos con posibilidad de inocularlas exitosamente con hongos micorrzicos arbusculares (HMA) o ectomicorrzicos (HECM) en el vivero.

Nombre cientfico

Tipo de planta

Simbiontes micorrzicosHMA HMA HECM HECM HMA HMA HMA HMA HECM HECM HMA HECM HMA

Condicin de adaptacin

Acacia spp Acer pseudoplatanus Betula papyrifera Betula pubescens Casuarina equisitefolia Crotalaria anagyroides Fraxinus americana Leaucaena leucocephala Pinus caribbea Pinus cembroides Platanus occidentalis Populus spp Prosopis spp

Leguminosa tropical Deciduo Deciduo Deciduo Tropical Leguminosa Tropical Deciduo Leguminosa Tropical Conifera Conifera Deciduo Deciduo Leguminosa

Sequa Sequa Acidez, fertilidad pobre Fertilidad pobre Acidez Acidez Sequa, alta humedad Sequa Acidez, sequa, fertilidad pobre Sequa, salinidad Alta humedad, metales pesados Acidez Sequa

2.10.4.4. Grado de perturbacin El grado de perturbacin de los suelos (alteracin del estado del suelo debido al impacto de fenmenos atmosfricos y manejo de los sistemas por el hombre; lvarez y Ferrera-Cerrato, 1995) es un aspecto que debe ser considerado al momento de la produccin de plantas en vivero, ya que stas deben tener caractersticas adecuadas que permitan que su tasa de supervivencia sea mayor y se garantice, en cierta forma, el xito de las plantaciones con fines de restauracin o rehabilitacin de zonas perturbadas. 2.10.4.4.1. Erosin Sin lugar a dudas, la erosin tanto elica como hdrica contribuye en forma significativa en la prdida de la capa frtil de los suelos. Algunas estimulaciones sealan que la prdida de suelos por accin del viento es de 10 mm ao-1 , mientras que por accin del agua es de 1 mm ao-1. Sin embargo, estas cifras son variables en funcin de la variabilidad ambiental y del60

tiempo de exposicin del suelo a la intensidad de los agentes de erosin, por lo que la prdida de suelo puede ser mayor en ciertas zonas. De forma natural, la sucesin vegetal se lleva acabo en forma lenta y se caracteriza por la presencia de especies pioneras y posterior aparicin y colonizacin de especies permanentes (Allen M, 1992, 1999; Allen E, 1999). El conocimiento de estos procesos de sucesin, permite aplicarlos utilizando principalmente plantas consideradas como permanentes y que adems sean susceptibles de formar micorriza. Con lo anterior, es posible crear condiciones que favorezcan los procesos de restauracin de zonas, al propiciar la creacin de manchones o islas de fertilidad (Carrillo-Garca et al., 1999a y b) que a largo plazo, contribuirn a la expansin de mayor cobertura vegetal y con ello a la restauracin de la zona. 2.10.4.4.2. Desertificacin La desertificacin es un proceso originado por la actividad de los agentes de erosin e inadecuados manejos agrcolas y minera. Este proceso se caracteriza por la sucesiva prdida

de las propiedades fsicas, qumicas, biolgicas del suelo, que definen la fertilidad del mismo. Al igual que en las zonas erosionadas, en zonas desrticas es posible implementar procesos de restauracin con base al manejo de especies con tolerancia a dichas condiciones y de acuerdo al conocimiento de los procesos de sucesin vegetal. En ambos casos es posible utilizar especies arbustivas y arbreas como leguminosas (Mimosa luisana, Prosopis laevigata, etc.) (Reyes-Quintanar et al., 2000) y algunas gramneas como Bouteluoa gracillis, mismas que son susceptibles de ser colonizadas por los hongos micorrzicos arbusculares los cuales confieren ventajas fisiolgicas a condiciones de estrs hdrico y temperaturas extremas. 2.10.4.4.3. Contaminacin La contaminacin del suelo puede ser originada por la deposicin de diferentes compuestos txicos. Actualmente este problema ha tenido especial preocupacin tanto en nuestro pas como en muchas otras regiones del mundo, ya que representa un constante riesgo para el ambiente y para la salud humana. Como alternativas para la recuperacin de reas contaminadas con hidrocarburos o metales pesados, estn la fitodescontaminacin y la fitoestabilizacin en las que se tiene la participacin directa de la planta y su microflora rizosfrica (Cunningham et al., 1996). Estas alternativas biolgicas de remediacin tienen como ventaja su bajo costo (comparado con la remediacin de suelos mediante tcnicas qumicas y de ingeniera), as como su aceptacin pblica para su aplicacin, adems de tener bajo o nulo impacto ecolgico. El uso de hongos micorrzicos en la fitorremediacin de suelos contaminados, representan una posibilidad de disminuir los riesgos de los contaminantes en el suelo, as como reestablecer la vegetacin en estas reas (Jasper, 1994). La presencia de los hongos ectomicorrzicos y hongos micorrzicos arbusculares es de vital importancia para el establecimiento de especies arbustivas y arbreas en suelos contaminados.61

Ejemplos de stas son: pinos, abedules, sauces (especies formadoras de ectomicorriza), Acer y Salix (que establecen simbiosis con hongos ectomicorrzicos y micorrzicos arbusculares). Por otra parte, las especies creciendo cerca de suelos mineros como Festuca rubra, F. ovina, F. arundinaceae, Andropogon gerardii, Holcus lanatus, Agrostis capilaris, A. stolonifera y Deschampsia flexuosa, tienen la capacidad de formar micorriza arbuscular La magnitud del problema de contaminacin en Mxico permite predecir el enorme potencial de los hongos micorrzicos con el fin de expandir su uso prctico en la fitorremediacin de suelos contaminados al inocularlos, ya sea por hidrocarburos o metales pesados.

2.11. Evaluacin micorrzica

de

la

colonizacin

En todos los sistemas donde se aplican los hongos formadores de micorriza es necesario evaluar la colonizacin. Esta evaluacin vara desde una simple observacin de las races e identificacin de la formacin de la micorriza, hasta la cuantificacin microscpica basada en mtodos especficos ya probados. En cualquiera de los casos, el propsito es identificar si las races fueron colonizadas por el hongo y en que cantidad. Para esto, se recurre a la evaluacin de muestras frescas de races con crecimiento secundario. Un proceso de clareo y tincin de la raz resulta indispensable cuando se han inoculado hongos formadores de micorriza arbuscular, no as para el caso de la ectomicorriza donde la cuantificacin se realiza directamente. As, el mtodo ms utilizado para evaluar la colonizacin por hongos micorrzicos arbusculares, es aqul donde se emplea KOH al 10% para eliminar todo el contenido celular, as como pigmentos con el fin de observar, sin interferencias, las estructuras fngicas que son teidas con azul tripano y con otros colorantes como negro E de clorazol, fucsina cida (Brundrett et al., 1996; Dickson y Smith, 1998) e incluso con anilina o tinta china (Dr. Chris Walker comunicacin personal). La medicin de la colonizacin puede realizarse mediante mtodos no sistemticos y

mtodos sistemticos, que de acuerdo con cierto proceso es posible realizarlo en los viveros o preferentemente enviar las muestras a laboratorios especializados para dar un diagnostico ms completo en la colonizacin tanto por hongos micorrzicos arbusculares como ectomicorrzicos (Alarcn, 2001). 2.11.1. Mtodos no sistemticos Para la micorriza arbuscular, los mtodos no sistemticos involucran la revisin subjetiva de la muestra que permite inferir la presencia de hongos micorrzicos arbusculares colonizando las races, como es el caso de pigmentacin amarilla en races de cebolla, pero no proporciona informacin del tipo de estructuras fngicas presentes. Esta observacin no representa para el evaluador ninguna seguridad de la frecuencia ni proporcin del sistema radical colonizado por los hongos, por lo que se requiere utilizar otros mtodos. Para el caso de la ectomicorriza, su evaluacin consiste en determinar si los hongos ectomicorrzicos se establecieron en la planta. El tipo de estructura micorrzica formada (digitiforme, bifurcada, coraloide, pinnada, etc. ver figura 17), se compara con la arquitectura original del sistema radical de plantas no colonizadas por los hongos (Ferrera-Cerrato, 1993). Con base lo anterior, se pueden crear clases subjetivas que consisten en comparar el grado de formacin de estructuras ectomicorrzicas en la raz (Figura 31a-d). Esta comparacin permite obtener valores numricos subjetivos en forma de escala, la cual es utilizada por el USDA Forest Service de Georgia, tomando en consideracin varias repeticiones para establecer los diferentes grados de colonizacin. Mediante esta observacin es posible estimar el porcentaje de colonizacin por ectomicorrzicos con base en el tipo y color de la estructura micorrzica que stos forman. Por ejemplo, Pisolithus tinctorius forma estructuras micorrzicas de color caf y Cenococcum geophylum de color negro.62

El establecimiento de la escala de colonizacin puede ser ajustada mediante la observacin del sistema radical al microscopio estereoscopio en la que se realiza una revisin minuciosa de toda la raz de la planta (separada cuidadosamente del sustrato de crecimiento) para detectar las ramificaciones y deformaciones de las races alimentadoras (feeder roots) inducidas por el hongo ectomicorrzico (Figura 16a-d). 2. 11. 2. Mtodos sistemticos Los mtodos sistemticos conllevan el seguimiento de procesos bien definidos que permiten evaluar cuantitativamente la colonizacin fngica en la raz con mayor precisin. En el caso de la micorriza arbuscular, con este tipo de mtodos se cuantifica la intensidad de la colonizacin y el tipo de estructuras presentes (hifas, arbsculos, vesculas) por cada segmento de raz evaluado. El procedimiento utilizado se basa en aquel que fue propuesto por Phillips y Haymann (1970). Este proceso inicia con la exposicin de las races en una solucin de KOH al 10%, expuesta a calor (a ebullicin o en olla de presin a 10 lb) durante 10 minutos, repitiendo este paso hasta obtener la raz libre de pigmentos (taninos, polifenoles, etc.). Posteriormente, las races son enjuagadas con agua corriente para despus exponerlas a agua oxigenada comercial durante 10-15 minutos. Las races se enjuagan nuevamente y se adiciona una solucin de HCl al 10% durante 10-15 minutos. Pasado este tiempo el cido se elimina, y sin enjuagar, las races son sumergidas en una solucin colorante de azul tripano al 0.05% en lactoglicerol (100 mL de cido lctico comercial, 100 mL de glicerina comercial y 100 mL de agua destilada). Las races se exponen a calor (a ebullicin o en olla de presin a 10 lb), durante 10 minutos, para facilitar su tincin (Figura 32).

0%Figura 31.

1-25%

26-50%

51-75%

76-100%

Evaluacin de la colonizacin ectomicorrzica en races de pinceas, mediante el establecimiento subjetivo de una escala (0-100 %) que representa la presencia, en porcentaje, de las diferentes estructuras ectomicorrzicas en el sistema radical de las plantas hospedantes.

Una vez teidas las races, stas se cortan en segmentos de 1.5 centmetros de largo (procurando que sean las races ms finas) y se colocan en forma paralela, sobre portaobjetos con unas gotas de lactoglicerol. En cada portaobjetos se montan de 25 segmentos de raz por cuatriplicado y finalmente, se les coloca un cubreobjetos, quedando la preparacin lista para su observacin al microscopio ptico a objetivo de inmersin 100x (Figura 33). Este procedimiento, a pesar de su laboriosidad, permite realizar una mejor estimacin de la colonizacin de las diferentes estructuras caractersticas de los hongos micorrzicos arbusculares en las clulas corticales. Una vez realizada la observacin microscpica de las races, y haber procedido a contar los segmentos radicales colonizados o no colonizados por los HMA, se procede a calcular el porcentaje de la frecuencia de colonizacin (Biermann y Linderman, 1981). La determinacin del porcentaje de colonizacin, se basa en la observacin microscpica de segmentos de raz teidos y en ellos, contabilizar aquellos que63

presentan estructuras fngicas (hifas, arbsculos y vesculas), a la vez de contar los segmentos no colonizados. El porcentaje de colonizacin total se determina dividiendo el nmero de segmentos de raz colonizados, por cualquier estructura fngica, entre el nmero de segmentos totales observados (suma de los segmentos colonizados y los segmentos no colonizados), multiplicado por 100:Nmero de segmentos colonizados (Hifas, arbsculos o vesculas) ------------------------------------Nmero de segmentos totales observados

% Colonizacin =

x 100

Por otra parte y considerando su rapidez de evaluacin, se tiene otro mtodo con base al uso de cajas de Petri con cuadrcula de 1cm2 (interseccin de cuadrantes, generado por Giovanetti y Mosse, 1980) y la observacin de las races al microscopio estereoscpico. El mtodo consiste en colocar aproximadamente un gramo de races, previamente teidas, en las cajas de Petri cuadriculadas. Las races se distribuyen en el interior de la caja y se les agrega un poco de agua para que no se deshidraten. La caja se coloca bajo el

microscopio estereoscpico y se comienza la observacin, siguiendo las lneas de la cuadrcula, empezando por las lneas de la cuadrcula horizontal y al finalizar, continuar con las lneas de la cuadrcula vertical (Figura 34).

c) b) a) d)

KOH 10%

KOH 10% 10 libras, 10 minutos

H2O2 10% 10 minutos

e)

f)

g)

h)

i)

Enjuague con agua corriente

HCl 10% 10 minutos

Azul tripano 0.05%

Tincin con calor 10 libras, 10 minutos

Races teidas

Figura 32.

Pasos metodolgicos de clarificacin y tincin de races colonizadas por hongos micorrzicos arbusculares. a) corte de races y colocacin de races en cpsulas esterilizadas, b) cpsulas de races en solucin de KOH al 10% , c) cpsulas expuestas a calor por ebullicin o sometidas a presin (10 lb) durante 10 minutos, d) cpsulas expuestas a solucin de agua oxigenada por 10 minutos, e) enjuague de las cpsulas con agua corriente, f) cpsulas expuestas a HCl al 10% durante 10 minutos, g) cpsulas expuestas a solucin colorante con azul tripano 0.05% en lactoglicerol, h) exposicin de las cpsulas a calor por ebullicin o a presin durante 10 minutos, i) cpsulas con races teidas, listas para su montaje.

Conforme se hace el recorrido de las lneas horizontales y verticales, se toman lecturas de las intersecciones de las races sobre las lneas de la cuadrcula y de aquellas races en las que se detecte colonizacin por los hongos micorrzicos arbusculares. Una vez cuantificadas todas las intersecciones, se contabiliza el total de races colonizadas y64

el total de races no colonizadas y con base en el total de segmentos cuantificados, se estima el porcentaje de longitud de raz colonizada e incluso el porcentaje de longitud total de la raz (Figura 34c).

b)

a)

c) )

Figura 33. Evaluacin de la colonizacin por hongos micorrzicos arbusculares en el sistema radical de las plantas, con base al montaje de races teidas sobre portaobjetos: a) colocacin de races teidas en cajas de Petri; b) montaje de races en portaobjetos con lactoglicerol; b) observacin de las preparaciones al microscopio de campo claro a objetivo de inmersin 100x e identificacin de las estructuras fngicas intrarradicales.

Este mtodo es recomendable para raicillas de fcil observacin (cebolla, poro, lechuga, etc.) cuya existencia y grado de colonizacin, permite observar la colonizacin por los hongos micorrzicos arbusculares; mientras que no muy es recomendable para races de consistencia semileosa o leosa (rboles forestales o frutales), por su dificultad para teirlas. La determinacin del porcentaje de raz colonizada mediante el mtodo de interseccin de cuadrantes se calcula mediante la siguiente ecuacin:Longitud de raz colonizada (%) = Total de intersecciones colonizadas (cm) -----------------------------------------------------------------------------Total de intersecciones no colonizadas (cm)

X 100

+

Total de intersecciones colonizadas (cm)

65

a)

Lneas horizontales

RM1

NRT2 3 3 6 6 6 3

c)

/ / / / / / /

b)

2 3 3 2 4 1

Lneas RM 0 Verticales / NRT 0

3 / 7

5 / 11

2 / 11

4 / 10

1 / 6

4 / 6

0 / 0

Total de races micorrizadas (RM) = 35 Total de races observadas (NRT) = 80 (35 / 80) x100 = Longitud de raz colonizada = 43.7%

Figura 34. Mtodo de evaluacin de la colonizacin micorrzica por interseccin de cuadrantes: a) Colocacin de races teidas en caja de Petri con cuadrcula de 1cm2; b) Observacin al microscopio estereoscpico; c) Secuencia del seguimiento de la observacin de las cajas de Petri (flechas en direccin vertical y horizontal) para la cuantificacin de segmentos colonizados por hongos micorrzicos arbusculares ubicados sobre las lneas de la cuadrcula ( ).

Ambos mtodos descritos, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal donde se inoculen los hongos que forman micorriza arbuscular, considerando un tiempo mnimo de tres meses para realizarlo, ya que en ese tiempo ya es posible encontrar colonizacin en races de plantas forestales leosas. Para cualquier simbiosis, la frecuencia en realizacin de estas determinaciones depender fundamentalmente de los objetivos del viverista, de modo que con ello se asegure liberar planta, a los sitios definitivos de transplante, con una simbiosis micorrzica bien establecida que confiera a las plantas mayor capacidad de adaptacin a las condiciones tanto edfica como climtica del sitio.66

Para el caso de los hongos ectomicorrzicos, el procedimiento sistemtico para la evaluacin de la colonizacin consiste en contabilizar las puntas con estructuras ectomicorrzicas en las races de conferas (Figura 35). Este mtodo es muy similar al de interseccin de cuadrantes descrito para la evaluacin de hongos micorrzicos arbusculares (ver Figura 34). El procedimiento del mtodo se lleva a cabo con base a los siguientes pasos: Las races se cortan en segmentos y se colocan en cajas de Petri cuadriculadas (1 cm2) Las cajas con las races se colocan en el microscopio estereoscpico y se realizan evaluaciones de las intersecciones de las

races en el sentido vertical y horizontal de la cuadrcula Se procede a cuantificar cada interseccin de la cuadricula con las races y se contabilizan las races colonizadas (con presencia de las estructuras ectomicorrzicas) y las no colonizadas

Los valores se expresan en centmetros cuadrados para cada condicin de raz evaluada Adems, es posible determinar la longitud radical de la muestra con base a la suma del conteo de races no colonizadas y races colonizadas

A continuacin se ilustran las estructuras ectomicorrzicas tpicas a observar y cuantificar con el mtodo de interseccin de cuadrantes (Tomado de Brundrett et al., 1996):

c)

a)

b)

75 Races sin colonizar

44

Races colonizada s Longitud radical total = 119 cm Longitud de raz colonizada = 44 cm (44/119) x 100 = Longitud radical colonizada = 36.97%

Figura 35.

Mtodo de evaluacin de la colonizacin por hongos ectomicorrzicos mediante el mtodo de interseccin de cuadrantes: a) colocacin de races de conferas en caja de Petri con cuadrcula de 1cm2; b) observacin al microscopio estereoscpico; c) observacin de la caja de Petri (en direccin vertical y horizontal) para la cuantificacin de la longitud radical y las puntas radicales con estructuras ectomicorrzicas que se sobrepongan a las lneas de la cuadrcula. 67

2.12. Calidad biolgica inoculantes

de

los

A pesar de la importancia que actualmente tienen los inoculantes microbianos en Mxico, desafortunadamente, no se cuenta con un organismo que regule y evale la calidad de los mismos. Dado que se carece de estndares que establezcan la cantidad mnima de propgulos infectivos de los hongos micorrzicos, as como de garantizar que los inoculantes estn libres de organismos fitopatgenos, ningn inoculante comercial pueden ser calificado como de alta calidad. Un inoculante debe contener una cantidad de propgulos de hongos micorrzicos que permita colonizar la planta y producir con el tiempo, efectos positivos en el crecimiento y desarrollo. Con base en lo anterior, cada compaa anuncia lo ms apropiado para sus productos y como consumidores solo queda el recurso de aplicarlos y esperar resultados; o bien, proceder a la evaluacin del inoculante y corroborar si cumple o no con lo que se presenta en la etiqueta del producto. 2.12.1. Evaluacin microbiolgica de los inoculantes La determinacin del nmero de bacterias, hongos y actinomicetos que vienen en conjunto con un inoculante micorrzico, debe realizarse mediante tcnicas de laboratorio especficas para Microbiologa de Suelos. En tal caso, se debe acudir a personal especializado que adems de cuantificar el nmero de microorganismos ajenos al inoculante (considerando la especificacin del producto), tambin pueda dar un diagnostico de la presencia de patgenos. Las tcnicas microbiolgicas se basan en el uso de medios de cultivo especficos para cada grupo microbiano y evaluar con ello, su posible actividad fisiolgica (fijadores de nitrgeno, solubilizadores de fsforo, patgenos, etc.). Para estudios microbiolgicos se requiere del uso de productos sellados de origen, y evitar con ello la introduccin de otros microorganismos por el manejo de los68

inoculantes. De acuerdo con la evaluacin de los microorganismos, la cantidad (poblacin) de contaminantes en inoculantes comerciales suele en algunos casos sobrepasar a la cantidad de hongos micorrzicos pudiendo causar efectos negativos sobre la planta inoculada, lo cual puede, equivocaramente, atribuirse al efecto del hongo micorrzico que incluye el inoculante. 2.12.2. Evaluacin micorrzicos de propgulos

2.12.2.1. Cuantificacin de esporas El nmero de esporas en el inoculante micorrzico (hongos micorrzicos arbusculares y ectomicorrzicos) debe ser cuantificado antes de que ste sea utilizado, de tal manera que se asegure que la colonizacin micorrzica se lleve a cabo. La separacin y el conteo de esporas se realizan un mtodo muy sencillo pero laborioso, ya que involucra la observacin y evaluacin al microscopio estereoscpico y en algunos casos en el microscopio ptico. Para el caso de hongos micorrzicos arbusculares, la separacin del soporte en que van incluidas las esporas se realiza, bsicamente, mediante el mtodo de tamizado y decantado en hmedo (Figura 36). En este mtodo, 100 g del inculo se disuelve con 1L de agua, la suspensin se deja reposar durante unos segundos y el sobrenadante se pasa a travs de tamices o mallas calibradas a 500, 250 y 44 micras para capturar las esporas de acuerdo a su tamao. Este procedimiento de decantacin se repite al menos tres veces. El material que queda atrapado en los tamices se recoge en su totalidad y se observa al microscopio estereoscopio y se procede a cuantificar el nmero de esporas por gramo de inoculante. Es importante recalcar que el conteo de esporas debe ser realizado por personal con experiencia para evitar confusiones y errores en el conteo.

a)

b)

c)

d)

e) f)

Figura 36. Mtodo de tamizado y decantacin en hmedo (Gerdemann y Nicolson, 1963) utilizado para la extraccin de esporas de hongos micorrzicos arbusculares tanto para aislamiento como para cuantificacin en muestras de suelo o en inoculantes. a) Muestra de suelo (100 g) depositada en 1 litro de agua; b) agitacin de la suspensin; c) Decantado del sobrenadante y captura de esporas en tamices de malla 520 y 45 micras; d) Colecta de esporas retenidas en los tamices; e y f) Observacin y cuantificacin de las esporas al microscopio estereoscopio.

Un mtodo muy sencillo para efectuar el conteo de esporas de hongos ectomicorrzicos se basa en diluciones seriales, y en cada suspensin se agregan unas gotas de Tween 20 al 1% para propiciar la separacin de las esporas y su suspensin total en el aproximadamente. Con base a la dilucin ms alta (10-7, 10-8 o 10-9) se colecta una alcuota de 100 L y se vierte ya sea en una caja de Petri cuadriculada y se observa al microscopio estereoscpico. Otra alternativa consiste en colocar la alcuota entre el cubreobjeto y la cmara de Newbauer. La alcuota pasara por capilaridad y con un papel filtro o absorbente se elimina el exceso. Posteriormente, se coloca la preparacin en el microscopio ptico. La cmara esta conformada por retculas (cuatro retculas perifricas con 16 cuadros y una retcula central con 400 cuadros). Tanto en la retcula central como en las perifricas, se69

procede a contar las esporas que estn tocando las lneas de la retcula. Una vez contabilizadas las esporas, se suma el total de ellas y se divide entre cinco (retculas) para obtener un promedio. Con base en que cada retcula tiene 1 mm2 de superficie y 0.1 mm de profundidad, el promedio obtenido es el que se encuentra en 0.1 mm3, lo que equivale en 0.0001 ml. Dado que el nmero de esporas se puede reportar por mililitro, se procede a calcularlo de la siguiente forma: X=[(nmero de esporas x 1.0 mL) / 0.0001 mL]. Este tipo de determinaciones se pueden utilizar para generar recomendaciones de la cantidad de producto para aplicar a una determinada cantidad de plantas, tal cantidad debe ser superior a inocular 1.1 x 106 esporas por plantas.

2.13. Interaccin con otros microorganismos benficos2.13.1. Bacterias crecimiento promotoras de

El trmino bacterias promotoras de crecimiento es aplicado a aquellas bacterias del suelo capaces de colonizar las races de las plantas y estimular el desarrollo de las mismas, a travs de la sntesis de reguladores del crecimiento como el cido indolacetico (AIA) (Azcon, 2000). Muchas de stas bacterias, adems de promover el crecimiento vegetal, presentas otras importantes actividades fisiolgicas como fijar nitrgeno atmosfrico, movilizacin de fuentes insolubles de nutrimentos, modificando el desarrollo y funcin de las races para mejorar la absorcin de agua y nutrimentos y contribuir en el control de microorganismos patgenos, mediante la secrecin de sustancias antibiticas. En los ltimos aos, se ha incrementado la informacin de los beneficios de estas bacterias, pudiendo actualmente formularse recomendaciones para su uso en los viveros, sobre todo en especies de lento crecimiento. El xito de la introduccin de estas bacterias y de los hongos micorrzicos en la propagacin de plantas en el vivero es seguro, puesto que se realizan algunas prcticas que favorecen su establecimiento en el sistema radical como la esterilizacin o desinfeccin de recipientes, envases y sustratos, el uso de frmulas fertilizantes de lenta liberacin o en bajas dosis, aplicacin racional de plaguicidas, as como hacer el seguimiento del contenido de humedad, mismos que repercuten en los beneficios tanto planta como a los simbiontes. 2.13.1.1. Bacterias fijadoras de Nitrgeno De acuerdo con diversas investigaciones reportadas en la literatura, se ha podido establecer el efecto benfico que tiene la doble inoculacin hongo micorrzico arbuscular-bacterias fijadoras de nitrgeno atmosfrico. Un tipo de planta que resulta beneficiada de este tipo de asociaciones son las leguminosas, pues establecen simbiosis con Rhizobium y hongos micorrzicos, por lo70

que tienen mayor capacidad de aprovechar N y P contenido. Es posible disminuir considerablemente los requerimientos nutrimentrales suministrado mediante fertilizacin qumica (Azcon, 2000). Las leguminosas herbceas y semileosas suelen presentar micorriza arbuscular, mientras que algunas leguminosas arbreas pueden presentan ectomicorriza (Cuadro 7). El establecimiento de ambos microorganismos en las leguminosas se establece a los pocos das de la inoculacin y al parecer no existe competencia entre el hongo y la bacteria por los puntos de colonizacin dando como resultado mayor crecimiento en el hospedante. La doble simbiosis en leguminosas forestales con propsitos de regeneracin o conservacin de suelos, es una alternativa que permitira a algunas especies como Acacia schaffneri, Dalea bicolor, Prosopis laevigata, Robinia sp. y Leucaena leucocephala mayor adaptacin y supervivencia en condiciones edafolgicas y climticas adversas. Adems la extensa red de hifas, que explora el suelo y transloca nutrimentos, no solo beneficia a la planta originalmente inoculada sino tambin a otras plantas que cohabitan en el mismo sitio, lo cual contribuye en la estabilidad de las comunidades de vegetales que conforman el ecosistema. Otra interaccin importante de la micorriza con fijadores de N, se da en plantas no leguminosas que forman ndulos en la raz y a la asociacin con actinomicetos del gnero Frankia (actinorriza). Esta simbiosis se establece en 20 gneros de especies vegetales que en su mayora son rboles y arbustos de vida perenne. Algunos como Casuarina, Eleagnus, Hyppophae, Ceanothus, Colletia, Discaria, Purshia, Robus y Dastica adems de asociarse con Frankia establecen simbiosis con hongos micorrzicos arbusculares; mientras que Alnus, Myrica, Comptonia, Dryas y Coriaria pueden establecer simbiosis con los tres simbiontes al mismo tiempo: actinorriza, micorriza arbuscular y ectomicorriza. Los efectos de estas interacciones sobre la planta se manifiestan en la nutricin y crecimiento del

hospedante. Por ltimo, la fijacin biolgica de N tambin la realizan bacterias de vida libre (diazotrofos); sin embargo, este tipo de bacterias no han sido inoculadas ni evaluadaspoco se les ha asociado con especies forestales y mucho menos en combinacin con hongos micorrzicos arbusculares. 2.13.1.2. Bacterias solubilizadoras de fsforo y productoras de reguladores del crecimiento vegetal

Existen bacterias que han mostrado actividad antibitica a hongos patgenos son Pseudomonas fluorescens y P. putida, adems de Agrobacterium y otras cuyo efecto antibitico no afecta a la micorriza sino que en ciertas ocasiones favorecen la germinacin de las esporas o estimulan el desarrollo del micelio hacia la raz, por lo que pueden usarse conjuntamente.

Las bacterias solubilizadoras de fosfatos (fosfobacterias) de algunos gneros como Pseudomonas y Agrobacterium facilitan el aporte de fsforo a la planta mediante algunos mecanismos como la secrecin de enzimas fosfatasas que permite que el fsforo se haga disponible a la planta. Cuando estas bacterias son inoculadas en combinacin con hongos micorrzicos la captacin de este elemento aumenta y se promueve considerablemente el crecimiento de la planta, con mnima fertilizacin qumica. Estas bacterias, pueden ser tambin promotoras de crecimiento, ya que producen hormonas del crecimiento como citocininas, giberelinas y cido indol-actico adems de algunas vitaminas y otras sustancias que inducen el crecimiento vegetal. Existen muchos ejemplos del efecto conjunto en el crecimiento de las plantas por el empleo de los hongos micorrzicos y estas bacterias promotoras en limonero, aguacate, capuln, aile y muchas otras de inters hortcola. 2.13.1.3. Bacterias antibiticas

El control de ciertos patgenos del suelo puede tambin lograrse con el empleo de bacterias (Lara, 1998; Lara et al., 1998a y b). Algunas de stas producen compuestos que inmovilizan nutrimentos (Fe) que los hongos patgenos utilizan para su nutricin, disminuyendo as la poblacin de los mismos por efecto de competencia (Crowley, 2001). Otra forma incluye la competencia por nutrimentos en la raz, donde las bacterias no patognicas, por lo general, son ms competitivas, impidiendo que la poblacin de patgenos se convierta en un problema.71

72

3. SERVICIOS REQUERIDOS3.1. Instituciones nacionales pueden dar servicio que Pruebas de viabilidad de esporas de hongos micorrzicos Evaluacin de la colonizacin de hongos micorrzicos en el sistema radical de las plantas inoculadas

El rea de Microbiologa de Suelos del Instituto de Recursos Naturales del Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrcolas (Montecillo, Estado de Mxico) tiene la infraestructura necesaria para desarrollar programas de servicio y asesora para las diferentes instancias productoras de plantas en vivero, as como instituciones gubernamentales, etc.

Para solicitar este tipo de servicios, acudir a: Dr. Ronald Ferrera-Cerrato rea de Microbiologa. Instituto de Recursos Naturales. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrcolas. Carretera Mxico-Texcoco km 35.5. Montecillo 56230, estado de Mxico. Tel-Fax: + 5 9520287 correo electrnico: ronaldfc@colpos.colpos.mx

3.2. Abastecimiento de inoculante previa programacinLa produccin de inoculante puede ser generada por sistemas de produccin con base a la programacin en la que se contemplen los futuros requerimientos de los viveros. Este proceso se realiza, por lo menos con seis meses con de anticipacin, y su calidad se verifica en funcin de la evaluacin de su efectividad en plantas indicadoras, as como de no llevar consigo microorganismos fitopatgenos.

3.3. Servicio de microbiolgica en inoculantes

evaluacin plantas e

La evaluacin de la calidad de los inoculantes comprende de manera general, las siguientes pruebas realizadas con base al seguimiento de los protocolos establecidos en el rea de Microbiologa: Microbiolgicas: pruebas de patogenicidad (bacterias y hongos), presencia de bacterias con diferente capacidad fisiolgica (fijacin de nitrgeno en vida libre, solubilizacin de fosfatos inorgnicos insolubles, capacidad antibitic