Manipulation of oil synthesis in Nannochloropsis strain NIES-2145 with a

phosphorus starvation–inducible promoter from Chlamydomonas

reinhardtiiMasako Iwai, KoichiHori, Yuko Sasaki - Sekimoto, Mie Shimojima and

Hiroyuki Ohta

Prima Fitria Hillman1420412010

Latar Belakang

Teknologi Biofuel Dari Mikroalga

Triasilgliserol(TAG)

Nutrien Stress

P Starvation

N Starvation

gen CrDGTT4

gen CrDGAT

Nannochloropsis

Ditentukan:1. Jumlah Total Lipid2. Jumlah neutral lipid3. Jenis Asam Lemak

Metodologi

Kondisi Kultur

Nannochloropsis sp

Medium f/2atau F2N

P starvation(tanpa pospat)

N stravation(Tanpa NaNO3

dan NH4Cl)

Standar

Analisis Diferensial Tingkat Ekspresi Gen

Tingkat ekspresi gen CrDGATdan gen SQD2

Tingkat ekspresi gen CrDGTT4

Nannochloropsis strain NIES-2145

Dikultur dalam medium standar,-N dan -P

Dikultur dalam medium standar,dan -P

quatitative real time PCR(q-PCR)

Konstruksi dan IdentifikasiCrDGTT4-overexpressing NIES-2145 Cell Lines

Dipotong dengan enzim restriksiEcoRV dan SpeI dengan

DNA Blunting Kit

Gen CrDGTT4 (pCrSQD2aDGTT4) yang mengandung

C.reinhardtiiSQD2 promoter region and mengkoding sequence dari

gen DGTT4

pMD-NT7 Dipotong dengan enzim restriksiEcoRV

Diklon ke dalam Dikembangkan dalam medium selektif

Level Overekspresi ditentukan dengan

qPCR

Ektraksi dan Pemisahan Lipid

Sel Nannochloropsis Dipanen denganSentrifugasi

Total Lipid diekstrak Dalam chloroform/methanol

Lipid dipisahkan Dengan two-dimensional thin-layer chromatography (TLC)

Lipid Divisualisasidi bawah sinar UV

Persiapan Fatty Acis Methyl Ester

Lipid Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 85oCdalam 5%(v/v)hydrogenchloride–methanol

FAME Diekstrak dengan hexan dan ditentukandengan GC

Kuantitatif : GC Kualitatif : GC-MS

SQD2 cDNA

RNADiekstrak dari medium standar

dan -P dengan metodaphenol/chloroform

Total RNA (500ng)

Digunakan untuk sintesis cDNAdengan oligo(dT)18 sebagai primer

dengan reverse transcriptase

Gen sekuens diklon kedalam vektor PMD20 untuk DNA sekuensing

Analisis Filogenetik

Asam Amino disekuens dengan MAFFTv7.220

Analisis Filogenetikdengan MEGA6

Analisis Motif

New PLACE (https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace), database of

cis-acting regulatory DNA elements from plants

menemukan binding motifs dari transcription factors

Hasil Pertumbuhan Sel

TAG Akumulasi

TAG Akumulasi Pada -P

Peningkatan Aktivitas PromotorHomolog SQDG dan SQD2 selama P starvation

Analisis Filogenetik

Ekspresi Gen SQD2 dengan q-PCR

Ekspresi Gen CrDGTT4 dengan q-PCR

Perubahan TAG Akumulasi Setelah Overexpresi

Analisis Komposisi Asam Lemak dari Total Lipid

Analisis Komposisi Asam Lemak dari Fraksi TAG

Analisis Kuantitatif Lipid

Analisis Kuantitatif Asam Lemak Pada Membran Lipid

Analisis Kuantitatif Asam Lemak 18:1 Pada Membran Lipid

Analisis Kuantitatif Asam Lemak 20:3 Pada Membran Lipid

Kesimpulan

Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa promotor SQD2 dari alga

hijau C. reinhardtii berguna sebagai promotor heterolog pada

Nannochloropsis strain NIES-2145. Hasil penelitian ini menunjukkan

bahwa ada sistem kontrol ekspresi umum dalam berbagai spesies

alga, termasuk mikroalga primer dan sekunder untuk adaptasi P

rendah. Hasil ini, bersama dengan terjadinya sintesis gen SQDG

diseluruh spesies alga. Ini juga menunjukkan bahwa promotor

SQD2 dari C. reinhardtii dapat diterapkan pada berbagai ganggang

sebagai upaya meningkatkan jumlah lipid sehingga lebih efisien

untuk produksi biodiesel dari mikroalga .

Daftar Pustaka

Masako Iwai, Koichi Hori, Yuko Sasaki -Sekimoto, Mie Shimojima and Hiroyuki Ohta. Manipulation of oil synthesis in Nannochloropsis strain NIES-2145 with a phosphorus starvation– inducible promoter from Chlamydomonas reinhardtii. 2015. Frontier In Microbiology Vol6(912):1-14