manipulación y determinación de estructuras de proteínas

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Manipulación y determinación de estructuras de proteínas. Curso de Bioquímica 2002 Dr. Enrique Rudiño-Piñera

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Manipulación y determinación de estructuras de proteínas. Curso de Bioquímica 2002 Dr. Enrique Rudiño-Piñera. 7606 Factores de estructura 1359 Archivos con restricciones de RMN 8965. ¿COMO DETECTAR LA POSICIÓN DE CADA ÁTOMO?. - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Manipulación y determinación de estructuras de proteínas.

Curso de Bioquímica 2002

Dr. Enrique Rudiño-Piñera

Page 2: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

7606 Factores de estructura1359 Archivos con restricciones de RMN8965

Page 3: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

¿COMO DETECTAR LA POSICIÓN DE CADA ÁTOMO?

Necesitamos medir una señal que detecte la posición de cada átomo individual (que interaccione con cada átomo)

debemos procesar la señal de la proteína completa y conseguir individualizar a partir de ella la posición de cada átomo

debemos tener una señal de suficiente intensidad para poder descifrarla y encontrar los detalles suficientes para lograr determinar la estructura

Page 4: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

MÉTODOS DE DETERMINACIÓNCristalografía Resonancia magnética nuclear

Necesidad de obtener cristales

para eso se necesita una preparación extremadamente pura y conformacionalmente homogénea

posibilidad de resolución atómica

Estructura en solución

menor cantidad de macromolécula

se interpretan los datos a partir de las posibles conformaciones (menos datos = mayor incertidumbre en los resultados)

Page 5: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Difracción de

Rayos X

Page 6: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Mapa inicialA

just

es a

utom

átic

os

Aju

stes

man

uale

s

Modelo final

Page 7: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

d

ONDAS ATRAVEZANDO UNA VENTANA

/d<<1

Page 8: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

DIFRACCIÓN DE ONDAS

d

/d>>1

Page 9: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

LA FUENTE

Page 10: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

RöntgenStrahlen

1895-Wilhem Röntgen tiene 50 años y es profesor de física, director del Instituto de Física y Rector de la Universidad de

Würtzburg.

*Experimenta en Rayos Catódicos, obtiene una donación de untubo de rayos catódicos de Lenard.*Su proyecto era: Encontrar radiaciones de alta frecuencia generadas junto a los rayos catódicos y predichas por von Helmholtz

Platinocianurode Bario

+1metro

Page 11: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas
Page 12: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Cómo se generan los rayos X:

ánodos rotatorios y sincrotrones

Espejos de rayos X

Ánodo rotatorio

Sincrotrón

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Page 15: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

EL OBJETO

Page 16: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

AceiteSemipermeable

Proteína 2LPrecipitante 2L

H2O

Page 17: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas
Page 18: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Un cristal se define por sus características físicas:a: Piezoelectricidadb: Cohesiónc: Difracción, etc.

Reloj de Cuarzo Lápiz Diamante

El orden a pequeña distancia induce orden a larga distancia

Page 19: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

¿Que pasa si cortas un cristal (en direcciones de cribado) ycada nuevo corte lo vez en el microscopio?

1X 5X 20X nX

Celda Unitaria

Page 20: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

3 magnitudes3 ángulos

ABC

Red 3D

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Page 22: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Nomenclatura simétrica

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Page 26: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

1AOL Triptasa

GrupoEspacial

P41

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1AOL Triptasa

GrupoEspacial

P41

4/4

3/4

2/4

1/4

0

Page 28: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

¡MOMENTO LO ESTOY CARGANDO!

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Page 34: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

a) one object d) two columns of objects, each as a)b) two objects, each as a) e) a two-dimensional lattice of objects, each as a)

c) four objects, each as a) f) as e), with larger separation between objects

Page 35: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Los cristales, después de

crecidos, deben colocarse en el has de rayos X

sin que se deterioren durante la medición

Page 36: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Los detalles del mapa de densidad,

que permiten ubicar cada átomo en su posición, son

el resultado de medidas de alta

resolución

Page 37: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

RESOLUCION

Resolución: Varia

Todos los mapas se calcularon con contornos a 1.

Page 38: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Aquí los datos son todos a 1.65 Å de resolución, pero los valores de

cambian de la siguiente manera:0.7 - 1.0 - 1.3 -1.6 y 2.1

0.7 1.0 1.3

1.6 2.1

Page 39: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

¿Qu₫ se sabe de los Rayos X de 1895 a 1912?

1. Se pueden polarizar.2. Existen los rayos X característicos.3.Según varios investigadores su esta entre 0.5 y 1.9A.4.Hay división entre: ¿onda o partícula?

Caf₫, Esquí, Físicos, Estudiantes de doctorado y Ocio

Difracción de rayos X

Page 40: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Universidad de MunichLab. de Röntgen Inst. de Física Teorica Inst. de Mineralogia

Est. Dr. Paul Knipping

Director SommerfeldInv. Max von Laue

Asociado W. FriedrichEst. Dr. Paul Ewald

Inv. P. von Groth

1. Laue discute con Ewald sobre la tesis de este último, Laueesta escribiendo un capitulo sobre ondas electromagn₫ticas para

la enciclopedia que edita Sommerfeld.2. Laue y Sommerfeld esquiando en los Alpes la vibración t₫rmicade los átomos produciría una red muy desordenada para difractar

los rayos X3. Laue, Sommerfeld, Knipping, Friedrich y von Groth en el caf₫

Lutz de Munich.

Page 41: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Placa Cristal Sulf. de Cobre

1er experimento Fte. Rayos X

Sulf. de Cobre2do experimento Fte. Rayos X

Cristal

Page 42: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Conclusiones:1. Los Rayos X tienen 1000 veces menor que la luz visible.

2. Los cristales son redes tridimensionales regulares.3. Laue explica el fenómeno derivando la difracción de 1D a 3D.

LaueRecibe el Nobel de Física de 1914,

lo recibe en 1920.

Page 43: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

2

¿Pueden los rayos X ser reflejados por los planos atómicos del cristal?

Page 44: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

d

d

= 2d sen

Sigue la analogía de la luz blanca sobre un espejo.

Page 45: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Pero podía medir , pero no conocía ni ni d!

1. Difractó cristales de NaCl, KCl, KBr y KI2. Uso el modelo de Pope y Barlow3. Midió la densidad del cristal de NaCl

= m/v ; v=m4. Ahora conocía el V de la celda Unitaria

si

en una celda cubica (d/)3 = V/3 entonces: d = V 1/3

y

Concluyo que = 1.10 A y que la distancia Na….Cl es 2.8A

= 2d sen

= 2V 1/3 sen

Page 46: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

¿Pero con que detector midió la difracción?

….paralelamente su padre invento el espectrómetrode ionización!!!!, y probo que la energía de los rayos X era

igual a la de los electrones usados en el tubo de rayos catódicos.

Juntos:1. analizaron los espectros de los rayos X generados por:Pt, Os, Ir, Pd, Rh, Cu, Ni, etc.2. Resolvieron la estructura de la fluorita (CaF2), la blenda(ZnS), la pirita (FeS2) y el Diamante (Cn).3. Prueban que los trabajos teóricos de Barlow y Fedorov sonreales.4. Reciben el premio Nobel de física en 1915.

Page 47: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

“La materia está constituida de partículas indivisibles denominadas átomos que pertenecen a un número finito de clases

distintas. En la realidad, solo existen los átomos y el vacío, lo demás es convención

1912-19501916- Debye y Scherrer descubren el m₫todo de polvos.1928-Kathleen Lonsdale resuelva la estructura del hexametilbenceno,Kekule descansa en paz.1934- Linus Pauling escribe “El enlace Químico.

…..y las macromoleculas? 1920-1 as evidencias de que las proteínascristalizan.

1949-Karle y Hauptman inventan los metodos directos (Nobel 1985).1950Žs-Perutz y Kendrew: Hemoglobina -Watson, Wilkins y Crick: ADN

Page 48: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Macromol₫cula Pura

Cristalizarla

Difractar

Determinar distancia entre planos

Calcular la celda

Encontrar el grupo espacial(Fedorow, Barlow y Schonflies)

Encontrar la fase(Metodos directos, MIR, MR, MAD) Construir un modelo

Ajustar el modelo

Pensar, pensar y pensar

Page 49: Manipulación y determinación de estructuras de proteínas

Resultado cristalográfico

Cómo traducirlo en

términos biológicos