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MALDI-TOF MS EN LA DETECCIÓN DE RESISTENCIAS BACTER IANAS Y ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS Dra. Mª Dolores Rojo Martín, Servicio de Microbiolo gía, Hospital Virgen de las Nieves, Granada Como se ha comentado en anteriores ponencias, MALDI-TOF tiene una importante
aplicación para la identificación bacterias y hongos en
los laboratorios de Microbiología, y está siendo
ampliamente usado por sus buenos aportes al
diagnóstico junto con razonables aspectos económicos.
El aporte de esta tecnología sería óptimo si nos
permitiera, al mismo tiempo, conocer la sensibilidad a los
antibióticos de los microorganismos que identifica. A
continuación vamos a ver en qué punto se encuentra
esta posible aplicación.
En la actualidad son preocupantes en los hospitales las infecciones por bacterias
multi-resistentes.
Para el control de la infección por estas bacterias, primero es necesario detectarlas y
conocer su perfil de resistencias para poder instaurar una antibioterapia dirigida y
adecuada. En segundo lugar, es importante conocer sus características
epidemiológicas para poner en marcha medidas de control específicas.
Para la detección de estas bacterias multi-resistentes los laboratorios de
Microbiología cuentan con métodos fenotípicos que necesitan normalmente unas 18 h
para disponer de resultados y no siempre tienen la sensibilidad y especificidad
Dra. Mª Dolores Rojo Martín
adecuadas para detectar determinados mecanismos de resistencia. Los métodos
genotípicos pueden acortar el tiempo de detección, y presentan una mayor
sensibilidad y especificidad; no obstante, esto último puede ser un problema, ya que
son necesarios primers específicos para cada enzima estudiada, lo cual incrementa la
complejidad técnica y el coste.
Para el control de estas infecciones, es importante la tipificación epidemiológica de
las cepas, siendo necesaria una metodología, que por su laboriosidad y coste, se
realiza normalmente en laboratorios de referencia.
Situados en este punto, es lógico preguntarse qué puede aportar en estos momentos
la tecnología MALDI-TOF ¿Puede ser una opción para afrontar estas necesidades en
la rutina de los laboratorios de Microbiología?
Investigación de resistencias con MALDI-TOF. Detecc ión de mecanismos basados en la degradación enzimática
Hasta el momento el campo en el que más se ha avanzado ha sido en la detección
de mecanismos de resistencia basados en la degradación enzimática del antibiótico.
En especial se ha avanzado en la detección de β-lactamasas.
Los antibióticos β -lactámicos tras
la hidrólisis por β -lactamasas del
anillo β-lactámico dan lugar a
productos de distinta masa (adición
de un residuo de H20, incremento en
la masa de 18 Da), además algunos
β -lactámicos son decarboxilados.
En los espectros (o huella proteica)
de la molécula original aparecen los
picos correspondientes al β-
lactámico y sus sales, mientras que en los espectros obtenidos tras incubar una
suspensión bacteriana con el
antibiótico (1-3 h), en caso de
hidrólisis, se producirá la desaparición
de los picos del β-lactámico o bien se
observarán los picos de los productos
de degradación.
La detección de carbapenemasas
de Enterobacterias, Pseudomonas
aeruginosa y Acinetobacter baumannii
por este sistema es un buen ejemplo
de aplicación.
En la mayoría de los estudios se utiliza la misma metodología: un cultivo bacteriano
es suspendido en un buffer y centrifugado (en algunos protocolos se obvia este paso y
se resuspende la colonia directamente en el buffer con ATB), el pellet resultante se
resuspende en otro buffer que contiene el β-lactámico, se incuba de 1-3 h, y la mezcla
de la reacción se centrifuga, siendo el sobrenadante, junto con la matriz apropiada,
analizado por MALDI-TOF. Los espectros con los picos del β-lactámico, sus sales
(usualmente de sodio) y/o sus productos de degradación son luego analizados
mediante un software adecuado, habitualmente suministrado por la casa comercial
PICOS DISTINTOS EN EL ESPECTRO (HUELLA PROTEICA)
BETA-LACTÁMICO
PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN (distinta masa molécula original)
Hidrólisis
Hidrólisis del meropenem
+ 18 Da
- 44 Da
383,4 Da
(Flex Analysis).
En 2011 se publicó uno de los primeros estudios para detectar carbapenemasas por
MALDI-TOF mediante la hidrólisis del meropenem en el que Hrabak et al. (1), probaron
distintas matrices y distintos buffers, obteniendo los mejores resultados con: DHB
(dihidroxibenzoico) y el buffer 20 mM Tris-HCl con una incubación de 3 h.
Posteriormente, estos mismos autores (2) aumentaron la especificidad del ensayo
modificando el buffer de reacción, suplementado con dodecil sulfato sódico 0,01%, que
reduce la cantidad de células bacterianas y disminuye tiempo de incubación a 2 h,
además mejora la visualización de los productos de degradación del meropenem.
El ensayo fue validado usando 145 cepas 100 productoras de carbapenemasas: P.
aeruginosa IMP-7 y VIM-2 y Enterobacterias (108) NDM-1, KPC-2, KPC-3, VIM-1,
OXA-48, OXA-162, y A. baumannii (2) NDM-1.
Los resultados fueron comparables al método de referencia (hidrólisis de imipenem
por espectrofotometria UV) con sensibilidad y especificidad del 100%.
Posteriormente, I. Burckhardt y S. Zimmermann (3) validaron un método similar para
detectar carbapenemasas en enterobacterias, pero utilizando ertapenem. Inicialmente,
caracterizan el espectro del ertapenem puro con cuatro picos: ertapenem (476 Da),
sales de Na (498 y 521 Da) y de ertapenem hidrolizado y decarboxilado (450 Da) por
Buffer con ATB
Incubación 35º C, 1-3 h
ANÁLISIS ESPECTROS
Centrifugación
Sobrenadante + matriz
MALDI-TOF
degradación espontánea. Validaron el ensayo con enterobacterias
Desaparición de los picos de ertapenem puro (476 Da) y sales de Na (498 y 521 Da) en las cepas productoras de carbapenemasa.
productoras de KPC-2, NDM-1, IMP y VIM. Observaron que el tiempo de degradación
fue diferente en función del tipo de enzima: NDM-1, IMP-1 (1 h), IMP-2, KPC-2, VIM-1
(1,5 h) y VIM-2 (2,5 h). También la sensibilidad y la especificidad fueron del 100 %.
Otros estudios han determinado la detección de carbapenemasas en A. baumannii
por hidrólisis de imipenem (4) utilizando una colección de 106 cepas de A. baumannii
(63 carbapenemasas y 43 no-carbapenemasas) así como 43 cepas de control (7
resistentes a carbapenem y 36 sensibles). También incluyeron 3 K. pneumoniae (KPC
y NDM-1) y 4 P. aeruginosa (VIM e IMP).
Imipenem (300 m/z), Producto de hidrólisis (254 m/z)
Se interpretó el resultado como positivo para la producción de carbapenemasas si el
pico específico para imipenem a 300 m/z desapareció durante el tiempo de incubación
o si el cociente entre el área bajo la curva del pico imipenem y de su producto de
degradación (254 m/z) fue < 0,5. Este ensayo, mostró una sensibilidad y una
especificidad del 100% y demostró su utilidad para la detección de OXA en A.
baumannii.
El grupo del Picazo, del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital Clínico San
Carlos, Madrid (5), desarrollaron un procedimiento para investigar carbapenemasas
con MALDI-TOF en especies de Acinetobacter caracterizados por secuenciación del
gen rpoB. Inicialmente establecieron el espectro característico del imipenem y tras
probar diferentes inóculos, concentraciones de imipenem, buffers y tiempos de
incubación, obtuvieron los mejores resultados con un inóculo de 2,5 x 1010 UFC/ml,
1mg/ml de imipenem, buffer ClNa 0,45%, Tris-HCl 20 mM, e incubación de 1 h, a 35º
C en agitación (500 rpm). Tras 1 h de incubación, todas las cepas productoras de
carbapenemasas tuvieron una reducción significativa de los picos en 300 y 489 Da. La
hidrólisis fue mayor en las que producían metalobetalactamasas (MBL) que en las que
producían OXA. Para distinguir el tipo de carbapenemasa hicieron un ensayo de
inhibición con dipicolínico, lo que les permitió diferenciar entre OXA y MBL.
ClNa 0,46%
Imipenem-cilastatina
Acinetobacter OXA-24
Acinetobacter IMP-8
El grupo de Sparbier (6) desarrolló un método para detectar diferentes antibióticos
(ampicillin, piperacillin, cefotaxima, ceftazidima, ertapenem, imipenem, meropenem) y
sus productos de degradación tras hidrólisis por β-lactamasas de Enterobacterias (E.
coli ATCC como control negativo, 5 E. coli productores de β-lactamasa, 2 K.
pneumoniae carbapnenemasa positiva y 1 negativa). Consiguieron identificar distintos
tipos de beta-lactamasas (BLEES, KPC), utilizando distintos inhibidores como ác.
clavulánico, tazobactam y ác. aminofenilborónico. Concluyeron que este tipo de
análisis es más fiable cuando se tiene en cuenta la desaparición de picos de la
molécula original y aparición de los picos correspondientes a los productos de
hidrólisis.
Experiencia del Hospital Virgen de las Nieves, Gran ada (7)
Detección de carbapenemasas por medio de hidrólisis de
ertapenem e identificación de MBL mediante un ensayo de
inhibición con EDTA. Se utilizaron 14 cepas productoras de
carbapenemasas (6 Enterobacterias: 2 IMP, 3 VIM 1 KPC; 8 P.
aeruginosa: 7 VIM y 1 IMP) y 49 cepas no productoras de
carbapenemasa, pero resistentes, al menos, a un carbapenem.
Espectro del ertapenem tras incubación con cepa E. coli ATCC 25922 y 3 cepas productoras de carbapenemasas
Se consideró que la cepa era productora de carbapenemasa cuando en el espectro
desaparecieron los siguientes picos moleculares: 476,5 Da [M + H]+, 498,5 Da [M +
Na]+, 520,5 Da [M + 2Na]+.
Cuando en la mezcla de reacción se incluyó EDTA, y la enzima presente fue una
MBL (IMP o VIM) se mantienen picos de la molécula de ertapenem. Se obtuvo una
concordancia del 100% al comparar los resultados de MALDI-TOF MS con la PCR.
Este método parece ser sencillo, rápido y fiable para distinguir en pocas horas las
diferentes clases de carbapenemasas, lo que puede ser muy útil para estudios
epidemiológicos o para establecer un tratamiento antibiótico específico.
Detección de beta-lactamasas a partir de hemocultiv os
Es otra aplicación de MALDI-TOF que puede tener un impacto positivo en el
tratamiento de los enfermos con bacteriemia. Varios autores han estudiado el tema
con excelentes resultados (6, 8-10). En el Hospital Virgen de las Nieves se ha
desarrollado un método (Hoyos Y, et al. J Microbiol Methods, en prensa) que se probó
con 20 cepas no productoras de carbapenemasas (10 P. aeruginosa y 10
Enterobacterias) y 19 productoras de carbapenemasa (11 Enterobacterias: 3 IMP, 4
VIM y 1 KPC, 3 OXA-48 y 8 P. aeruginosa: 7 VIM y 1 IMP)
Para cada cepa se inoculó un frasco BACTECTM Plus Aerobic/F con 10 mL sangre
fresca estéril y 1 mL suspension bacteriana (10-100 UFC) a partir de un cultivo de 18-
24 h. Los frascos fueron incubados en BACTEC 9240 hasta que fueron detectados
como positivos. En ese momento se tomaron 8 ml de sangre, y se hicieron una serie
de lisis y lavados con H20 estéril; el pellet resultante se utilizó para identificación y el
sobrenadante para ensayo de hidrólisis con ertapenem. Se consiguió una sensibilidad
del 100% y una especificidad del 90% (2 falsos positivos: E. coli y Enterobacter
cloacae AmpC+). En la Identificación bacteriana se obtuvo una buena concordancia
con la identificación a partir del subcultivo.
En conclusión, se trata de una técnica rápida (tiempo máximo 4,5 h) y fiable para
detectar carbapenemasas directamente de hemocultivos positivos, aunque sería
conveniente estudiar más cepas para confirmar la sensibilidad y la especificidad del
método.
Uso habitual de MALDI-TOF en los laboratorios de Mi crobiología Clínica para detectar carbapenemasas A la vista de los resultados expuestos se puede concluir que esta aplicación de
MALDI-TOF presenta una serie de ventajas:
− Es rápida, fiable y fácil de realizar.
− Bajo coste.
− Útil en situaciones de brotes (carbapenemasas ya identificadas).
− El principio de degradación enzimática puede ser aplicado a otros antibióticos.
Igualmente tiene limitaciones:
− No detecta otros mecanismos de resistencia que producen resistencia a
carbapenemes:
− Alteraciones de porinas y bombas de achique en K. pneumoniae y P.
aeruginosa.
− Alteraciones de PBP en A. baumannii
− Una baja expresión de las carbapenemasas puede dificultar su detección
Los medios que se necesitan para desarrollar esta aplicación son:
− Software adecuado (Flex Analysis, ClinProTools, Bruker Daltonik GmbH,
Germany)
− Uso de procedimientos validados: definir patrón de resistencia y sensibilidad.
− Habilidades para analizar e interpretar espectros: evaluación visual cualitativa.
− Y sería deseable disponer de un software que permitiera realizar
automáticamente la interpretación de los espectros. Con este objetivo Bruker ha
desarrollado el software MBT STAR-BL, que calcula automáticamente el logaritmo
del cociente entre la suma de las intensidades de los picos de las formas
hidrolizadas y la suma de las intensidades de los picos del antibiótico no
hidrolizado (logRQ). Los resultados aparecen como positivos o negativos en forma
de diagrama de cajas.
MALDI-TOF e investigación de otros mecanismos de re sistencia
Esta aplicación de MALDI-TOF se basa en la diferente huella proteica o espectro
(proteínas codificadas por los genes causantes de la resistencia) de microorganismos
portadores de determinados mecanismos de resistencia. Se ha utilizado con éxito en
algunos estudios, aunque, hasta ahora, se han realizado en laboratorios de
investigación, y por el momento, no están lo suficientemente optimizados y validados.
Con estos métodos se ha estudiado la capacidad de MALDI-TOF para detectar S.
aureus resistente a la meticilina (SARM), con resultados muy diferentes de un estudio
a otro. Uno de los primeros estudios se realizó por un grupo de la Universidad de
Manchester en el año 2000 (11). Utilizando células bacterianas intactas de siete cepas
SARM hospitalario, 7 de S. aureus sensible a la meticilina (SASM) y 6 de estafilococos
coagulasa negativa (ECN). Detectaron 6 picos específicos para SARM y 2 para SASM;
además observaron que SARM producía mayor número de picos que SASM, lo que
ayudaba a diferenciarlos. También encontraron diferencias entre especies en el grupo
de ECN.
Otros autores han tenido dificultades para diferenciar SASM y SARM con MALDI-
TOF. Un estudio consiguió detectar biomarcadores específicos que podrían diferenciar
SARM hospitalario del adquirido en la comunidad (distinto cassette cromosómico
mec), o detectar hVISA y VISA; sin embargo, no fue posible distinguir entre SASM y
SARM (12). En otro trabajo (13) se estudiaron dos cepas con el mismo origen
genético, una portadora de SCCmec (OXA-R) y la otra no (OXA-S), obteniendo
espectros virtualmente idénticos con MALDI-TOF; no obstante, observaron una
excelente reproducibilidad de espectros específicos para una determinada cepa a lo
largo del tiempo, lo que se podría utilizar para caracterizar clones de cepas de S.
aureus.
Viendo en conjunto estos estudios, la simple predicción de SARM a partir de los
perfiles de MALDI-TOF, por ahora, no parece posible. Probablemente las diferencias
en el perfil proteico entre SARM y SASM se deben a variaciones en los picos
relacionados con los diferentes linajes clonales.
Por otro lado, se ha utilizado con éxito en algunos estudios, la diferente huella
proteica (proteínas causantes de la resistencia) de microorganismos portadores de
determinados mecanismos de resistencia,. Camara et al. (14) detectaron un pico de 29
Kda específico de la β-lactamasa en E. coli resistente a la ampicilina; Griffin et al. (15),
consiguieron la detección de E. faecium portador del gen vanB, Cai et al. (16)
detectaron la pérdida de la porina OMpK36 de Klebsiella pneumoniae causante de
resistencia a carbapenemes y Wybo et al. (17) diferenciaron Bacteroides fragilis
portador del gen cfiA que codifica una MBL. La reproducibilidad de estos hallazgos no
ha sido comprobada, hasta el momento, por otros laboratorios.
Otra aplicación de MALDI-TOF para detectar resistencias se acerca más a los
métodos fenotípicos y se basa en la detección del CMCP (Concentración mínima que
produce un cambio en el perfil). Se ha utilizado con buenos resultados para detectar
resistencia de hongos y levaduras a antifúngicos (18-20).
Muy recientemente, se ha desarrollado un nuevo método de detección de
resistencias con MALDI-TOF tras utilización de medios de cultivo marcados con
isótopos estables (21). Se basa en que en presencia de antibióticos solo los
microorganismos resistentes son capaces de crecer y sintetizar proteínas,
incorporando los aminoácidos marcados del medio, lo que incrementa la masa de las
proteínas sintetizadas, produciéndose un cambio en el espectro con respecto a los
microorganismos sensibles.
Aplicación de MALDI-TOF en estudios epidemiológicos
El uso de MALDI-TOF para estudios epidemiológicos, aunque está en una fase más
inicial que los estudios de resistencia y limitado generalmente a laboratorios de
investigación, se basa en su capacidad para discriminar entre cepas estrechamente
relacionadas. En el espectro de una determinada cepa encontramos:
− Picos característicos de género o de especie (perfil primario)
− Picos más variables dentro de la especie (perfil secundario), cuya similitud
podría ser paralela a la proximidad genética de los microorganismos.
Esto permitiría establecer niveles de proximidad entre los aislados bacterianos
equiparables a los que se establecen actualmente mediante diferentes técnicas
génicas (REP-PCR, PFGE, etc.), pero de manera más rápida y económica; no
obstante, se trata de un área en la que casi todo se mueve aun en el terreno de la
hipótesis, ya que hay pocos estudios contrastados que lo avalen.
Metodología
En primer lugar hay que crear una base de datos con los espectros de las cepas a
estudiar y posteriormente analizar la similitud de los espectros obtenidos mediante
software (ClinProTools, flex Analysis). Se puede hacer un análisis PCA (Principal
Component Analysis) que proporciona información sobre la hetero / homogeneidad de
un juego de datos (espectros); el resultado se puede ver como diagramas de
puntuación y carga o como dendrogramas de agrupación. La matriz CCI (Composite
Correlation Index) puede emplearse para el análisis estadístico de las relaciones entre
espectros.
La aplicación de MALDI-TOF para tipificar microorganismos y caracterización de
brotes se ha utilizado con éxito en bastantes estudios con resultados comparables a
los métodos moleculares de referencia :
A modo de resumen, se puede afirmar que, en general, la aplicación de MALDI-TOF
en epidemiología tiene buena correlación con técnicas moleculares, siendo una
herramienta potencial para detectar en tiempo real brotes de infecciones
nosocomiales, aunque no existe actualmente un procedimiento uniforme de tipificación
de cepas por espectrometría de masas, siendo necesario desarrollar protocolos
adaptados a cada tipo de cepa estudiada y que tengan en cuenta una serie de
variables: tiempo de incubación, de almacenamiento, calidad de los espectros, y otros
aspectos
Conclusiones
− MALDI-TOF MS es una herramienta prometedora para los laboratorios clínicos de
Microbiología, no solo para la identificación de microorganismos, sino para aportar
de manera rápida y fiable información sobre su perfil de resistencias y
características epidemiológicas, lo cual afianza el papel de la Microbiología el
campo del diagnóstico y control de la infección; no obstante, es necesario
desarrollar procedimientos de trabajo validados que permitan incluir esta
tecnología en el flujo de trabajo de nuestros laboratorios.
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