Les outils non génétiques de diagnostic pour les Maladies Rares

Roseline Froissart

Laboratoire des Maladies Héréditaires du Métabolisme

et Dépistage Néonatal

Centre de Biologie Est

Hospices Civils de Lyon

Bron

24 Octobre 2012

Maladies rares

• Difficultés du diagnostic

– Extrême diversité des maladies

– Hétérogénéité pour une même maladie • Expression à tout âge (anténatal / adulte)

– Complexité

• Approche multidisciplinaire (expertise)

– Clinique

– Anatomopathologique

– Biochimique

– Génétique

Les différentes étapes d’une analyse

Demande d’analyse

avec données cliniques Prélèvement

(respect des conditions)

Envoi au laboratoire (délai

de transport)

Réception et identification

Préanalytique

(centrifugation, isolement des leucocytes, stockage)

Analyse Contrôle de qualité

(interne, +/- externe)

Recueil des résultats

Interprétation

Compte-rendu écrit

Réponse du biologiste

Diversité des prélèvements

• Sang (sérum, leucocytes, lymphocytes…)

• Urines

• LCR

• Biopsie organe (muscle, foie..)

• Biopsie de peau (culture de cellules, microscopie électronique…)

• Villosités choriales, cellules amniotiques (diagnostic prénatal)

– Sang foetal

• Sang séché sur papier buvard (Guthrie)

Le prélèvement de Guthrie

Prélèvement de sang déposé sur buvard: Au talon pour dépistage néonatal systématique à J3 Au bout du doigt Sang veineux (prise de sang) déposé sur papier

Après séchage, transport à température ambiante

Excellente conservation (métabolites, enzymes, protéines…)

Utilisation d’un spot de 3mm de diamètre (environ 2,5µl sang total)

Méthodes de diagnostic

Analyses « de routine »: orientation

• Glycémie, corps cétoniques, ammoniémie, acide lactique, cholestérol, triglycérides, acide urique, enzymes hépatiques, CPK, LDH…..

Bien réalisé peut orienter vers un type de pathologie

• Numération/Formule sanguine, frottis sanguin (cellules de surcharge …)

Examen anatomopathologique • Etude morphologique

• Batterie standard de colorations

• Techniques spéciales: enzymo-histochimiques (enzymes) et immuno-histochimique (antigènes), en fonction renseignements cliniques et hypothèses diagnostiques

• Orientation ou diagnostic

Podocytes, HE, x600 Dr R. Bouvier, Lyon

Déficit enzymatique dans une voie métabolique

7

GENES G1 G2 G3

ENZYMES E1 E3 E2

METABOLITES A B C D

Déficit enzymatique dans une voie métabolique

8

GENES G1 G2 G3

ENZYMES E1 E3 E2

METABOLITES A B C D

Accumulation Déficit

Méthodes de diagnostic

Métabolites:

Anomalie: reflet déficit enzymatique ou transporteur

• Urines, plasma, LCR…

• Qualitatif: examen d’orientation

chromatographie couche mince

électrophorèse……

OLIGOSACCHARIDES (urines) Chromatographie couche mince

Mucopolysaccharidose type I

11

MPS IV

MPS I

MPS III

Profil normal

Profil normal

Malade

Malade traité

HS

KS

CS

DS

MPS III

Exploration biochimique par

méthode globale : profil des

mucopolysaccharides

urinaires (électrophorèse,

colorimétrie)

Mucopolysaccharidose de type I :

maladie de surcharge lysosomale

liée à un déficit en -L-

iduronidase, transmission

autosomique récessive

Traitement : perfusion d’enzyme

produite par génie génétique

Méthodes de diagnostic

Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur

• Urines, plasma, LCR

• Qualitatif: examen d’orientation

chromatographie couche mince, électrophorèse…

• Quantitatif: méthodes complexes

– Spectrométrie de masse en tandem MS/MS (acides aminés, acylcarnitines, hormones…..)

– Spectrométrie de masse couplée à la chromatographie gazeuse : GC-MS (acides organiques…)

Analyse protéique

Etude génétique souvent dans un 2° temps (si test biochimique fiable)

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Implantation dans les laboratoires de diagnostic depuis environ 20 ans

• Séparation très fine d’un grand nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés (étalon interne du composé à doser, marqué par isotope stable)

• Injection directe ou étape de séparation (chromatographie liquide)

• Composition: source d’ionisation / 2 quadripôles en série / détecteur

Principe MS/MS

– Principe: séparation des molécules (préalablement ionisées) en

fonction de leur rapport masse/charge (m/z)

– Source Electrospray (ESI): ionisation à pression atmosphérique

des métabolites à analyser, mode positif [M+H]+ ou négatif [M-H]-

– Triple quadripôle

• Q1 détermine le poids moléculaires des ions (ions parents)

• Q2 est une chambre de collision : fragmentation des ions

• Q3 analyse les fragments produits par Q2 (ions fragments)

– Détecteur : multiplicateur d’électrons

Q3 D ES

I

Q1 Q2

Source

d’ionisation

Echantillon

m/z

Ab

on

da

nce

Analyseur Détecteur

*

* * * * *

C0

C2

C8

C10:1

* *

déficit en MCAD (beta-oxydation des acides gras à chaîne moyenne)

* * *

*

* *

Control *

* * * *

*

C0

C2

* *

C3 C4 C5

C6

15

*Étalons internes (acylcarnitines deutérées)

MS/MS

Avantages: – Spécificité

– Grande sensibilité

– Grande variété des applications (sur un même appareil)

– Multiplex: dosage simultané de nombreux composés

– Analyse de nombreuses molécules sur faible volume d’échantillon (ex: quelques µl de sérum, tache de sang…)

– Temps d’analyse court (2’ au lieu de 2h pour Phénylalanine): de nombreux pays l’ont adopté pour le dépistage néonatal

– Ex: acides aminés: 15’ pour identifier 76 composés (avant: 2h30 avec moins de composés)

– Ex: Profil des acylcarnitines: 30 maladies testées en 3’ (temps machine)

MS/MS

Limites:

– Composés ionisables

– Séparation préalable indispensable si composés isomasses

– Étapes préparatives de l’échantillon (extraction, purification…), assez longues

– Coût: investissement important >200.000 euros mais coût des réactifs faible

– Personnel qualifié: technicien spécialisé et interprétation des données nécessitant un niveau d’expertise élevé

– Ingénieur nécessaire (appareillage sophistiqué)

Méthodes de diagnostic

Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur

• Urines, plasma, LCR

• Qualitatif: examen d’orientation

chromatographie couche mince, électrophorèse…

• Quantitatif: méthodes complexes

Analyse protéique

• Cellules sanguines, cultivées, tissus, plasma…

• Western blot: CDG, protéines musculaires…

• Etude enzymatique (activité): MS/MS (multiplex), fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif…

Etude génétique souvent dans un 2° temps

Western blot • Principe: séparation des protéines par électrophorèse + Immunodétection =

séparation en fonction du poids moléculaire

• Intérêt pour protéines non enzymatiques

• Analyse qualitative et quantitative

• Ex: CDG (Carbohydrate Deficient Glycoprotein):

= anomalies de glycosylation des glycoprotéines

• Diagnostic de certaines myopathies Ex: dystrophine (taille, quantité)

• Limites: peut être normal

80 kDa

77 kDa

74 kDa

N CDG I CDG II

Western Blot (transferrine)

Etudes enzymatiques • Utilisation substrat spécifique:

– fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif

– MS/MS (multiplex)

• Recherche déficit

• Activité résiduelle: seuil?

– Il peut être difficile de différencier un malade et un hétérozygote (non atteint): rare

• Enzyme non mesurable (activité trop faible)

• Enzyme exprimée dans un seul tissu (ex: foie, rein, cerveau…)

• Pseudodéficits (variants non pathologiques)

• Déficits multiples (sulfatases)

• Déficits protéines activatrices

• Tissu ou cellules fraîches parfois nécessaires

Contrôle de qualité/ Validation

• Interne (échantillon normal, pathologique, étalon interne)

• Externe (ERNDIM….)

• Validation de méthode

– Chaque labo valide sa méthode (protocole peut être variable d’un labo à l’autre)

– Valeurs usuelles (parfois fonction de l’âge)

– Connaître les limites de chaque test (faux positifs et faux négatifs)

Expertise

• Un résultat normal exclut-il le diagnostic?

• Un résultat anormal affirme t’il le diagnostic?

• Confrontation à la clinique

• Si conclusion impossible:

– Nouveau prélèvement

– Analyse complémentaire: autre méthode biochimique, étude génétique

• Pas d’intérêt à multiplier les labos

– Surtout important pour des maladies rares!

– Plusieurs biologistes doivent être formés

Pourquoi est ce parfois si long?

• Sauf urgence+++ si urgence vitale et si maladie traitable (étude métabolites)

• Analyses très spécialisées • Techniques manuelles chronophages • Analyses regroupées pour raisons économiques (séries) • Analyses faites à fréquence variable • Faites par peu de laboratoires

– (ex: sulfite oxydase: 2 laboratoires dans le monde)

• Vérification parfois nécessaire • Autre technique requise • Temps de culture

Risques de passer à côté du diagnostic?

• Qualité du prélèvement – Conservation (enzymes+++) – Ex: urines: lactates d’or bactérienne ou endogène – Labilité du composé (ex: sulfocystéine, homocystéine…)

• Moment du prélèvement – Normalisation biochimique peut exister entre les crises (AA, AO, cycle de

l’urée…): prélever au moment accès aigu ex: déficit beta-oxydation des acides gras, cycle de l’urée (OCT)

– Intérêt de prélèvement avant toute mesure thérapeutique (quand une maladie métabolique est suspectée)

• Formes tardives et frustes: dialogue avec le clinicien +++ – Ex: acidémie glutarique – Déficit enzymatique partiel – Profils atypiques

• Nécessité d’une expertise pour chaque test et pour un diagnostic dans son ensemble (réseaux nationaux)

Conclusions

• Les résultats doivent être interprétés par le biologiste

• Garder l’expertise biochimique même pour les maladies très rares

• Etude génétique: permet de confirmer ou est nécessaire au diagnostic

• Utilité des tests biochimiques +++ pour confirmer les résultats des explorations génétiques (séquençage haut débit)

• Techniques récentes mais coûteuses et d’interprétation difficile (non disponible en labo de diagnostic): – Spectro RMN in vitro (nouvelles maladies identifiées)

– MALDI/TOF

• Identification de nouveaux biomarqueurs (« omique »)