MAKALAH

SEMESTER PENDEK

ISOLASI DNA KROMOSOM DARI BAKTERI

DI SUSUN OLEH :

KELOMPOK III (3)

Abdul Lathief (0811015155)

Noor Dwi Yunitasari (0913015051)

UP.FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MULAWARMAN

SAMARINDA

2013

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan

berkah, rahmat, dan limpahan karuniaNya lah kami selaku tim penulis dapat

menyelesaikan makalah ini.

Makalah ini dibuat dalam rangka untuk memberikan informasi tambahan

mengenai Isolasi DNA kromosom dari bakteri. Penulis menyadari bahwa didalam

pembuatan makalah ini masih jauh dari kesempurnaan baik materi maupun cara

penulisannya.

Namun demikian penulis telah berupaya dengan segala kemampuan dan

pengetahuan yang dimiliki sehingga dapat menyelesaikan makalah dengan baik dan

oleh karenanya, penulis dengan rendah hati dan dengan tangan terbuka menerima

saran, masukan dan usul demi penyempurnaan makalah ini.

Akhirnya penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi seluruh

pembaca.

Samarinda, Juli 2013

Penulis

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara

ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan

protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan

tidak berasosiasi dengan protein histon. Kemudian kromosom merupakan struktur di

dalam sel  berupa deret panjang  molekul  yang terdiri dari  satu  molekul  DNA dan

berbagai  protein terkait yang merupakan  informasi genetik  suatu  organisme.

Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri

umumnya berbentuk sirkular atau lingkaran. Disamping memiliki kromosom.

Beberapa bakteri mempunyai ektra-kromosomal DNA yang bentuknya juga sirkular

namun ukuranya jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan ukuran kromosom

aslinya. Plasmid dapat mereplikasi sendiri. Jumlah, bentuk, dan ukuran plasmid antar

bakteri berbeda antara satu dengan yang lainya, bahkan antar sel dalam satu spesies

bakteri.

Isolasi plasmid bisa dilakukan dengan menggunakan metode minipreparasi alkali

lisis. Metode ini menggunakan dasar bahwa plasmid mempunyai ukuran yang kecil

dan bentuknya melingkar kuat, sedangkan kromosom ukuranya lebih besar dan

bentuknya kurang melingkar kuat. Dari hal ini memungkinkan pemilihan secara

selektif dengan menggunakan presipitasi. Plasmid penting untuk diisolasi, hal ini

untuk karakteristik beberapa bakteri.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan kromosom ?

2. Bagaimana Prinsip DNA kromosom ?

3. Bagaimana metode dalam DNA kromosom bakteri?

1.3 Tujuan

1. Mengetahui pengertian kromosom.

2. Mengetahui prinsip DNA kromosom.

3. Mengetahui metode dalam DNA kromosom bakteri.

BAB II

ISI

2.1 Isolasi DNA Kromosom Dari Bakteri

2.1.1.      Pengertian Kromosom

Kromosom (bahasa Yunani: chroma, warna; dan soma, badan) merupakan

struktur di dalam sel  berupa deret panjang  molekul  yang terdiri dari  satu  molekul 

DNA dan berbagai  protein terkait yang merupakan  informasi genetik  suatu

organisme.

Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris:

deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul

utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak

di dalam inti sel.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara

ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan

protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan

tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal

ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari

kedua orangtua.

Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi

genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku

umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa

jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human

Immunodeficiency Virus).

Gambar 1. Struktur DNA

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur

DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,

sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. DNA

memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-

komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.

Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan

pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur

cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang

memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan

terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin

maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun

(building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang

basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi

genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.

Rantai DNA memiliki lebar 22-24 Å, sementara panjang satu unit nukleotida

3,3 Å. Walaupun unit monomer ini sangatlah kecil, DNA dapat memiliki jutaan

nukleotida yang terangkai seperti rantai. Misalnya, kromosom terbesar pada manusia

terdiri atas 220 juta nukleotida.

Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin

dengan timin dan guanin dengan sitosin) yang membentuk DNA beruntai

ganda.Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-

seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2-deoksiribosa.

Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom

karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah

satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah

ribosa.

 DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda.

Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan

dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-

masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen,

yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks

ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada

kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenin

(dilambangkan A), sitosin (C, dari cytosine), guanin (G), dan timin (T). Adenin

berikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanin berikatan dengan sitosin.

2.1.2.      Bakteri

Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa

dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan

uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa

nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.

Struktur sel mereka dijelaskan lebih lanjut dalam artikel mengenai prokariota, karena

bakteri merupakan prokariota, untuk membedakan mereka dengan organisme yang

memiliki sel lebih kompleks, disebut eukariota. Istilah "bakteri" telah diterapkan

untuk semua prokariota atau untuk kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan

mengenai hubungan mereka.

Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka

tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme

lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya

hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam

diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan

dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang

bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela

kelompok lain.

Seperti prokariota (organisme yang tidak memiliki selaput inti) pada

umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur

bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi

dua kelompok yaitu Gram positif dan Gram negatif didasarkan pada perbedaan

struktur dinging sel. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas

lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic. Sementara bakteri Gram negatif

memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan

peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran

sitoplasmik).

Banyak bakteri memiliki struktur di luar sel lainnya seperti flagela dan fimbria

yang digunakan untuk bergerak, melekat dan konjugasi. Beberapa bakteri juga

memiliki kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu

permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan

beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.

Beberapa bakteri mampu membentuk endospora yang membuat mereka

mampu bertahan hidup pada lingkungan ekstrim.

2.2. Prinsip DNA Kromosom

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari

komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise,

atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk

membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang

berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA),

sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu

90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA

kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

2.3.      Isolasi DNA Bakeri

Isolasi DNA kromosom bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan

dan pembuanagn dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA

dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan

pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau

sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara

sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan

kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian

dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil

isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak

mengalami fragmentasi.

2.3.1 Metode Alkali Lysis

Metode isolasi alkali lysis berstandar pada sifat DNA kromosom bakteri.

Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam tahap, yakni tahap

kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap lisis sel dan

denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap pemekatan DNA.

1. Kultivasi dan pemanenan sel

Prosedur isolasi diawali dengan kultivasi bakteri yang mengandung plasmid

yang akan diisolasi. Untuk inang Escherichia coli, umumnya bakteri dikultur selama

12-18 jam pada media Luria-Bertani broth. Pada umur tersebut, pertumbuhan bakteri

masih berada dalam fase eksponensial. Pemanenan pada jam tesebut bertujuan untuk

memperoleh jumlah sel yang memadai sebagai sumber plasmid. Pemanenan sel

dilakukan dengan sentrifugasi. Gaya sentrifugal yang ada akan memisahkan massa sel

bakteri yang berbentuk padat dari cairan media pertumbuhan. Massa sel akan

terendapkan pada dasar tabung sebagai pelet. Untuk memperoleh DNA plasmid

dalam jumlah yang tinggi, kultur bakteri yang digunakan dalam isolasi plasmid

haruslah yang berada dalam fase logaritmik akhir atau awal fase stasioner.

Sentrifugasi untuk pemanenan sel bakteri

2. Resuspensi sel

Pelet sel kemudian diresuspensikan dalam larutan yang mengandung Tris-

EDTA dan glukosa. Larutan ini umumnya dikenal sebagai larutan atau solution I.

EDTA dalam larutan I berfungsi mengkhelat (mengikat) kation-kation divalen seperti

Mg2+ dan Ca2+. Kedua ion ini berfungsi sebagai kofaktor yang esensial bagi

aktivitas Dnase dalam mencacah molekul DNA. Selain itu, ion Mg dan Ca diketahui

berperan penting dalam memelihara integritas dan kestabilan membran plasma

bakteri sehingga kerja EDTA juga berfungsi membantu destabilisasi membran.

Glukosa berfungsi menjaga tekanan osmotik sel agar tidak pecah. Keutuhan sel pada

tahap ini penting untuk tetap terpelihara, Dnase yang ada di dalam sel tidak bertemu

dengan DNA plasmid yang akan diisolasi. Penelitian Qiagen menyimpulkan tanpa

glukosa pun, metode alkalin lisis dapat bekerja dengan baik dalam mengisolasi

plasmid.

3. Lisis sel dan Denaturasi DNA

Tahap selanjutnya lisis sel dan denaturasi DNA dengan pemberian larutan II

yang terdiri dari SDS dan NaOH. SDS merupakan garam deterjen anionik, yang

ketika dilarutkan dalam air akan berdisosiasi menjadi ion Na+ dan dan dodesil sulfat.

Dodesil sulfat adalah molekul deterjen berantai hidrofobik panjang dengan gugus

sulfat bermuatan negatif pada salah satu ujungnya. Dodesil sulfat akan berikatan

dengan bagian interior lipid bilayer pada membran sehingga mengakibatkan lisis sel.

Komponen selular bakteri termasuk DNA dan RNA akan keluar dan larut dalam. Ion

deterjen dodesil sulfat juga mendenaturasi protein yang ada dalam lisat, dengan jalan

memutuskan ikatan-katan non kovalen (terutama ikatan hidrogen) pada protein,

sehingga kembali ke struktur primernya, sebagai rantai linier polipeptida. Hal ini

membuat protein-protein enzim kehilangan aktivitas enzimatiknya , termasuk enzim

Dnase yang dikhawatirkan merusak DNA plasmid. Pada tahap ini larutan akan berisi

asam nukleat (DNA dan RNA) dan debris sel yang terdapat dalam kompleks dodesil

sulfat-lipid-protein.

Sementara itu, NaOH yang bersifat basa membuat seluruh molekul DNA

berutas ganda baik DNA kromosomal maupun plasmid mengalami denaturasi

menjadi utas-utas tunggal. Itulah mengapa metode ini disebut sebagai metode lisis

basa (alkaline lysis). Pada tahapan ini, DNA kromosomal terpisah sempurna menjadi

utas-utas tunggal terpisah; sedangkan utas tunggal plasmid yang berbentuk lingkaran

tetap terhubung, seperti dua cincin yang saling bertautan. Karakter ukuran dan

struktur kedua jenis DNA inilah yang menjadi dasar pemisahan DNA plasmid dari

DNA kromosomal.

Sodium dodesil sulfat (SDS)

NaOH (sodium hidroksida)

4. Netralisasi

Tahap selanjutnya adalah netralisasi dengan penambahan larutan III sodium

asetat pH ~5,5. Ion K+ bebas yang berasal dari potasium asetat pada larutan III akan

menetralkan muatan negatif dari kompleks kompleks dodesil sulfat-lipid-protein

terdenaturasi, membentuk potasium dodesil sulfat (KDS) yang tidak larut dan

terpresipitasi bersama lipid membran dan protein yang terdenaturasi. Laju presipitasi

KDS dapat ditingkatkan dengan inkubasi pada suhu es (4oC).

Larutan III adalah sodium asetat yang diatur pHnya ke 5,5 menggunakan asam

asetat. Asam asetat berfungsi menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh ion

hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap lisis sebelumnya. Ketika pH larutan

kembali netral, ikatan-ikatan hidrogen antar basa utas tunggal DNA terbentuk

kembali, sehingga molekul tersebut dapat berenaturasi menjadi DNA berutas ganda.

Proses renaturasi inilah yang menjadi tahap seleksi bagi plasmid. Utas-utas tunggal

sirkular DNA plasmid yang yang berukuran kecil dan tetap saling bertautan dapat

berenaturasi sempurna membentuk utas ganda yang tetap berada dalam larutan;

sedangkan DNA kromosomal yang berukuran jauh lebih besar dari plasmid tidak

dapat berenaturasi sempurna, membentuk struktur kusut tak beraturan yang

terperangkap dan ikut terpresipitasi bersama kompleks KDS-lipid-protein. Oleh

karena itu, pencampuran pada tahap lisis sel harus dilakukan dengan perlahan.

Pengocokan yang kuat (misalnya vortex) akan mengakibatkan molekul DNA

kromosom akan terpotong menjadi fragmen-fragmen yang kecil yang dapat ikut

berenaturasi seperti halnya DNA plasmid, dan mengkontaminasi DNA plasmid.

5. Purifikasi

Purifikasi bertujuan untuk membersihkan isolat dari kontaminasi bahan selain

DNA. Pada tahap ini, kontaminan yang umum terdapat dalam larutan adalah protein

dan komponen buffer yang digunakan dalam tahap sebelumnya seperti garam

potasium asetat, SDS, dan EDTA. Terdapat berbagai metode purifikasi DNA hasil

ekstraksi. Salah satu metode tradisional yang efektif dan relatif murah untuk

purifikasi DNA plasmid adalah metode ekstraksi fenol-kloroform. Campuran pelarut

organik ini secara signifikan dapat mendenaturasi protein dan melarutkan komponen

lipid. Jumlah fenol-kloroform yang ditambahkan umumnya satu kali volume larutan

yang akan dipurifikasi. Umumnya fenol-kloroform disiapkan dalam bentuk campuran

fenol-kloroform-isoamil alkohol dengan perbandingan volume 25:24:1. Campuran

fenol-kloroform adalah campuran yang homogen. Fenol-kloroform dan air tidak

dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua fase yakni fase air (fase aqueous) dan fase

fenol-kloroform. Fenol-kloroform lebih ‘berat’ daripada air sehingga fasenya berada

di bawah fase air. Kedua fase kemudian dicampur dengan cara vorteks. Pencampuran

akan membuat fenol merangsek ke dalam lapisan air dan membentuk emulsi droplet.

Protein akan terdenaturasi dan terperangkap dalam fase fenol-kloroform, sedangkan

DNA tetap berada di air. Kedua fase kemudian dapat dipisahkan dengan baik dengan

sentrifugasi. Fase atas yang berisi DNA akan dapat dengan mudah diambil dengan

pemipetan, dan fase fenol-kloroform dapat dibuang.

Polaritas fenol dan air (sumber: bitesizebio.com)

Prinsip purifikasi DNA dengan ekstraksi fenol-kloroform:

Air adalah pelarut yang sangat polar, sedangkan fenol bersifat kurang polar

dibandingkan dengan air. DNA adalah molekul polar yang disebabkan oleh adanya

gugus-gugus fosfat dalam kerangkanya. Hal ini membuat DNA sangat larut dalam air

dan kurang larut dalam fenol. Ketika isolat DNA yang larut dalam air dicampurkan

dengan fenol, DNA tidak akan larut dalam fenol, namun tetap berada dalam fase air.

Protein memiliki sifat yang berbeda dari DNA. Protein adalah polimer rantai panjang

polipeptida yang tersusun atas berbagai macam asam amino. Asam amino ada yang

bersifat polar (seperti glutamat, lisin dan histidin) karena memiliki residu yang

bermuatan, dan ada juga asam amino yang non polar (seperti fenilalanin, leusin dan

triptofan) akibat residunya yang tak bermuatan. Dalam lingkungan berpelarut air,

rantai polipeptida melipat sedemikian rupa sehingga residu-residu asam amino yang

kurang polar daripada air akan berada di sisi dalam protein (jauh dari air), sedangkan

rantai samping asam amino yang polar akan tertata pada sisi luar protein, berikatan

dengan air. Dengan kata lain residu-residu asam amino yang polar bersifat hidrofilik

(“suka air”), dan yang non polar bersifat hidrofobik (“takut air”). Maka, ketika

dicampurkan dengan fenol, protein terekspos dengan pelarut yang kurang polar,

sehingga pola pelipatannya protein berubah. Pada dasarnya dalam kondisi tersebut

residu-residu asam amino dari protein akan bertukar tempat. Residu yang kurang

polar yang tadinya tersembunyi di sisi dalam protein ketika berada dalam pelarut air,

kini mendesak menuju ke sisi luar untuk berinteraksi dengan pelarut fenol.

Sebaliknya, residu-residu asam amino yang polar akan terselip ke sisi dalam protein,

berlindung dari fenol. Dalam waktu singkat, protein mengalami denaturasi akibat

perubahan pola pelipatannya. Residu non polar yang kini berada di sisi luar protein

yang terdenaturasi membuat protein tersebut lebih larut di dalam fenol daripada di

dalam air. Hal inilah yang mendasari proses pemisahan DNA dari protein dalam

metode ekstraksi fenol. Protein akan terpisah di fase fenol, sedangkan molekul DNA

yang polar tetap berada pada fase air.

Mode aksi ekstraksi protein oleh fenol (sumber: bitesizebio.com)

6. Pemekatan DNA

Pemekatan DNA bertujuan memisahkan DNA dari larutan sehingga

diperoleh konsentrasi yang lebih tinggi. Cara sederhana dan murah untuk

memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi etanol. Prosedur

dasarnya adalah etanol absolut ditambahkan ke larutan DNA. Proses presipitasi

etanol umumnya dapat dibantu dengan penambahan garam. Setelah perlakuan itu,

DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya

pelet DNA dicuci dengan etanol 70%. Kemudian pelet dikeringkan dan setelah itu

dilarutkan kembali ke dalam air atau buffer tris EDTA (TE). Berikut sekelumit

penjelasan mengenai mekanisme presipitasi etanol.

Ekstraksi fenol-kloroform dan presipitasi etanol (sumber: wikipedia.org)

Sebagai pelarut polar, molekul air memiliki muatan negatif parsial di sekitar

atom oksigennya, dan muatan positif parsial di sekitar atom hidrogennya. Oleh karena

itu DNA yang bermuatan negatif dapat berinteraksi dengan molekul air, dan larut di

dalamnya. Garam berfungsi untuk menetralkan muatan pada kerangka gula fosfat.

Garam yang umum dipakai adalah sodium asetat. Selain sodium asetat 0,3 M, sodium

klorida 0,3 M dan amonium asetat 2,5 M juga dapat digunakan sebagai garam

alternatif. Dalam larutan, sodium asetat terdisosiasi menjadi ion sodium (Na+) dan

ion [CH3COO]-. Kation monovalen dalam hal ini ion (Na+) sodium akan

menetralkan muatan negatif pada gugus fosfat (PO43-) DNA, sehingga membuat

molekulnya kurang larut dalam air.

Namun demikian penambahan garam saja tidak serta merta menyebabkan

presipitasi DNA dari larutan. Interaksi antar ion dalam larutan dipengaruhi oleh Gaya

Coulumb yang sangat bergantung pada konstanta dielektrik pelarut. Air sebagai

pelarut memiliki konstanta dielektrik yang tinggi sehingga membuat ion sodium dan

gugus fosfat DNA sulit untuk berinteraksi. Sebaliknya etanol memiliki konstanta

dielektrik yang jauh lebih rendah daripada air. Penambahan etanol akan menurunkan

konstanta dielektrik larutan sehingga memudahkan interaksi ion sodium dan gugus

fosfat DNA. Netralisasi muatan pada gugus fosfatnya membuat DNA menjadi kurang

hidrofilik dan akhirnya keluar dari larutan (terpresipitasi). DNA akan terpresipitasi

pada larutan dengan konsentrasi akhir etanol minimal 70%. Oleh karena itu,

dibutuhkan etanol absolut sebanyak 2-2,5 kali volume sampel. Inkubasi campuran

DNA-garam-etanol pada suhu rendah (-20oC atau -80oC) umum digunakan dalam

prosedur presipitasi. Suhu rendah mendukung flokulasi DNA untuk membentuk

kompleks presipitat yang lebih besar, sehingga dengan mudah terpeletkan dengan

sentrifugasi. Pencucian dengan etanol 70% berfungsi untuk menghilangkan sisa-sisa

garam yang masih terikut pada pelet DNA hasil presipitasi. Pelet yang ada

dikeringkan dengan menguapkan sisa etanol pada suhu ruang atau dapat pula dengan

menggunakan oven bersuhu 50oC atau speed vacum. Yang terpenting untuk diingat

adalah jangan sampai membuat pelet DNA terlalu kering. Hal ini akan menyulitkan

resuspensinya dalam air atau buffer.

Pelet DNA kemudian dilarutkan dengan air bidestilata (double destiled water)

atau buffer Tris-EDTA (TE) pH 7,5. Stok DNA dapat disimpan pada suhu -20 atau -

80oC. Prinsipnya, semakin rendah suhu penyimpanan, maka semakin baik kualitas

preservasinya. Untuk penyimpanan jangka panjang DNA umumnya dilarutkan dalam

buffer TE. Buffer Tris yang berpH netral akan menjaga DNA dari proses depurinasi

yang terjadi pada pH rendah. Selain itu, buffer TE dapat mencegah degradasi DNA

oleh nuklease, karena EDTA dalam TE mengkhelat kation-kation divalen (seperti

Mg2+ dan Ca2+) yang menjadi kofaktor Dnase. Akan tetapi, hal ini membuat DNA

dengan pelarut TE kurang cocok digunakan untuk aplikasi hilir enzimatis, contohnya

PCR, karena EDTA mengikat Mg2+ yang merupakan kofaktor bagi Taq polimerase.

Oleh karena itu untuk stok DNA yang akan segera dipakai atau hanya disimpan untuk

jangka waktu pendek, penyimpanan dalam pelarut air lebih disarankan.

Dalam prakteknya isopropanol juga dapat digunakan untuk presipitasi DNA.

Isopropanol kurang volatil daripada etanol sehingga butuh waktu lebih lama untuk

diuapkan. Selain itu, beberapa garam kurang larut dalam isopropanol (dibandingkan

dengan dalam etanol) dan akan lebih cenderung terpresipitasi bersama dengan DNA.

Oleh karena itu, pencucian ekstra dengan etanol 70% perlu dilakukan untuk

menghilangkan kontaminasi garam. Isopropanol memiliki kelebihan karena jumlah

volume yang dibutuhkan untuk presipitasi DNA hanya setengah dari jumlah volume

etanol.

2.3.2 Metode Dalam Isolasi DNA Kromosom

Cara kerja Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode lysis alkali (Wang)

yaitu:

1. Kultur semalam bakteri dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara

memindahkan satu koloni bakteri ke media LB cair. Inkubasi dilakukan di dalam shaker-

incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).

2. Sebanyak 3 ml kultur hasil inkubasi 16 jam diambil dan dimasukkan ke dalam

tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

3. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri, kemudian pellet

diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan

kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim dengan

cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama satu jam.

5. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis,

diresuspensi dengan cara dibolak-balik.

6. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah 100 µl CI dan 100 µl fenol dingin,

diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm

pada suhu 4 0C selama 10 menit.

7. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifugasi dan

diperkirakan besar volemenya.

8. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan,

diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm

pada suhu 4 0C selama 10 menit.

9. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung mikrosentrifuga

yang baru dan diperkirakan besar volemenya.

10. Supernatan tersebut ditambah Na asetat dan etanol absolut masing-masing sebanyak

0,1 volume supernatan dan 2x volume supernatan.

11. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu -20 0C

selama 2 jam.

12. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000

rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.

13. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl

etanol 70%, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali dengan

kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.

14. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 µl TE dan

diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA

kromosom bakteri.

BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

1. Kromosom merupakan struktur di dalam sel  berupa deret panjang  molekul

yang terdiri dari  satu  molekul  DNA dan berbagai  protein terkait yang

merupakan  informasi genetik  suatu  organisme.

2. Prinsip DNA kromosom bakteri adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA

genom dari komponen-komponen sel lain.

3. Metode yang digunakan dalam isolasi kromosom bakteri adalah Metode isolasi

alkali lysis berstandar pada sifat DNA kromosom bakteri.