CUPRINS INTRODUCERE 3 PARTEA I

Date bibliografice privind Genul CampylobacterCAPITOLUL I Taxonomie/Nomenclatur .. 6 CAPITOLUL II Proprieti culturale, biochimice i antigenice .. .8 CAPITOLUL III Viabilitatea bacteriilor din Genul Campylobacter ... ...11 3.1. Viabilitatea bacteriilor n ap.11 3.2. Viabilitatea bacteriilor n alimente.12 CAPITOLUL IV Patogenez ..........14 4.1. Factorii de virulen..14 4.2. Mecanismele patogenitii...16 CAPITOLUL V Toxiinfeciile alimentare produse de Campylobacter jejuni.18 5.1. Modul de transmitere i sursele se infecie..18 5.2. Manifestri clinice20 5.3. Tabloul anatomopatologic.. .22 5.4. Diagnostic clinic i de laborator ..22 PARTEA a-II a Cercetri proprii CAPITOLUL VI Obiectivele cercetrii .25 CAPITOLUL VII Material i metod 7.1. Aparatur i sticlrie.25 7.2. Medii de cultur i reactivi,,,27 7.3. Protocolul de lucru36

1

7.3.1. Izolarea i identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din carcasele de pui broiller......37 7.3.2. Izolarea i identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din cecumul de pui broiller37 CAPITOLUL VIII Rezultate i discuii.......44 CAPITOLUL IX Concluzii...51 BIBLIOGRAFIE

2

INTRODUCERE

Datorit

rolului

important

al

Campylobacter

jejuni

n

producerea

gastroenteritei acute la om, cu caracter epidemiologic de toxiinfecie alimentar, Comitetul de experi FAO/OMS asupra securitii alimentelor a inclus aceast bacteria pe lista agenilor care produc boli de origine alimentar. Experii Organizaiei Mondiale a Sntii reunii la Moscova n 1984 au subliniat faptul c nu va fi posibil s se neleag pe deplin relaia dintre infeciile umane i animale cu Campylobacter fr intensificarea cercetrilor n acest domeniu i c specialitii care lucreaz n sectorul sntii publice veterinare trebuie s contribuie mai mult la prevenirea i combaterea acestor infecii la om (13). n ultimile dou decenii s-a cunoscut adevratul rol al Campylobacter jejuni n infeciile omului, care este ngrijortor. Pe baza studiilor clinice, epidemiologice i de laborator, Campylobacter jejuni este considerat acum a fi una din cele mai frecvente cauze a infeciilor gastro-intestinale umane n multe ri ale lumii. n SUA, aceast bacteria depete speciile de Salmonella n producerea bolilor gastro-intestinale, n anumite state i perioade, numrul anual de mbolnviri produse de Campylobacter jejuni depind 2 milioane. De civa ani s-a stabilit c infeciile umane produse de Campylobacter jejuni sunt deseori asociate cu sindromul Guillain-Barre, ceea ce a sporit i mai mult interesul cercettorilor pentru studierea lor i pentru gsirea unor mijloace profilactice eficiente. Acest interes explic apariia n ultimii ani a unui numr enorm de publicaii de specialitate cu acest subiect, probabil neegalat de alte boli. n ara noastr dr. Rusu mpreun cu o serie de colaboratori din Institutul Cantacuzino i din Spitalul V. Babe din Bucureti au studiat mai muli ani aceast bacterie i infeciile pe care le produce (14,15,16).

3

Asemenea studii au fcut i ali specialiti, dar ntr-o msur mai mic (6,7,13). n acest context, n lucrarea de fa ne-am propus monitorizarea bacteriilor din Genul Campylobacter cu implicaii n toxiinfeciile alimentare, prezente pe suprafaa carcaselor i n coninutul cecal la puii broiller sacrificai n abatoarele din judeul Iai, n perioada 2008-2010.

4

PARTEA I Date bibliografice privind Genul Campylobacter

5

CAPITOLUL I TAXONOMIE/NOMENCLATUR Taxonomia genului Campylobacter a fost mult discutat i revizuit n ultima decad. La nceput n acest gen erau incluse numai dou specii : Campylobacter fetus i Campylobacter bubulus. n prezent genul Campylobacter cuprinde mai mult de 20 de specii i subspecii cunoscute n privina ecologiei i capacitii lor patogene. (Tabelul nr. 1).Tabelul nr. 1

Genul Campylobacter Campylobacter jejuni C.jejuni subsp. jejuni C.jejuni subsp. doylei Campylobacter coli (C. hyoilei) Campylobacter lari Campylobacter upsaliensis Campylobacter helveticus Campylobacter fetus C.fetus subsp.fetus C. fetus subsp.venerealis Campylobacter hyointestinalis C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis C. hyointestinalis subsp. lawsonii Campylobacter sputorum C sputorum biovar sputorum C sputorum biovar fecalis C sputorum biovar paraureolyticus Campylobacter mucosalis Campylobacter concisus Campylobacter curvus Campylobacter gracilis Campylobacter rectus Campylobacter showae

6

Genul Campylobacter cuprinde bacterii Gram negative, cu forme de bastonae subiri, curbate, n S sau n spiral, groase de 0,2-0,5m i lungi 0,5-5 m, microaerofile, mobile datorit prezenei unui flagel polar care determin o mobilitate specific n zbor de musculi.(5). n culturile vechi, bacteria devine cocoid, imobil i necultivabil. Nu fermenteaz i nu oxideaz hidraii de carbon i au ADN-ul cu un coninut de G+C de 29-36 moli%. Sunt oxidaz pozitive, reduc nitraii, nu hidrolizeaz gelatina i ureea i dau reacia VP i RM negative. Se pot dezvolta la 250C-430C. Prezena sau absena catalazei permite separarea genului n: Specii catalaz pozitive: Campylobacter jejuni este semnificativ pentru om, fiind responsabil de 8590% din cazurile de gastroenterit acut campilobacterian la om, cu caracter epidemiologic de toxiinfecie alimentar, iar uneori implicat i n infeciile urinare. Este larg rspndit la psri i mamifere, cele mai multe cu rol de purttor intestinal. Campylobacter coli a fost separat ca specie distinct pe baza hibridizrii ADN, fiind implicat n 5-15% din cazurile de enterit campilobacterian la om. Se gsete n intestinul diferitelor animale, gazda ei obinuit fiind porcul (16). Se dezvolt mai uor pe mediile de cultur dect alte specii i trece mai lent n forme cocoide. Se deosebete de C. jejuni pe baza incapacitii sale de a hidroliza hipuratul.(1,8) Campylobacter lari apare frecvent pe carcasele, pipotele i ficaii de pasre, producnd enterite la om i psri. Campilobacteriile catalaz pozitive se mpart n dou grupe n funcie de comportarea lor fa de temperatur: 1) specii care se dezvolt la 250C, dar nu i la 420C (C.fetus); 2) specii care se dezvolt la 420C, dar nu i la 250C, numite campilobacterii termotolerante i care sunt principalii ageni ai gastroenteritelor umane.

7

Acestea din urm includ mai multe specii dintre care cele mai importante sunt: C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C.hyoilei, C.hyointestinalis i C. showae. Dintre speciile genului Campylobacter, C. jejuni este cea mai des izolat n patologia uman; C.coli i C. fetus sunt izolate n proporii asemntoare. Alte specii cum ar fi C. upsaliensis, C. lari, sunt mai puin izolate n Europa. Specii catalaz negative: Campylobacter sputorum cu 3 subspecii (sputorum, bubulus i mucosalis), cu toleran mai mare fa de oxigen, capabile s reduc nitraii i s produc H2S. Campylobacter concisus care produce gingivite i peritonite la om. CAPITOLUL II PROPRIETI CULTURALE, BIOCHIMICE I ANTIGENICE Campylobacter jejuni este un microaerofil i se dezvolt mai bine ntr-o atmosfer care conine 5% oxigen. Microaerofilia se datoreaz incapacitii lui de a sintetiza compui care leag Fe+++ la nivele suficiente care s-i permit dezvoltarea n condiii aerobe. Unii cercettori au constatat o cretere a toleranei fa de aerul atmosferic n mediile agarizate la care se adaug cte 0,025% sulfat feros, metasulfit de sodiu i piruvat de sodiu (FBP). Adugarea acestor substane la mediile de cultur mrete capacitatea de supravieuire a C. jejuni i i pstreaz morfologia caracteristic, mobilitatea i viabilitatea la 4oC (30 zile) sau la temperatura camerei (20 zile) n condiii atmosferice normale. Pentru dezvoltare, n afar de o concentraie optim de 5%O2, bacteria are nevoie, de asemenea, de o concentraie optim de dioxid de carbon (10%) i de una de azot (85%), (18). Absena uneia sau a dou componente din atmosfera de incubare inhib dezvoltarea acestei bacterii (9,12). Sulfatul feros i clorura de cadmiu au efect

8

antagonic asupra dezvoltrii bacteriei, iar factorii prezeni n mediul cu snge i cu tioglicolat neutralizeaz activitatea inhibitoare a srurilor de cadmiu. Pe medii lichide campilobacteriile produc turbiditate discret observabil la civa mm sub faa superioar a coloanei de mediu. Coloniile dezvoltate pe suprafa mediilor solide pot avea dou aspecte principale: a) colonii foarte mici, aplatizate, gri-cenuii, fin granulate i translucide, cu margini neregulate, asemntoare picturilor mici de miere; b) colonii rotunde cu margini translucide. Uneori formeaz colonii de tip R, cu suprafaa uscat, marginile neregulate cu colonii cu aspect mucos. Mediile cu snge sunt favorabile dezvoltrii campilobacteriilor, acestea producnd doar o uoar hemoliz de tip alfa. Campilobacteriile au metabolism de tip respirator i proprieti metabolice limitate. Reduc nitraii cu excepia speciilor aerotolerante (15,17). Speciile catalaz negative pot reduce nitraii. Sunt incapabile s fermenteze sau s oxideze hidraii de carbon, deoarece nu pot fosforila i transporta glucoza. Nu produc acizi sau substane finale neutre din metabolizarea diferitelor substraturi. Nu hidrolizeaz gelatina, cazeina, esculina, ADN-ul, ARN-ul i sunt indol, RM i VP negative, oxidaz pozitive i catalaz, n mod obinuit, pozitive (18,20). Nu elaboreaz lipaze i cu excepia speciei C. mucosalis care produce pigmeni galbeni, sunt apigmentogene. n tabelul nr. 2 sunt prezentate criteriile cu care se difereniaz specii sau subspecii cu semnificaie patogen pentru om.

9

Tabelul nr. 2 Teste C. jejuni + + + + S R R R C. coli + + + + S R R S C. lari C. upsa liensis + - () + S S S S C. fetus s.fetus + + R S S S C. hyoin testinalis s. hyoin testinalis. + R S S S C. jejuni s. dolylei + + + + S S S S C. concis us (R) S S S

Oxidaz Catalaz Ureaz Hemoliza Hidroliza hipuratului Cretere la 25oC Glucoza (TSI) Lactoz (TSI) Zaharoz (TSI) Gaze (TSI) H2S (TSI) Acid nalidixic Cefalotin Cefapetazon Carbecilin

+ + R R R R/S

+ = >99% positive; - = > 99% negative; = > 50% pozitive; - + = > 50% negative; R = rezistent; S = sensibil; (R) = de regula rezistent; R/S = 50% R si 50% S. Structura chimic a peretelui celular la campilobacterii este asemntoare cu cea a celorlalte bacterii Gram negative, peptidoglicanul fiind format din acid Nacetilmuramic i N-acetilglucozamin.. Membrana extern conine doi compui majori, bine studiai, cu rol n antigenitatea bacteriilor i care stau la baza unor teste biochimice sau serologice de difereniere: lipopolizaharidele (LPS) i preteina i polipeptidele majore (OMP = outer membrane protein). La C. jejuni s-a identificat o fraciune de suprafa care nu face parte din OMP, care joac rolul unei microcapsule i este responsabil de inaglutinabilitate. n general, hidraii de carbon din structura LPS sunt glucoza, galactoza i manoza la C.jejuni i C. coli i galactoza i manoza la C.fetus s. venerealis. Studiile serologice au artat c tulpinile de C. jejuni sunt diferite din punct de vedere antigenic10

i c astzi se disting cel puin 42 de serotipuri printr-un sistem de serotipizare bazat pe antigenele O termostabile. Aceste antigene au la baz LPS. Componentele polipeptidice din membrana exterioar (OMP) sunt de natur flagelar. Proteina flagelar este principalul component antigenic din schema de serotipara a lui Lior i este un imunogen dominant, evideniat n infeciile cu C. jejuni. Structura de suprafa a C. jejuni difer mult de aceea a C. fetus. Aceast polipeptid unic deosebete C. jejuni i C. coli de E. coli i S. typhimurium, ca i de C. fetus care are dou sau mai multe benzi de OMP majore. Schema Lior este o alternativ de serotipare prin aglutinare pe lam pentru diferenierea serotipurilor de C. jejuni. Pentru aceasta s-au folosit factorii antigenici termolabili pentru produserea antiserurilor, care apoi s-au aplicat pentru serotiparea tulpinilor izolate prin reacia de seroaglutinare rapid pe lam (4,7). CAPITOLUL III TOXIINFECIILE ALIMENTARE PRODUSE DE CAMPYLOBACTER JEJUNI 3.1. Viabilitatea bacteriilor din Genul Campylobacter n ap Campylobacter spp., este frecvent izolat din apele de suprafa . Supravieuirea este mai important la temperatur joas (4-100C) i este redus prin procesul de aerare-oxigenare a apei. ntre speciile de Campylobacter spp exist variaii mari (6). Astfel populaiile de C.jejuni i C.lari par a fi mai rezistente, n apele fluviilor la 50C iar timpul de supravieuire este variabil n funcie de tulpin. Campylobacter devin necultivabile dup 30-90 minute (11). Aplicarea radiaiilor UV/24 ore asupra apelor de suprafa demonstreaz faptul c populaiile de

11

3.2. Viabilitatea bacteriilor din Genul Campylobacter n produsele alimentare Multe experimente s-au concentrat asupra evoluiei numrului de campilobacterii n produsele alimentare. n condiii normale de prelucrare, transport i distribuie, numrul lor este sczut i nu este influenat de temperatur, atmosfer, pH sau de natura substratului alimentar. Supravieuirea i dezvoltarea n produse alimentare a fost demonstrat prima data n carnea depozitat la 370C/420C, (10). Supravieuirea n produse alimentare se afl sub influena unui numr de factori descrii mai jos: Temperaturile negative

n perioada 1980-1996, n Islanda au fost vndute carcase de pui congelate, rata de infecie cu Campylobacter scznd. Dup aprobarea vnzrii carcaselor de pui n stare proaspt, rata de infecie cu Campylobacter a crescut la valori semnificative. Studiile au artat c procesul de congelarea a redus ncrctura bacterian prezent pe carcase de 1-2 log10. Astfel se consider c, cu ct numrul de celule bacteriene este mai mare pe carcas cu att riscul de infecie este mai mare. Prin urmare temperaturile negative stopeaz creterea lui C. jejuni i reduce ncrctura bacterian de pe suprafaa carcaselor. Diferii factori influeneaz aceast evoluie:1)

condiiile de mediu: C. jejuni pare a fi mai sensibil la nghe n medii lichide dect n cele solide; utilizarea de ventilare forat n timpul congelrii reduce semnificativ contaminarea carcaselor de pui la suprafa comparativ cu congelarea fr ventilaie.

2)

3)

tulpinile izolate de la om sunt mai puin sensibile la congelare fa de tulpinile de origine animal.

Temperaturile pozitive

n general, indiferent de produsul alimentar temperaturile de refrigerare (0100C) sunt mai favorabile pentru supravieuirea campilobacteriilor dect temperaturile12

mai ridicate, (21). Mai mult, supravieuirea depinde foarte mult de condiiile de mediu (mediu solid este mai puin sensibil). Prezena aditivilor permite diminuarea numrului de bacterii cultivabile, chiar i la temperaturi de refrigerare. Campylobacter este sensibil la deshidratare n timpul refrigerrii (raportul rece umed/ rece uscat). Inactivarea termic

Campilobacteriile sunt foarte sensibile la cldur, iar tratamentele termice mai mari de 600C le distrug indiferent de mediu (lichid sau solid). pH-ul

Intervalul de pH optim pentru creterea lui C.jejuni este de 6,5-7,5 dar poate crete i la pH = 5,5-8,5. Este omort n substraturile cu pH mai m ic de 3,5-4,5, n funcie de temperatur. La aceleai valori de pH, moare mai repede la 420C dect la 40C. La 370C, C. jejuni se poate multiplica n crnurile cu pH ridicat ( 6,4), dar nu i n cele cu pH normal. Campylobacter este mai sensibil la aciunea acizilor organici dect la aciunea celor minerali.(3). NaCl

Campylobacter spp., nu este halofil (concentraia optim de 0,5% NaCl). Limita concentraiei de NaCl pentru multiplicarea speciilor termotolerante este de 2%. Concentraiile de peste 6,5% au efect letal. Acidul ascorbic

Acidul ascorbic care se adaug n mediul nutritiv, are un efect bactericid asupra C. jejuni la 420C. Acest efect este confirmat n carne. Atmosfera modificat

Supravieuirea bacteriei este n funcie de concentraia de O2 (scade o dat cu creterea concentraiei) i de cantitatea de CO2 (crete odat cu creterea cantitii). Dezinfectanii i iradierea

C. jejuni este foarte sensibil la o serie de dezinfectani ca hipocloritul de sodiu (soluiile de 5 ppm, concentraiile de 107 celule/ml sunt distruse n 15 minute), compuii fenolici 0,15% compuii de amoniu cuaternar, etanol 70%, glutaraldehid13

0,125%, monocloramin (1ppm omoar 99% din celulele bacteriene din ap dup un contact de 15 minute). Din aceste dezinfectante, cloramina apei din bazinele de prercire i-a gsit aplicarea practic n unele abatoare din rile dezvoltate pentru distrugerea campilobacteriilor de pe suprafaa carcaselor de pasre. n acelai timp este la fel de sensibil sau mai sensibil dect salmonelele la aciunea razelor gama care au o valoare de reducere zecimal egal cu 32 Krad, ceea ce este de zece ori mai puin dect doza care se aplic n mod obinuit n unele ri, n procedeele de iradiere a produselor de carne. (2). CAPITOLUL IV PATOGENEZ Caracteristicile care confer caracterul de patogenitate au fost studiate n principal pentru C. jejuni. In vitro pe culturi de celule epiteliale C. jejuni ader i se implanteaz. Procesul de adeziune este reversibil i depinde de mobilitate (22). 4.1. Factorii de virulen i toxicitate Capacitatea patogen a C. jejuni variaz de la tulpin la tulpin i este determinat de mai muli factori legai de bacterie sau de gazd. Unii cercettori au demonstrat c, n cazul unor tulpini, doza minim infectant pentru om este de 500 celule, iar n alte cazuri aceast doz este mult mai mare, n funcie de o serie de factori de virulen (2):a. Producerea de toxine. Simptomele clinice produse de diferite

tulpini de C.jejuni depind de toxinele pe care le produc. n prezent se cunoate c aceast specie bacterian produce o enterotoxin asemntoare cu enterotoxina holeric. Aproximativ 75% din tulpinile izolate din materiale clinice produc aceast toxin, n timp ce tulpinile izolate de la purttorii asimptomatici nu o produc sau o produc ntr-o proporie redus. S-a demonstrat de asemenea, c tulpinile izolate din probe de la pacieni cu diaree de tip secretor provoac acumulare de lichid n ansa14

ligaturat de obolan, iar cele izolate din cazuri de diaree hemoragic produc citotoxin pentru celulele Vero i HeLa, dar nu i acumulare de lichid n ansa ligaturat de obolan. Enterotoxina C.jejuni este o protein mare cu o greutate molecular de 60.000-70.000, termolabil, care se inactiveaz ntr-o or la 560C, ca i la pH 2 i 8 i numai parial la pH 4. Activitatea ei se pierde n timp de o lun la 40C. C. jejuni este capabil s invadeze direct mucoasa intestinal la pacienii cu enterit hemoragic, ca i celulele HeLa n care, dup ptrundere, se multiplic. Puterea invaziv pentru celulele HeLa este mai accentuat la tulpinile izolate de la bolnavi, dect la cele izolate din ap. Citotoxina este o alt toxin produs de C. jejuni i ea provoac efecte citopatice pentru celulele renale de bovine, ovariene de hamster chinezesc, Vero i HeLa. Ea se gsete n preparatele de culturi sonicate, fr celule, i eliberarea ei crete cnd celulele bacteriene se trateaz cu polimixin B, nainte de centrifugare i filtrare. Citotoxina este sensibil la tripsin i este mai tolerant fa de cldur dect enterotoxina. Ea nu poate fi neutralizat de serul de iepure antitoxin Shiga sau antiLT. Endotoxina reprezentat de lipopolizaharidele (LPS) din peretele celular este un factor endotoxic important care contribuie la virulena bacteriei. LPS C. jejuni conin glucoz, galactoz, L-glicero-D-manoz-heptoz, glucozamin, galactozamin, acid gras 3-hidroxi-tetradecanoic i acid 2-cheto-3-deoxioctonic. LPS unor tulpini de C. jejuni au aceeai lipid A ca determinani antigenici, ca regiunea corului LPS ale numeroaselor bacterii Gram-negative. Regiunea cu lipida A este partea toxic a endotoxinei (5).b. Patogenitate. C. jejuni depinde, cel puin n parte, de structura

suprafeei celulare format, n principal, de LPS i OMP (outer membrane protein). Aceste dou componente celulare servesc ca interfa ntre bacterie i celula gazd i ajut bacteria s15

nving mecanismele de aprare a gazdei. LPS i OMP sunt implicate n aderena i invazia bacteriei n celula gazd, fenomene n care microcapsula bacterian, ca factor antifagocitar, ar juca un rol important n infecia cu alte specii sau subspecii de Campylobacter, cum este C. fetus (8).c. Folosirea fierului de ctre C.jejuni este socotit n prezent, ca i

n cazul altor bacterii Gram-negative, un factor important de virulen. Compuii proteici produi de bacteriile care leag fierul sunt numii, n general, siderofori. Proteinele bacteriene au capaciti mai mari de a lega fierul dect cele produse de gazde. Producerea toxinei de ctre C. jejuni este sporit cnd fierul este n exces. Tulpinile care nu produc nivele detectabile de toxin, devin productoare de toxin dac se cultiv pe medii suplimentate cu fier. Aceast constatare a determinat pe unii cercettori s considere c fierul este un element cheie n patogeneza acestei specii bacteriene. Factorii de virulen, menionai mai sus, pot fi codificai prin informaia genetic prezent n plasmide. Din C. jejuni s-au izolat mai multe plasmide, dar numai dou caracteristici ale acestei bacterii sunt mediate de plasmide: rezisten fa de tetraciclin i n anumite condiii producerea enterotoxinei. Nu s-a constatat nici o omologie ADN ntre plasmidele C. jejuni i sondele genice ale subunitilor A i B ale CT sau gena care codific LT la E. coli. n acelai timp s-a constatat c numai 61% din tulpinile de C. jejuni enterotoxigene posedau ADN plasmidic specific, ceea ce arat c producerea enterotoxinei la multe tulpini poate fi codificat de gene cromozomice. La tulpini de C. fetus netoxigene s-a reuit s se transfere proprietatea de a produce enterotoxina, odat cu transferul rezistenei la tetraciclin, iar transconjugatele de C. fetus au fost capabile s transfere plasmidele PGK 103 i PGK

16

104 la o tulpin netoxigen de C. jejuni fcndu-o rezistent la tetraciclin i productoare de enterotoxin. 4.2. Mecanismele patogenitii Dei mecanismele de patogenitate a C. jejuni nu sunt pe deplin cunoscute, totui n ultima decad s-au fcut progrese importante pentru nelegerea corect a factorilor de virulen, aa cum s-a artat mai sus. Mecanismele prin care C. jejuni poate provoca infecia au fost presupuse pe baza datelor studiilor fcute asupra diferitelor sindroame clinice, asemntoare cu cele produse de alte bacterii enteropatogene. Izolarea C. jejuni din snge i din alte esuturi extraintestinale, ca i din fecale, arat c aceast bacterie nu este un patogen oportunist. Ca i alte bacterii enteropatogene, C. jejuni produce boala prin diferite mecanisme. Unul din mecanismele enterotoxigene const din colonizarea bacteriei n intestinul subire, multiplicarea pe suprafaa mucoasei intestinale i elaborarea enterotoxinei.Aceast toxin determin un aflux de lichid i de electrolii, urmat de apariia diareei apoase. O alt cale de producere a bolii este procesul invaziv prin care bacteria ptrunde n peretele intestinului subite i al colonului. Dup aceast ptrundere, bacteria se multiplic intracelular i disemineaz n i n afara mucoasei, dar leziunea ramne superficial. Poriunea terminal a ileonului i colonul sunt cel mai des afectate, iar scaunele, n aceste cazuri, sunt adesea hemoragice i conin leucocite. Leziunile constau din infiltrate inflamatorii n lamina propria i din abcese n criptele mucoasei, asemntoare cu cele din shigeloz i salmoneloz. Dup infecia cu C. jejuni apar n serul sangvin titruri mari de anticorpi Ig G i Ig M, ceea ce arat contactul intim componenilor celulari ai bacteriei cu sistemul imun extraintestinal. Variaia simptomelor n enterita campilobacterian se datoreaz diferitelor mecanisme prin care diferite tulpini de C. jejuni produc boala. Instalarea unei infecii enterice depinde deseori de capacitatea bacteriei de a coloniza mucoasa intestinal. C.

17

jejuni este capabil s colonizeze masiv i s se multiplice n intestinul omului, dup cum arat numrul mare de asemenea bacterii n fecalele diareice. Mucusul intestinal care acoper ca un gel mucoasa, reprezint o barier de ptrundere a majoritii patogenilor enterici, dar campilobacteriile fiind foarte mobile, subiri i spiralate, sunt capabile s penetreze aceast matrice foarte vscoas i s colonizeze mucoasa intestinal. Colonizarea este uurat i de stimuli chemotactici, prin mrirea mobilitii bacteriilor selectate. Se pare c C. jejuni se ataeaz de esutul intestinal prin colonizarea mucusului i nu prin aderen. Capacitatea acestei specii de a coloniza mucoasa intestinal pe calea mucusului este considerat ca un factor de patogenitate important. De asemenea , se consider c adezinele flagelare ajut ataarea C. jejuni de liniile celulare epiteliale, ataare care este inhibat prin diferite tratamente i substane: L-fucoza, glucoza, N-acetilglucozamina, N-acetil, galactozamina i sorbitolul, enzimele proteolitice, glutaraldehida (2,5%), D-manoza.

CAPITOLUL V TOXIINFECIILE CAMPYLOBACTER JEJUNI 5.1.Modul de transmitere i sursele de infecie C. jejuni poate face parte din microflora intestinal obinuit a multor specii de animale domestice i slbatice, ca i a animalelor de apartament sau agrement. Din cauza acestor rezervoare extinse, C. jejuni poate contamina apele de suprafa i solul. Transmiterea la om are loc prin ingestia alimentelor de origine animal contaminate i a apei contaminate, netratate, sau prin contactul direct cu animalele infectate, n special cu cele de apartament. Foarte rar infecia se poate transmite de la om la om.18

ALIMENTARE

PRODUSE

DE

Episoadele extinse de enterit cu C. jejuni se datoreaz, n mod obinuit, ingerrii de lapte nepasteurizat sau apei contaminate i numai rareori ingerarea crnii de pasre sau de alte alimente. Din contra, cazurile endemice izolate, au ca surs de infecie ingerarea de carne de pasre n proporie de 50-70% din toate cazurile endemice, care reprezint 95% din toate cazurile de enterit campilobacterian. Dei laptele crud este raportat ca vehicolul cel mai frecvent al episoadelor de enterit cu Campylobacter, rezultatele numeroaselor aciuni de supraveghere au scos n eviden c primul vehicul de transmitere a enteritei cu C. jejuni de origine alimentar este carnea de pasre. Episoadele asociate cu carnea de pasre, foarte rar cuprind un numr mare de mbolnviri, asemntor cu cele produse prin consumul laptelui. Din aceast cauz, numrul infeciilor atribuite consumului crnii de pasre contaminate este mic. Aproape toate carcasele de pasre proaspete, refrigerate sau congelate sunt contaminate cu C. jejuni la nivele de circa 105 celule/g de carcas. Frecvena si nivelul contaminrii explic de ce carnea de pasre constituie sursa cea mai important pentru infecia de origine alimentar la om. C. jejuni nu se multiplic pe carne, din contra, datorit unor factori nefavorabili, numrul ei scade. De asemenea, numrul acestei bacterii scade mult n timpul refrigerrii i congelrii, dar celulele care supravieuiesc procesului de congelare rmn viabile i infectante mai multe luni. C. jejuni triete ca un comensal n tractul intestinal al multor animale cu snge cald, domestice i slbatice, care trebuie considerate surse de infecie pentru om i rezervoare ale bacteriei prin care se contamineaz alimentele i apa de suprafa. (19) Psrile de ferm sunt purttoare i excretoare de C. jejuni n proporie de 91100%, bovinele de 43%, cinii de curte - 49%. Multe mamifere i psri slbatice sunt, de asemenea, purttoare de C. jejuni reprezentnd un rezervor natural important. Un procent foarte mare de purttori s-a gsit la pescrui i ciori, n special la cele care au acces la deeurile din zonele urbane i la psrile acvatice migratoare.19

Frecvena mare a acestei bacterii n intestinul psrilor este legat de caracterul ei termotolerant i de temperatura corporal a psrilor mai mare dect aceea a mamiferelor. Se poate spune c pentru numeroase specii de psri, C. jejuni face parte din microflora intestinal normal, densitatea ei fiind deseori de 104-107 celule/g fecale. Mutele din fermele de psri i porci sunt frecvent purttori de C. jejuni putnd juca un rol important n transmiterea indirect a bolii prin contaminarea alimentelor. Carnea de pasre este contaminat cu C. jejuni intr-o proporie mult mai mare, datorit procentului foarte mare de purttori intestinali i procesului de tiere i de obinere a carcaselor, care determin contaminarea acestora prin fecale. Numrul de celule bacteriene vii de pe suprafaa carcaselor se reduce, dar nu dispare, n timpul stocrii n condiii de refrigerare sau congelare. Campilobacteriile termotolerante s-au gsit i pe legumele proaspete din piee i magazine. 5.2. Manifestri clinice Toxiinfecia alimentar produs de C. jejuni se manifest din punct de vedere clinic i anatomopatologic ca o enterit, enterocolit sau gastroenterit acut. Perioada de incubaie obinuit este de 1-3 zile, dar poate fi i de o sptmn sau mai lung. Durata perioadei de incubaie este, de regul, direct proporional cu numrul de bacterii ingerate i invers proporional cu scderea rezistenei organismului infectat. Aceti doi factori explic faptul c la unele persoane doza minim infectant este de 500 celule bacteriene, iar la altele de 106. Semnele prodromale sunt, n mod obinuit, nespecifice i constau din dureri de cap, mialgii, frisoane i febr, uneori mai mare de 40oC. Dup 24 de ore de la apariia semnelor prodromale se instaleaz manifestarea clinic major care const dintr-o boal diareic acut, nsoit, deseori, de crampe abdominale acute i de febr.20

Fecalele devin repede lichide, urt mirositoare i apoi apoase, iar numrul de scaune pe zi n perioada de vrf a bolii, este de 8 sau chiar 20. n a doua sau a treia zi de boal poate s apar snge proaspt n fecale, numeroase leucocite polimorfonucleare i mucus. Scaunele pot cpta o tent biliar sau uneori, devin sanguinolente. n unele cazuri durerile abdominale sunt aa de pronunate nct boala se poate confunda cu apendicita acut. Apogeul bolii este atins la 24-48 ore de la apariia semnelor care pot dispare n decurs de o sptmn, iar disconfortul abdominal poate persista mai multe zile. La pacienii netratai pot apare recidive la 20% din cazuri. Boala diareic ce nsoete infecia cu C. jejuni este considerat un proces inflamator din cauza exprimrii predominante a febrei i a simptomelor specifice, ca i din cauza scaunelor care conin leucocite polimorfonucleare i snge. Colonoscopia i biopsia pun n eviden o colit inflamatorie difuz i o enterit. Aceste semne clinice i modificrile anatomice nsoite de creterea titrurilor de anticorpi fa de C. jejuni n serul bolnavilor demonstreaz natura invaziv a agentului cauzal. Fecalele conin un numr foarte mare de celule de C. jejuni, ceea ce face posibil ca laboratoarele clinice s pun diagnosticul foarte precoce pe baza examenului microscopic n contrast de faz direct al probelor proaspete de fecale. Infecia tipic cu C. jejuni se manifest prin enterocolit acut cu dureri abdominale, diaree hemoragic, inflamarea stratului lamina propria i abcese criptice. n cele mai multe cazuri boala se remite fr tratament,alteori este nevoie de o terapie cu eritromicin. Rareori enterocolita cu campilobacterii se complic cu hemoragii gastroimtestinale masive n segmentele inferioare ale tractusului intestinal, ulcere ale mucoasei ileonului sau valvulei ileocecale sau printr-o infecie a apendicelui. C. jejuni poate provoca i infecii extraintestinale care se pot manifesta ca pancreatit, colecistic, cistit, avort. S-au descris, de asemenea, cazuri de bacteriemii, n special la persoanele imunosupresate, cu diseminri la distan. Infecia se poate complica dup cteva zile de evoluie. Complicaiile au caracter21

nesupurativ i alergic: artrit reactiv la persoanele cu antigen de histocompatibilitate HLA-B 27 (human leukocyte antigen), sindrom Reiter, miocardit, meningoencefalit. Gastroenterita campilobacterian la om, n afar de C. jejuni, poate fi produs i de speciile nrudite: C.coli, C.laridis, C.upsaliensis, C.butzleri. C. coli se izoleaz de la aproximativ 3,2% din bolnavii cu enterit, iar C. lari provoac diaree sau crampe abdominale severe. Transmiterea bacteriei la om se face pe cale alimentar. 5.3. Tabloul anatomopatologic Leziunile sunt destul de variate i inconstant ntlnite. n mod deosebit atrag atenia leziunile hepatice a cror gravitate este dependent de tipul evolutiv al bolii. n forma acut ficatul este de dimensiuni normale sau uor mrit n volum i cu prezen de focare necrotice solitare sau confluente, cu marginile neregulate i de culoare albglbuie sau gri glbuie. La pui se ntlnesc frecvent hemoragii hepatice, localizate subcapsular pe marginea lobilor i pe parenchim. n pereii vezicii biliare, care poate fi dilatat, se pot gsi focare necrotice miliare. Mai rar sunt semnalate o uoar splenomegalie nsoit sau nu de leziuni punctiforme, miocardoz, epicardit hemoragic, peritonit seroas. La unele psri se gsesc leziuni de enterit cataral, cataral-hemoragic sau fibrino-necrotic, obinuit difuz. n forma cronic se ntlnete degenerescena foliculilor ovarieni, splenomegalie, hipertrofie. Examenul histopatologic al ileonului i al sacilor cecali relev edemul mucoasei i prezena lui C. jejuni la suprafaa eritrocitelor, uneori i atrofia vilozitilor, cu acumularea de mucus, eritrocite i celule inflamatorii n lumenul intestinal. Microscopic, n ficat se evideniaz infiltraie periportal, distrofie gras, focare necrotice, hiperplazia mezenchimal.(14)

22

5.4. Diagnostic clinic i de laborator Diagnosticul clinic nu este posibil, tabloul de enterit, enterocolit sau gastroenterocolit bacterian neavnd nimic caracteristic. Manifestrile clinice coroborate cu datele epidemiologice pot contribui la fixarea unui diagnostic prezumtiv, care orienteaz pe clinician ctre examenul de laborator.(10) Diagnosticul diferenial se face fa de celelalte enterocolite acute, dizenteria, colita ulceroas, boala Crohn. O problem de diagnostic aprut n ultimii ani este aceea a sindromului Guillain-Barre, care dup diagnosticarea pe baza semnelor clinice neurologice, trebuie investigat asupra legturii lui cu enterita produs de C. jejuni. Diagnosticul de laborator el enterocolitei acute campilobacteriene se bazeaz pe examenul microbiologic prin culturi al probelor de fecale de la bolnavi sau, n cazul formelor sistemice, cu bacteriemii, i al probelor de snge. Acest examen este relativ simplu i const n strierea pe suprafaa agarelor selective de izolare a materialelor clinice, care, de regul, conin n exclusivitate (cazul sngelui) sau n numr dominant (cazul fecalelor) celule de campilobacterii.(12) Un diagnostic prezumtiv rapid se poate pune prin vizualizarea bacteriei din fecale prin examinarea microscopic a frotiurilor fcute din fecale i colorate prin metoda Gram sau prin examinarea microscopic n contrast de faz a preparatelor native. Infecia cu C. jejuni determin apariia anticorpilor specifici n serul bolnavilor, dar acetia ating titruri de diagnostic, dup ce semnele clinice au disprut. C. jejuni persist n fecale un timp limitat, de obicei mai scurt de 3 sptmni. n general examenul bacteriologic al fecalelor, n vederea stabilirii precise a diagnosticului, este eficient numai n prima sptmn de boal. ntruct n aceast faz acut a bolii, C. jejuni se gsete n numr foarte mare sau reprezint microflora dominant din fecale, izolarea bacteriei se face relativ uor prin strierea diluiilor de fecale pe suprafaa mediilor selective. Din contra, alimentele conin un numr mic de

23

celule campilobacteriene i mult mai multe celule de bacterii concurente. Din aceast cauz, izolarea din alimente necesit totdeauna o faz de mbogire selectiv. Marea majoritate a speciilor de Campylobacter, printre care si C. jejuni, pentru a fi cultivate au nevoie de o atmosfer de incubare microaerob, format din 5%O 2,

10%CO2, i 85%N2 . Aceast atmosfer se poate obine pe diferite ci. Multe firme livreaz n prezent aparate speciale cu atmosfer controlat cum ar fi incubatorul Cytocell n mediu cu CO2, model 500 Anaerostat, productor MMM Medcenter Germania.

PARTEA a II a CERCETRI PROPRII

24

CAPITOLUL VI OBIECTIVELE CERCETRII Scopul prezentei lucrri l-a constituit punerea n eviden a bacteriilor din Genul Campylobacter (Campylobacter jejuni), pe carcasele proaspete i n coninutul cecal la puii broiller i rezistena acestora la procesele de refrigerare i congelare. CAPITOLUL VII MATERIAL I METOD Investigaiile s-au efectuat pe 200 probe carcase de pui Broiller i 75 probe cecumuri. Aparatura, sticlria, mediile de cultur i alte materiale utilizate pe parcursul lucrrii, au fost cele recomandate de STAS SR EN ISO 10272/2/2007, (19). 7.1 APARATUR I STICLRIE

Anaerostat reglabil Cytocell (Fig. nr. 1).

25

Fig .1 Anaerostat Cytocell

Incubator, reglabil ntre 250C - 370C. Baie de ap, reglabil ntre 440C i 470C. Balan electronic pH-metru, cu exactitate de 0,1 uniti pH la 250C. Recipiente, de exemplu sticle, eprubete, flacoane, corespunztoare pentru sterilizare i depozitare diluani i medii de cultur. Cutii Petri, de preferat cu rugoziti, de sticl sau plastic, cu diametrul de 90 mm pn la 100 mm. Pipete gradate cu scurgere total, cu vrf lrgit i capacitate nominal de 1 ml i 10 ml, gradate cu diviziuni de 0,1 ml. Par de cauciuc, sau orice alt sistem de siguran capabil s fie adaptat la pipete gradate. Anse sterile, de platin/iridiu, nichel/crom sau plastic, de aproximativ 3 mm diametru i sub form de srm din acelai material sau baghet de sticl sau plastic.

Instrument de ntindere, de sticl sau plastic.26

Microscop cu contrast de faz (pentru a se observa caracteristica de mobilitate a Campylobacter).

7.2. MEDII DE CULTUR I REACTIVI Medii de cultur Bulion Bolton Mediu de baz Compoziie Digest enzimatic de esuturi animaliere10,0g Lactalbumin hidrolizat..10,0g Extract de drojdie...5,0g Clorur de sodiu.5,0g Piruvat de sodiu..0,5g Metabisulfit de sodiu...0,5g Carbonat de sodiu0,6g -Ketoglutaric acid..1,0g Haemin (dizolvat n hidroxid de sodiu 0,1%)0,01g Ap ..1000 ml Preparare Se dizolv componentele de baz sau mediul de baz complet, deshidratat, n ap, prin aducere la fierbere.27

Se ajusteaz pH-ul, dac este necesar, aa nct dup sterilizare s fie 7,40,2 la 250C. Se repartizeaz mediul de baz n flacoane de capacitate corespunztoare. Se sterilizeaz n autoclav fixat la 1210C timp de 15 min (Fig.nr.2 )

Fig .2 Bulion Bolton - forma comercial Agar modificat cu crbune cefoperazon deoxicolat (agar mCCD) Mediu de baz Compoziie Extract de carne..10,0 g Digest enzimatic de esuturi animaliere .10,0 g Clorur de sodiu ..5,0 g Crbune 4,0 g Digest enzimatic de cazein .3,0 g Sodium deoxicolat 1,0 g Sulfat de fier (II) .0,25 g Sodium piruvat ..0,25 g Agar ..8,0 g pn la 10,0 ga Ap .1000 ml a n funcie de puterea de gelifiere a agarului Preparare Se dizolv componentele de baz sau mediul de baz complet, deshidratat, n ap, prin aducere la fierbere.

28

Se ajusteaz pH-ul, dac este necesar, aa nct dup sterilizare s fie 7,40,2 la 250C. Se repartizeaz mediul de baz n flacoane de capacitate corespunztoare. Se sterilizeaz n autoclav fixat la 1210C timp de 15 min (Fig. nr. 3).

Fig .3 Mediu baz mCCD - forma comercial Soluia de antibiotic Compoziie Cefoperazon.0,032 g Amfotericin B0,01 g Ap ..5 ml Preparare Se dizolv componentele n ap. Se sterilizeaz prin filtrare. Mediu complet Compoziie Mediu de baz (mCCD.)..1000 ml Soluie de antibiotic ...................5 ml Preparare

29

Se adaug soluia de antibiotic la mediul de baz, rcit la 470C20C, apoi se omogenizeaz cu atenie. Se toarn circa 15 ml mediu complet n cutii Petri sterile. Se las s se solidifice. Chiar nainte de folosire, se usuc cu atenie plcile de agar, de preferat fr capace i cu suprafaa agarului orientat n jos, ntr-o etuv de uscare timp de 30 min sau pn cnd suprafaa agarului este lipsit de umiditate vizibil. Dac au fost preparate nainte, plcile de agar neuscate nu se pstreaz mai mult de 4 h la temperatura ambiant, sau la ntuneric la 50C30C mai mult de 7 zile. Agar Karmali Mediu de baz Compoziie Agar...12 g Crbune ..4 g Amidon de porumb.1 g Pepton special23 g Clorur de sodiu.5 g Ap 1000 ml Preparare Se dizolv componentele de baz sau mediul de baz complet, deshidratat, n ap, prin aducere la fierbere. Se ajusteaz pH-ul, dac este necesar, aa nct dup sterilizare s fie 7,40,2 la 250C. Se repartizeaz mediul de baz n flacoane de capacitate corespunztoare. Se sterilizeaz n autoclav fixat la 1210C timp de 15 min (Fig. nr. 4).

30

Fig .4 Mediu baz Karmali forma comercial Campylobacter Selective Supplement (Karmali) Compoziie/ flacon pentru 500 ml mediu baz(Karmali) Sodium pyruvate. 50 mg; Vancomycin 10 mg; Cefoperazon 16 mg; Cycloheximide .50 mg Preparare Se dizolv componentele de baz n 2 ml - ethanol: ap distilat (n proporie de 1:1) apoi se adaug in mediul de baz topit i rcit la 470C20C, apoi se omogenizeaz cu atenie. Se toarn circa 15 ml mediu complet n cutii Petri sterile. Se las s se solidifice. Chiar nainte de folosire, se usuc cu atenie plcile de agar, de preferat fr capace i cu suprafaa agarului orientat n jos, ntr-o etuv de uscare timp de 30 min sau pn cnd suprafaa agarului este lipsit de umiditate vizibil. Dac au fost preparate nainte, plcile de agar neuscate nu se pstreaz mai mult de 4 h la temperatura ambiant, sau la ntuneric la 50C30C mai mult de 7 zile. Agar cu snge Columbia Mediu de baz Compoziie31

Digest enzimatic de esuturi animaliere 23,0 g Amidon ..1,0 g Clorur de sodiu . 5,0 g Agar 8,0 g pn la 10,0 ga Ap .1000 ml a n funcie de puterea de gelifiere a agarului Preparare Se dizolv componentele de baz sau mediul de baz complet, deshidratat, n ap, prin aducere la fierbere. Se ajusteaz pH-ul, dac este necesar, aa nct dup sterilizare s fie 7,30,2 la 250C. Se repartizeaz mediul de baz n flacoane de capacitate corespunztoare. Se sterilizeaz n autoclav fixat la 1210C timp de 15 min (Fig. nr. 5).

Fig .5 Mediu baz agar Columbia - forma comercial Snge de oaie defibrinat steril Mediu complet Compoziie Mediu de baz (Ag. Columbia)1000 ml Snge de oaie defibrinat steril ....5 ml Preparare Se adaug aseptic sngele la mediul de baz, rcit la 470C20C, apoi se omogenizeaz cu atenie. Se toarn circa 15 ml mediu complet n cutii Petri sterile. Se32

las s se solidifice. Chiar nainte de folosire, se usuc cu atenie plcile de agar, de preferat fr capace i cu suprafaa agarului orientat n jos, ntr-o etuv de uscare timp de 30 min sau pn cnd suprafaa agarului este lipsit de umiditate vizibil. Dac au fost preparate nainte, plcile de agar neuscate nu se pstreaz mai mult de 4 h la temperatura ambiant, sau la ntuneric la 50C30C mai mult de 7 zile la 50C30C. Bulion Brucella Compoziie Digest enzimatic de cazein .10,0 g Digest enzimatic de esuturi animaliere 10,0 g Glucoz .1,0 g Extract de drojdie ..2,0 g Clorur de sodiu 5,0 g Disulfit de sodiu 0,1 g Ap .1000 ml Preparare Se dizolv componentele de baz sau mediul de baz complet, deshidratat, n ap, prin nclzire dac este necesar. Se ajusteaz pH-ul, dac este necesar, aa nct dup sterilizare s fie 7,00,2 la 250C.Se repartizeaz mediul n cantiti de 10 ml n eprubete de capacitate corespunztoare. Se sterilizeaz n autoclav fixat la 1210C timp de 15 min.

Reactivi Reactivii utilizai pentru confirmarea biochimic a tulpinilor izolate, au fost: reactiv pentru detecia oxidazei, reactiv pentru detectarea hidroliza hippurate, ninhydrin soluie de 3,5%, discuri cu Indoxyl acetat, (Fig. nr.6). Reactiv pentru detecia oxidazei Compoziie33

N,N,N,N Tetrametil -1-4-fenilendiamin dihidrocloric ..1,0 g Ap ...100 ml Preparare Se dizolv componentul n ap chiar nainte de folosire. Reactiv pentru detectarea hidroliza hippurate

Soluie de hipurat de sodiu Compoziie Hippurate de sodium..10 g Soluie salin tamponat cu fosfat(PBS) constnd din: Clorur de sodium.8,5 g Hidrogen disodic dihidrat (Na2HPO42H2O).8,98 g Hidrogen fosfat de sodiu monohidrat (NaH2PO4H2O).2,71 g Ap 1000 ml Preparare Se dizolv Hippurate de sodium n soluie PBS. Se sterilizeaz prin filtrare. Se distribuie reactiv aseptic, n cantiti de 0,4 ml n tuburi mici, de capacitate corespunztoare. Se pstreaz la aproximativ -200C. Ninhydrin soluie de 3,5% (mas/volum) Compoziie Ninhydrin.1,75 g Aceton 25 ml Butanol..25 ml Preparare Se dizolv Ninhydrin ntr-un amestec de aceton/butanol. Se pstreaz soluia la frigider pentru o perioad de maxim 1 sptmn, la ntuneric.

Discuri cu Indoxyl acetat Compoziie34

Indoxyl acetat0,1 g Aceton .1 ml Preparare Se dizolv Indoxyl acetatul n aceton. Se adaug 25l din aceast soluie, pe discurile de hrtie goal. Dup uscare la temperatura camerei, discurile se pstreaz la 4oC ntr-un tub de sticla maro sau n prezena silicagelului.(Fig. nr. 6)

Fig.6.Reactivii utilizai pentru testarea tulpinilor de Campylobacter spp.

Modul de utilizarea a reactivilor este urmtorul: intr-o placa Petri n care s-a turnat agar nutritiv, se pune la uscat n etuv, apoi se face o suspensie ntr-o soluie de NaCl 2% cu colonii izolate de Campylobacter, luate de pe mediul selectiv mCCD. Apoi se inund suprafaa mediului cu 0,1-0,2 ml din suspensia obinut. Se las 2-3 min. pentru a ptrunde inoculul, dup care se aplic dischetele cu reactivii mai sus menionai. Placa astfel inoculat se termostateaz la 41,50C timp de 24 h, (Fig.nr.7)

35

Fig .7. Culturi de Campylobacter spp i reactivi utilizai pentru identificare

7.3. PROTOCOL DE LUCRU Protocolul de lucru se execut conform SR EN ISO 10272/2/2007 astfel:

36

DIAGRAMA DE PROCEDUR PENTRU GENUL CAMPYLOBACTER CONFORM SR EN ISO 10272-2/2007 PORIUNEA DE TESTARE x g sau x ml x g sau x ml Bulion Bolton IMBOGAIRE Incubare n atmosfer microaerob La 370C pentru 4h 6 h i apoi la 41,50C pentru 44h 4h IZOLARE mCCD agar + Al doilea mediu preferat agar Karmali Incubare n atmosfer microaerob 41,50C pentru 44h 4h 5 Colonii caracteristice Confirmare Identificare (opional) Exprimarea rezultatelor i rapoarte de ncercare 7.3.1. Izolarea i identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din carcasele de pui broiller

37

Pregtirea probei pentru analiz

Se pregtete proba pentru analiz conform cu standardul internaional specific, care se refer la produsul respectiv. Dac nu exist un standard internaional specific, se recomand ca prile implicate s ajung la un acord referitor la acest subiect.

Mod de lucru

Din proba de analizat se iau 25g prob (din pielea gtului) cu 225 ml bulion Bolton, ntr-un balon Elermayer. Se incubeaz la 370C 4-6 h apoi la 41,50C 44h.

Inoculare i incubare

Se transfer cu o pipet stril 0,1ml din bulionul Bolton n dou plci Petri cu mediu agar mCCD, Se etaleaz cu atenie inoculul, uniform i ct se poate mai repede, pe suprafaa plcii de agar, fr s ating marginile plcii, folosind un instrument de intindere pn cnd nu mai exist nici un pic de lichid vizibil pe suprafaa agarului. Se incubeaz plcile la 41,50C timp de 40-48 h n atmosfer microaerob. Enumerarea i selectarea coloniilor pentru confirmare Pe agar mCCD coloniile tipice sunt cenuii, adesea cu un luciu metalic, plate i umede, cu o tendin de mprtiere. Coloniile se mprtie mai puin pe suprafee de agar uscate. Pot s apar i alte forme de colonii. Se selecteaz plcile care conin mai puin de 150 colonii tipice sau suspecte, se numr aceste colonii. Apoi se aleg la ntmplare 5 astfel de colonii pentru subcultivare n scopul analizelor de confirmare. Se nsmneaz n linie dreapt coloniile selectate pe o plac de agar cu snge Columbia pentru a permite dezvoltarea de colonii bine izolate. Se incubeaz plcile n atmosfer microaerofil la 41,50C timp de 24-48 h .Culturile pure se folosesc pentru examen morfologic, mobilitate, cretere microaerob la 250C, cretere microaerob la 41,50C 0C i prezena oxidazei.

Confirmarea speciilor de Campylobacter

Deoarece bacteriile se deterioreaz rapid la aer se efectueaz modul de lucru descris mai jos fr ntrziere.38

Examinarea morfologiei i a mobilitii

Se suspend o colonie de pe placa de agar cu snge Columbia n 1 ml bulion Brucella i se examineaz pentru morfologie i mobilitate folosind un microscop. Se rein pentru examinare ulterioar toate culturile n care s-au gsit bacili curbai cu mobilitate de tirbuon spiralat.

Studiu de cretere la 250C (microaerob) i la 41,50C (aerob)

Folosind colonii izolate, se inoculeaz, cu ajutorul unei anse suprafaa unei plci de agar cu snge Columbia. Se incubeaz o plac la 250C n atmosfer microaerob timp de 40 h pn la 48 h. Se incubeaz cealalt plac la 41,50C n atmosfer aerob timp de 40 h pn la 48 h. Se examineaz plcile pentru creteri vizibile de colonii de Campylobacter. Detecia oxidazei Folosind o ans de platin/iridiu sau o baghet de sticl, se ia cte o poriune dintro colonie bine izolat de pe fiecare plac individual i se transfer pe o hrtie de filtru umectat cu reactiv pentru detecia oxidazei. Apariia culorii mov, violet sau albastru intens n 10 s indic reacia pozitiv. Interpretare Campylobacter spp dau rezultatele sistematizate n tabelele nr. 3 i 4Tabelul nr. 3 Caracteristici ale Campylobacter spp.

Morfologie Mobilitate Cretere microaerob la 250C Cretere aerob la 41,50C Oxidaz

Bacili mici curbai Caracteristic +

Confirmarea rezultatelor utiliznd controale pozitive i negative cu tulpini de Campylobacter.

39

Exemple de tulpini de control corespunztoare sunt Campylobacter jejuni NCTC 11351 (prob de control pozitiv), Campylobacter lari NCTC 11352 (prob de control negativ).Tabelul nr. 4 Criterii de difereniere a speciilor genului Campylobacter

Caracteristici C,jejuni C.coli Catalaza + + Acid nalidixic S S Cephalothin R R Hidroliza + hipuratului Indoxyl acetate + + +=pozitiv; - = negativ; S = sensibil; R = rezistent.

C.lari +R/S R -

C.upsaliensis S S +

7.3.2. Izolarea i identificarea bacteriilor din Genul Campylobacter din cecumul de pui broiller

Pregtirea probei pentru analiz

Cecumul de pasre a fost dezinfectat cu alcool etilic absolut timp de 2-3 minute, apoi a fost uscat ntr-o plac Petri. (Fig. nr.8). S-a tiat vrful cecumului i s-a recoltat din coninut, utiliznd o pipet Pasteur, (Fig. nr.9,10). nsmnarea s-a efectuat pe mediul solid mCCD pentru izolare (Fig. nr.11).

40

Fig.8. Cecumuri de pasre

Fig.9. Secionarea apexului cecal

41

Fig.10. Recoltare coninutului cecal

Fig.11. nsmnare pe agar mCCD

Incubare

Incubarea s-a realizat n mediu cu 10%CO2, la 41,50C pentru 48h.

42

Confirmarea biochimic

Departajarea speciilor n cadrul genului Campylobacter se bazeaz pe testele biochimice i sensibilitatea fa de unele antibiotice (Tabelul nr. 5)Tabelul nr. 5

TESTE Hidroliza hipuratului de sodiu Hidroliza EndoxilAcetat Catalaza sol.3% H2O2 Oxidaza Acid nalidixic Cefalotin

C.jejuni + + + + S sau R R

C.coli + + + S sau R R

C lari + + S R

C.upsaliensis + (pozitiv sau slab pozitiv) + S sau R S

Testele biochimice de identificare a speciilor sunt: Hidroliza hipuratului de Na 2 tubulee mici cu hipurat de Na 1% se pun n ele cultur din plac (se preleveaz cu tampoane mici) A doua zi se adaug sol. de ninhidrin 3,5% Tuburile se introduc la termostat la 370C- 10 min. sau se las pe mas Interpretarea n cazul probei pozitive apare culoarea albstrui-violet, la cele negative culoare galben pai Se preleveaz cultur din agar Columbia cu un tampon Cultura trebuie s fie proaspt i abundent. Hidroliza indoxil acetat Se preleveaz cu ansa, cultur din placa cu agar Columbia se dispune pe suprafaa benzii impregnat cu endoxil acetat i apoi se umecteaz cu ap distilat o pictur43

Interpretare-apare n timp la locul de descrcare al ansei o culoare violet-negru Catalaza- se dispune pe lam o pictur ap oxigenat 3 %, apoi se preleveaz cultura i se dispune pictura, se omogenizeaz i apare reacia de efervescen n cazul reaciei pozitive. Oxidaza- se dispune pe lam hrtie de filtru + reagent pentru oxidaz + cultura i apoi se pune reagentul de oxidaz Interpretare- reacia pozitiv apare culoarea negru violet. Aspecte culturale pe agar Columbia colonii mici,mijlocii n gazon, semitransparente sau semiopace, lucioase (tip S) nehemolitice. Nu este o regul dar de obicei colonii mici, s fie de C. jejuni i colonii mai mari de C. coli. Antibiograma metoda difuzimetric se testeaz sensibilitatea la eritromicina, tetraciclin, streptomicin, ciprofloxacin, gentamicin. Aprecierea concentraiei minime inhibitorii (CMI) se face n funcie de diametrul zonei de inhibiie.

44

CAPITOLUL VIII REZULTATE I DISCUII Menionm faptul c cercetrile noastre au avut drept scop izolarea i identificarea speciei Campylobacter jejuni deoarece este o bacterie cu potenial patogen crescut, capabil s produc toxiinfecii alimentare la om. S-a urmrit apoi testarea rezistenei acestei specii bacteriene la temperatura de refrigerare i congelare. Primele 100 probe de piele din regiunea gtului, din cele 200 recoltate n abator imediat dup sacrificarea puilor, au fost examinate microbiologic n stare proaspt (dup 1-2 ore de la prelevare) i dup refrigerare timp de 72 ore la temperatura de 40C. Celelalte 100 probe au fost examinate n stare proaspt i dup congelate timp de 1 lun la temperatura de -180C. Culturile s-au dezvoltat dup 2-4 zile de incubaie n anaerostat la temperatura de 41,50C. Identificarea culturilor obinute pe mediile speciale de izolare pentru campilobacterii s-a efectuat pe baza caracterele culturale, morfologice, biochimice i a sensibilitii la acid nalidixic i cephalotin, n conformitate cu cerinele STAS SR EN ISO 10272/2/2007. Caracterele culturale Pe agar mCCD coloniile considerate tipice pentru Campylobacter spp. au fost cele de culoare cenuie, uneori cu luciu metalic, plate i umede, cu tendina de a se ntinde de-a lungul striurilor (Fig. nr.12).

45

Fig .12. Mediul mCCD izolare Campylobacter jejuni.

Pe agarul snge Columbia, coloniile transplantate de pe mediul mCCD au format culturi nehemolitice dup 24-48 ore de incubare. n culturile de 24 ore coloniile au avut un diametru de 1-2 mm i uneori au putut fi observate numai la o examinare atent a suprafeei mediului (Fig.nr. 13A). n culturile de 48 ore creterea a fost mai abundent, coloniile ajungnd la un diametru de 4-6 mm.(Fig.13B).

A 46

B Fig .13. Culturi de Campylobacter jejuni pe agar snge Columbia: A cultur de 24 ore; B cultur de 48 ore.

Caracterele morfologice La examenul bacteriilor n stare vie s-au observat bacili curbai, foarte mobili, cu micri de rotaie sau micri anarhice n cmpul microscopic. n frotiurile colorate Gram, efectuate din coloniile caracteristice, de 24 ore, s-au observat celule bacteriene tipice: bacili Gram negativi de 1-2m lungime, n forma literelor S i C (Fig. nr.14).

Fig.14 Campylobacter spp. frotiu din cultur de 24 ore. Coloraie Gram(x1000) 47

n frotiurile efectuate din culturi de 48 ore, pe lng formele caracteristice au fost prezente numeroase forme cocoide, slab colorate, atipice, care reprezint celulele degenerate prin procesul de mbtrnire (Fig. nr.15).

Fig.15 Campylobacter spp. frotiu din cultur de 48 ore. Coloraie Gram(x1000)

Procesul de degenerescen a celulelor bacteriene de Campylobacter spp., determinat de nvechirea culturilor, menionat i n literatur (22), prezint importan practic deoarece n acest stadiu apar nu numai modificri morfologice ci i fiziologice, care ar putea genera erori de identificare. Caracterele biochimice Primul test biochimic care s-a efectuat pe coloniile caracteristice pentru confirmarea genului a fost testul oxidazei. Campilobacteriile sunt oxidaz pozitive, adic n prezena reactivului culturile se coloreaz n mov (Fig.nr. 16).

48

Fig.16. Testul oxidazei

Testul care a servit la departajarea speciei Campylobacter jejuni de celelalte specii ale genului a fost testul de hidroliz a hipuratului de Na pozitiv (Tabelul nr.6).Tabelul nr. 6 TESTE Hidroliza hipuratului de sodiu Hidroliza Endoxil-Acetat Catalaza sol.3% H2O2 Oxidaza Acid nalidixic Cefalotin C.jejuni + + + + S sau R R C.coli + + + S sau R R C lari + + S R C.upsaliensis + (pozitiv sau slab pozitiv) + S sau R S

Rezultatele privind contaminarea carcaselor proaspete de pui broiller cu specia Campylobacter jejuni i efectele procesului de refrigerare asupra acestui contaminant sunt redate sintetic n tabelul nr. 7. Analiza datelor din tabel relev faptul c din cele 100 carcase investigate, 14 carcase (14%) au fost contaminate cu specia Campylobacter jejuni . n urma procesului de refrigerare a carcaselor timp de 72 ore la temperatura de 40C, bacteria a mai fost izolat doar de pe 3 carcase (3%), ceea ce nseamn c la temperatura frigiderului are loc o reducere cu 21 % a acestor germeni.49

Tabelul nr. 7 Prezena speciei Campylobacter jejuni / 25g. piele din regiunea gtului la carcasele proaspete i refrigerate Carcase de Numrul Probe pozitive Probe negative pasre Proaspete Refrigerate probelor 100 100 Nr. 14 3 % 14% 3% Nr. 86 97 % 86% 97%

Rezultatul congelrii asupra bacteriilor din specia Campylobacter jejuni sunt sistematizate n tabelul nr. 8.Tabelul nr. 8 Prezena speciei Campylobacter jejuni / 25g. piele din regiunea gtului la carcasele proaspete i congelate Carcase de Numrul Probe pozitive Probe negative Nr. % Nr. % pasre probelor Proaspete Congelate 100 100 20 7 20% 7% 80 93 80% 93%

Datele din tabel arat c incidena contaminrii cu Campylobacter jejuni la cele 100 probe investigate n stare proaspt, a fost mai mare comparativ cu primele 100 probe (20% fa de 14 %), dar prin procesul de congelare incidena s-a redus cu 35% (fa de numai 21 % prin refrigerare). Per ansamblu, rezultatele cercetrilor efectuate demonstraz c specia Campylobacter jejuni este sensibil la temperaturile sczute, congelarea fiind mai eficient dect refrigerarea (Fig.nr.17).

50

25

20

15

10

t a d e i p . 5 2 / C F U g o l5 0 Campylobacter jejuniCarcase proaspete Carcase refrigerate Carcase congelate

Fig.17. Reprezentarea grafic

Examenele bacteriologice pentru depistarea speciei Campylobacter jejuni n coninutul cecumurilor s-au soldat cu rezultate pozitive la 11 (14,6 %) din cele 75 probe investigate (tabelul nr. 9).Tabelul nr.9Incidena speciei Campylobacter spp. n cecumuriCarcase de pasre Cecumuri Numrul probelor 75 Probe pozitive Nr. 11 % 14,6% Probe negative Nr. 64 % 85,4%

Rezultatele obinute confirm datele din literatur potrivit crora psrile sunt purttoare de Campylobacter spp. i constituie sursa de contaminare a carcaselor n timpul procesului de eviscerare (9).

51

CONCLUZII1. n perioada 2008-2010 au fost investigate bacteriologic 200 carcase pui broiller i

75 probe de coninut cecal n scopul izolrii speciei Campylobacter jejuni i a testrii rezistenei acesteia la temperaturi sczute. 2. Investigaiile s-au desfurat n conformitate cu prevederile STAS SR EN ISO 10272/2/2010.3. Incidena speciei Campylobacter jejuni a fost de 34% pe carcase i 14,6 % n

coninutul ceccumurilor.4. Procesul de refrigerare a redus incidena speciei Campylobacter jejuni pe carcase

cu 21%, iar procesul de congelare cu 35%.

52

BIBLIOGRAFIE 1. Apostu S., 2006 Microbiologia produselor alimentare. Vol. I.,Editura Risoprint, Cluj Napoca. 2. Atanassova Viktoria and Christian Ring , 1999 Prevalence of Campylobacter spp., in poultry and poultry meat in Germania, Mirobiology. Vol.51, pag. 187-190. 3. Baqar S. i col., Immunogenicity and protective efficacy of a prototype Campylobacter killed whole-cell vaccine in mice. 4. Brzoi D., 1985 Microbiologia produselor alimentare de origine animal, Ed. Ceres, Bucureti. 5. Brzoi D., Meica I., Marian Negu, 1999 Toxiinfecii alimentare, Ed. Diacon Coresi, Bucureti. 6. Brzoi D., 1985 Toxiinfecie alimentar frecvent dar puin cunoscut, produs de Campylobacter fetus subsp. Jejuni. Rev. De creterea animalelor, 8,55. 7. Brzoi D., Natalia Maier, Lidia Tulu, 1985, Incidena bacteriei C. jejuni n unele produse de origine animal. Lucrare prezentat la L.C.C.P.O.A.F. Bucureti. 8. Bondoc I.,indilar E.V.,2002- Controlul sanitar veterinar al calitii i salubritii alementelor. Vol. I Editura Ion Ionescu de la Brad Iai. 9. Creu Carmen, 2009 Cercetri privind dinamica microflorei din carnea de pasre proaspt refrigerat i congelat n funcie de pH i temperatur. Tez de Doctorat, F.M.V. Iai. 10. Guguianu E., 2002 Bacteriologie general, Casa de Editur Venus, Iai

53

11. Handan A. Dincer and Taner Baysal, 2004 Decontamination Technizues of Pathogen Bacteria in Meat and Poutry, Critical Reviews in Microbiology, 30: 197-204. 12. Ienitea C., 1982 Procedeu simplu de izolare i studiere a bacteriilor anaerobe, Bact. Virus. Parazit. Epidemiol.,Vol.27, Nr. 1, p. 29. 13. O.M.S., 1984 Raportul Organizaiei Mondiale a Sntii asupra sntii publive veterinare privind prevenirea i combaterea infeciilor produse de Campylobacter.Reuniunea de la Moscova, 20-22 febr. 14. Perianu T., 2003 Boli infecioase ale animalelor. Bacterioze. Vol. I, Editura Venus, Iai. 15. Pun L. i col., 1983 Infecia cu Campylobacter v. jejuni. Studiu clinic pe 60 cazuri. Viaa Medical, 30,125. 16. Rusu V., C. Niulescu, M. Kovaci, 1986 Incidena C. jejuni/coli la porcine i psri. Bacteriol., 31,303, Bucureti. 17. Rusu V., i col., 1988 Infecii sistemice cu Campylobacter jejuni. Viaa Medical, 34, 87.. 18. Salloway S. i col., 1996 Miller-Fisher syndrome associated with Campylobacter jejuni bearing lipopolysaccharide molecules that mimic human ganglioside GD -3.Inf.Immun.,, 64,2945. 19. STAS SR EN ISO 10272/2/2007 Microbiologia alimentelor i nutreurilor. Metode orizontale pentru detectarea i enumerarea Campylobacter spp.Partea 1: Metod de detectare. 20. Stern N.J. i col, 1992- A differential selective medium and dry icegenerated atmosphere for recovery of Campylobacter jejuni, 55,514. 21. indilar E., 1996 Expertiza sanitar veterinar a produselor de origine animal vol. I Editura CENTRAL Chiinu, Republica Moldova. 22. Timofte Dorina,1998 Cercetri bacteriologice asupra Genului Campylobacter izolat de la animale i implicaii epidemiologice. Tez de Doctorat, F.M.V Iai.54

55