1

TEHNICI MODERNE ÎN BIOLOGIA CELULARĂ

2

STUDIUL PROCESELOR CELULARE

2 aspecte:2 aspecte:

Tehnici si metode adecvate de Tehnici si metode adecvate de urmurmăărire a fenomenelor celulare rire a fenomenelor celulare

Modelarea experimentalModelarea experimentalăă a a fenomenelor celulare fenomenelor celulare

3

MODALITĂŢI DE STUDIU

1.     1.     in vivoin vivo

2.     2.     in situ in situ

3.     3.     in vitroin vitro

4

MODALITĂŢI DE STUDIU

in vivoin vivo - cand celulele sau organele ale carui - cand celulele sau organele ale carui celule dorim sa le studiem sunt abordate in celule dorim sa le studiem sunt abordate in organismul intactorganismul intact. .

Avantaje: rezultatele obţinute sunt edificatoare Avantaje: rezultatele obţinute sunt edificatoare pentru procesul studiat la nivel de organismpentru procesul studiat la nivel de organism

Dezavantaje: rDezavantaje: rezultatele experimentelor suntezultatele experimentelor sunt dificil de interpretat dificil de interpretat datorită datorită influen influenţţeleloror celorlalte componente ale organismuluicelorlalte componente ale organismului

5

MODALITĂŢI DE STUDIUin situ in situ – cand organul de interes este – cand organul de interes este

mentinut la locul sau in organism dar mentinut la locul sau in organism dar sunt controlate unele influente cum sunt controlate unele influente cum sunt cele nervoase sau endocrinesunt cele nervoase sau endocrine

Avantaje: se pot studia variaţiile Avantaje: se pot studia variaţiile procesului în condiţii controlateprocesului în condiţii controlate

Dezavantaje: nu se poate identifica Dezavantaje: nu se poate identifica rezultatul cu cel în vivorezultatul cu cel în vivo

6

MODALITĂŢI DE STUDIU

in vitroin vitro – cand organul , – cand organul , ţţesutul sau esutul sau celulele sunt izolate din organism celulele sunt izolate din organism

Avantaje: Avantaje: se permite un control se permite un control riguros al experimentului.riguros al experimentului.

Dezavantaje: nu se poate garanta Dezavantaje: nu se poate garanta obţinerea aceloraşi rezultate in obţinerea aceloraşi rezultate in vivo.vivo.

7

Tehnici in vitro

Baia de organBaia de organ

Cultura de celuleCultura de celule

8

Baia de organ

- - permite men permite menţţinerea viabilitinerea viabilităţăţii unor ii unor fragmente de organ sau fragmente de organ sau ţţesuturi.esuturi.

--variate îvariate în funcn funcţţie de organul supus ie de organul supus experimentuluiexperimentului

-- asigurasigurăă o temperatura constant o temperatura constantăă , , oxigenarea materialului biologic , oxigenarea materialului biologic , posibilitatea controlposibilitatea controlăării compozirii compoziţţiei mediului iei mediului din baie din baie şşi culegerea de date funci culegerea de date funcţţionale ionale şşi i eeşşantioaneantioane

9

Culturi de celule - Etape DigestiaDigestia enzimatica enzimatica a tesutului cu obtinerea a tesutului cu obtinerea

unei suspensii de celule unei suspensii de celule   IzolareaIzolarea unei pop unei popuulalaţţii celulare pureii celulare pure   IInsnsăămmâânnţţareaarea îîn flacoane de culturn flacoane de culturăă sau sau

plplăăci Petri obci Petri obţţininâându-se astfel o culturndu-se astfel o culturăă primarprimarăă

Pasarea Pasarea -- resuspendarea celulelor din resuspendarea celulelor din cultura primara urmatcultura primara urmatăă de de de de rereîînsnsăămmâânnţţarea area îîn flacoane de culturn flacoane de culturăă sau sau plplăăci Petri obci Petri obţţininâându-se culturi secundarndu-se culturi secundaree

10

Culturi celulare - Evoluţie

1.1.       Faza de lagFaza de lag sau de induc sau de inducţţie ie - - celulele celulele îşîşi i refac suprafarefac suprafaţţa a şşi se acomodeazi se acomodeazăă cu cu mediul de culturmediul de culturăă

2.2.    FFaza exponenaza exponenţţialialăă - - celulele se divid celulele se divid rapid, exponenrapid, exponenţţialial

3.3.     Faza staFaza staţţionarionarăă - - nnumăumărrulul de celule de celule rrăămmââne constant. In aceastne constant. In aceastăă faz fazăă se se efectueazefectueazăă pasarea pasarea

4.4. Faza de declinFaza de declin - - scscăăderea nr. de celule derea nr. de celule datoritdatorităă îîmbmbăătrtrâânirii nirii şşi mori morţţii . ii .

11

Medii de cultură - Componente

1.1.   AmimoaciziAmimoacizi şi v şi vitamineitamine

2.2. SSăăruri – necesare menruri – necesare menţţinerii echilibrului inerii echilibrului ionic ionic şşi pH mediului de culturi pH mediului de culturăă

3.3. Glucoza pentru necesarul energeticGlucoza pentru necesarul energetic

4.4.   Ser fetalSer fetal

5.5. AntibioticeAntibiotice

6.6. Rosu fenol ca indicator de pHRosu fenol ca indicator de pH

12

1.1. MMorfologia si morfometriaorfologia si morfometria2.2. Citometria in fluxCitometria in flux 3.3. Fractionarea celularaFractionarea celulara 4.4. Citochimia si citoenzimologiaCitochimia si citoenzimologia5.5. ImunocitochimiaImunocitochimia 6.6. Fluorescenta si imunofluorescentaFluorescenta si imunofluorescenta7.7. Microfiziologia si microinjectiaMicrofiziologia si microinjectia 8.8. RadioautografiaRadioautografia 9.9. Metode biochimiceMetode biochimice10.10. Tehnici si metode de biologie Tehnici si metode de biologie

molecularamoleculara

13

MORFOMETRIA

- utilizează un utilizează un analizor de imagineanalizor de imagine. . - se stabileşte se stabileşte criteriul dupa care se va criteriul dupa care se va

efectua analizaefectua analiza, precum şi limitele maximă , precum şi limitele maximă şi minimă ale acestuiaşi minimă ale acestuia

- Rezultat: Rezultat: diferitdiferitee popula populaţţii celulare.ii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub Rezultatul analizei cantitative este afisat sub forma unei histograme.forma unei histograme.

14

Citometria în flux

- - ppeermite analiza rmite analiza şşi separarea celulelor pe i separarea celulelor pe baza unor caractere morfologice baza unor caractere morfologice şşi i biochimicebiochimice

OferOferăă informa informaţţii asupra :ii asupra :

1.     m1.     măărimii relative a celulelorrimii relative a celulelor

2.     granularit2.     granularităţăţii interne (neomogenitatea ii interne (neomogenitatea interninternăă citoplasmatic citoplasmaticăă) relativ) relativăă

3.     intensitatea relativ3.     intensitatea relativăă a fluorescen a fluorescenţţeiei..

15

Citometria în flux - utilitate1.     1.     mmăăsurarea caracteristicilor fizice ale surarea caracteristicilor fizice ale

celuleicelulei2.     identificarea si separarea popula2.     identificarea si separarea populaţţiilor iilor

de celule sanguine ( granulocite, monocite de celule sanguine ( granulocite, monocite , limfocite T sau B), limfocite T sau B)

3.     m3.     măăsurarea cantitsurarea cantităţăţii de ADii de ADNN din celul din celulăă4.     m4.     măăsurarea cantitsurarea cantităţăţii intracelulare de Caii intracelulare de Ca5.     masurarea pH-ului intracelular5.     masurarea pH-ului intracelular  

16

Citometria in flux

17

Fracţionarea celulară

- - tehnictehnicăă ce permite izolarea ce permite izolarea diferitelor elemente ultrastructurale diferitelor elemente ultrastructurale si biochimice ale celulelorsi biochimice ale celulelor

18

Fracţionarea celulară - Etape

      Omogenizarea Omogenizarea –distrugerea –distrugerea integritintegrităţăţii tisulare ii tisulare şşi apoi celulare cu i apoi celulare cu obobţţinerea unei suspensii de organite inerea unei suspensii de organite şşi membrane veziculate i membrane veziculate îîn mediul de n mediul de omogenizareomogenizare

Separarea Separarea prin centrifugare prin centrifugare şşi/ sau i/ sau ultracentrifugareultracentrifugare

19

OMOGENIZAREA

a.   prin a.   prin soc osmoticsoc osmotic.. Diferen Diferenţţa de osmolaritate a de osmolaritate îîntre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea ntre mediul i.c. si cel e.c. duce la umflarea celulelor pana la ruperea membranelor. celulelor pana la ruperea membranelor.

b.   prin b.   prin ultrasonicare ultrasonicare – presupune ruperea – presupune ruperea membranelor sub acmembranelor sub acţţiunea undelor ultrasoniceiunea undelor ultrasonice

c.    c.    cu omogenizatoarecu omogenizatoare se realizeaza sub se realizeaza sub acacţţiunea foriunea forţţelor de frecare elor de frecare şşi torsiune care i torsiune care contribuie la ruperea membranelor. contribuie la ruperea membranelor.

20

SEPARAREA

        diferendiferenţţialialăă – cand organitele se – cand organitele se depun la baza tubului , depun la baza tubului , îîn ordinea n ordinea densitdensităţăţii lor prin centrifugari repetate ii lor prin centrifugari repetate la forla forţţe din ce e din ce îîn ce mai marin ce mai mari

îîn gradient de densitaten gradient de densitate –printr-o –printr-o singursingurăă centrifugare la for centrifugare la forţţe suficient e suficient de ridicate se obde ridicate se obţţin organitele ca fracin organitele ca fracţţii ii separate . separate .

21

NUC LEI

Ultra so n ic a re

M ito c o nd rii

Lizo zo m i

M e m b ra nec e lu la reG o lg i

m ic ro so m i

Rib o so m i re tic u l e nd o p la sm ic

Purific a re in g ra d ie ntd e d e nsita te

Se p a ra re a c o nstitue n tilo rc e lu la ri p rin vite ze d e c e ntri-fug a re c re sc a nd e

22

AUTORADIOGRAFIA

  --tehnica de investigare celulartehnica de investigare celularăă ce permite ce permite identificarea morfologicidentificarea morfologicăă şşi ultrastructurali ultrastructuralăă a a unor compuunor compuşşi radioactivi.i radioactivi.

trasori radioactivi trasori radioactivi : : - aminoacizi, glucide, nucleotideaminoacizi, glucide, nucleotide - fosfat sau sulfat radioactiv fosfat sau sulfat radioactiv

- liganzi radioactivi specificiliganzi radioactivi specifici

Marcarea unor Marcarea unor componente componente celularecelulare

receptori sau receptori sau anticorpi radioactivianticorpi radioactivi

23

METODE BIOCHIMICE

ELECTROFOREZAELECTROFOREZA

IMUNOELECTROFOREZAIMUNOELECTROFOREZA

TRANSFERUL ELECTROFORETICTRANSFERUL ELECTROFORETIC

24

ELECTROFOREZA

PRINCIPIU: PRINCIPIU: particulele particulele îîncncăărcate rcate electric migreazelectric migreazăă îîntr-un mediu ntr-un mediu vvââscos , sub acscos , sub acţţiunea unui ciunea unui cââmp mp electric.electric.

Aplicaţii practice:Aplicaţii practice: studiul proteinelor studiul proteinelor şşi a i a acizilor nucleici.acizilor nucleici.

25

ELECTROFOREZA PROTEINELOR

a.  a.      unidimensionalunidimensionalăă , cand migrarea se , cand migrarea se realizeazrealizeazăă îîn gel n gel îîntr-o singntr-o singuurrăă direc direcţţieie

b.    b.    bidimensionalbidimensionalăă , c , câând migrarea se nd migrarea se realizeazrealizeazăă succesiv succesiv îîn doun douăă direc direcţţiiii

Aplicaţii practice – electroforeza Aplicaţii practice – electroforeza unidimensionalăunidimensională

SDS – PAGESDS – PAGE FOCALIZAREA IZOELECTRICAFOCALIZAREA IZOELECTRICA

26

ELECTROFOREZA SDS-PAGE

--realizeazrealizeazăă separarea proteinelor dintr-un separarea proteinelor dintr-un amestec pe baza gabaritului molecular amestec pe baza gabaritului molecular direct propordirect proporţţional cu masa molecularional cu masa molecularăă..

PrincipiuPrincipiu: : adsorbadsorbţţiiaa dodecilsulfat dodecilsulfatuluiului de de sodiu unitar pe proteinesodiu unitar pe proteine,, realiz realizâând o nd o densitate de sarcindensitate de sarcinăă negativ negativăă uniform uniformăă. .

27

ELECTROFOREZA SDS-PAGE

28

Focalizarea izoelectrica

- separarea proteinelor dintr-un amestec separarea proteinelor dintr-un amestec se face pe baza punctului lor izoelectric.se face pe baza punctului lor izoelectric.

Principiu: migrarea pPrincipiu: migrarea protroteeinelineloror îîn funcn funcţţie ie de punctul izoelectric, de punctul izoelectric, până în până în zona cu zona cu pH-ul identic cu cel al punctului lor pH-ul identic cu cel al punctului lor izoelectricizoelectric, unde, unde devin neutre oprindu- devin neutre oprindu-şşi i miscarea.miscarea.

29

Focalizarea izoelectrica

Benzi p ro te ic e la p unc tul izoe le c tric

30

Electroforeza bidimensionala--migrarea proteinelor migrarea proteinelor îîn doun douăă direc direcţţii :ii :

1.     in prima direc1.     in prima direcţţie ie îîn funcn funcţţie de punctul lor ie de punctul lor izoelectric izoelectric -- FOCALIZARE IZOELECTRICA FOCALIZARE IZOELECTRICA

2.     a doua direc2.     a doua direcţţie ie -- SDS – PAGE , SDS – PAGE , îîn funcn funcţţie ie de greutatea molecularde greutatea molecularăă a proteinelor. a proteinelor.

Rezultatul se prezinta sub forma uneiRezultatul se prezinta sub forma unei h hăărrţţi cu i cu proteinele separate proteinele separate îîn planul gelului.n planul gelului.

31

Electroforeza bidimensionala

Ele c tro fo reza la p unc t izoe le c tric

SDS-

32

IMUNOELECTROFOREZA

  - - o varianto variantăă a electroforezei ce combin a electroforezei ce combinăă migrarea migrarea îîn cn cââmp electric a proteinelor cu mp electric a proteinelor cu realizarea unei reactii imune realizarea unei reactii imune de tip Ag-Acde tip Ag-Ac

Reactia imunaReactia imuna::

--dupa terminarea migrarii electroforetice, dupa terminarea migrarii electroforetice,

--concomitent concomitent ((imunoelectroforeza imunoelectroforeza îîn rachetn rachetă) -ă) - apreciere cantitativapreciere cantitativăă a Ag a Ag ((== supraf suprafaţaaţa descris descrisăă de linia de precipitare cu linia de startde linia de precipitare cu linia de start)). .

33

IMUNOELECTROFOREZA

34

TRANSFERUL ELECTROFORETIC

--metodmetodăă de extragere a proteinelor de extragere a proteinelor separate electroforetic dintr-un gel , cu separate electroforetic dintr-un gel , cu adsorbirea lor pe niste hadsorbirea lor pe niste hâârtii cu rtii cu proprietproprietăţăţi speciale.i speciale.

Proteinele Proteinele suferă suferă reacreacţţii de recunoaii de recunoaşştere tere specificspecificăă prin intermediul unor prin intermediul unor interacinteracţţiuni de tip receptor – ligand sau iuni de tip receptor – ligand sau Ag – AAg – Acc. .

35

Bloturile

- Metodă de transfer a unor proteine, Metodă de transfer a unor proteine, secvente ADN sau ARN, dintr-un gel secvente ADN sau ARN, dintr-un gel electroforetic pe un suport care permite electroforetic pe un suport care permite vizualizarea lor ulterioarăvizualizarea lor ulterioară

- Utilizate pentru identificarea prezenţei Utilizate pentru identificarea prezenţei unor proteine/ secvenţe ADN într-un unor proteine/ secvenţe ADN într-un lizat celularlizat celular

36

Southern Blot

- Utilizat pentru identificarea unei anumite Utilizat pentru identificarea unei anumite secvenţe ADN, prin folosirea unei probe secvenţe ADN, prin folosirea unei probe ce conţine secvenţa complementară ce conţine secvenţa complementară celei căutate.celei căutate.

- Proba de hibridizare este marcată Proba de hibridizare este marcată fluorescent sau radiografic, permiţând fluorescent sau radiografic, permiţând depistarea ulterioară a preparatelor care depistarea ulterioară a preparatelor care conţin secvenţa căutatăconţin secvenţa căutată

37

Northen Blot

- Detectarea anumitor secvente de ARNDetectarea anumitor secvente de ARN- Similară ca procedură Southern Blot –Similară ca procedură Southern Blot –

uluiului- Furnizează informaţii legate de Furnizează informaţii legate de

exprimarea anumitor gene în anumite exprimarea anumitor gene în anumite populaţii celularepopulaţii celulare

38

Western Blot

- identificarea unei anumite identificarea unei anumite proteine într-un omogenizat proteine într-un omogenizat tisulartisular-Proteinele din preparat sunt Proteinele din preparat sunt separate prin electroforeză în separate prin electroforeză în gel, apoi transferate pe o gel, apoi transferate pe o membrană suport unde, prin membrană suport unde, prin adăugarea Ac specific, se va adăugarea Ac specific, se va identifica prezenţa/absenţa identifica prezenţa/absenţa proteinei sau cantitatea ei în proteinei sau cantitatea ei în proba dată.proba dată.

39

Western Blot

Utilizări:Utilizări: Cea mai folosită metodă pentru Cea mai folosită metodă pentru

determinare cantitativă de proteinedeterminare cantitativă de proteine Oferă informaţii legate de modificarea Oferă informaţii legate de modificarea

cantitativă a unei proteine în funcţie de cantitativă a unei proteine în funcţie de tipul celular sau tratamentele aplicate tipul celular sau tratamentele aplicate unei populaţii celulareunei populaţii celulare

40

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

- Folosită pentru obţinerea unui număr mare - Folosită pentru obţinerea unui număr mare de copii a unei anumite secvenţe de ADNde copii a unei anumite secvenţe de ADN

EtapeEtape

1. denaturarea ADN cu separarea catenelor 1. denaturarea ADN cu separarea catenelor complementarecomplementare

2. adaugarea primerilor (secvenţe ADN 2. adaugarea primerilor (secvenţe ADN complementare secvenţei-ţintă)complementare secvenţei-ţintă)

3. sub acţiunea Taq-polimerazei se 3. sub acţiunea Taq-polimerazei se sintetizează noi secvenţe de ADN dcsintetizează noi secvenţe de ADN dc

41

42

RT – PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE PCR)

- Metodă foarte sensibilă de detectare şi Metodă foarte sensibilă de detectare şi cuantificare a ARNmcuantificare a ARNm

- Iniţial din ARN-ul ţintă se sintetizează Iniţial din ARN-ul ţintă se sintetizează secvenţa cADN, apoi urmează etapele PCRsecvenţa cADN, apoi urmează etapele PCR

- Utilizată în diagnosticul unor boli genetice, Utilizată în diagnosticul unor boli genetice, cuantificarea expresiei diverselor gene prin cuantificarea expresiei diverselor gene prin determinarea cantităţii de ARNm determinarea cantităţii de ARNm

43

Animale transgenice

- Animale de laborator cărora li se inseră Animale de laborator cărora li se inseră gene mutante pentru a studia efectul lor gene mutante pentru a studia efectul lor asupra organismului gazdă.asupra organismului gazdă.

- Mediu de studiu pentru evoluţia unor boli cu Mediu de studiu pentru evoluţia unor boli cu determinism genic şi a opţiunilor terapeuticedeterminism genic şi a opţiunilor terapeutice

44

Animale de laborator transgenice

45

Animale knockout

- Înlocuirea genei de interes cu o genă Înlocuirea genei de interes cu o genă inactivă sau o alelă mutatăinactivă sau o alelă mutată

- Animalul purtător nu va exprima Animalul purtător nu va exprima această genă, putându-se studia efectul această genă, putându-se studia efectul absenţei ei in organism.absenţei ei in organism.

46

leptin knockout mouse