linfoma canino: classificaÇÃo histopatolÓgica ... · universidade federal de goiÁs escola de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
LINFOMA CANINO: CLASSIFICAÇÃO HISTOPATOLÓGICA,
IMUNOFENOTIPAGEM E EXPRESSÃO DE p53
Ricardo Guimarães Pecego
Orientador: Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno
GOIÂNIA
2012
ii
RICARDO GUIMARÃES PECEGO
LINFOMA CANINO: CLASSIFICAÇÃO HISTOPATOLÓGICA,
IMUNOFENOTIPAGEM E EXPRESSÃO DE p53
Dissertação apresentada para
obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás
Área de concentração:
Patologia, clínica e cirurgia animal
Orientador:
Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno
Comitê de orientação:
Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo – EVZ/UFG
Prof. Dr. David Jendiroba – FM/UFG
GOIÂNIA
2012
iii
RICARDO GUIMARÃES PECEGO
Dissertação defendida e aprovada em 21/12/2012, pela Banca
Examinadora constituída pelos professores:
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AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Adilson Damasceno, agradeço por toda
disponibilidade, orientação, apoio ao desenvolvimento deste tema e pela grande
amizade que se formou.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araujo pela
transmissão de conhecimento que permitiram a realização desta dissertação.
Ao meu amigo e também Co-orientador Prof. Dr. David Jendiroba (in
memoriam) pelo profissionalismo e pela grande sabedoria.
Aos professores da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG, em
especial ao Setor de Patologia Animal, pela disponibilidade e pelo ambiente de
camaradagem, pelo profissionalismo vivido e pelas experiências compartilhadas.
Um especial agradecimento à Vanessa da Cruz Pimenta, pelo carinho e por estar
sempre presente quando precisei.
À Yandra Cássia Lobato do Prado pela ajuda na realização da
imunoistoquímica.
Às estagiárias Juliana Carvalho de A. Borges e Patricia de Almeida
Machado pela disponibilidade, colaboração e comprometimento com o projeto. Ao
Danilo Rezende e Silva pela colaboração com a leitura e fotografias das lâminas
histológicas.
Ao Dr. Sebastião Alves Pinto do Laboratório de Anatomia Patológica do
INGOH, pelo inestimado auxílio na confecção e leitura das lâminas histológicas.
Ao Prof. Marcos de Almeida Souza e ao Prof. Edson Molleta Colodel,
do Laboratório de Patologia Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária da Universidade Federal do Mato Grosso por terem cedido gentilmente
as amostras.
À minha companheira de todos os momentos, Vanuzza Correa Costa,
pelo apoio e pela paciência sempre demonstrada.
À minha família, meus filhos, meus irmãos e em especial a meus pais
pelo melhor que me proporcionaram, amor, caráter e educação. Beijo no coração.
v
Enfim, a todos que colaboraram direta ou indiretamente e que por um
equívoco não foram citados, mas que tiveram importância na realização deste
trabalho.
vi
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA .......................................................... 1
1.1 Aspectos gerais do Linfoma Canino .................................................................. 1
1.2 Proteína p53...................................................................................................... 7
1.2.1 Mutação da p53 ............................................................................................. 9
1.2.2 Inibição da função da p53 ............................................................................ 10
1.3 Referências ..................................................................................................... 11
1.4 Objetivos ......................................................................................................... 17
1.4.1 Geral ............................................................................................................ 17
1.4.2 Específicos ................................................................................................... 17
CAPÍTULO 2 – PERFIL DE EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE p53 EM
DIFERENTES TECIDOS DE CÃES COM LINFOMA T E B .................................. 18
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 21
Obtenção das amostras ........................................................................................ 21
Histologia .................................................................. Erro! Indicador não definido.
Imunoistoquímica .................................................................................................. 22
RESULTADOS ...................................................................................................... 24
Histologia .............................................................................................................. 24
Imunofenotipagem ................................................................................................ 26
Expressão de p53 ................................................................................................. 29
DISCUSSÃO ......................................................................................................... 32
CONCLUSÃO ....................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 35
CAPÍTULO 3 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................... 41
vii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
Figura 1 - Fotomicrografia de tecidos caninos com linfoma maligno (HE, obj. 40x). (A) linfoma difuso de grandes células pleomórfico (LDGC) de partes moles mostrando células grandes monomorfas com nucléolos proeminentes e citoplasma basofílico; (B) linfoma de Burkitt em linfonodo tipicamente composto de células linfóides de tamanho médio com uma fração elevada de proliferação, entremeada de macrófagos contendo debris celulares (seta); (C) linfoma T angio-imunoblástico de pele, mostrando células de morfologia variável, incluindo células “claras“ atípicas com núcleo dentado e citoplasma abundante e pálido; (D) linfoma de zona marginal esplênico (LZME) caracterizado pela presença de células pequenas centrocíticas-like, células monocitóides, linfócitos e plasmócitos................................................................... 25
Figura 2 - Fotomicrografia de tecidos caninos com linfoma maligno imunomarcados com anticorpos anti-CD79a (CD79a+; anti-B) e anti-CD3 (CD3+; anti-T) (IHQ - DAB com hematoxilina; obj. 40x). Linfoma de Burkitt em linfonodo exibindo marcação positiva para CD79a (A) e negativa para CD3 (B) em linfócitos neoplásicos; Linfoma de grandes células em pele, padrão paniculítico, apresentando marcação negativa para CD79a (C) e positiva para CD3 (D); Linfoma difuso de grandes células pleomófico (LDGC) em partes moles caracterizado por marcação positiva para CD79a (E) e CD3 (F), denominada dupla marcação...................... 28
Figura 3 - Fotomicrografia representativa da expressão imunoistoquímica de p53 positiva em linfoma de células T em pele (A), linfoma de células B em pele (B), linfoma de células T e B em partes moles (C) e negativa em linfoma de células T em pulmão (D) (IHQ - DAB sem hematoxilina; obj. 40x)................................................... 31
viii
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 1
Quadro 1 - Sistema de estágios clínicos para linfoma maligno em animais domésticos segundo a OMS ……………………………………….. 3
Quadro 2 - Classificação histológica dos tumores do sistema linfóide dos animais domésticos segundo a OMS ……………………………... 5
CAPÍTULO 2
Quadro 1 - Especificações dos anticorpos primários anti-CD79a, anti-CD3 e anti-p53 utilizados na técnica de imunoistoquímica para linfoma em diferentes tecidos caninos…………………………………………………. 23
Quadro 2 - Resultado da análise histológica e da imunofenotipagem das amostras de tecidos caninos (n=26) com linfoma não-Hodgkin conforme a Classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS)... 27
Quadro 3 - Média da marcação da proteína p53 expressa na unidade pixels/polegada, em ordem decrescente, em amostras (n=26) de tecidos caninos com linfoma não-Hodgkin conforme a Classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS)………………………………. 30
ix
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 - Resultado dos testes de normalidade e da análise de variância das médias de expressão da densidade óptica (pixels/polegada) de marcação da proteína p53 em amostras (n=26) de tecidos caninos com linfoma...................................................................... 31
x
RESUMO
O linfoma representa uma das mais frequentes neoplasias encontradas em cães. Para definição dos tipos histológicos de linfoma em animais recomenda-se a classificação da Organização Mundial da Saúde. Contudo, a imunofenotipagem deve ser empregada para determinar a presença de uma população homogênea de células de mesmo fenótipo (T ou B) com vistas ao prognóstico e tratamento. Ademais, ainda para fins de prognóstico, pode-se avaliar o perfil de expressão imunoistoquímica da proteína p53 mutante, que aumentada induz a perpetuação de linhagens celulares anormais. O objetivo do estudo foi determinar o imunofenótipo dos linfomas caninos classificados pela OMS e relacionar os subtipos histológicos com a imunoexpressão da p53. Neste sentido, vinte e seis blocos de parafina contendo fragmentos de diferentes tecidos de cães foram classificados por meio de histologia e imunofenotipagem e avaliados quanto a expressão de p53 por imunoistoquímica. O linfoma estava presente em diversos tecidos caninos, partes moles (26,9%), pele (19,2%), baço (19,2%), fígado (7,7%), tecidos linfoides (7,7%), rim (7,7%), sistema nervoso central (3,8%), pulmão (3,8%) e linfonodo (3,8%). Na imunofenotipagem verificou-se que a maioria foi do tipo B (57,7%), sendo que o tipo T correspondeu a 34,6% e duas amostras (7,7%) apresentaram dupla marcação. A expressão de p53 foi detectada em 18 amostras (69,2%), sendo 10 amostras (38,5%) de linfoma de células B e 6 amostras (23,1%) de linfoma de células T. Oito amostras (30,7%) foram negativas para a expressão da p53. As amostras que apresentaram dupla marcação para T e B expressaram marcação para p53 (7,7%). Não houve diferença na expressão imunoistoquímica da proteína p53 nos diferentes subtipos histológicos de linfoma de células B e T em diferentes tecidos de cães.
Palavras-chave: antígeno CD3, antígeno CD79, canidae, imunofenotipagem,
linfoma maligno, linfoma não Hodgkin, neoplasias
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ABSTRACT
Lymphoma is one of the most frequent neoplasms in dogs. Histological types of lymphoma in animals are determinated according to the classification recommended by the World Health Organization. However, immunophenotyping should be used to determine the presence of a homogeneous population of cells with the same phenotype (T or B) aiming at prognosis and treatment. Moreover, for prognostic purposes, the immunohistochemical expression profile of mutant p53 protein, whose elevation induces the perpetuation of abnormal cell lines, should be evaluated. The purpose of the present study was to determine the immunophenotype of canine lymphomas classified according to the WHO Classification and associate the histological subtypes with immunoexpression of p53. Thus, twenty-six paraffin blocks with fragments of different tissues of dogs were classified by means of histology and immunohistochemical and evaluated for p53 expression by immunohistochemistry. Lymphoma was present in various canines tissues, soft tissues (26.9%), skin (19.2%), spleen (19.2%), liver (7.7%), lymphoid tissues (7.7%), kidney (7.7%), central nervous system (3.8%), lungs (3.8%) and lymphnode (3.8%). Immunophenotyping study revealed that most of them were B-cell lymphoma (57.7%), and 34.6% were T-cell lymphoma and two samples (7.7%) showed double staining. Expression of p53 was detected in 18 samples (69.2%), ten samples (38.5%) were B-cell lymphoma and six samples (23.1%) were T-cell lymphoma. Eight samples (30.7%) were negative for p53 expression. The samples that showed double staining for T and B expressed marking for p53 (7.7%). There were no differences in immunohistochemical expression of p53 protein in the histologic subtypes of B-cell lymphoma and T-cell lymphoma in different tissues of dogs.
Keywords: antígen CD3, antígen CD79, canidae, immunophenotyping, malignant
lymphoma, neoplasms, non Hodgkin lymphoma.
CAPÍTULO 1 – REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Aspectos gerais do Linfoma Canino
O linfoma, também conhecido como linfoma maligno, linfossarcoma ou
linfoma não-Hodgkin (LNH), corresponde a um grupo de neoplasias que têm em
comum sua origem nas células linfóides que sofrem transformação na fase de
desenvolvimento. Os órgãos linfóides primários, como timo e medula óssea, e os
órgãos linfóides secundários, como baço e linfonodos, são os principais sítios da
transformação neoplásica, mas pode ocorrer em quase todos os órgãos do corpo
(VAIL & YOUNG, 2007).
O linfoma representa uma das mais frequentes neoplasias
encontradas em cães (GREENLEE et al., 1990). A incidência anual nos Estados
Unidos tem sido estimada em 13 a 24 casos por 100.000 cães, sendo que para
idades específicas estima-se 1,5 casos por 100.000 cães com menos de 1 ano
de idade e 84 casos por 100.000 em idades variando entre 10 e 12 anos. Além
disso, verifica-se que o linfoma atinge cães das mais variadas raças, como
Boxer, Rottweiller, Poodle, Beagle, São Bernardo entre outros (DHALIWAL et al.,
2003), representando 83% dos tumores de origem hematopoética e 24% de
todas as formas de câncer (VAIL & YOUNG, 2007). Um baixo risco de ocorrência
tem sido relatado em fêmeas não castradas mas, a maioria das pesquisas
mostra que o gênero não é um fator importante de risco (PARODI et al., 1968;
PRIESTON & MCKAY, 1980).
A etiologia do linfoma no homem tem como fatores, a predisposição
genética, a exposição a agentes carcinogênicos e virus, que levam à ativação de
proto-oncogenes e/ou à inativação de genes supressores de tumor, facilitando o
desenvolvimento da neoplasia. Em cães, a causa do linfoma ainda é
desconhecida mas, acredita-se que seja de origem multifactorial, sendo que as
causas mais prováveis estão ligadas a aberrações cromossomiais, à
imunossupressão crônica e à exposição a agentes químicos (solventes
orgânicos, herbicidas, dentre outros). Ainda, pelo fato de que há muitos anos o
2
compartilhamento do espaço de convivência entre seres humanos e caninos tem
se mostrado mais íntimo ou próximo, o papel de fatores ambientais deve ser
melhor avaliado nos estudos epidemiológicos do linfoma canino (VAIL &
YOUNG, 2007).
Seguindo a proposta da Organização Mundial de Saúde (OMS), o
linfoma canino é classificado anatomicamente, de acordo com sua origem, em
multicêntrico, mediastinal, alimentar, cutâneo e extranodal (VONDERHAAR &
MORRISON, 2002). A mais comum, ocorrendo em mais de 80% dos casos, é
multicêntrica, seguida da alimentar, mediastínica e cutânea. A forma extranodal é
menos prevalente, inferior a 18% dos casos (PONCE et al., 2010) e pode ocorrer
em qualquer tecido ou órgão que não os órgãos linfóides (VAIL & YOUNG,
2007).
O estadiamento do linfoma em animais domésticos proposto pela
OMS compreende a extensão da doença em outros órgãos e a sintomatologia
(Quadro 1), fundamentando-se em parâmetros clínicos, laboratoriais, exames de
imagens e avaliação histopatológica (GREENLEE et al., 1990). Os
estadiamentos mais frequentes em cães são os quadros mais avançados, III, IV
e V, em virtude da provável inabilidade dos proprietários em identificar as
manifestações da doença em fase inicial, o que reflete diretamente no
prognóstico, pois alguns estudos demonstraram que cães com estágios IV e V
apresentaram uma sobrevida mais curta (TESKE, 1994).
Ao longo do tempo têm sido feitas várias tentativas de classificar o
linfoma multicêntrico com base em critérios citológicos, histológicos e
imunofenotípicos. Desta forma foram feitas adaptações à classificação humana
de modo a permitir sua aplicação na espécie canina (DOBSON et al., 2001).
As abordagens clínicas ao linfoma mostraram-se insuficientes para
estabelecer o prognóstico destes tumores e assim, as correlações anatomo-
clínicas foram estabelecidas em bases de classificação utilizando dados
morfológicos e/ou imunológicos. Os linfomas de fenótipo B são caracterizados
pela expressão de antígenos de diferenciação pan-B (CD19, CD20, CD22,
CD79a) e a expressão de imunoglobulinas de superfície ou citoplasmáticas. Os
3
linfomas de células T são identificados por antígenos pan-T (CD2, CD3, CD7) e
por antígenos de diferenciação funcional (CD4, CD8) (VAIL & YOUNG, 2007).
QUADRO 1 – Sistema de estágios clínicos para linfoma maligno em animais
domésticos segundo a OMS.
ESTADIO CARACTERÍSTICA
I Envolvimento limitado à apenas um linfonodo ou tecido linfóide de
um órgão, excluindo medula óssea
II Envolvimento dos linfonodos de uma determinada região, com ou
sem envolvimento das tonsilas
III Envolvimento generalizado dos linfonodos
IV Envolvimento do fígado e baço, com/sem o estadio III
V Manifestação no sangue e envolvimento da medula óssea e/ou de
outros órgãos, com/sem o estadio I ao IV
Sub-estadio
a
b
Sem sinais clínico
Com sinais clínicos (febre, anorexia e emaciação)
Fonte: DOBSON & LASCELLES (2011).
De acordo com VALLI et al. (2002), as primeiras classificações de
referência dos linfomas foram realizadas por RAPPAPORT (1966) e depois por
LENNERT (1967), que a denominou de classificação de Kiel. Novas
classificações foram propostas por vários hematopatologistas com divergências
na identificação dos tipos celulares o que conduziu a controvérsias. Em 1982, a
proposta de uma classificação de uso clínico permitiu encontrar correspondência
entre seis classificações mais utilizadas em base exclusivamente morfológicas.
Esta classificação, nominada de Working Formulation (WF) foi reconhecida em
escala internacional, sobretudo nos Estados Unidos, já que os europeus
utilizavam a classificação de Kiel atualizada, que se baseia em critérios tanto
morfológicos quanto imunológicos. Nesta celeuma, o Instituto Nacional do
Câncer dos Estados Unidos conseguiu adaptar as classificações Working
Formulation e a de Kiel atualizada para tumores caninos com grande sucesso.
4
Os progressos consideráveis da imunologia, da citogenética e a introdução da
biologia molecular permitiram um melhor conhecimento de formas já definidas,
culminando em 1994 com a proposta de classificação denominada Classificação
Euro-Americana Revisada das Neoplasias Linfóides (REAL - Revised European-
American Classification of Lymphoid Neoplasms).
Vários sistemas histológicos têm sido utilizados para classificar os
linfomas em cães. A OMS, em 2002, publicou uma classificação de linfoma
maligno, tendo como base a classificação REAL, para a definição de categorias
histológicas para os tumores hematopoiéticos nos animais domésticos cuja
utilização tem sido cada vez maior. Este sistema passou a acompanhar a
classificação humana com o objetivo de facilitar o intercâmbio de conhecimentos
e a realização de estudos comparativos entre medicina e medicina veterinária,
pois incorpora tanto os critérios morfológicos quanto os imunológicos (VALLI et
al., 2002; VALLI et al., 2011). A classificação dos tumores do sistema linfóide
para os animais domésticos encontra-se descrita no Quadro 2.
Existem poucos estudos correlacionando a morfologia celular com
prognóstico dos linfomas caninos, porém, sabe-se que o grau histológico pode
ser considerado um indicador prognóstico. Os cães com linfoma de baixo grau
tendem a apresentar maior tempo de sobrevida, mas somente uma pequena
porcentagem (5,3 a 29%) dos linfomas apresenta esta característica histológica.
Entretanto, os linfomas de alto grau têm maiores taxas de remissão em
comparação aos de baixo grau, mas em uma taxa mais baixa de sobrevida livre
de doença (TESKE, 1994; VAIL & YOUNG, 2007).
5
QUADRO 2 - Classificação histológica dos tumores do sistema linfóide dos
animais domésticos segundo a OMS. Neoplasias linfóides das células B Neoplasias linfóides das células T
Neoplasias de células B precursoras Neoplasias de células T/NK precursoras
Leucemia/linfoma linfoblástico de células B Leucemia/linfoma linfoblástico de células T
Neoplasias de células B maduras Neoplasias de células T/NK maduras
Leucemia/linfoma linfocítico crônico de células B Distúrbios linfoproliferativos de células grandes e
granulares:
Leucemia linfocítica crônica de células T
Linfoma/leucemia linfoproliferativa de células T
grandes granulares.
Leucemia linfocítica crônica de células NK
Linfoma linfocítico do tipo intermediário de células B Neoplasias cutâneas de células T
Linfoma cutâneo epiteliotrópico
Linfoma cutâneo não-epiteliotrópico
Linfoma linfoplasmocítico Linfoma de células T extranodal/periférico
Tipo linfóide misto
Tipo inflamatório misto
Linfomas foliculares Linfoma/leucemia de células adultas tipo células T
Linfoma das células do manto
Linfoma folicular de células centrais tipo I, II ou III
Linfoma nodal da zona marginal
Linfoma nodal esplênico da zona marginal
Linfoma extranodal da zona marginal do tecido
linfóide associado às mucosas ( MALT )
Linfoma angioimunoblástico
Leucemia de Hairy cells ou de Células Cabeludas Linfoma angiotrópico
Linfoma angiocêntrico
Linfoma angioinvasivo
Tumores plasmocíticos Linfoma intestinal de células T
Plasmocitoma indolente
Plasmocitoma anaplásico
Mieloma de células plasmáticas
Linfoma de células B grandes Linfoma anaplásico de células grandes
Linfoma de células B rico em células T
Linfoma imunoblástico de células grandes
Linfoma difuso de células B grandes
Linfoma tímico de células B ( mediastínico )
Linfoma intravascular de células B grandes
Linfoma de células B de alto grau tipo Burkitt
Fonte: VALLI et al. (2002)
6
A imunofenotipagem é usada para a identificação de marcadores de
linfócitos empregando anticorpos específicos para o reconhecimento dos
diferentes tipos celulares, uma vez que, a sensibilidade para detecção, até
mesmo precoce, de células tumorais entre uma população de células não
neoplásicas, pelos métodos citológicos e histológicos é limitada. Como exemplo,
o anticorpo monoclonal anti-CD3 identifica os linfomas de células T e o anticorpo
monoclonal anti-CD79a reconhece os linfomas de células B (DICKINSON, 2008).
Desse modo, pode-se determinar a presença de uma população homogênea de
células com o mesmo fenótipo (T ou B), essencial ao diagnóstico do linfoma
(VAIL & YOUNG, 2007). As características histológicas, imunológicas e a
resposta à terapia dos linfomas são semelhantes no cão e no homem, sendo que
nos cães, os linfomas ocorrem com maior frequência e o linfoma T tem pior
prognóstico (KIUPEL et al., 1999; CALAZANS, 2009). O imunofenótipo de células
T corresponde a 30% dos linfomas humanos e 23% no cão (SUEIRO et al.,
2004).
Também como parâmetro prognóstico, a imunofenotipagem é
importante, já que existem diferenças na apresentação clínica e na resposta ao
tratamento entre linfomas de células B e T (KIUPEL et al., 1999). Os linfomas
caninos de células T são biologicamente mais agressivos resultando em tempo
livre de progressão e de sobrevida mais curtos (SUEIRO et al., 2004).
Na ausência de quimioterapia, a sobrevida superior a um mês após o
diagnóstico é incomum em cães e gatos. Embora o linfoma seja altamente
heterogêneo, tanto clinicamente quanto histologicamente, como nos linfomas
não-Hodgkin em humanos, é considerada uma malignidade quimioresponsiva no
cão (MACEWAN, 1990).
Indicadores de diagnóstico e prognóstico tem sido descritos para
auxiliar no manejo clínico dos cães com linfoma (GREENLEE et al., 1990;
KUIPEL et al., 1999; DOBSON et al., 2001). A avaliação imunoistoquímica dos
linfomas humanos fornece aos pesquisadores importantes informações para o
diagnóstico e prognóstico não determinados apenas pelo estádio clínico. Várias
alterações da proteína p53 são consistentemente associadas a subgrupos
7
histológicos ou imunológicos específicos dando uma maior confiabilidade ao
diagnóstico e/ou prognóstico. Alterações na expressão de p53 têm sido descritas
em linfócitos de cães com linfoma, entretanto, pequeno número de casos tem
sido estudado (HAHN et al., 1994).
1.2 Proteína p53
A intensidade da expressão de p53 está relacionada ao grau
histológico do linfoma canino, sendo maior nos linfomas de célula T (SUEIRO et
al., 2004).
O gene supressor de tumor TP53 (Tumor Protein 53) localizado no
cromossoma 17p13.1 na espécie humana e no cromossomo 5 na canina codifica
a proteína p53 (phosphoprotein 53) (GUEVARA-FUJITA et al., 1995; MAXIMOV
& MAXIMOV, 2008). O TP53 é um gene regulador de uma extensa rede que
controla a integridade do genoma frente a danos celulares, como alterações
cromossômicas, depleção de metabólitos, choque térmico, hipóxia,
oncoproteínas virais e ativação de oncogenes celulares, agindo como um
verdadeiro guardião do genoma (MENENDEZ et al., 2007; MAXIMOV &
MAXIMOV, 2008; FERREIRA & ROCHA, 2010). A variedade de fatores, como o
estresse e cofatores de transcrição pode influenciar a interação direta entre p53
e o reparo ao DNA (VOGELSTEIN et al., 2000).
A sequência do gene TP53 e a expressão da p53 foram analisadas
em amostras de neoplasia, linfonodo e bulbo piloso de tecido normal de 12 cães
com linfoma canino. A imunomarcação de p53 foi obtida pela imunoistoquímica e
a sequência do gene por extração do DNA genômico e PCR (CALAZANS, 2009).
A maioria (90%) dos linfomas expressou a p53. O único linfoma que não
apresentou marcação foi classificado como centrocítico-centroblástico, com baixo
grau de malignidade. As maiores expressões ocorreram nos cães com menor
tempo de sobrevida, associando a imunomarcação de p53 com o prognóstico
desfavorável (CALAZANS, 2009).
Tais eventos ocorrem durante o desenvolvimento do câncer e
8
resultam em mudanças biológicas, como o equilíbrio entre a apoptose e a
sobrevivência celular (MENENDEZ et al., 2007; PETITJEAN et al., 2007),
tornando as células tumorais geneticamente instáveis, acumulando rearranjos
cromossômicos desequilibrados (PAMPALONA et al., 2012).
A proteína p53 está diretamente relacionada ao bloqueio do ciclo
celular no caso de dano ao DNA. Esta proteína sinaliza o bloqueio do ciclo
celular no ponto de checagem na fase G1/S (G = Gap - Intervalo/S= Synthesis -
Síntese). O ponto de checagem corresponde a um mecanismo para impedir a
formação de células anômalas. A p53 possui vários mecanismos para efetuar o
reparo ou induzir a apoptose, e diferentes fatores induzem a p53 a gerar a
resposta celular mais adequada (ZÖRNIG et al., 2001; BROOKS & GU, 2003;
WU et al., 2006; MAXIMOV & MAXIMOV, 2008).
A p53 foi a primeira proteína não-histona, ou seja, que permanece
após as histonas serem removidas, regulada por acetilação e desacetilação. Os
níveis de acetilação da p53 aumentam, significativamente, em resposta ao
estresse. Na ausência de estresse celular, a proteína p53 é mantida em baixos
níveis, sem exercer efeito sobre o destino da célula (LUO et al., 2000; OREN,
2003).
Os tipos de estresse que promovem a ativação da p53 incluem as
condições associadas com a iniciação e progressão do câncer. Desta forma, p53
é um ativador de transcrição de sequência específica, pois se liga a elementos
dentro do genoma e ativa a transcrição de genes que residem nas imediações
dos locais de ligação. Existe um contexto celular, dentre eles a disponibilidade de
sinais de sobrevivência, definido por eventos de sinalização intra e
extracelulares, que promove alterações genéticas e afeta o estado funcional da
p53 (OREN, 2003).
As alterações genéticas que tenham impacto sobre a competência de
outras proteínas associadas à apoptose, o controle do ciclo celular e o reparo de
danos ao DNA, são capazes de modular a ação da p53, bem como o resultado
da ativação biológica e suas múltiplas interações para controlar o crescimento
das células neoplásicas (OREN, 2003).
9
Quando as células sofrem agressão, a p53 se acumula no núcleo,
onde pode regular os seus alvos de transcrição para induzir os eventos como
apoptose e parada do ciclo celular (ZHANG & XIONG, 2001). Assim, na célula, o
núcleo é a principal localização da p53, onde promove a transativação dos
genes-alvo. No entanto, a p53 também pode ter alguma função de transcrição no
citoplasma e, raramente, para a indução da apoptose, será encontrada na
membrana plasmática (ERSTER et al., 2004). Em células normais, a
concentração nuclear de p53 encontra-se abaixo dos valores detectáveis por
estudos imunoistoquímicos, por sua vez, a p53 mutante se acumula nas células
por ser eliminada lentamente, o que permite sua detecção imunoistoquímica (DE
NARDI, 2007).
1.2.1 Mutação da p53
Em resposta ao estresse, a acetilação de p53 pode induzir a
acetilação da lisina 120, dentro do domínio de ligação ao DNA, interferindo na
capacidade de interromper o crescimento celular (TANG et al., 2006).
A inativação da via p53 no câncer frequentemente ocorre pela
expressão da proteína p53 mutante, não funcional (ANDREOTTI et al., 2011) em
decorrência de mutações do gene TP53, que combinadas com diferentes
polimorfismos, exercerão efeitos anti-apoptóticos e, assim, garantirão a
sobrevivência das células neoplásicas (PIETSCH et al., 2006; WU et al., 2006;
KIM et al., 2009). As mutações podem ser herdadas ou ocorrerem após
exposição à carcinógenos ambientais ou agentes infecciosos, dentre outros
(CADWELL & ZAMBETTI, 2001).
A p53 mutante ocorre em mais de 50% das neoplasias e está
associada à pior sobrevida global livre de doença e tem sido implicada na
resistência às terapias anti-neoplásicas, podendo então, sua expressão indicar
um prognóstico desfavorável (NGUYEN et al., 1996; ZÖRNIG et al., 2001;
MILLER et al., 2005; SOUSSI & LOZANO, 2005). Neste sentido, o aumento da
frequência de p53 mutante em um nódulo inflamatório não tumoral, pode ser
10
considerado como um marcador de aumento da susceptibilidade ao câncer
(HUSSAIN et al., 2000).
1.2.2 Inibição da função da p53
A proteína p53 tem sua função supressora de tumor regulada de
forma negativa pela ação do gene Mdm2 (Murine Double Minute 2), um proto-
oncogene superexpresso na maioria dos tumores humanos (BROOKS & GU,
2006; TANG et al., 2008), que levará à ubiquitinação da extremidade carboxi-
terminal da p53, o que induzirá sua exportação do núcleo para o citoplasma,
onde se acumulará até ser degradada por proteossomas. Tal situação explica a
esporádica expressão imunoistoquímica citoplasmática da p53 em condições
normais e o aumento de sua expressão citoplasmática nos linfomas, que a
qualifica como fator preditivo para formas mais agressivas de tumor (ZHANG &
XIONG, 2001; TEIXEIRA et al., 2011).
Segundo TANG et al. (2008), a acetilação da p53 é suficiente para
revogar a repressão de Mdm2 durante a resposta ao estresse. Além disso, a
acetilação e interação de p53 com Mdm2, no DNA, resultam na ativação de p53,
independentemente do seu estado de fosforilação. Desta forma, as funções de
transcrição da p53 podem ser restauradas pela inativação de Mdm2.
11
1.3 Referências
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17
1.4 Objetivos
1.4.1 Geral
Comparar a expressão da proteína p53 em células B e T em diferentes órgãos
de cães portadores de linfoma, nos diferentes subtipos histológicos.
1.4.2 Específicos
Determinar a expressão de marcadores de linfócitos B e T nas amostras de
órgãos de cães com linfoma por meio da técnica de imunoistoquímica;
Descrever a expressão de p53, nos diferentes subtipos histológicos de linfoma
em cães.
Descrever a expressão de p53, nos diferentes tipos de linfoma (T e B) em
cães;
18
CAPÍTULO 2 – LINFOMA CANINO: CLASSIFICAÇÃO HISTOPATOLÓGICA,
IMUNOFENOTIPAGEM E EXPRESSÃO DE p53.
RESUMO
O linfoma representa uma das mais frequentes neoplasias encontradas em cães. Para definição dos tipos histológicos de linfoma em animais recomenda-se a classificação da Organização Mundial da Saúde. Contudo, a imunofenotipagem deve ser empregada para determinar a presença de uma população homogênea de células de mesmo fenótipo (T ou B) com vistas ao prognóstico e tratamento. Ademais, ainda para fins de prognóstico, pode-se avaliar o perfil de expressão imunoistoquímica da proteína p53 mutante, que aumentada induz a perpetuação de linhagens celulares anormais. O objetivo do estudo foi determinar o imunofenótipo dos linfomas caninos classificados pela OMS e relacionar estes achados com a imunoexpressão da p53. Neste sentido, vinte e seis blocos de parafina contendo fragmentos de diferentes tecidos de cães foram classificados por meio de histologia e imunofenotipagem e avaliados quanto a expressão de p53 por imunoistoquímica. O linfoma estava presente em diversos tecidos caninos, partes moles (26,9%), pele (19,2%), baço (19,2%), fígado (7,7%), tecidos linfoides (7,7%), rim (7,7%), sistema nervoso central (3,8%), pulmão (3,8%) e linfonodo (3,8%). Na imunofenotipagem verificou-se que a maioria foi do tipo B (57,7%), sendo que o tipo T correspondeu a 34,6% e duas amostras (7,7%) apresentaram dupla marcação. A expressão de p53 foi detectada em 18 amostras (69,2%), sendo 10 amostras (38,5%) de linfoma de células B e 6 amostras (23,1%) de linfoma de células T. Oito amostras (30,7%) foram negativas para a expressão da p53. As amostras que apresentaram dupla marcação para T e B expressaram marcação para p53 (7,7%). Não houve diferença na expressão imunoistoquímica da proteína p53 nos diferentes subtipos histológicos de linfoma de células B e T em diferentes tecidos de cães.
Palavras-chave: antígeno CD3, antígeno CD79, Canidae, imunofenotipagem, linfoma maligno, linfoma não-Hodgkin, neoplasias
19
CHAPTER 2 – CANINE LYMPHOMA: HISTOPATHOLOGIC CLASSIFICATION,
IMMUNOPHENOTYPING AND p53 EXPRESSION.
ABSTRACT
Lymphoma is one of the most frequent neoplasms in dogs. Histological types of lymphoma in animals are determinated according to the classification recommended by the World Health Organization. However, immunophenotyping should be used to determine the presence of a homogeneous population of cells with the same phenotype (T or B) aiming at prognosis and treatment. Moreover, for prognostic purposes, the immunohistochemical expression profile of mutant p53 protein, whose elevation induces the perpetuation of abnormal cell lines, should be evaluated. The purpose of the present study was to determine the immunophenotype of canine lymphomas classified according to the WHO Classification and to relate these findings to the immunoexpression of p53. Thus, twenty-six paraffin blocks with fragments of different tissues of dogs were classified by means of histology and immunohistochemical and evaluated for p53 expression by immunohistochemistry. Lymphoma was present in various canines tissues, soft tissues (26.9%), skin (19.2%), spleen (19.2%), liver (7.7%), lymphoid tissues (7.7%), kidney (7.7%), central nervous system (3.8%), lungs (3.8%) and lymphnode (3.8%). Immunophenotyping study revealed that most of them were B-cell lymphoma (57.7%), and 34.6% were T-cell lymphoma and two samples (7.7%) showed double staining. Expression of p53 was detected in 18 samples (69.2%), ten samples (38.5%) were B-cell lymphoma and six samples (23.1%) were T-cell lymphoma. Eight samples (30.7%) were negative for p53 expression. The samples that showed double staining for T and B expressed marking for p53 (7.7%). There were no differences in immunohistochemical expression of p53 protein in the histologic subtypes of B-cell lymphoma and T-cell lymphoma in different tissues of dogs.
Keywords: antígen CD3, antígen CD79, Canidae, immunophenotyping, malignant lymphoma, neoplasms, non-Hodgkin lymphoma.
INTRODUÇÃO
O linfoma, também conhecido como linfoma maligno, linfossarcoma ou
linfoma não-Hodgkin (LNH), corresponde a um grupo variado de neoplasias
localizadas primariamente no timo e medula óssea ou em órgãos linfóides
secundários, como baço e linfonodos, mas pode se desenvolver em quase todos
20
os tecidos do corpo, a partir de células linfóides anormais (VAIL & YOUNG,
2007).
O linfoma representa uma das mais frequentes neoplasias
encontradas em cães, atingindo as mais variadas raças, como Boxer, Rottweiller,
Poodle, Beagle e São Bernardo (GREENLEE et al., 1990; DHALIWAL et al.,
2003), representando 83% dos tumores de origem hematopoética e 24% de
todas as formas de câncer (VAIL & YOUNG, 2007).
Seguindo a classificação anatômica proposta pela Organização
Mundial de Saúde (OMS), o linfoma canino é classificado anatomicamente nas
seguintes categorias: multicêntrico, mediastinal, alimentar, cutâneo e extranodal.
A mais comum, ocorrendo em mais de 80% dos casos, é a multicêntrica, seguida
da digestiva, mediastínica e cutânea. A forma extranodal é menos prevalente,
inferior a 18% dos casos (PONCE et al., 2010) e pode ocorrer em qualquer
tecido ou órgão que não o tecido linfóide (VONDERHAAR & MORRISON, 2002;
VAIL & YOUNG, 2007).
Vários sistemas histológicos têm sido utilizados para classificar os
linfomas em cães. A OMS, em 2002, publicou uma classificação de linfoma
maligno, tendo como base a classificação REAL (Revised European-American
Classification of Lymphoid Neoplasms), para a definição de categorias
histológicas para os tumores hematopoiéticos nos animais domésticos (VALLI et
al., 2002; VALLI et al., 2011).
Contudo, a imunofenotipagem deve ser empregada para determinar a
presença de uma população homogênea de células com o mesmo fenótipo (T ou
B), essencial ao diagnóstico e ao prognóstico do linfoma (VAIL & YOUNG, 2007),
uma vez que o imunofenótipo de células T corresponde a 23% no cão e possui
pior prognóstico, pois são biologicamente mais agressivo resultando em tempo
livre de progressão e de sobrevida mais curtos (KIUPEL et al., 1999; SUEIRO,
2004; CALAZANS, 2009).
Indicadores de prognóstico tem sido descritos para auxiliar no manejo
clínico dos cães com linfoma (GREENLEE et al., 1990; KUIPEL et al., 1999;
DOBSON et al., 2001). A proteína p53 está diretamente relacionada ao bloqueio
21
do ciclo celular para efetuar o reparo do DNA ou induzir a apoptose (ZÖRNIG et
al., 2001; BROOKS & GU, 2003; WU et al., 2006; MAXIMOV & MAXIMOV,
2008). A inativação da via p53 no câncer, em decorrência de mutações podem
ser herdadas ou ocorrerem após exposição à carcinógenos ambientais ou
agentes infecciosos (CADWELL & ZAMBETTI, 2001), frequentemente ocorre
pela expressão da proteína p53 mutante, não funcional (ANDREOTTI et al.,
2011), que combinadas com diferentes polimorfismos, exercerão efeitos anti-
apoptóticos e, assim, garantirão a sobrevivência das células neoplásicas
(PIETSCH et al., 2006; WU et al., 2006; KIM et al., 2009).
A p53 mutante ocorre em mais de 50% das neoplasias e está
associada à pior sobrevida global livre de doença e tem sido implicada na
resistência às terapias anti-neoplásicas, podendo então, sua expressão indicar
um prognóstico desfavorável (NGUYEN et al., 1996; ZÖRNIG et al., 2001;
MILLER et al., 2005; SOUSSI & LOZANO, 2005).
O objetivo deste estudo foi comparar a expressão da proteína p53 em
células B e T de diferentes órgãos, nos diferentes subtipos histológicos de cães
com linfoma.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras
Vinte e seis (n=26) blocos de parafina contendo fragmentos de
diferentes tecidos de cães foram gentilmente cedidos pelo Laboratório de
Patologia Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da
Universidade Federal do Mato Grosso, com diagnóstico histopatológico de
linfoma.
22
Histopatologia
Os linfomas foram classificados morfologicamente conforme a
Classificação da Organização Mundial da Saúde (VALLI et al., 2002). Para este
procedimento, secções de 3µm foram obtidas dos diferentes tecidos de linfoma
canino, cortadas em micrótomo automático e distendidas em lâminas
histológicas. Seguindo o protocolo de rotina do Laboratório de Patologia do
Banco de Sangue do Instituto Goiano de Hematologia (INGOH), o material foi
corado pela técnica da hematoxilina e eosina (HE) e examinado em microscopia
de luz comum.
Imunoistoquímica
A técnica de imunoistoquímica foi realizada no Laboratório de
Imunopatologia do Setor de Patologia Animal da Escola de Veterinária e
Zootecnia da UFG para imunofenotipagem empregando os anticorpos primários
CD79a e CD3, para determinação de linfoma de células B e T, respectivamente,
e para caracterização do perfil de ativação da proteína p53 utilizando anticorpo
primário específico (QUADRO 1).
Os fragmentos dos órgãos caninos, incluídos em parafina, foram
seccionados em micrótomo automático, na espessura de 3µm e aderidos em
lâminas impregnadas por solução de organosilano à 3% (3-aminopropyl-
triethoxysilane) em acetona.
Em seguida, procedeu-se a desparafinização e rehidratação de rotina
das amostras. Para o bloqueio da atividade da peroxidase endógena as lâminas
foram submersas em solução de peróxido de hidrogênio à 30% em álcool
metílico acrescido de Triton (0,1%), durante 10 minutos, por duas vezes. A
recuperação antigênica ocorreu em solução de citrato, pH 6,0, em banho-maria à
96ºC, por 15 minutos. A marcação de ligação inespecífica foi bloqueada com 3%
de soro albumina bovina (BSA), por uma hora, em câmara úmida à temperatura
média de 26ºC.
23
Os anticorpos primários (Quadro 1), diluídos em BSA 1,5%, foram
instilados e o material foi incubado por 18 horas em câmara úmida, sob
refrigeração a 4ºC.
QUADRO 1 - Especificações dos anticorpos primários anti-CD79a, anti-CD3 e
anti-p53 utilizados na técnica de imunoistoquímica para linfoma
em diferentes tecidos caninos.
Anticorpo Primário
Clone Referência Lote Laboratório Diluição
CD79a mouse
monoclonal anti-human
M7051 59642 Dako Denmark A/S 1:500
CD3 rabbit
polyclonal anti-human
AO452 57820 Dako Denmark A/S 1:1000
p53 Mouse
monoclonal anti-dog
SC-71785 Santa Cruz Biotechnology 1:500
Ao final da incubação dos anticorpos primários, as lâminas foram
lavadas com tampão salino fosfato (PBS) e, em seguida, incubadas por 30
minutos, à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário biotinilado (LSAB,
DAKO, Ref. K0690, Dinamarca). Após lavagem com PBS, foi adicionado o
complexo estreptoavidina-perodidase (LSAB, DAKO Ref. K0690, Dinamarca), por
30 minutos em temperatura ambiente. Novamente, as lâminas foram lavadas
com PBS.
A reação foi revelada pela incubação com o cromógeno
diaminobenzidina-peroxidase (Liquid DAB Substrate Chromogen System, DAKO,
Ref. K3468, Dinamarca), por 3 minutos, em todos os cortes, exceto para p53 que
foi de 10 minutos. Ao final, as lâminas foram contracoradas com hematoxilina de
Mayer, desidratadas e montadas com solução de tolueno (Entellan, Merck,
Alemanha) e lamínulas histológicas. A análise das lâminas foi feita em
microscópio de campo claro.
24
Para efeito de classificação do tipo de tumor, uma amostra foi
considerada como imunofenótipo B, quando apresentou reação, em pelo menos
10% das células, com o anticorpo anti-CD79a. Do mesmo modo, para o
imunofenótipo T, observou-se a expressão do anticorpo anti-CD3 em pelo menos
10% das células neoplásicas, exclusivamente.
As lâminas marcadas com o anticorpo anti-p53 foram analisadas pelo
programa de imagem Image J (National Institutes of Health, Estados Unidos da
América). O programa forneceu o valor das densidades ópticas de quinze
campos por amostra de regiões de interesse para análise, sendo as áreas de
concentração de células neoplásicas. Os resultados obtidos foram expressos na
unidade pixels/polegada. Os resultados foram transferidos para uma planilha
eletrônica (Microsoft Office Excel, Microsoft, Estados Unidos da América). Para
cada amostra foi calculado a média para representar a tendência central, que foi
posteriormente avaliada pela análise de variância seguida do teste de Tukey (a
probabilidade de erro de 5%), empregando o software R (R CORE TEAM, 2012).
RESULTADOS
Histopatologia
Das 26 amostras avaliadas, 7 (26,9%) eram de partes moles (tecidos
localizados entre a epiderme e as vísceras, excetuando-se os ossos); 5 (19,2%)
eram de pele; 5 (19,2%) de baço; 2 (7,7%) de fígado, 2 (7,7%) de tecido linfoide,
2 (7,7%) de rim, 1 (3,8%) de sistema nervoso central, 1 (3,8%) de pulmão e 1
(3,8%) de linfonodo.
Em relação à classificação histológica das amostras, conforme a
Classificação da OMS, constatou-se que 16 (61,5%) eram de linfoma difuso de
grandes células, sendo duas com padrão paniculítico e três pleomórfico (Figura
1A); três (11,5%) eram Linfoma de Burkitt (Figura 1B); duas (7,7%) eram linfoma
T angioimunoblástico (Figura 1C); duas (7,7%) eram de zona marginal esplênico
25
(Figura 1D). Linfoma plasmoblástico, linfoma de pequenas células e linfoma
linfoblástico foram identificados em uma amostra (3,8%), cada.
Os resultados da análise histológica estão apresentados no Quadro 2.
FIGURA 1 – Fotomicrografia de tecidos caninos com linfoma maligno (HE, obj. 40x). (A) linfoma
difuso de grandes células pleomórfico (LDGC) de partes moles mostrando células
grandes monomorfas e citoplasma basofílico; (B) linfoma de Burkitt em linfonodo
tipicamente composto de células linfóides de tamanho médio com uma fração
elevada de proliferação, entremeada de macrófagos contendo debris celulares
(seta); (C) linfoma T angio-imunoblástico de pele, mostrando células de morfologia
variável, incluindo células “claras“ atípicas com núcleo dentado e citoplasma
abundante e pálido; (D) linfoma de zona marginal esplênico (LZME) caracterizado
pela presença de células pequenas centrocíticas-like, células monocitóides,
linfócitos e plasmócitos.
26
Imunofenotipagem
Após imunofenotipagem das 26 amostras foi observado 15 casos
(57,7%) de linfoma de célula B (CD79a+, CD3-) (Figura 2A/B) e 9 casos (34,6%)
como linfoma de células T (CD79a-, CD3+) (Figura 2C/D). Duas amostras (7,7%)
apresentaram marcação condizente com dupla população (CD79a+, CD3+)
(Figura 2E/F).
De 16 amostras classificadas como linfoma difuso de grandes células,
dez (62,5%) eram de células B e quatro (25%) eram de células T e duas (12,5%)
com dupla marcação T e B. Em relação aos três casos de linfoma pleomórfico
difuso, uma amostra (33,3%) era de célula T, uma amostra (33,3%) apresentou
população B e uma amostra (33,3%) com população mista, T e B. Os três casos
de linfoma de Burkitt foram de células B (100%). O linfoma T angioblástico,
observado em duas amostras, foram de células T (100%). O linfoma
plasmoblástico, com uma amostra, mostrou-se ser de célula B. O único caso de
linfoma linfoblástico e de linfoma de pequenas células apresentaram padrão de
marcação de células T. Nas duas amostras identificadas como linfoma de zona
marginal esplênico, observou-se uma marcação de célula T e outra de célula B.
A frequência de ocorrência dos imunofenótipos T e B, nos diferentes
tipos histológicos caninos, está apresentada no Quadro 2.
27
QUADRO 2 – Resultado da análise histológica e da imunofenotipagem das
amostras de tecidos caninos (n=26) com linfoma não-Hodgkin
conforme a Classificação da Organização Mundial da Saúde
(OMS).
Tecido Diagnóstico Imunofenotipagem
B (CD79a+) T (CD3+)
Pele e Sistema
Nervoso Central Linfoma T angioimunoblástico
- +
- +
Partes moles Linfoma difuso de grandes células + -
Tecido linfóide Linfoma difuso + -
Tecido linfóide Linfoma difuso de grandes células + -
Fígado Linfoma difuso de grandes células + -
Rim Linfoma difuso de grandes células - +
Pele Linfoma difuso de grandes células padrão paniculítico + -
Partes moles Linfomas de pequenas células - +
Partes moles Linfoma difuso de grandes células - +
Partes moles Linfoma difuso de grandes células + +
Partes moles Linfoma plasmablástico + -
Pele Linfoma histiocítico + -
Baço Linfoma de zona marginal esplênico + -
Linfonodo Linfoma de Burkitt + -
Pele Linfoma difuso de grandes células padrão paniculítico - +
Partes moles Linfoma pleomórfico difuso - +
Baço Linfoma de zona marginal esplênico - +
Partes moles Linfoma difuso de grandes células pleomórfico + -
Partes moles Linfoma difuso de grandes células + -
Pele Linfoma linfoblástico - +
Partes moles Linfoma difuso de grandes células pleomórfico
angiotrópico + +
Baço e pulmão Linfoma difuso de grandes células + -
Baço Linfoma difuso de grandes células + -
Linfonodo Linfoma de Burkitt + -
Baço Linfoma de Burkitt variante plasmocitária/ Linfoma
difuso de grandes células plasmocitóide + -
28
FIGURA 2 - Fotomicrografia de tecidos caninos com linfoma maligno imunomarcados com
anticorpos anti-CD79a (CD79a+; anti-B) e anti-CD3 (CD3
+; anti-T) (IHQ - DAB com
hematoxilina; obj. 40x). Linfoma de Burkitt em linfonodo exibindo marcação
positiva para CD79a (A) e negativa para CD3 (B) em linfócitos neoplásicos;
Linfoma de grandes células em pele, padrão paniculítico, apresentando marcação
negativa para CD79a (C) e positiva para CD3 (D); Linfoma difuso de grandes
células pleomófico (LDGC) em partes moles caracterizado por marcação positiva
para CD79a (E) e CD3 (F), denominada dupla marcação.
29
Expressão de p53
A expressão de p53 foi detectada em 18 amostras (69,2%), sendo 10
amostras (38,5%) de linfoma de células B e 6 amostras (23,1%) de linfoma de
células T. Assim, 8 (30,7%) amostras foram negativas para a expressão da p53.
Nas duas amostras que apresentaram dupla marcação (T/B) expressaram
marcação para p53 (7,7%).
As amostras marcadas com o anticorpo p53 apresentaram marcação
evidenciando o núcleo dos linfócitos neoplásicos (Figura 3) e em raros casos a
marcação ocorreu no citoplasma.
Os valores das densidades ópticas correspondentes a marcação
imunoistoquímica da expressão de p53 em tecidos caninos com linfoma
resultaram em uma média para cada amostra ou caso (Quadro 3). Os casos
foram agrupados conforme resultado da imunofenotipagem (T, B e T/B), para
obtenção de uma média geral, que foi submetida aos testes de normalidade
(Shapiro-Wilk e de Bartlett) e à análise de variância, cujos resultados (Tabela 1)
demonstraram que os dados são normais e que não existe diferença significativa
entre as médias, isto é, não há diferença na expressão de p53 nos linfomas T e
B nas amostras estudadas.
30
QUADRO 3 – Média da marcação da proteína p53 expressa na unidade
pixels/polegada, em ordem decrescente, em amostras (n=26) de
tecidos caninos com linfoma não-Hodgkin conforme a
Classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS).
Tecido Diagnóstico Tipo de Linfoma Média
Partes moles Linfoma difuso de grandes células B 116428
Pele Linfoma histiocítico B 103474
Linfonodo Linfoma de Burkitt B 103189
Baço Linfoma de zona marginal esplênico B 69689
Pele Linfoma difuso de grandes células padrão
paniculítico B 64093
Tecido linfóide Linfoma difuso de grandes células B 63858
Partes moles Linfoma difuso de grandes células B 42149
Fígado Linfoma difuso de grandes células B 36002
Partes moles Linfoma difuso de grandes células pleomórfico B 35977
Partes moles Linfoma plasmablástico B 30271
Baço Linfoma de Burkitt variante plasmocitária/ Linfoma
difuso de grandes células plasmocitóide B 0
Baço e pulmão Linfoma difuso de grandes células B 0
Baço Linfoma difuso de grandes células B 0
Tecido linfóide Linfoma difuso B 0
Partes moles Linfoma difuso de grandes células B 0
Pele e Sistema
Nervoso Central Linfoma T angioimunoblástico T 157840
Partes moles Linfoma pleomórfico difuso T 92915
Partes moles Linfomas de pequenas células T 92641
Pele e Sistema
Nervoso Central Linfoma T angioimunoblástico T 52452
Rim Linfoma difuso de grandes células T 28123
Baço Linfoma de zona marginal esplênico T 22286
Partes moles Linfoma difuso de grandes células T 0
Pele Linfoma linfoblástico T 0
Pele Linfoma difuso de grandes células padrão
paniculítico T 0
Partes moles Linfoma difuso de grandes células pleomórfico
angiotrópico T/B 37598
Partes moles Linfoma difuso de grandes células T/B 27625
31
TABELA 1 – Médias de expressão da densidade óptica (pixels/polegada) de
marcação da proteína p53 em amostras (n=26) de órgãos caninos
com linfoma.
Tratamento Média Erro
Padrão Valor-P
Valor do
Teste
Shapiro-
Wilk
Valor
Teste de
Bartlett
Coeficiente
de Variação
(%)
T 53214,99a 16933,29
0,1254 0,0423 0,2589 102,9 B 43816,95a 12800,37
T/B 38950,37a 33866,59
FIGURA 3 - Fotomicrografia representativa da expressão imunoistoquímica de p53 positiva em
linfoma de células T em pele (A), linfoma de células B em pele (B), linfoma de
células T e B em partes moles (C) e negativa em linfoma de células T em pulmão
(D) (IHQ - DAB sem hematoxilina; obj. 40x).
32
DISCUSSÃO
O material avaliado consistia de diversos órgãos caninos, sendo que
em ordem descrescente eram de partes moles (26,9%), pele (19,2%), baço
(19,2%), fígado (7,7%), tecidos linfoides (7,7%), rim (7,7%), sistema nervoso
central (3,8%), pulmão (3,8%) e linfonodo (3,8%). Tal distribuição reforça a
descrição de VAIL & YOUNG (2007) de que o linfoma pode ocorrer em vários
órgãos do corpo. A frequência da forma extranodal (61,4%) foi superior ao
descrito por ANDRADE et al. (1994) e DEYKIN & SMITH (1997) sendo
considerada forma rara de linfoma, por ocorrer em menos de 18% dos casos,
conforme PONCE et al. (2010). Ademais, o referido valor também foi superior ao
observado nos linfomas humanos (30%), conforme SWERDLOW et al. (2008).
Tal resultado deve ser interpretado com cautela, por ser um material que foi
cedido sem maiores informações a respeito da casuística local e, assim, pode
não refletir a realidade da incidência da doença. Por se tratar de amostras
caninas sem identificação da raça, idade, estadio anatômico e clínico, não se
pode fazer inferências sobre tais parâmetros à luz dos resultados obtidos.
A despeito da localização do linfoma, é essencial a sua classificação
histológica, empregando a Classificação da OMS, conforme sugerido por VALLI
et al. (2002). Assim, em ordem decrescente foram constatadas os tipos linfoma
difuso de grandes células, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal esplênico,
linfoma plasmoblástico, linfoma de pequenas células e linfoma linfoblástico. Com
a determinação dos diferentes tipos histológicos, o intercâmbio de informações
entre pesquisadores de diferentes áreas, permite que novos conhecimentos
relacionados a tratamento e prognóstico, possam ser averiguados em diferentes
espécies, principalmente entre o cão e o homem, nos quais o linfoma apresenta
vários aspectos similares, em especial, epidemiológicos, anatômicos e clínicos.
Entretanto, cabe ressaltar que mesmo empregando a Classificação
dos linfomas da Organização Mundial de Saúde (OMS), o diagnóstico histológico
dos subtipos de linfoma nos seres humanos é universalmente impreciso de
acordo com MILITO et al. (2002), e consequentemente, a realidade é semelhante
33
em cães. Tal dificuldade pode ser contornada com a aplicação desta
classificação pelos patologistas veterinários, que poderão obter sucesso no
diagnóstico morfológico em 85 a 90% dos casos, dependendo da experiência.
Neste contexto, VALLI et al. (2011) que descreveram as seis categorias mais
comuns dos linfomas caninos (linfoma difuso de grandes células B, linfoma de
zona marginal, linfoma de células T periféricas, linfoma de zona T, linfoma
linfoblástico de células T e linfoma folicular), que corresponderam a
aproximadamente 80% dos casos, defendem que a aplicação da Classificação
Histológica da OMS deve ser rotineira, por se tratar de um trabalho que avançará
em termos qualitativos quanto mais informações forem adquiridas.
Em relação a imunofenotipagem dos linfomas caninos, verificou-se
que a maioria foi do tipo B (57,7%), sendo que o tipo T correspondeu a 34,6% e
duas amostras (7,7%) apresentaram dupla marcação. A determinação do
imunofenótipo é fundamental para classificar os linfomas como entidades
clinicopatológicas e subdividi-los em grupos com bom ou mal prognóstico
(LINDER, 1991; KURTIN & ROCHE, 1993). A quantidade de linfomas de células
B foi inferior aos 74% observado por FOURNEL-FLEURY et al. (1997), e
semelhante ao constatado por TESKE et al. (1994), que foi 58,9%. Uma menor
porcentagem de linfoma T, 21,8% e 23%, também foram observada por SUEIRO
et al. (2004) e KIUPEL et al. (1999), respectivamente, mas a incidência
observada neste estudo discretamente acima dos descritos por FOURNEL-
FLEURY et al. (2002) e PONCE et al. (2010) tanto para cães como em seres
humanos (PONCE et al., 2010).
Os dados epidemiológicos apresentados constituem dados de grande
relevância clínica, pois a maioria dos pacientes com linfoma apresentarão o tipo
celular B, de melhor prognóstico, uma vez que o linfoma T está associado a uma
sobrevida menor, independente de tratamento. A existência de amostras com
dupla marcação foi observado em outro estudo (VEZZALI et al., 2010) e
nenhuma relação quanto ao prognóstico foi determinada.
Nenhum caso estudado exibiu imunofenotipagem negativa para os
dois marcadores celular CD79a e CD3. Tanto no homem como em animais
34
existe uma alta prevalência de marcação dupla negativa principalmente nas
variantes plasmacitóides, o que pode estar relacionado com uma avançada
diferenciação destas células (MASON et al., 1995). Esta discrepância pode ser
um reflexo da utilização de anticorpos policlonais, uma vez que as células
plasmáticas normais tanto no homem quanto no cão reagem com o marcador B
CD79a.
A expressão de p53 por densitometria óptica foi detectada na maioria
das amostras (69,2%) tanto de linfoma de células T (23,1%) quanto de linfoma
de células B (38,5%), incluindo as amostras com dupla marcação, mas não
houve diferenças estatísticas entre os diferentes imunofenótipos. Contudo, a
expressão de p53 em linfoma canino observada por SOKOLOWSKA et al.
(2005), empregando técnica imunoistoquímica e análise estimada de marcação
de células linfóides, sob microscopia de campo claro em magnificação de 400x,
foi observada em todas as amostras, mas para efeito de positividade, que
deveria ser igual ou superior a 10%, nenhuma amostra apresentou valor superior
a 3,4% e, assim, todas as amostras foram classificadas como negativas. Diante
do exposto, apesar de serem apresentados dados numéricos para comparação
estatística neste trabalho, é de suma importância que a densitometria óptica seja
constratada com a técnica proposta por SOKOLOWSKA et al. (2005), para
verificarmos a eficácia da técnica empregada.
Em duas das amostras estudadas, foi verificado o tipo histológico
conhecido como linfoma de Burkitt, sendo que uma apresentou um alto valor de
expressão de p53, terceira maior para o tipo celular B, enquanto que a outra
amostra mostrou-se negativa. Em parte, os resultados foram semelhantes ao
estudo, realizado em seres humanos, por VILLUENDAS et al. (1993), em que foi
observado as maiores marcações em todas as amostras de linfomas de Burkitt.
Apesar de não ser observada diferença significativa entre os linfomas
de células T e linfomas de células B na expressão densitométrica da p53,
verificou-se maiores valores em alguns tipos histológicos de linfoma T. Além de
uma maior média para este imunofenótipo, tendência observada também no
trabalho de SUEIRO et al. (2004). Todos os esforços devem ser concentrados na
35
tentativa de estabelecer a real relação entre o linfoma T, de pior prognóstico, ou
até mesmo em linfoma de célula de B e a expressão da p53, pois o diagnóstico,
prognóstico e a escolha do tratamento dos linfomas, tanto nos cães como na
espécie humana, devem ser baseados não apenas na morfologia celular,
histologia e estadiamento clínico, mas também no imunofenótipo, na biologia
molecular, nos índices de proliferação celular e também na expressão da p53
mutante.
CONCLUSÃO
Não houve diferença na expressão imunoistoquímica da proteína p53
nos diferentes subtipos histológicos de linfoma de células B e T em diferentes
órgãos de cães.
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41
CAPÍTULO 3 – CONSIDERAÇÕES FINAIS
O linfoma é uma neoplasia frequente em cães e tipicamente reduz a
sobrevida dos pacientes acometidos ou até mesmo leva a morte muito
rapidamente se não tratados. Face a esse comportamento, a demanda
preemente é de entender os mecanismos celulares associados ao seu
aparecimento, de modo a determinar as vias moleculares envolvidas, para serem
neutralizadas como forma de tratamento objetivando o controle da doença.
Antes de mais nada, deve haver a preocupação com um diagnóstico
preciso do linfoma. Há alguns anos, o diagnóstico era apenas realizado pela
morfologia celular, contudo, hoje para alcançar tal objetivo, é imperativo o
emprego de técnicas imunológicas, dentre outras, a imunoistoquímica para
determinacão de marcadores de superfície celular específicos.
Ainda dentro da questão de aumento de sobrevida, fatores
prognósticos, como idade, sexo, tipo histológico e carga tumoral devem ser
considerados, entrentanto, o emprego da imunoistoquímica tem mostrado que
possui grande valor no estabelecimento da expressão de sinalizadores celulares,
como fatores independentes do prognóstico. Como exemplo, a proteína p53, que
na forma mutante está associada a eventos que perpetuam linhagens celulares
neoplásicas e a resistência a agentes quimioterápicos, determinando um mau
prognóstico.
Assim, é preciso conhecer mais intimamente as vias moleculares,
incluindo a p53, e manter-se atualizado sobre os avanços científicos para melhor
interpretar os resultados da sua expressão nos diferentes tipos de câncer. As
divergências podem ocorrer por muitos fatores, incluindo a diferença
interespécie, os métodos de fixação de tecido, tipos de anticorpos utilizados, a
intensidade e localização da imunomarcação, tipo de técnica imunoistoquímica
empregada e, por fim, a subjetividade da interpretação dos resultados.
Mesmo assim, esta investigação procurou caracterizar o linfoma
canino e verificar a relação do tipo histológico e imunológico com a expressão da
p53 de forma a obter dados que permitam estabelecer uma interface com casos
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na medicina, para que as projeções prognósticas possam ser extrapoladas aos
humanos e, assim, os cães servirem como modelo de estudo do linfoma no
homem. Por outro, o avanços obtidos com os estudos em humanos certamente
auxiliarão na condução dos casos em cães. Contudo, mesmo não tendo obtidos
resultados significativos neste trabalho, foi notado uma tendência de maior
expressão de p53 em linfomas canino de células T, que a priori apresenta pior
prognóstico. Assim, tal cenário nos impele a sugerir que estudos prospectivos
bem controlados em cães permitirão a obtenção de dados referentes a evolução
clínica e ao diagnóstico morfológico e imunológicos de amostras representativas,
para alimentar banco de dados a serem analisados para melhor esclarecer os
parâmetros de prognóstico e tratamento do linfoma.