limited reagent immunoassay

Download Limited Reagent Immunoassay

Post on 24-Oct-2015

25 views

Category:

Documents

1 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

Reagen terbatas atau immunoassay kompetitif terkait dengan fenomena analit sampel dan kompetisi berlabel analit untuk antibodi . ( Lihat Gambar 2.2 ) Pengukuran Sinyal itu akan menunjukkan jumlah senyawa target yang hadir . Kebanyakan , jenis tes utama adalah tes yang kompetitif dimanfaatkan dalam program pengujian obat kerja .

- " reagen terbatas " : disebut SM ini hanya rendah , quantitiy tetap reagen antibodi capture ditambahkan , dan hanya satu antibodi yang digunakan- bentuk reagen analit diberi label , dan ditambahkan ke sampel . ini antigen berlabel ( pelacak ) bersaing dengan antigen berlabel ( analit ) untuk situs mengikat terbatas antibodi penangkapan .Semakin - analit ( antigen berlabel ) hadir dalam sampel , semakin akan mengikat antibodi menangkap , leabing lebih dari analit reagen ( berlabel Ag ) gratis .hubungan langsung antara jumlah sampel analit dan sinyal yang dihasilkan .

Format kompetitifDalam format yang kompetitif , analit berlabel (biasanya antigen ) dalam sampel uji diukur oleh kemampuannya untuk bersaingdengan antigen berlabel dalam immunoassay . The berlabel blok antigen kemampuan antigen berlabel untuk mengikatkarena situs mengikat antibodi sudah ditempati . Dengan demikian , dalam immunoassay kompetitif , kurang labeldiukur dalam pengujian tersebut berarti lebih dari berlabel ( sampel uji ) antigen hadir . Jumlah antigen dalamsampel uji berbanding terbalik dengan jumlah label yang diukur dalam format kompetitif ( Gambar 1-7 ) .

Prinsip-prinsip pengukuran yang mendasari menitjumlah zat dalam cairan biologis oleh kompetitiftes pengikatan protein , dan radioimmunoassaysmapan . Kompetitif tes pengikatan proteindan prosedur radioimmunoassay mengharuskansubstansi bersaing ( ligan , hapten , maupun antigen ) menjadiberlabel dengan radioisotop , untuk mencapai yang diinginkanspesifisitas dan sensitivitas .

Kompetitif Assay Binding

Sebuah uji pengikatan kompetitif didasarkan pada persaingan berlabel, dan berlabel ligan untuk sejumlah lokasi antibodi mengikat (Gambar 2). Tes inhibisi kompetitif sering digunakan untuk mengukur analit kecil. Tes ini juga digunakan ketika pasangan yang cocok antibodi terhadap analit tidak ada. Hanya satu antibodi digunakan dalam mengikat ELISA kompetitif. Hal ini disebabkan oleh halangan sterik yang terjadi jika dua antibodi akan berusaha untuk mengikat molekul yang sangat kecil. Sebuah jumlah yang tetap berlabel ligan (tracer) dan sejumlah variabel ligan berlabel diinkubasi dengan antibodi. Menurut hukum aksi massa jumlah ligan berlabel merupakan fungsi dari total konsentrasi ligan berlabel, dan berlabel. Sebagai konsentrasi ligan berlabel meningkat, ligan kurang berlabel dapat mengikat antibodi dan respon diukur menurun. Jadi lebih rendah sinyal, analit lebih berlabel ada dalam sampel. Standar lekukan binding assay kompetitif memiliki kemiringan negatif.

InggrisBahasa IndonesiaJermanDeteksi bahasaMerjemahkan teks atau laman web

Ketikkan teks atau alamat situs web atau terjemahkan dokumen.BatalTerjemahkan dari: InggrisContoh penggunaan "":diterjemahkan oleh Google secara otomatisBahasa IndonesiaInggrisArabPROSEDUR REKOMENDASI : KOMPETITIF ELISAProsedur ini telah dikembangkan untuk aplikasi di mana konsentrasi analit harusditentukan dalam sampel air . Immunoassay reagen pasang dari SLRC telah dioptimalkan untuk kompetitif ini prosedur ELISA . Reagen dan perlengkapan lainnya adalah standar untuk setiap prosedur ELISAdan tersedia dari berbagai sumber komersial.

Reagen dan Perlengkapan :Immunoassay Reagen Pasangan ( antibodi monoklonal , dan BSA konjugasi )Anti- tikus - Ig enzim konjugat ( misalnya Goat anti - tikus - Ig , alkali fosfatase konjugasi )Substrat untuk enzim konjugat ( misalnya p - nitrophenyl fosfat untuk alkaline phosphatase ) di tepatpenyanggaPBS ( 0.15M NaCl , Fosfat 20mm , 7,5 pH )PBST ( PBS dengan 0,05 % Tween - 20 )

INSTRUMENTASIPiring microwell atau strip ( dasar datar , mengikat protein tinggi , ELISA grade)lempeng pembaca

PROSEDURLangkah 1 - piring mikro Coating maupun strip . Encerkan BSA konjugasi dalam PBS [ bukan PBST ] sesuai denganpengenceran faktor tertentu (biasanya 1500X ) . Mendistribusikan ke microwells pada 50 ul / sumur . Tinggalkan di kamarsuhu untuk 1 jam maupun pada suhu 4 C semalam.Langkah 2 - Siapkan sampel dan standar tersebut. Siapkan kurva standar analit Anda dalam konsentrasikisaran 0-1000 ng / ml . Pengenceran dapat dilakukan dalam PBST maupun lainnya buffer yang cocok . PENTING:Untuk menginterpretasikan uji , Anda harus menyertakan nol kontrol dengan pengencer saja . Sampel dapat diencerkandi PBST jika konsentrasi analit diperkirakan akan lebih tinggi dari 1000 ng / ml .Langkah 3 - Siapkan antibodi . Encerkan antibodi monoklonal di PBST sesuai dengan faktor pengenceran tertentu(biasanya 1500X ) .Langkah 4 - Antibodi / Contoh Inkubasi . Cuci microwells menyeluruh dalam PBST . Tambahkan 25 ul / sumurstandar sumur sampel / , kemudian tambahkan 25 ul / sumur antibodi terhadap sumur . Menetaskan 30 menit . di kamarsuhu.[ Catatan : untuk sensitivitas yang lebih tinggi , sampel dapat ditambahkan pada 45 ul / baik, dan antibodi diencerkan 5X kurang daripengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1:300 bukan 1:1500 ) dan ditambahkan pada 5 ul / sumur . Atau, gunakan lebih tinggipengenceran antibodi ( 1:5.000 bukannya 1:1500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga dapat meningkatkansensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit . ]Langkah 5 - antibodi sekunder . Cuci microwells menyeluruh dalam PBST . Tambahkan 50 ul / sumur Kambing antimouse -Ig enzim konjugasi , diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi . Inkubasi 30 min . disuhu kamar .Langkah 6 - Substrat , dan Hasil . Cuci microwells menyeluruh dalam PBST . Tambahkan 50 ul / sumur substrat .Setelah waktu pengembangan yang cukup , membaca absorbansi pada panjang gelombang yang sesuai .Langkah 7 - penafsiran Assay . Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal. Sampel dengan rendahabsorbansi positif untuk analit . Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) . analitkonsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar

Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung antigen yang menarik menjadi hewan. Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen, karena dapat merangsang kekebalan tubuh respon. Seiring waktu, dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan, sistem kekebalan tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan. Darah dikumpulkan dari hewan, dan serum diisolasi dari darah. Serum ini biasanya kaya antibodi yang mengenali antigen, dan disebut antiserum yang

BAHAN PEMERIKSAANSerum, TUJUANIni adalah yang paling kompleks ELISA, dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen (atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang diharapkan.

Competitive ELISA: Prinsip Dasar

Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh antigen asli (sampel antigen), dan add-in antigen. Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung, Sandwich ELISA dan Direct ELISA. Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut:

1. Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen. 2. Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-dilapisi dengan antigen sama. 3. Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring. (Semakin banyak antigen dalam sampel, kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur, maka "persaingan.") 4. Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer, dan terkonjugasi dengan enzim ditambahkan. 5. Substrat A ditambahkan, dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau neon.

Bagi kompetitif ELISA, semakin tinggi konsentrasi antigen sampel, semakin lemah akhirnya signal. Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin hadir.

(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada antibodi enzyme-linked. Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat dengan antigen sampel Anda (berlabel). Semakin banyak antigen dalam sampel antigen kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal).

Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur.Kompetitif keuntungan ELISA:

Spesifisitas * Tinggi, sejak dua antibodi digunakan antigen / analit secara khusus ditangkap dan terdeteksi Cocok untuk * sampel kompleks, sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum pengukuran Fleksibilitas dan sensitivitas *, karena metode pendeteksian langsung maupun tidak langsung dapat digunakan

PROSEDURC. Kompetitif protokol ELISAprosedurlapisan1. Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi dengan menambahkan100 ml larutan diencerkan.Catatan: Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg / ml.2. Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 C selama 2 jam atau pada suhu 4 C semalam.3. Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali.pemblokiran4. Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur dilapisi.5. Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 C selama 1 jam atau pada suhu 4 C semalam.6. Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali.Inkubasi kompetitif7. Encerkan standar / sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokirBuffer pada waktu yang sama.8. Campur standar / sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml campuran diencerkan dengansumur.9. Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 C untuk 2 jam.10. Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali.11. Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur

Recommended

View more >