limited reagent immunoassay
TRANSCRIPT
Reagen terbatas atau immunoassay kompetitif terkait dengan fenomena analit sampel dan
kompetisi berlabel analit untuk antibodi ( Lihat Gambar 22 ) Pengukuran Sinyal itu akan
menunjukkan jumlah senyawa target yang hadir Kebanyakan jenis tes utama adalah tes
yang kompetitif dimanfaatkan dalam program pengujian obat kerja
- reagen terbatas disebut SM ini hanya rendah quantitiy tetap reagen antibodi capture
ditambahkan dan hanya satu antibodi yang digunakan
- bentuk reagen analit diberi label dan ditambahkan ke sampel ini antigen berlabel
( pelacak ) bersaing dengan antigen berlabel ( analit ) untuk situs mengikat terbatas antibodi
penangkapan
Semakin - analit ( antigen berlabel ) hadir dalam sampel semakin akan mengikat antibodi
menangkap leabing lebih dari analit reagen ( berlabel Ag ) gratis
hubungan langsung antara jumlah sampel analit dan sinyal yang dihasilkan
Format kompetitif
Dalam format yang kompetitif analit berlabel (biasanya antigen ) dalam sampel uji diukur
oleh kemampuannya untuk bersaing
dengan antigen berlabel dalam immunoassay The berlabel blok antigen kemampuan antigen
berlabel untuk mengikat
karena situs mengikat antibodi sudah ditempati Dengan demikian dalam immunoassay
kompetitif kurang label
diukur dalam pengujian tersebut berarti lebih dari berlabel ( sampel uji ) antigen hadir
Jumlah antigen dalam
sampel uji berbanding terbalik dengan jumlah label yang diukur dalam format kompetitif
( Gambar 1-7 )
Prinsip-prinsip pengukuran yang mendasari menit
jumlah zat dalam cairan biologis oleh kompetitif
tes pengikatan protein dan radioimmunoassays
mapan Kompetitif tes pengikatan protein
dan prosedur radioimmunoassay mengharuskan
substansi bersaing ( ligan hapten maupun antigen ) menjadi
berlabel dengan radioisotop untuk mencapai yang diinginkan
spesifisitas dan sensitivitas
Kompetitif Assay Binding
Sebuah uji pengikatan kompetitif didasarkan pada persaingan berlabel dan berlabel ligan
untuk sejumlah lokasi antibodi mengikat (Gambar 2) Tes inhibisi kompetitif sering
digunakan untuk mengukur analit kecil Tes ini juga digunakan ketika pasangan yang cocok
antibodi terhadap analit tidak ada Hanya satu antibodi digunakan dalam mengikat ELISA
kompetitif Hal ini disebabkan oleh halangan sterik yang terjadi jika dua antibodi akan
berusaha untuk mengikat molekul yang sangat kecil Sebuah jumlah yang tetap berlabel
ligan (tracer) dan sejumlah variabel ligan berlabel diinkubasi dengan antibodi Menurut
hukum aksi massa jumlah ligan berlabel merupakan fungsi dari total konsentrasi ligan
berlabel dan berlabel Sebagai konsentrasi ligan berlabel meningkat ligan kurang berlabel
dapat mengikat antibodi dan respon diukur menurun Jadi lebih rendah sinyal analit lebih
berlabel ada dalam sampel Standar lekukan binding assay kompetitif memiliki kemiringan
negatif
Inggris
Bahasa Indonesia
Jerman
Deteksi bahasa
Merjemahkan teks atau laman web
Bahasa Indonesia
Inggris
Arab
PROSEDUR REKOMENDASI KOMPETITIF ELISA
Prosedur ini telah dikembangkan untuk aplikasi di mana konsentrasi analit harus
ditentukan dalam sampel air Immunoassay reagen pasang dari SLRC telah dioptimalkan
untuk kompetitif ini prosedur ELISA Reagen dan perlengkapan lainnya adalah standar
untuk setiap prosedur ELISA
dan tersedia dari berbagai sumber komersial
Reagen dan Perlengkapan
Immunoassay Reagen Pasangan ( antibodi monoklonal dan BSA konjugasi )
Anti- tikus - Ig enzim konjugat ( misalnya Goat anti - tikus - Ig alkali fosfatase konjugasi )
n _t id UTF-8
Substrat untuk enzim konjugat ( misalnya p - nitrophenyl fosfat untuk alkaline phosphatase )
di tepat
penyangga
PBS ( 015M NaCl Fosfat 20mm 75 pH )
PBST ( PBS dengan 005 Tween - 20 )
INSTRUMENTASI
Piring microwell atau strip ( dasar datar mengikat protein tinggi ELISA grade)
lempeng pembaca
PROSEDUR
Langkah 1 - piring mikro Coating maupun strip Encerkan BSA konjugasi dalam PBS
[ bukan PBST ] sesuai dengan
pengenceran faktor tertentu (biasanya 1500X ) Mendistribusikan ke microwells pada 50 ul
sumur Tinggalkan di kamar
suhu untuk 1 jam maupun pada suhu 4 deg C semalam
Langkah 2 - Siapkan sampel dan standar tersebut Siapkan kurva standar analit Anda dalam
konsentrasi
kisaran 0-1000 ng ml Pengenceran dapat dilakukan dalam PBST maupun lainnya buffer
yang cocok PENTING
Untuk menginterpretasikan uji Anda harus menyertakan nol kontrol dengan pengencer saja
Sampel dapat diencerkan
di PBST jika konsentrasi analit diperkirakan akan lebih tinggi dari 1000 ng ml
Langkah 3 - Siapkan antibodi Encerkan antibodi monoklonal di PBST sesuai dengan faktor
pengenceran tertentu
(biasanya 1500X )
Langkah 4 - Antibodi Contoh Inkubasi Cuci microwells menyeluruh dalam PBST
Tambahkan 25 ul sumur
standar sumur sampel kemudian tambahkan 25 ul sumur antibodi terhadap sumur
Menetaskan 30 menit di kamar
suhu
[ Catatan untuk sensitivitas yang lebih tinggi sampel dapat ditambahkan pada 45 ul baik
dan antibodi diencerkan 5X kurang dari
pengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1300 bukan 11500 ) dan ditambahkan pada 5 ul
sumur Atau gunakan lebih tinggi
pengenceran antibodi ( 15000 bukannya 11500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga
dapat meningkatkan
sensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit ]
Langkah 5 - antibodi sekunder Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur Kambing antimouse -
Ig enzim konjugasi diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi Inkubasi 30 min di
suhu kamar
Langkah 6 - Substrat dan Hasil Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur substrat
Setelah waktu pengembangan yang cukup membaca absorbansi pada panjang gelombang
yang sesuai
Langkah 7 - penafsiran Assay Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal Sampel
dengan rendah
absorbansi positif untuk analit Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) analit
konsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
Prinsip-prinsip pengukuran yang mendasari menit
jumlah zat dalam cairan biologis oleh kompetitif
tes pengikatan protein dan radioimmunoassays
mapan Kompetitif tes pengikatan protein
dan prosedur radioimmunoassay mengharuskan
substansi bersaing ( ligan hapten maupun antigen ) menjadi
berlabel dengan radioisotop untuk mencapai yang diinginkan
spesifisitas dan sensitivitas
Kompetitif Assay Binding
Sebuah uji pengikatan kompetitif didasarkan pada persaingan berlabel dan berlabel ligan
untuk sejumlah lokasi antibodi mengikat (Gambar 2) Tes inhibisi kompetitif sering
digunakan untuk mengukur analit kecil Tes ini juga digunakan ketika pasangan yang cocok
antibodi terhadap analit tidak ada Hanya satu antibodi digunakan dalam mengikat ELISA
kompetitif Hal ini disebabkan oleh halangan sterik yang terjadi jika dua antibodi akan
berusaha untuk mengikat molekul yang sangat kecil Sebuah jumlah yang tetap berlabel
ligan (tracer) dan sejumlah variabel ligan berlabel diinkubasi dengan antibodi Menurut
hukum aksi massa jumlah ligan berlabel merupakan fungsi dari total konsentrasi ligan
berlabel dan berlabel Sebagai konsentrasi ligan berlabel meningkat ligan kurang berlabel
dapat mengikat antibodi dan respon diukur menurun Jadi lebih rendah sinyal analit lebih
berlabel ada dalam sampel Standar lekukan binding assay kompetitif memiliki kemiringan
negatif
Inggris
Bahasa Indonesia
Jerman
Deteksi bahasa
Merjemahkan teks atau laman web
Bahasa Indonesia
Inggris
Arab
PROSEDUR REKOMENDASI KOMPETITIF ELISA
Prosedur ini telah dikembangkan untuk aplikasi di mana konsentrasi analit harus
ditentukan dalam sampel air Immunoassay reagen pasang dari SLRC telah dioptimalkan
untuk kompetitif ini prosedur ELISA Reagen dan perlengkapan lainnya adalah standar
untuk setiap prosedur ELISA
dan tersedia dari berbagai sumber komersial
Reagen dan Perlengkapan
Immunoassay Reagen Pasangan ( antibodi monoklonal dan BSA konjugasi )
Anti- tikus - Ig enzim konjugat ( misalnya Goat anti - tikus - Ig alkali fosfatase konjugasi )
n _t id UTF-8
Substrat untuk enzim konjugat ( misalnya p - nitrophenyl fosfat untuk alkaline phosphatase )
di tepat
penyangga
PBS ( 015M NaCl Fosfat 20mm 75 pH )
PBST ( PBS dengan 005 Tween - 20 )
INSTRUMENTASI
Piring microwell atau strip ( dasar datar mengikat protein tinggi ELISA grade)
lempeng pembaca
PROSEDUR
Langkah 1 - piring mikro Coating maupun strip Encerkan BSA konjugasi dalam PBS
[ bukan PBST ] sesuai dengan
pengenceran faktor tertentu (biasanya 1500X ) Mendistribusikan ke microwells pada 50 ul
sumur Tinggalkan di kamar
suhu untuk 1 jam maupun pada suhu 4 deg C semalam
Langkah 2 - Siapkan sampel dan standar tersebut Siapkan kurva standar analit Anda dalam
konsentrasi
kisaran 0-1000 ng ml Pengenceran dapat dilakukan dalam PBST maupun lainnya buffer
yang cocok PENTING
Untuk menginterpretasikan uji Anda harus menyertakan nol kontrol dengan pengencer saja
Sampel dapat diencerkan
di PBST jika konsentrasi analit diperkirakan akan lebih tinggi dari 1000 ng ml
Langkah 3 - Siapkan antibodi Encerkan antibodi monoklonal di PBST sesuai dengan faktor
pengenceran tertentu
(biasanya 1500X )
Langkah 4 - Antibodi Contoh Inkubasi Cuci microwells menyeluruh dalam PBST
Tambahkan 25 ul sumur
standar sumur sampel kemudian tambahkan 25 ul sumur antibodi terhadap sumur
Menetaskan 30 menit di kamar
suhu
[ Catatan untuk sensitivitas yang lebih tinggi sampel dapat ditambahkan pada 45 ul baik
dan antibodi diencerkan 5X kurang dari
pengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1300 bukan 11500 ) dan ditambahkan pada 5 ul
sumur Atau gunakan lebih tinggi
pengenceran antibodi ( 15000 bukannya 11500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga
dapat meningkatkan
sensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit ]
Langkah 5 - antibodi sekunder Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur Kambing antimouse -
Ig enzim konjugasi diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi Inkubasi 30 min di
suhu kamar
Langkah 6 - Substrat dan Hasil Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur substrat
Setelah waktu pengembangan yang cukup membaca absorbansi pada panjang gelombang
yang sesuai
Langkah 7 - penafsiran Assay Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal Sampel
dengan rendah
absorbansi positif untuk analit Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) analit
konsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
berlabel ada dalam sampel Standar lekukan binding assay kompetitif memiliki kemiringan
negatif
Inggris
Bahasa Indonesia
Jerman
Deteksi bahasa
Merjemahkan teks atau laman web
Bahasa Indonesia
Inggris
Arab
PROSEDUR REKOMENDASI KOMPETITIF ELISA
Prosedur ini telah dikembangkan untuk aplikasi di mana konsentrasi analit harus
ditentukan dalam sampel air Immunoassay reagen pasang dari SLRC telah dioptimalkan
untuk kompetitif ini prosedur ELISA Reagen dan perlengkapan lainnya adalah standar
untuk setiap prosedur ELISA
dan tersedia dari berbagai sumber komersial
Reagen dan Perlengkapan
Immunoassay Reagen Pasangan ( antibodi monoklonal dan BSA konjugasi )
Anti- tikus - Ig enzim konjugat ( misalnya Goat anti - tikus - Ig alkali fosfatase konjugasi )
n _t id UTF-8
Substrat untuk enzim konjugat ( misalnya p - nitrophenyl fosfat untuk alkaline phosphatase )
di tepat
penyangga
PBS ( 015M NaCl Fosfat 20mm 75 pH )
PBST ( PBS dengan 005 Tween - 20 )
INSTRUMENTASI
Piring microwell atau strip ( dasar datar mengikat protein tinggi ELISA grade)
lempeng pembaca
PROSEDUR
Langkah 1 - piring mikro Coating maupun strip Encerkan BSA konjugasi dalam PBS
[ bukan PBST ] sesuai dengan
pengenceran faktor tertentu (biasanya 1500X ) Mendistribusikan ke microwells pada 50 ul
sumur Tinggalkan di kamar
suhu untuk 1 jam maupun pada suhu 4 deg C semalam
Langkah 2 - Siapkan sampel dan standar tersebut Siapkan kurva standar analit Anda dalam
konsentrasi
kisaran 0-1000 ng ml Pengenceran dapat dilakukan dalam PBST maupun lainnya buffer
yang cocok PENTING
Untuk menginterpretasikan uji Anda harus menyertakan nol kontrol dengan pengencer saja
Sampel dapat diencerkan
di PBST jika konsentrasi analit diperkirakan akan lebih tinggi dari 1000 ng ml
Langkah 3 - Siapkan antibodi Encerkan antibodi monoklonal di PBST sesuai dengan faktor
pengenceran tertentu
(biasanya 1500X )
Langkah 4 - Antibodi Contoh Inkubasi Cuci microwells menyeluruh dalam PBST
Tambahkan 25 ul sumur
standar sumur sampel kemudian tambahkan 25 ul sumur antibodi terhadap sumur
Menetaskan 30 menit di kamar
suhu
[ Catatan untuk sensitivitas yang lebih tinggi sampel dapat ditambahkan pada 45 ul baik
dan antibodi diencerkan 5X kurang dari
pengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1300 bukan 11500 ) dan ditambahkan pada 5 ul
sumur Atau gunakan lebih tinggi
pengenceran antibodi ( 15000 bukannya 11500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga
dapat meningkatkan
sensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit ]
Langkah 5 - antibodi sekunder Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur Kambing antimouse -
Ig enzim konjugasi diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi Inkubasi 30 min di
suhu kamar
Langkah 6 - Substrat dan Hasil Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur substrat
Setelah waktu pengembangan yang cukup membaca absorbansi pada panjang gelombang
yang sesuai
Langkah 7 - penafsiran Assay Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal Sampel
dengan rendah
absorbansi positif untuk analit Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) analit
konsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
Substrat untuk enzim konjugat ( misalnya p - nitrophenyl fosfat untuk alkaline phosphatase )
di tepat
penyangga
PBS ( 015M NaCl Fosfat 20mm 75 pH )
PBST ( PBS dengan 005 Tween - 20 )
INSTRUMENTASI
Piring microwell atau strip ( dasar datar mengikat protein tinggi ELISA grade)
lempeng pembaca
PROSEDUR
Langkah 1 - piring mikro Coating maupun strip Encerkan BSA konjugasi dalam PBS
[ bukan PBST ] sesuai dengan
pengenceran faktor tertentu (biasanya 1500X ) Mendistribusikan ke microwells pada 50 ul
sumur Tinggalkan di kamar
suhu untuk 1 jam maupun pada suhu 4 deg C semalam
Langkah 2 - Siapkan sampel dan standar tersebut Siapkan kurva standar analit Anda dalam
konsentrasi
kisaran 0-1000 ng ml Pengenceran dapat dilakukan dalam PBST maupun lainnya buffer
yang cocok PENTING
Untuk menginterpretasikan uji Anda harus menyertakan nol kontrol dengan pengencer saja
Sampel dapat diencerkan
di PBST jika konsentrasi analit diperkirakan akan lebih tinggi dari 1000 ng ml
Langkah 3 - Siapkan antibodi Encerkan antibodi monoklonal di PBST sesuai dengan faktor
pengenceran tertentu
(biasanya 1500X )
Langkah 4 - Antibodi Contoh Inkubasi Cuci microwells menyeluruh dalam PBST
Tambahkan 25 ul sumur
standar sumur sampel kemudian tambahkan 25 ul sumur antibodi terhadap sumur
Menetaskan 30 menit di kamar
suhu
[ Catatan untuk sensitivitas yang lebih tinggi sampel dapat ditambahkan pada 45 ul baik
dan antibodi diencerkan 5X kurang dari
pengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1300 bukan 11500 ) dan ditambahkan pada 5 ul
sumur Atau gunakan lebih tinggi
pengenceran antibodi ( 15000 bukannya 11500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga
dapat meningkatkan
sensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit ]
Langkah 5 - antibodi sekunder Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur Kambing antimouse -
Ig enzim konjugasi diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi Inkubasi 30 min di
suhu kamar
Langkah 6 - Substrat dan Hasil Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur substrat
Setelah waktu pengembangan yang cukup membaca absorbansi pada panjang gelombang
yang sesuai
Langkah 7 - penafsiran Assay Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal Sampel
dengan rendah
absorbansi positif untuk analit Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) analit
konsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
(biasanya 1500X )
Langkah 4 - Antibodi Contoh Inkubasi Cuci microwells menyeluruh dalam PBST
Tambahkan 25 ul sumur
standar sumur sampel kemudian tambahkan 25 ul sumur antibodi terhadap sumur
Menetaskan 30 menit di kamar
suhu
[ Catatan untuk sensitivitas yang lebih tinggi sampel dapat ditambahkan pada 45 ul baik
dan antibodi diencerkan 5X kurang dari
pengenceran faktor yang ditentukan ( yaitu 1300 bukan 11500 ) dan ditambahkan pada 5 ul
sumur Atau gunakan lebih tinggi
pengenceran antibodi ( 15000 bukannya 11500 ) - ini akan menurunkan sinyal tapi juga
dapat meningkatkan
sensitivitas dalam kisaran yang lebih rendah konsentrasi analit ]
Langkah 5 - antibodi sekunder Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur Kambing antimouse -
Ig enzim konjugasi diencerkan dalam PBST sesuai dengan instruksi Inkubasi 30 min di
suhu kamar
Langkah 6 - Substrat dan Hasil Cuci microwells menyeluruh dalam PBST Tambahkan 50
ul sumur substrat
Setelah waktu pengembangan yang cukup membaca absorbansi pada panjang gelombang
yang sesuai
Langkah 7 - penafsiran Assay Nol sumur kontrol memiliki absorbansi maksimal Sampel
dengan rendah
absorbansi positif untuk analit Membuat kurva standar ( absorbansi vs konsentrasi ) analit
konsentrasi dalam sampel dapat dihitung dari kurva standar
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
Proses membuat antiserum diawali dengan menyuntikkan larutan yang mengandung
antigen yang menarik menjadi
hewan Ini antigen bunga kadang-kadang disebut imunogen karena dapat merangsang
kekebalan tubuh
respon
Seiring waktu dan dalam beberapa kasus dengan beberapa suntikan sistem kekebalan
tubuh hewan menghasilkan antibodi terhadap antigen yang disuntikkan
Darah dikumpulkan dari hewan dan serum diisolasi dari darah Serum ini biasanya kaya
antibodi yang mengenali antigen dan disebut antiserum yang
BAHAN PEMERIKSAAN
Serum
TUJUAN
Ini adalah yang paling kompleks ELISA dan digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
(atau antibodi) dalam sampel dengan mengamati interferensi dalam output sinyal yang
diharapkan
Competitive ELISA Prinsip Dasar
Acara utama ELISA kompetitif adalah proses pengikatan kompetitif dilaksanakan oleh
antigen asli (sampel antigen) dan add-in antigen Prosedur ELISA bersaing berbeda dalam
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
beberapa hal dibandingkan dengan ELISA Tidak Langsung Sandwich ELISA dan Direct ELISA
Daftar Prosedur simplized adalah sebagai berikut
1 Antibodi primer (berlabel) diinkubasi dengan sampel antigen
2 Kompleks antibodi-antigen tersebut kemudian ditambahkan ke piring 96-yang pra-
dilapisi dengan antigen sama
3 Antibodi Unbound dihilangkan dengan mencuci piring (Semakin banyak antigen dalam
sampel kurang antibodi akan mampu mengikat antigen di dalam sumur maka
persaingan)
4 Antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer dan terkonjugasi dengan
enzim ditambahkan
5 Substrat A ditambahkan dan enzim yang tersisa menimbulkan sinyal kromogenik atau
neon
Bagi kompetitif ELISA semakin tinggi konsentrasi antigen sampel semakin lemah akhirnya
signal Keuntungan utama dari ELISA kompetitif adalah kemampuan untuk menggunakan
sampel kasar atau tidak murni dan masih selektif mengikat setiap antigen yang mungkin
hadir
(Perhatikan bahwa beberapa ELISA kompetitif termasuk antigen enzyme-linked daripada
antibodi enzyme-linked Berlabel antigen bersaing untuk situs antibodi primer mengikat
dengan antigen sampel Anda (berlabel) Semakin banyak antigen dalam sampel antigen
kurang berlabel masih dipertahankan dalam baik dan lemah sinyal)
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
Adalah umum bahwa antigen tidak pertama diposisikan dalam sumur
Kompetitif keuntungan ELISA
Spesifisitas Tinggi sejak dua antibodi digunakan antigen analit secara khusus
ditangkap dan terdeteksi
Cocok untuk sampel kompleks sejak antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum
pengukuran
Fleksibilitas dan sensitivitas karena metode pendeteksian langsung maupun tidak
langsung dapat digunakan
PROSEDUR
C Kompetitif protokol ELISA
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan
antibodi dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
3 Cuci piring bersama 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam
sumur dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
5 Tutup piring dengan plastik dan perekat mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada
suhu 4 deg C semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP
di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan
100 ml campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C untuk 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C
selama 30 menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari TMB Reagen per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Note 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Membaca absorbansi setiap sumur menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari standar kurva
DETEKSI LIMIT
The detection limit of the competitive immunoassay is 5 microgramsL
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
The limit of detection was 10 ngml with a linear working range of 10 to 10000 ngml
httpwwwgenscriptcomdocumentproductFile_notes
bc5d49f144e358e334336a6d3e691b08pdf
Konsentrasi terendah analit terdeteksi yang memberikan
respon yang memiliki perbedaan yang signifikan dari
respon konsentrasi analit nol deteksi
membatasi Untuk memiliki tingkat kepercayaan 95 berarti
dari ulangan dari analit nol dan konsentrasi yang tidak diketahui
harus berbeda oleh dua SD dan oleh tiga SD memiliki 99
tingkat kepercayaan dalam perbedaan
Faktor-faktor yang menentukan sensitivitas akhir dari
uji kompetitif adalah afinitas antibodi konstan dan
kesalahan eksperimental tetapi tidak biasanya pendeteksian dari
substrat Telah dihitung secara teoritis bahwa dengan K =
1012 M-1 (sebuah konstanta yang sangat tinggi untuk antigen antibodi
interaksi) dan CV 1 untuk respon dengan dosis nol
dengan batas deteksi terendah akan menjadi 10-14 M
Faktor membatasi sensitivitas alat tes roti yang
afinitas antibodi kesalahan eksperimental dan
mengikat spesifik dari antibodi berlabel dinyatakan sebagai
persentase dari total antibodi Telah diperkirakan bahwa
dengan K = 1012 M-1 1 CV dari respon pada dosis nol dan
mengikat nonspesifik 1 dari antibodi berlabel deteksi
batas bisa serendah 10-16 M Selain itu ini dapat
n _t id UTF-8
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
ditingkatkan lebih lanjut dengan menggunakan substrat deteksi dengan tinggi
pendeteksian
Hasil
Gunakan data kurva standar dan membangun profil presisi Periksa tingkat latar belakang
Lihat di bawah untuk model kurva kalibrasi non-linear pas dalam immunoassay
Perhatikan bahwa kurva standar dalam semua tiga kondisi pengencer matriks memberikan
rentang dinamis dan sensitivitas yang diperlukan untuk penggunaan yang dimaksudkan
Untuk pengujian ini khususnya belum ada perkembangan lebih lanjut yang diperlukan
(berdasarkan kurva standar latar belakang rendah dan profil presisi)
QUALITY KONTROL
Kosong adalah tabung diisi dengan solusi yang jelas atau jika solusi yang ditambahkan
memiliki warna dengan solusi satu-satunya untuk menentukan latar belakang setiap zat
hadir dalam larutan asli harus dihitung keluar
1048713 Kontrol adalah zat dengan berbagai diketahui nilai dan umumnya tiga tingkat dijalankan
normal tinggi dan rendah
1048713 Jika kontrol tidak memberikan nilai-nilai yang diharapkan hasilnya tidak dapat dilaporkan
keluar
Praktik laboratorium yang baik mensyaratkan bahwa rendah sedang dan tinggi spesimen
kontrol kualitas (kontrol) dijalankan dengan masing-masing
kurva kalibrasi untuk memverifikasi kinerja assay Untuk menjamin kinerja yang tepat
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
sejumlah signifikan secara statistik
kontrol harus diuji untuk menetapkan nilai rata-rata dan rentang yang dapat diterima Kontrol
yang mengandung natrium azida
tidak boleh digunakan
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi
antigen
c) Plate dicuci sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel
semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan
lubang karena inilah disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer Antibodi sekunder ini
berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik
fluoresensi
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahuluPrinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu competitor ke
dalam lubang mikrotiterTeknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen atau antibody
Pada pendeteksian antigen pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut enzim signal
sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
lubangmikrotiter Lalu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan
dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen
spesifik bertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan
antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen
spesifik tertaut enzim signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik
Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal yang tertaut pada antigen spesifik sehingga enzim yang tertaut dengan
antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses pendeteksian ini pendeteksian positif
ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan yang berarti bahwa antigen yang
diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antibody spesifik
Sedangkan pada pendeteksian antibody pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang
dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut enzim
signal sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding
mikrotiter kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak
menempel pada dinding-dinding mikrotiter Lalu larutan yang mengandung antibody spesifik
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
yang telah ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibody
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi
antara antibody spesifik tertaut enzim signal dengan antibody yang diinginkan untuk
dapatberinteraksi dengan antigen spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter
untuk membuang antibody spesifik tertaut enzim signal atau antibody yang tidak berinteraksi
dengan antigen spesifik Lalu kedalam lubang-lubang mikrotiter tersebut ditambahkan
substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibody spesifik
sehingga enzim yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik
akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi Pada proses
pendeteksian ini pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang
ditimbulkan yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan
antibody spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi
terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody
dan antigen
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
References
1 Stuart MC The immunoassay revolution Clin Biochem Rev 19921314ndash21
2 Kroll MH Elin RJ Interference with clinical laboratory analyses Clin Chem 1994401996ndash2005
[PubMed]
3 Ismail AAA Barth JH Wrong biochemistry results [editorial] Br Med J 2001323705ndash6 [PMC free
article] [PubMed]
4 Cole LA Rinne KM Shahabi S Omrani A False-positive hCG assay results leading to unnecessary
surgery and chemotherapy and needless occurrences of diabetes and coma Clin Chem
199945313ndash4 [PubMed]
5 Rotmensch S Cole LA False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in
women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations Lancet 2000355712ndash5
[PubMed]
6 Cole LA False positive hCG immunoassay results [Abstract] Clin Chem 200248 (Suppl 6)A115
7 Torjesen PA Bjoslashro T Antibodies against [I125] testosterone in patients serum A problem for the
laboratory and the patient Clin Chem 1996422047ndash8 [PubMed]
8 Covinsky M Laterza O Pfeifer JD Farkas-Szallasi T Scott MG An IgM λ antibody to Escherichia coli
produces false-positive results in multiple immunometric assays Clin Chem 2000461157ndash61
[PubMed]
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
9 Krahn J Parry DM Leroux M Dalton J High percentage of false positive cardiac troponin I results
in patients with rheumatoid factor Clin Biochem 199932477ndash80 [PubMed]
10 Plebani M Mion M Altinier S Girotto MA Baldo G Zaninotto M False-positive troponin I
attributed to a macrocomplex [letter] Clin Chem 200248677ndash9 [PubMed]
11 Bohner J von Pape K-W Hannes W Stegmann T False-negative immunoassay results for cardiac
troponin I probably due to circulating troponin I autoantibodies [letter] Clin Chem 1996422046
[PubMed]
12 Norden AGW Jackson RA Norden LE Griffin AJ Barnes MA Little JA Misleading results from
immunoassays of serum free thyroxine in the presence of rheumatoid factor Clin Chem
199743957ndash62 [PubMed]
13 Sapin R Simon C False hyperprolactinemia corrected by the use of heterophilic antibody-
blocking agent [letter] Clin Chem 2001472184ndash5 [PubMed]
14 Steimer W Muumlller C Eber B Emmanuilidis K Intoxication due to negative canrenone
interference in digoxin drug monitoring Lancet 19993541176ndash7 [PubMed]
15 Kricka LJ Interferences in immunoassay - still a threat [editorial] Clin Chem 2000461037ndash8
[PubMed]
16 Leape LL Striving for perfection [editorial] Clin Chem 2002481871ndash2 [PubMed]
17 Valdes Jr R Jortani SA Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity now
a demonstrated cause for concern [editorial] Clin Chem 200248405ndash6 [PubMed]
18 Panteghini M Performance of todays cardiac troponin assays and tomorrows [editorial] Clin
Chem 200248809ndash10 [PubMed]
19 Davies C Concepts In Wild D editor The immunoassay handbook 2nd edition United
Kingdom Nature Publishing Group 2001 pp 78ndash110
20 Weber TH Kaumlpyaho KI Tanner P Endogenous interference in immunoassays in clinical
chemistry A review Scand J Clin Lab Invest 199050 (Suppl 201)77ndash82 [PubMed]
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
21 Boscato LM Egan GM Stuart MC Specificity of two-site immunoassays J Immunol Methods
1989117221ndash9 [PubMed]
22 Hursting MJ Raisys VA Opheim KE Drug-specific Fab therapy in drug overdose Arch Pathol Lab
Med 1987111693ndash7 [PubMed]
23 Jones G Handling common laboratory interferences Clin Biochem Rev 200223105ndash11
24 Price C Newman D In Price CP Newman
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
prosedur
lapisan
1 Encerkan antibodi dengan Coating Buffer dan mantel sumur sesuai plat ELISA dengan antibodi
dengan menambahkan
100 ml larutan diencerkan
Catatan Konsentrasi antigen dilapisi adalah 1 mg ml
2 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
3 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
pemblokiran
4 Tambahkan 200 ml blokir Buffer untuk memblokir situs mengikat non-spesifik dalam sumur
dilapisi
5 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 1 jam atau pada suhu 4 deg C
semalam
6 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
Inkubasi kompetitif
7 Encerkan standar sampel dalam Buffer blokir dan mencairkan antigen terkonjugasi HRP di blokir
Buffer pada waktu yang sama
8 Campur standar sampel dan antigen HRP-terkonjugasi bersama-sama dan tambahkan 100 ml
campuran diencerkan dengan
sumur
9 Tutup piring dengan plastik perekat dan mengeram pada 37 deg C selama 2 jam
10 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
11 Tambahkan antibodi sekunder HRP-terkonjugasi ke sumur dan mengeram pada 37 deg C selama 30
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
menit
12 Cuci piring dengan 200 ml Cuci Buffer selama tiga kali
deteksi
13 Tambahkan 100 ml dari Reagen TMB per sumur dengan pipet multichannel
14 Setelah pembangunan warna yang cukup tambahkan 100 ml Stop Buffer ke sumur
Catatan 10-15 menit sudah cukup untuk pengembangan warna
15 Baca absorbansi masing-masing dengan baik menggunakan 450 nm
16 Hitung konsentrasi sampel dari kurva standar
Procedure
Coating
1 Dilute the antibody with Coating Buffer and coat appropriate wells of ELISA plate
with the antibody by adding
100 μl of the diluted solution
Note The concentration of coated antigen is 1 μgml
2 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours or at 4 degC
overnight
3 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Blocking
4 Add 200 μl of Blocking Buffer to block the non-specific binding sites in the coated
wells
5 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 1 hour or at 4 degC
overnight
6 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Competitive Incubation
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
7 Dilute the standardsamples in the Blocking Buffer and dilute the HRP conjugated
antigen in the Blocking
Buffer at the same time
8 Mix the standardssample and HRP-conjugated antigen together and add 100 μl of
the diluted mixture to the
wells
9 Cover the plate with an adhesive plastic and incubate at 37 degC for 2 hours
10 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
11 Add HRP-conjugated secondary antibody to the wells and incubate at 37 degC for 30
minutes
12 Wash the plate with 200 μl of Washing Buffer for three times
Detection
13 Add 100 μl of the TMB Reagent per well with a multichannel pipette
14 After sufficient color development add 100 μl of Stop Buffer to the wells
Note 10-15 minutes is enough for color development
15 Read the absorbance of each well using 450 nm
16 Calculate the concentration of the sample from standard curve
Immunoassay kompetitif antibodi tunggal khusus untuk hapten analit Untuk hasil yang optimal
afinitas dimurnikan reagen lebih disukai
ReagentsCoating Buffer (1XPBS Buffer)85 g NaCl14 g Na2HPO4
02 g NaH2PO4
1000 ml ddH2OAdjust to pH 74Store at 4 degCWashing Buffer05 ml Tween 20
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-
1000 ml PBS BufferStore at 4 degCBlocking Buffer100 ml Washing Buffer1 g BSAStore at 4 degCStop Buffer83 ml 12 molL HCl917 ml ddH2OStore at 4 degC
- References
-