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Library Poolの際のIndexの選び方

イルミナ株式会社

テクニカル アプリケーション サイエンティスト

渡辺 真子

2

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングする

ガイドラインを考慮するのか？

マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？

– TruSeq LT and RNA v2

– TruSeq HT

– Nextera

最適なインデックスの組み合わせを選択するためのIllumina Experiment

Managerを使用する方法は？

目的

3

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

– インデックス付きのライブラリー構造とインデックスリードの順序の概要

目的

4

TruSeq DNA LT and TruSeq RNA v2 Single Index Library

5

詳細は “Sequencing: Illumina’s Dual Indexing Strategy” をご覧ください:

http://support.illumina.com/training/sequencing_training.ilmn

TruSeq HT and Nextera – Dual Index Library

6

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要

– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？

目的

7

同一サイクルに同数の赤 (A and C) と緑(G and T)の塩基

– 蛍光強度により適切にクラスターの位置を定めるために両カラーが必要。

一般的に、多数のサンプル＝よりよいカラーバランス

カラーバランスの重要性

A

T

C

A

C

G

C

G

A

T

G

T

T

T

A

G

G

C

T

G

A

C

C

A

A

C

A

G

T

G

G

C

C

A

A

T

C

A

G

A

T

C

A

C

T

T

G

A

G

A

T

C

A

G

T

A

G

C

T

T

G

G

C

T

A

C

C

T

T

G

T

A

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

Cycle 6

✓

8

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要

– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？

– カラーバランスがとれていないと、何が起こるか？

目的

9

クラスターの位置で、 intensity （蛍光強度）が正しく並らばないかもしれない。

インデックスによるサンプルの振り分けに問題が生じる。

– インデックスがない = 使用可能なデータがない。

– 期待されるアウトプットより少ない。

すべてのクラスターに影響を及ぼすのではないかもしれない

カラーバランスがとれていないと、何が起こるか?

10

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

– インデックス付きのライブラリ構造とインデックスリードの順序の概要

– なぜインデックスリードでカラーバランスが重要なのか？

– カラーバランスがとれていないと、何が起こるか？

いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？

目的

11

ライブラリー調製前にインデックスの組み合わせを考えることが重要！

特に以下のような場合にインデックスの組み合わせを考慮してください：

– キット内にある全セットより少ないサンプル数でプーリングする場合

– インデックス付のサンプルを不均一な濃度でプーリングする場合

12

なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？

マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？

目的

13

重要な役割：各インデックスサイクルにおける赤と緑 のヌクレオチドの量のバランスをとる。

– Single-index と dual-index サンプルに適用。

– すべてのサンプル調製キットとシーケンスプラットフォームに適用。

マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？

G

C

C

A

A

T

C

T

T

G

T

A

適切な

組み合わせ

G

C

C

A

A

T

C

A

G

A

T

C

不適切な

組み合わせ

注：これらのサンプルは等モル量をプールしていると仮定。

Cycle 1

Cycle 2

Cycle 3

Cycle 4

Cycle 5

Cycle 6

14

いくつかの最適な組み合わせについて実施しており、これらの組み合わせは下記のガイドにてご覧いただけます！

ライブラリーに合わせて適切なサンプル調製キットのガイドをご使用下さい！

The good news...

15

詳しく見てみましょう...

TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines

Single index library structure:

16

詳しく見てみましょう...

17

詳しく見てみましょう...

TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines

AD006 GCCAAT

AD012 CTTGTA

AD005 ACAGTG

AD019 GTGAAA

インデックス配列は Illumina Adapter Sequence Letterにて掲載。

https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw

18

インデックス配列は Illumina Adapter Sequence Letterにて掲載。

詳しく見てみましょう...

TruSeq DNA LT/RNA v2 pooling guidelines

AD005 ACAGTG

AD006 GCCAAT

AD015 ATGTCA

AD006 GCCAAT

AD012 CTTGTA

+ any other adapter

AD005 ACAGTG

AD019 GTGAAA

+ any other adapter

AD002 CGATGT

AD007 CAGATC

AD019 GTGAAA

19

ライブラリーは2つのインデックス配列を含む:

Index 1 のみ読むことができる

Index 1 とIndex 2 の両方を読むことができる

カラーバランスのルールは両インデックスリードに適用！

Truseq HT and Nextera – 2つのインデックスが可能

20

Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide

21

Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide

カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。

22

Truseq HT ガイドライン – Index 1 のみ TruSeq DNA sample prep guide

カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。

注意: ガイドラインでは、全ての適用

可能な組み合わせを、示しておりません。

23

Truseq HT ガイドライン – Index 1 と Index 2 TruSeq DNA sample prep guide

24

Truseq HT ガイドライン – Index 1 と Index 2 TruSeq DNA sample prep guide

カラーバランスのとれたプールが 緑のウェルを含むライトグレーの枠で示されている。

Note: カラーバランスのとれたプールの全てが記載されているわけではありません。

25

Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide

26

Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide

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なぜ、インデックスの組み合わせを考える必要があるのか？

いつ、フローセルの１レーンに複数のインデックスをプーリングするためのガイドラインを考慮するのか？

マニュアルで最適なインデックスの組み合わせを選択するには？

適切なインデックスの組み合わせを選ぶために、Illumina Experiment

Manager ソフトウェアをどのように使用するか？

Objectives

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HiSeq/MiSeq/HiScan/GAIIx用のサンプルシートを作製するのに役立つソフトウェア

– インデックスのカラーバランスの確認もします！

以下のリンクからダウンロード (インストーラーとユーザーガイドを含む):

https://my.illumina.com/download/summary/Do_qnPtQYkG3Inh3jPkOTA

サンプル調製の前にサンプルシートを作製するのに役立ちます！

Illumina Experiment Manager ソフトウェア

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Illumina Experiment Manager の使用方法

30

Illumina Experiment Managerの使用方法

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Illumina Experiment Managerの使用方法

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Illumina Experiment Managerの使用方法

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Illumina Experiment Managerの使用方法

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Illumina Experiment Managerの使用方法

どのようにして決めるか？

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Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリードNextera sample prep guide

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Nextera ガイドライン – 1つまたは２つのインデックスリード Nextera sample prep guide

Index 1 Index 2

N701 TAAGGCGA N505 GTAAGGAG

N701 TAAGGCGA N506 ACTGCATA

N702 CGTACTAG N505 GTAAGGAG

N702 CGTACTAG N506 ACTGCATA

N704 TCCTGAGC N505 GTAAGGAG

N704 TCCTGAGC N506 ACTGCATA

N705 GGACTCCT N505 GTAAGGAG

37

Illumina Experiment Managerの使用方法

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Illumina Experiment Managerの使用方法

39

Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ

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Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ

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Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ

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Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ

43

Illumina Experiment Manager ―不適切なインデックスの組み合わせ

どのようにして修正するか?

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Index 1 Index 2

インデックス配列- Illumina Adapter Sequence Letter

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Index 1 Index 2

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Index 1 Index 2

各インデックスの各サイクルで少なくとも１つの赤または緑の塩基がある!

47

Experiment Managerで確認しましょう...

修正できた!

48

プーリングガイドラインは、インデックスリードの各サイクルにおいて 赤または緑のカラーチャンネルを持つことに、基づいてる。

– もし、カラーバランスが取れていなかったら、デマルチプレックスの後で、

データのアウトプットが低くなるかもしれない。

ガイドラインは全てのインデックスリードの全てのサイクルに適用。

Illumina Experiment Managerまたは、赤と緑のバランスを実際に見て 確認することで、プーリングガイドラインに基づいたインデックスの組み合わせを設定できる。

まとめ

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Product Support Pages: (Pooling guidelines)

– TruSeq DNA LT:

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_lt_sample_prep_kit.ilmn

– TruSeq DNA HT:

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_ht_sample_prep_kit.ilmn

– TruSeq RNA v2:

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2.ilmn

– Nextera: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_dna_kit.ilmn

– Nextera XT: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit.ilmn

IEM software and user guide:

https://my.illumina.com/download/summary/Do_qnPtQYkG3Inh3jPkOTA

– IEM short online training course:

https://mycourses.illumina.com/courses/Sequencing_Illumina_Experiment_Manager/index.html

Illumina Adapter Sequence Letter:

https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw

Dual-indexing short online training course:

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_dna_kit/training.ilmn

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