lezione : antibiotici e antibiogramma docente :...

Corso integrato di Corso integrato di microbiologiamicrobiologia

prof. ord. e coordinatore del corso : prof. ord. e coordinatore del corso : prof. M.A.Tufanoprof. M.A.Tufano

Lezione :Lezione :Antibiotici e antibiogrammaAntibiotici e antibiogramma

Docente : M.R.IoveneDocente : M.R.IoveneIndirizzo Mail: [email protected] Mail: [email protected]

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Struttura batterica

22


33

BATTERIBATTERI

Gram PositiviGram PositiviAerobi Aerobi

Gram NegativiGram Negativi

Gram PositiviGram PositiviAnaerobiAnaerobi

Gram NegativiGram Negativi


44


55


Numerosi ceppi batterici colonizzano differenti distretti corporei66


77

BACTERIA COMMONLY FOUND ON THE SURFACES OF THE HUMAN BODY

BACTERIUM Skin Conjunctiva Nose Pharynx Mouth Lower Intestine

Anterior urethra Vagina

Staphylococcus epidermidis (1) ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ Staphylococcus aureus* (2) + +/- + + + ++ +/- + Streptococcus mitis + ++ +/- + + Streptococcus salivarius ++ ++ Streptococcus mutans* (3) + ++ Enterococcus faecalis* (4) +/- + ++ + + Streptococcus pneumoniae* (5) +/- +/- + + +/- Streptococcus pyogenes* (6) +/- +/- + + +/- +/- Neisseria sp. (7) + + ++ + + + Neisseria meningitidis* (8) + ++ + + Veillonellae sp. + +/- Enterobacteriaceae* (Escherichia coli) (9) +/- +/- +/- + ++ + +

Proteus sp. +/- + + + + + + Pseudomonas aeruginosa* (10) +/- +/- + +/- Haemophilus influenzae* (11) +/- + + + Bacteroides sp.* ++ + +/- Bifidobacterium bifidum (12) ++ Lactobacillus sp. (13) + ++ ++ ++ Clostridium sp.* (14) +/- ++ Clostridium tetani (15) +/- Corynebacteria (16) ++ + ++ + + + + + Mycobacteria + +/- +/- + + Actinomycetes + + Spirochetes + ++ ++ Mycoplasmas + + + +/- +


Meccanismi di difesa dell’ospite

L’ integrità delle superfici corporee costituisce insieme ad una “serie di fattori”, una barriera all’iniziale attecchimento e

penetrazione dell’agente patogeno88


FontiFonti-- da dove provengono i microrganismi?da dove provengono i microrganismi?

Via trasplacentare

Canale del partoAllattamentoMadreMadre

Noi stessiNoi stessi

Altri individuiAltri individui

AnimaliAnimaliAmbiente

SaniPortatoriMalati

Ambiente

99


I batteri patogeni possono prendere il sopravvento, quando “l’equilibrio e i meccanismi di difesa dell’ospite”

vengono, per fattori interni o esterni, ad alterarsi.1010


Il primo a dare un approccio diverso Il primo a dare un approccio diverso alla ricerca sulle malattie infettive fu alla ricerca sulle malattie infettive fu Paul Ehrlich (Paul Ehrlich (18541854--19151915).).

Egli propose che per combattere Egli propose che per combattere queste malattie,si utilizzassero queste malattie,si utilizzassero farmaci precisi, i chemioterapicifarmaci precisi, i chemioterapici((termine coniato dallo stesso scienziatotermine coniato dallo stesso scienziato),), tossicitossiciper il per il microrganismo patogeno microrganismo patogeno

1111


CHEMIOTERAPIA (definizione)Paul Ehrlich, 1910

1212

Insieme dottrinale e metodologico volto alla ricerca di sostanze chimiche artificiali e naturali dotate di tossicità selettiva nei confronti di cellule procariotiche od eucariotiche responsabili di infezioni, infestioni, neoplasie o disordini immunologici.

SI DISTINGUONO, IN FUNZIONE DEI DIVERSI BERSAGLI , TRESETTORI DELLA CHEMIOTERAPIA:

1) ANTIMICROBICA (ETIOTROPA)2) ANTIBLASTICA 3) IMMUNOMODULANTE


•(Paul Erlich 1891-1914)

1313

Basi razionali della Basi razionali della chemioterapia chemioterapia

TossicitTossicitàà selettivaselettivaRecettore specifico dellRecettore specifico dell’’agente patogenoagente patogenoScreening di prototipi naturali e semisintesi di Screening di prototipi naturali e semisintesi di analoghianaloghiRuolo dei modelli animaliRuolo dei modelli animaliProblema della chemioresistenzaProblema della chemioresistenza

Corpora non agunt nisi fixata (P. Erlich 13 giugno 1914)


Da un consiglio di Ehrlich Da un consiglio di Ehrlich pubblicato nel 1913pubblicato nel 1913

““Frapper fort et frapper viteFrapper fort et frapper vite””

Colpisci forte e colpisci in frettaColpisci forte e colpisci in fretta

Paul Ehrlich, Lancet 1913

1414


Tra gli scienziati che parteciparono attivamente alle ricerche sui chemioterapici vi fu anche Alexander Fleming (1881-1955) casualmente, scoprì nel 1928 una sostanza che presentava effetti antibatterici e che arrivò più tardi a chiamare penicillina. Egli, infatti, mentre era intento a pulire nel suo laboratorio, fu incuriosito da una piastra di petri con Stafilococchi che era stata inquinata da una muffa. Le colonie di questa muffa, che egli stabilì essere di Penicillium notatum,avevano causato una zona di inibizione della crescita degli Stafilococchi che stavano nelle vicinanze delle stesse. Fleming ipotizzò che la muffa avesse prodotto una sostanza letale per gli Stafilococchi, che era, appunto, la penicillina

1515


penicillium notatumpenicillium notatum

1616


Alone di inibizione formatosi intorno a Alone di inibizione formatosi intorno a penicillum notatum inoculato con stafilococcopenicillum notatum inoculato con stafilococco

1717


Howard Walter Florey (1898-1968)

Ernst Boris Chain (1906-1979)

Discovery of terapeutic effects of penicillin1945 - Nobel Prize in Physiology or Medicine

“for the discovery of penicillin and its therapeutic effects”

Sir Alexander FlemingSir Ernst Boris Chain

Baron Howard Walter Floreypenicillin culture

at the Sir William Dunn School of Pathology Oxford, England, 1940

1818


A poster from World War Two

1919


Sviluppo ed efficacia della chemioterapia antimicrobica(1935 – 1993)

2020


2121

I capostipitiI capostipiti

1935 PRONTOSIL ROSSO1935 PRONTOSIL ROSSO(Domagk)(Domagk)

1941 PENICILLINA G1941 PENICILLINA G(1929) (Fleming, Chain, Florey)(1929) (Fleming, Chain, Florey)

1944 STREPTOMICINA1944 STREPTOMICINA(Waksman, Shatz, Bugle)(Waksman, Shatz, Bugle)

1945 CEFALOSPORINE P,N,C1945 CEFALOSPORINE P,N,C(Brotzu)(Brotzu)

1947 CLORTETRACICLINA1947 CLORTETRACICLINA(Duggar)(Duggar)

1947 CLORAMFENICOLO1947 CLORAMFENICOLO(Burkholder)(Burkholder)

1952 ISONIAZIDE1952 ISONIAZIDE(Fox)(Fox)

1952 ERITROMICINA1952 ERITROMICINA(Mc Guire)(Mc Guire)

1955 VANCOMICINA1955 VANCOMICINA

1955 AMFOTERICINE A,B1955 AMFOTERICINE A,B(Gold)(Gold)

1959 RIFAMICINE A,B,C,D,E1959 RIFAMICINE A,B,C,D,E(Sensi)(Sensi)

1959 STAFILOMICINA1959 STAFILOMICINA(Vanderhaege)(Vanderhaege)

1962 AC. NALIDIXICO1962 AC. NALIDIXICO(Lesher)(Lesher)

(Mc Cormick)(Mc Cormick)

1987 DuP 7211987 DuP 721


ANTIBIOTICIDefinizione:

Con il termine antibiotico si intende una molecola naturale, metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e Funghi inferiori, prodotta in coincidenza della differenziazione di strutture cellulari specializzate per la sopravvivenza microbica quando il substrato è esaurito, questa molecola è in grado di inibire la crescita di altri microrganismi.

Dal momento che attualmente molte molecole vengono prodotte per via sintetica o semisintetica è più corretto utilizzare il termine CHEMIOANTIBIOTICO.

2222


Produzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metProduzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metaboliti aboliti azotatiazotati

CRESCITAESPONENZIALE

CRESCITA POST-LOGARITMICA

ESAURIMENTOSUBSTRATO CRESCITA

PRE-SPORULAZIONE

DEPRESSIONE CATABOLICA

LISI

2323

SPORE

ANTIBIOTICIESOENZIMI

ESOTOSSINEActimomiceti

Funghi inferioriBacillacee


Classificazione degli Classificazione degli ANTIBIOTICIANTIBIOTICI

Esistono diversi sistemi di Esistono diversi sistemi di classificazione in classificazione in

considerazione del notevole considerazione del notevole numero di molecole utilizzate numero di molecole utilizzate

nella pratica clinicanella pratica clinica..

2424


CLASSIFICAZIONECLASSIFICAZIONE1. 1. Classificazione in FAMIGLIEClassificazione in FAMIGLIE2. Secondo l' ORIGINE2. Secondo l' ORIGINE3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE4. Secondo il TIPO D'AZIONE4. Secondo il TIPO D'AZIONE5. 5. In base al In base al MECCANISMO D'AZIONEMECCANISMO D'AZIONE

2525


1.Classificazione in FAMIGLIE

Vengono classificati in "famiglie" molecole che presentano

caratteristiche simili (es. penicilline, cefalosporine,aminoglucosidi, tetracicline etc.)

2626


Classificazione degli Classificazione degli ANTIBIOTICIANTIBIOTICI

2. Secondo l' ORIGINEEstrattiva: da batteri e funghi (Penicillium,Cephalosporium, Streptomyces)

Semisintetica: partendo da una struttura base, ottenuta per estrazione (fermentazione) e aggiungendo catene di sintesi

Sintesi chimica: molti composti si ottengono per sintesi chimica (chinoloni, monobattami, cloramfenicolo etc)

2727


Classificazione degli ANTIBIOTICI

2828

3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONESi intende per spettro d'azione, il ventaglio delle specie batteriche nei riguardi delle quali l'antibiotico mostra attività.Ampio: (Gram positivi e negativi)

Medio: (Gram + ed alcuni Gram -)

Ristretto: (solo Gram - o solo Gram +)



4. Secondo il TIPO D'AZIONEbatteriostatica: blocca la riproduzione dei batteri

battericida: (determina la morte dei batteri)

Si definisce battericida un antibiotico il quale dopo 24 h di contatto "in vitro“ determina una

sopravvivenza dei germi uguale o inferiore allo 0,01% .

2929



5. In base al MECCANISMO D'AZIONE1. Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare,

tale inibizione si può verificare:nella prima fase di sintesi (inibizione della fosfoenolpiruvatotransferasi) : Fosfomicina oppure (mancata utilizzazione della alanina): Cicloserina.nella seconda fase (trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale) Vancomicina. a livello terminale (fase di transpeptidizzazione) Penicilline, Cefalosporine.

3030


Classificazione degli ANTIBIOTICI5. In base al MECCANISMO D'AZIONE2. Antibiotici che inibiscono la sintesi proteica, tale

inibizione può avvenire:• a livello della subunità 30S dei ribosomi

(aminoglicosidi,tetracicline)• a livello della subunità 50S dei ribosomi

(cloramfenicolo,macrolidi)

3. Antibiotici che inibiscono il meccanismo di replicazione e di trascrizione degli acidi nucleici:• inibizione della RNA-polimerasi (rifamicine)• inibizione della DNA-girasi o topoisomerasi (chinoloni)

3131



5. In base al MECCANISMO D'AZIONE

4. Antibiotici che alterano la membrana citoplasmatica batterica o micotica (polimixine, polieni)

5. Antibiotici che agiscono come antimetaboliti (sulfamidici, trimetropim)

3232


MECCANISMI DI AZIONE DELLE MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICIPRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica

(macrolidi, tetracicline,aminoglicosidi, oxazolidinoni)

Inibizione della sintesi della parete cellulare

(penicilline, cefalosporine, glicopeptidi)

Inibizione della replicazione del DNA

(fluorochinoloni)

Trasformazioni metaboliche nel citoplasma

(sulfonamidi, trimetoprim)

Interferenza con la membrana citoplasmatica

(polimixina)3333


ANTIBIOTICO RESISTENZAANTIBIOTICO RESISTENZA

E’ la capacità dei batteri di essere o di diventare resistenti nei confronti degli antibiotici.

Principale problema dell’antibiotico-terapia di grande attualità e di profondo impatto pratico.

Condiziona la scelta, l’impiego, il futuro della chemioterapia

Iniziato con la nascita della chemioterapia, ne segue costantemente il decorso

3434


MECCANISMI DELLMECCANISMI DELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA

3535

I meccanismi attraverso i quali può I meccanismi attraverso i quali può instaurarsi una resistenza instaurarsi una resistenza

antibiotica sono:antibiotica sono:

ridotta permeabilitridotta permeabilitàà cellularecellulareaumentato efflussoaumentato efflussoalterazione del bersaglioalterazione del bersaglioproduzione di enzimi inattivantiproduzione di enzimi inattivanti



1. 1. Ridotta permeabilitRidotta permeabilitàà cellulare:cellulare:la penetrazione di un antibiotico può essere la penetrazione di un antibiotico può essere ridotta da cambiamenti strutturali negli ridotta da cambiamenti strutturali negli involucri superficiali della cellula. involucri superficiali della cellula.

Nei GramNei Gram-- la resistenza può essere dovuta ad la resistenza può essere dovuta ad alterazione delle porine (proteine di alterazione delle porine (proteine di membrana attraverso le quali penetrano molti membrana attraverso le quali penetrano molti antibiotici)antibiotici)

3636



2. 2. Aumentato efflusso:Aumentato efflusso:LL’’antibiotico penetrato nella cellula antibiotico penetrato nella cellula

batterica batterica èè allontanato da sistemi di allontanato da sistemi di efflusso.efflusso.

Nei GramNei Gram-- le pompe di efflusso operano le pompe di efflusso operano accoppiate a accoppiate a ”” proteine canaleproteine canale”” che che provocano lprovocano l’’espulsione diretta del farmacoespulsione diretta del farmaco

3737



33. . Alterazione del bersaglio:Alterazione del bersaglio:il bersaglio dellil bersaglio dell’’antibiotico antibiotico èè alterato e non alterato e non èè

pipiùù riconosciuto dallriconosciuto dall’’antibiotico.antibiotico.

4.4. Produzione di enzimi inattivantiProduzione di enzimi inattivanti::ll’’antibiotico perde la sua attivitantibiotico perde la sua attivitàà biologica, biologica, poichpoichéé viene inattivato da enzimi specifici. viene inattivato da enzimi specifici. ((betabeta--lattamasilattamasi, acetiltransferasi, , acetiltransferasi, fosfotransferasi, adeniltransferasi)fosfotransferasi, adeniltransferasi)

3838


3939

MECCANISMI MECCANISMI DELLDELL’’ANTIBIOTICO ANTIBIOTICO RESISTENZARESISTENZA

Produzione di enzimi inattivantiProduzione di enzimi inattivanti

1)1) nello spazio periplasmico per i nello spazio periplasmico per i Gram negativi (a,b,c)Gram negativi (a,b,c)

2)2) extra cellulari per i Gram extra cellulari per i Gram positivi (d)positivi (d)


RESISTENZA NATURALE (origine naturaleRESISTENZA NATURALE (origine naturale))

4040

Insensibilità costituzionale di un microrganismo verso un determinato antibiotico

Immutabile nel tempo, geneticamente determinataSi manifesta in tutti i ceppi di una stessa specie

Dipende:caratteristiche dell’antibioticostrutture del microrganismomancata penetrazione del farmaco attraverso le

struttureesterne del microrganismo

Es. insensibilità degli Enterobatteri per la penicillina o dei batteri Gram negativi per i glicopeptidi


RESISTENZA ACQUISITARESISTENZA ACQUISITA(variazione informazionale(variazione informazionale))

Comparsa di ceppi che, nellComparsa di ceppi che, nell’’ambito ambito di una specie microbica di una specie microbica

originariamente sensibile ad un originariamente sensibile ad un chemioterapico, hanno perduto la chemioterapico, hanno perduto la sensibilitsensibilitàà verso concentrazioni verso concentrazioni del farmaco terapeuticamente del farmaco terapeuticamente

raggiungibili in vivo.raggiungibili in vivo.4141


EE’’ favorita dallfavorita dall’’elevata velocitelevata velocitààcon cui i batteri si moltiplicanocon cui i batteri si moltiplicano

Distinguiamo :Distinguiamo :cromosomica o endogenacromosomica o endogenaextracromosomica o esogenaextracromosomica o esogena

4242


RESISTENZA CROMOSOMICARESISTENZA CROMOSOMICA

4343

Costituisce solo il 10Costituisce solo il 10--15% di tutte le resistenze acquisite 15% di tutte le resistenze acquisite (bassa frequenza di insorgenza)(bassa frequenza di insorgenza)

Si realizza tramite unSi realizza tramite un’’alterazione mutazionale spontaneaalterazione mutazionale spontaneadelldell’’informazione genetica cromosomicainformazione genetica cromosomica

LL’’antibiotico esercita unantibiotico esercita un’’azione selettiva (seleziona i mutanti azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti inibendo le cellule sensibili)resistenti inibendo le cellule sensibili)

Tale resistenza interessa solo lTale resistenza interessa solo l’’antibiotico verso il quale sonoantibiotico verso il quale sonostati isolati i mutanti resistentistati isolati i mutanti resistenti

Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altrGli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altriiantibiotici con caratteristiche simili (resistenza antibiotici con caratteristiche simili (resistenza crociata o cross crociata o cross --resistenza)resistenza)

Si trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellSi trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellula madre ula madre a cellula figlia)a cellula figlia)


RESISTENZA CROMOSOMICARESISTENZA CROMOSOMICA

Può essere:Può essere:multimulti--stepstep: : sono necessarie pisono necessarie piùù mutazioni mutazioni

perchperchéé possa instaurarsi (es. betapossa instaurarsi (es. beta--lattamine, lattamine, macrolidi, cloramfenicolo)macrolidi, cloramfenicolo)

oneone--stepstep: : èè sufficiente una sola mutazione per sufficiente una sola mutazione per determinare la comparsa di ceppi totalmente determinare la comparsa di ceppi totalmente resistenti (es. rifamicine, chinoloniresistenti (es. rifamicine, chinoloni))

4444


RESISTENZA EXTRACROMOSOMICARESISTENZA EXTRACROMOSOMICA

Costituisce il 90% di tutte le resistenze Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza)(alta frequenza di insorgenza)

Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica cheSi origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da deriva da altri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccaaltri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di nismi di coniugazione, trasformazione e trasduzioneconiugazione, trasformazione e trasduzione

Riguarda piRiguarda piùù antibiotici contemporaneamente (antibiotici contemporaneamente (resistenza multiplaresistenza multipla))

EE’’ a trasmissione orizzontale (a trasmissione orizzontale (tramite lo scambio geneticotramite lo scambio genetico))

Può essere trasferita anche a microrganismi appartenente a spePuò essere trasferita anche a microrganismi appartenente a specie cie differenti differenti (resistenza contagiosa(resistenza contagiosa))

EE’’ dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (elementi genici mobilielementi genici mobili))

4545


4646


TrasduzioneTrasduzione ::

UnUn batteriofagobatteriofago funge da vettore e funge da vettore e trasferisce il DNA contenente un trasferisce il DNA contenente un gene di resistenza da una cellula gene di resistenza da una cellula

batterica ad un'altra.batterica ad un'altra.

4747


Principali meccanismi di resistenza Principali meccanismi di resistenza antibattericaantibatterica

Deflusso(macrolidi,chinoloni)

Ridotta permeabilità(co-trimossazolo)

Modifica della sede bersaglio(intra o extracellulare; β-lattamici, macrolidi, chinoloni, glicopeptidi)

Degradazioneenzimatica

(intra o extracellulare; β-lattamici, aminoglucosidi)

XX

Bypass(co-trimossazolo)

4848


Classi di AntibioticiClassi di Antibiotici

TetraciclineTetraciclineCloramfenicoloCloramfenicoloPolipeptidiciPolipeptidici

PolimixinePolimixineStreptogramineStreptogramineAltriAltri

VariVariFosfomicinaFosfomicinaAcido fusidicoAcido fusidicoSpectinomicinaSpectinomicinaNovobiocina

BetalattamiciBetalattamiciAminoglucosidiAminoglucosidiChinoloniChinoloniGlicopeptidiGlicopeptidiOxazolidinoniOxazolidinoniMacrolidiMacrolidiKetolidiKetolidiLincosamidiLincosamidiRifamicineRifamicine Novobiocina

4949


MECCANISMI DI AZIONE DELLE MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICIPRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica

(macrolidi, tetracicline,aminoglicosidi, oxazolidinoni)

Inibizione della sintesi della parete cellulare

(penicilline, cefalosporine, glicopeptidi)

Inibizione della replicazione del DNA

(fluorochinoloni)

Trasformazioni metaboliche nel citoplasma

(sulfonamidi, trimetoprim)

Interferenza con la membrana citoplasmatica

(polimixina)5050


Che cosa si intende per antibiogramma ?

L’antibiogramma è un metodo di valutazione in vitro dell’interazione

tra il microrganismo isolato e gli antibiotici più appropiati per il

trattamento in vivo.

5151


Isolare l’agente eziologico in coltura pura, identificarlo con i test biochimici per

permettere la classificazione in genere e specie

L’identificazione dei germi isolatidai campioni biologici, riveste importanza clinica ed epidemiologica ed è una tappa

fondamentale per allestire i test di sensibilità agli antibiotici

5252


5353

La scelta degli antibiotici da saggiare in vitro viene fatta per via generale in base

alle linee guida di NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standard).

In particolare, però, ogni laboratorio ha il dovere di aggiornarsi e/o partecipare

attivamente agli studi epidemiologici recenti o in corso, che studiano per ogni patologia la

frequenza di isolamento degli agenti patogeni da cui possiamo estrapolare

le resistenze batteriche locali.


Metodi di antibiogrammaMetodi di antibiogramma

PER DILUIZIONEPER DILUIZIONE--in terreno liquidoin terreno liquido--in terreno solidoin terreno solido

PER DIFFUSIONEPER DIFFUSIONE--in terreno solidoin terreno solido

5454

In ogni caso,i risultati ottenuti devono In ogni caso,i risultati ottenuti devono essere tradotti in categorie di essere tradotti in categorie di

sensibilitsensibilitàà o di resistenza.o di resistenza.


Definizione di MIC e MCB

Per valutare se un antibiotico è batteriostatico o battericida si determinano le M.I.C e le M.B.C.

o- M.I.C. o minima concentrazione inibente è la minima concentrazione di antibiotico in grado di

impedire lo sviluppo dei microrganismi

5555

o- M.B.C. o minima concentrazione battericida è la minima concentrazione di antibiotico in grado di portare a morte le

cellule batteriche.scaricato da www.sunhope.it

5656


5757


Si prelevano con una ansa sterile tre o Si prelevano con una ansa sterile tre o quattro colonie isolatequattro colonie isolate

5858


Quindi si stemperano in un brodo sterile (inoculo)Quindi si stemperano in un brodo sterile (inoculo)

5959


6060

Viene misurata con un turbidimetro la torbiditViene misurata con un turbidimetro la torbiditàà delldell’’inoculo che secondo i metodi inoculo che secondo i metodi standard non deve superare 0.5 Mac Farlandstandard non deve superare 0.5 Mac Farland((101088 CFU/mlCFU/ml ), l), l’’inoculo utilizzato inoculo utilizzato dovrebbe condurre a crescita semidovrebbe condurre a crescita semi--confluente delle colonie dopo una incubazione confluente delle colonie dopo una incubazione notturna. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluentenotturna. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluente o separate) può o separate) può essere rapidamente riconosciuto e le prove con inoculo non idoneessere rapidamente riconosciuto e le prove con inoculo non idoneo dovrebbero o dovrebbero essere ripetute. essere ripetute.


Metodo per Metodo per diluizione in diluizione in

terreno liquidoterreno liquido

6161


Metodo per diluizioneMetodo per diluizione(determinazione della MIC)(determinazione della MIC)

16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12

6262


Metodo per diluizioneMetodo per diluizione(determinazione della MIC)(determinazione della MIC)

16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12

MIC 6363


6464


6565

Determinazione della MIC (micrometodo)Determinazione della MIC (micrometodo)


6666




6767


Metodica di Antibiogramma su micropiastra per la determinazione Metodica di Antibiogramma su micropiastra per la determinazione della MICdella MIC

6868


Metodo per diffusione Metodo per diffusione in terreno solidoin terreno solido

6969


l'antibiogramma per diffusionel'antibiogramma per diffusioneDensitDensitàà dell'inoculo : 0,5 McFarland = 10dell'inoculo : 0,5 McFarland = 1088 CFU/ml CFU/ml Terreno di coltura:Terreno di coltura:

—— composizione (Mullercomposizione (Muller--Hinton agar)Hinton agar)—— spessore: 4 mm spessore: 4 mm

(25 ml per piastre da 9 cm, 60 ml per piastre da 15 cm)(25 ml per piastre da 9 cm, 60 ml per piastre da 15 cm)

—— pH: 7,2 pH: 7,2 -- 7,47,4-- Uso di dischetti in carta bibula Uso di dischetti in carta bibula (diametro 6,35 mm)(diametro 6,35 mm) imbevuti imbevuti

da Concentrazione standard degli antibiotici da da Concentrazione standard degli antibiotici da saggiare saggiare

Temperatura d'incubazione 35Temperatura d'incubazione 35°°-- 3737°°CCTempo d'incubazione 15Tempo d'incubazione 15--18h18h

7070


Esecuzione dellEsecuzione dell’’antibiogramma col metodo antibiogramma col metodo per diffusioneper diffusione

7171



7272



7373


Antibiogramma per diffusione secondo KirbyAntibiogramma per diffusione secondo Kirby--Bauer : aloni di inibizioneBauer : aloni di inibizione

7474


Misura degli aloni di inibizioneMisura degli aloni di inibizione

7575


Misura degli aloni di inibizioneMisura degli aloni di inibizione

7676


Antibiogramma Antibiogramma per diffusione su per diffusione su Escherichia coliEscherichia coli

7777


Antibiogramma Antibiogramma per diffusione per diffusione

su su Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosaaeruginosa

7878


Antibiogramma Antibiogramma per diffusione per diffusione

su su Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosaaeruginosa

7979


VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI TRADIZIONALITRADIZIONALI

Metodo per diluizione in terreno liquidoMetodo per diluizione in terreno liquidoPro:Pro: risultati quantitativi (MIC)risultati quantitativi (MIC)Contro:Contro: lentezza e complessitlentezza e complessitàà di esecuzione di esecuzione (se non automatizzato)(se non automatizzato)

••Metodo per diffusione in terreno solidoMetodo per diffusione in terreno solidoPro:Pro: rapiditrapiditàà e facilite facilitàà di esecuzionedi esecuzioneContro:Contro: risultati qualitativi (sensibile risultati qualitativi (sensibile -- intermedio intermedio --resistente)resistente)

8080

EtestEtestPro: rapiditPro: rapiditàà e facilite facilitàà di esecuzionedi esecuzionePro: risultati quantitativi (MIC)Pro: risultati quantitativi (MIC)


Caratteristiche di EtestCaratteristiche di Etest

8181

La tecnica di semina La tecnica di semina èè analoga a quella analoga a quella delldell’’antibiogramma per diffusione secondo Kirbyantibiogramma per diffusione secondo Kirby--Bauer.Bauer.La lettura della MIC si effettua dove la crescita La lettura della MIC si effettua dove la crescita batterica interseca la striscia.batterica interseca la striscia.

Etest Etest èè costituito da strisce di plastica costituito da strisce di plastica di 5 x 50 mm contenenti un gradiente di 5 x 50 mm contenenti un gradiente corrispondente a 15 concentrazioni a corrispondente a 15 concentrazioni a raddoppio di antibiotico (in mg/ml).raddoppio di antibiotico (in mg/ml).

Queste sono variabili secondo i diversi Queste sono variabili secondo i diversi antibiotici:antibiotici:0.00025 0.00025 -- 440.002 0.002 -- 32320.016 0.016 -- 2562560.032 0.032 -- 5125120.064 0.064 -- 1024.1024.


8282


Applicazione della strisciaApplicazione della striscia

8383


Applicazione della strisciaApplicazione della striscia

8484


5 o 6 5 o 6 strisce strisce sulle sulle piastre piastre da 15 da 15 cm...cm...

8585

...2 strisce sulle ...2 strisce sulle piastre da 9 cmpiastre da 9 cm


E test : metodica per diffusione , lettura in MICE test : metodica per diffusione , lettura in MIC

8686


8787

Gli antibiotici battericidi formano un’ellissi

molto netta


8888

Gli antibiotici Gli antibiotici batteriostatibatteriostatici possono ci possono formare formare unun’’ellissi ellissi sfumatasfumata


8989

Sottopopolazione Sottopopolazione resistente di resistente di pneumococcopneumococco


9090

Sottopopolazione Sottopopolazione resistente ad resistente ad

elevata frequenza elevata frequenza di mutazionedi mutazione


E testE test

9191


METODI AUTOMATIZZATIMETODI AUTOMATIZZATINuovo tipo di apparecchiatura chiusa, e computerizzata che ci daNuovo tipo di apparecchiatura chiusa, e computerizzata che ci da la possibilitla possibilitàà di di identificare con certezza un agente patogeno e di eseguire lidentificare con certezza un agente patogeno e di eseguire l’’antibiogramma o MIC antibiogramma o MIC

in automaticoin automatico

9292


ANTIMICOGRAMMA

9393


Nei primi anni 90 i derivati azolici erano considerati Nei primi anni 90 i derivati azolici erano considerati la soluzione alle infezioni fungine.la soluzione alle infezioni fungine.Attualmente, specie prima infrequenti di Attualmente, specie prima infrequenti di Candida Candida (Candida krusei)(Candida krusei) risultano intrinsecamente risultano intrinsecamente resistenti al fluconazolo, mentre le altre specie resistenti al fluconazolo, mentre le altre specie possono acquisire resistenza secondaria.possono acquisire resistenza secondaria.I ceppi di I ceppi di CandidaCandida con resistenza secondaria al con resistenza secondaria al fluconazolo sono probabilmente resistenti anche fluconazolo sono probabilmente resistenti anche allall’’ itraconazoloitraconazoloVerso la flucitosina cVerso la flucitosina c’è’è un rapido sviluppo di un rapido sviluppo di resistenza da parte dei ceppi di resistenza da parte dei ceppi di CandidaCandidaAmfotericina B Amfotericina B èè il farmaco a piil farmaco a piùù ampio spettro di ampio spettro di azione. Risultano resistenti azione. Risultano resistenti Zygomiceti, Zygomiceti, Trichosporon, Fusarium e Candida lusitaniaeTrichosporon, Fusarium e Candida lusitaniae

9494


METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO SECONDO METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO SECONDO NCCLS NCCLS (M27(M27--A)A) PER LA VALUTAZIONE DELLA PER LA VALUTAZIONE DELLA

SENSIBILITASENSIBILITA’’ DEI LIEVITI VERSO GLI DEI LIEVITI VERSO GLI ANTIMICOTICIANTIMICOTICI

9595

Inoculo standardizzato Inoculo standardizzato ⇒⇒ 0.5 Mc Farland0.5 Mc FarlandTerreno Terreno ⇒⇒ RPMI 1640, a pH 7RPMI 1640, a pH 7Metodica in piastra Metodica in piastra ⇒⇒ MicrodiluizioneMicrodiluizioneTemperaturaTemperatura ⇒⇒ 3535°°CCDurata dellDurata dell’’incubazione incubazione ⇒⇒ 48h 48h ((Candida spp) Candida spp)

72h (72h (C.neoformans)C.neoformans)Gli antimicotici saggiati sono : Amfotericina B, Gli antimicotici saggiati sono : Amfotericina B, Fluorocitosina, Ketoconazolo, Fluconazolo e Fluorocitosina, Ketoconazolo, Fluconazolo e ItraconazoloItraconazoloA diluizioni seriate di antimicotico viene aggiunto lA diluizioni seriate di antimicotico viene aggiunto l’’inoculo inoculo del lievito, la lettura del lievito, la lettura èè spettrofotometrica.spettrofotometrica.


ATB FUNGUS (bioMATB FUNGUS (bioMéérieux)rieux)

La lettura della galleria può essere manuale o La lettura della galleria può essere manuale o automatica (automatica (lettore ATB bioMlettore ATB bioMéérieuxrieux))

9696


SENSITRE YeastOneSENSITRE YeastOneControlloControllo

Amfotericina BAmfotericina BFluconazoloFluconazoloItraconazoloItraconazoloKetonazoloKetonazolo

55--FlucitosinaFlucitosina

9797


METODICHE ALTERNATIVE ALLA MIC IN METODICHE ALTERNATIVE ALLA MIC IN BRODO BRODO

E TESTE TEST (AB Biodisk, Solna, Sweden)(AB Biodisk, Solna, Sweden)

Determinazione di MIC in piastraDeterminazione di MIC in piastraCorrelata con i test di riferimentoCorrelata con i test di riferimentoUna crescita non uniforme del micete, e la Una crescita non uniforme del micete, e la frequente presenza di ricrescita frequente presenza di ricrescita allall’’interno dellinterno dell’’alone di inibizione, possono alone di inibizione, possono provocare difficoltprovocare difficoltàà nella lettura del punto nella lettura del punto di inibizione della crescita.di inibizione della crescita.LL’’uso delluso dell’’E test presuppone molta E test presuppone molta esperienzaesperienza

9898


E test E test (AB Biodisk.Sweden)(AB Biodisk.Sweden) Metodo di MIC in piastraMetodo di MIC in piastra

9999


100100


METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO PROTOCOLLO METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO PROTOCOLLO NCCLS M38NCCLS M38--PP,, PER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITAPER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA’’

DELLEDELLE MUFFE MUFFE NEI CONFRONTI DEGLI ANTIMICOTICINEI CONFRONTI DEGLI ANTIMICOTICI

InoculoInoculo ⇒⇒ 0.4x10 0.4x10 -- 5x10 cfu/ml 5x10 cfu/ml (Conidium (Conidium ––and sporeand spore--forming fungi)forming fungi)

Inoculo standardizzatoInoculo standardizzato ⇒⇒ Metodo Metodo spettrofotometrico spettrofotometrico (varia col genere di fungo)(varia col genere di fungo)

Terreno Terreno ⇒⇒ RPMI 1640 a pH7RPMI 1640 a pH7MetodoMetodo ⇒⇒ MicrodiluizioneMicrodiluizioneTemperatura Temperatura ⇒⇒ 3535°°CCDurata dellDurata dell’’incubazione incubazione ⇒⇒ Variabile Variabile (dipende dalla (dipende dalla

Muffa in esame) Muffa in esame)

101101


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grazie per l’attenzione

103103


lezione : antibiotici e antibiogramma docente :...

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