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TOTIPOTENZA
Caratteristica fondamentale delle cellule vegetali
È possibile rigenerare un’intera pianta da singole cellule
differenziate
Tranne quelle che hanno perso il nucleo (tracheidi, elementi del cribro)
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Le cellule vegetali possono essere coltivate in vitro,cioè un ambiente asettico in cui le condizioni chimico-fisiche sono sotto controllo
� LUCE (composizione spettrale, fotoperiodo)
� TEMPERATURA
� COMPOSIZIONE CHIMICA DEL MEZZO (nutrienti minerali, carboidrati, vitamine, regolatori di crescita)
� DENSITA’ DELLA POPOLAZIONE CELLULARE(numero di cellule per unità di volume)
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Cellule in coltura private della parete PROTOPLASTI possono propagarsi indefinitamente
protoplasti di cellule del protoplasti di cellule del mesofillo mantenute in coltura in presenza di mannitolo per evitare la lisi
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Le colture cellulari possono essere impiegate:
• nella RICERCA DI BASE (studio della biologia cellulare)
• per SCOPI APPLICATIVI (produzione di metaboliti secondari)
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In natura le condizioni ambientali variano nello spazio e nel tempo in modo non controllabile
RICERCA DI BASE
In vitro è possibile variare uno specifico fattore ambientale (mantenendo invariati gli altri) per studiare la sua influenza su particolari aspetti della biologia cellulare
studio del ruolo di un componente del terreno di coltura su una specifica via biosintetica
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le colture cellulari possono essere utilizzate per lo studio di specifiche vie biosintetiche
RICERCA DI BASE
precursore 1
precursore 2
prodotto
il prodotto deriva dal precursore 1 o
dal 2?
precursore 1 marcato
prodotto non
marcato
ESPERIMENTO 1
precursore 2 marcato
prodotto marcato
ESPERIMENTO 2
IL PRODOTTO DERIVA DAL PRECURSORE 2
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INTERESSE APPLICATIVO
le cellule in coltura possono essere utilizzate per produrre sostanze utili sostanze utili per l’industria farmaceutica, agroalimentare, cosmetica, ecc.
l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta generalmente la distruzione della pianta stessa
problema se:
� RARA (difficile da reperire, protetta)
� DI DIFFICILE COLTIVAZIONE� A CRESCITA LENTA (piante legnose)
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Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono:
cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate (ghiandole, latticiferi, ecc.)
tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento)
organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo (radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)
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In coltura possono essere mantenute anche strutture organizzate
meristemigermogli germogli radici
embrioninodi
antere
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germoglio
radici
antere
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Terreni di coltura per cellule e tessuti vegetali
• sali minerali
• fonte di carbonio
• vitamine
• regolatori di crescita• regolatori di crescita
• altri composti organici
Optimum di pH 5.0 – 6.0
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MACROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione > 0.5 mM
Macroelementi essenziali: N, K, P, Ca, S, Mg, Cl
COMPOSIZIONE - SALI MINERALI
MICROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione< 0.5 mM
Microelementi essenziali: Fe, Mn, B, Cu, Zn, I, Mo, Co
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composizione in sali minerali di alcuni terreni
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Funzione dei sali minerali nella crescita in vitro
Elemento Funzione
N
K
Ca
Mg
P
Componente di proteine, acidi nucleici, alcuni coenzimi –richiesto in elevate quantità
Regola il potenziale osmotico – principale catione inorganico
Parete cellulare, funzione della membrana, signalling
Cofattore enzimatico, componente clorofilla
Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonioP
S
Cl
Fe
Mn
Co
Cu
Zn
Mo
Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonio
Componente di alcuni amminoacidi e di alcuni cofattori
Richiesto nella fotosintesi, movimenti stomatici
Componente dei citocromi (trasferimento energia)
Cofattore enzimatico
Componente di alcune vitamine
Reazioni di trasferimento elettronico, cofattore enzimatico
Biosintesi clorofilla, cofattore enzimatico
Componente della nitrato-reduttasi (metabolismo dell’azoto)
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SORGENTE DI CARBONIO E VITAMINE
� Saccarosio o glucosio, concentrazione 2-5%
� indispensabile vitamina B1 (tiamina)
� crescita aumentata da acido nicotinico e vitamina B6 (piridossina)vitamina B6 (piridossina)
� alcuni terreni contengono: acido pantotenico, biotina, acido folico, acido p-amminobenzoico, colina, riboflavina e acido ascorbico
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Dai tessuti in coltura è possibile rigenerare l’intera pianta
germogli caulogenesigermogli caulogenesi
radici rizogenesi
embrioni embriogenesi somatica
embrioidi o embrioni somatici
avventizi
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caulogenesi
rizogenesi
embriogenesi somatica
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MORFOGENESI DIRETTAda cellule differenziate di tessuto senza proliferazione di tessuto indifferenziato
MORFOGENESI INDIRETTA da cellule de-differenziate di callo (proliferazione di tessuto indifferenziato)
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TessutoTessuto vegetalevegetalecheche sisi forma forma intornointorno ad ad unauna
feritaferitaintornointorno ad ad unauna
feritaferita
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massa di tessuto amorfo formato da cellule che si moltiplicano in maniera disorganizzata
si può ottenere da espianti di tessuto
sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni o presenti nel mezzo, le cellule di un espianto di tessuto vanno incontro a de-differenziamento e formano un nuovo tessuto di cellule non specializzate
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embriogenesi somatica diretta
sviluppo di embrioni somatici su espianto di
tessuto
embriogenesi somatica indiretta
sviluppo di embrioni somatici su callo
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sviluppo di germogli su callo
morfogenesi indiretta
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callo nodulare(embriogenico)
callo friabile
(non-morfogenico)
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la capacità di formare un callo è diversa da specie a specie e da tessuto a tessuto (particolarmente nelle monocotiledoni)
canna da zucchero
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la morfogenesi è stata osservata in numerosespecie, ma non può essere indotta universalmente,anche all’interno di una stessa specie alcunevarietà sono recalcitranti
cellule che hanno la capacità di dar luogo a morfogenesi sono dette COMPETENTI
la competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo:una cellula competente per lo sviluppo dell’embrione somatico non lo è anche per lo sviluppo del germoglio
Le cellule possono essere indotte a diventare competenti aggiungendo nel mezzo di coltura opportuni regolatori di crescita
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pianta
Espianti fogliari
• Prelievo degli espianti
• Sterilizzazione
• Inoculo in mezzo callogenico
Espianti caulinari
Dal callo è possibile Dal callo è possibile ottenere cellule in ottenere cellule in sospensionesospensione
callo
callogenesi callogenesi
Inoculo in mezzo liquido
SOSPENSIONE CELLULARE
BIOREATTORE
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COME SI RIGENERA UNA PIANTA?
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ruolo fondamentale nel processo morfogenetico è svolto da ormoni vegetaliormoni vegetali
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Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco
auxina e citochinine intervengono nella regolazione della divisione cellulare
WT transgeniche
ritardo nello sviluppo del germogliodovuto alla riduzione della velocità diproliferazione cellulare nel meristemaapicale
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Sovraespressione del gene che codifica per la citochinina ossidasi (ridotti livelli di citochinine) in tabacco
aumento della velocità di crescita della radice aumento della proliferazione nel meristema radicale
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la carenza di auxina provoca l’arresto in fase G1la carenza di citochinine provoca l’arresto in fase G2
auxina e citochinine partecipano alla regolazione del ciclo cellulare controllando l’attività delle CHINASI CICLINA-DIPENDENTI
Cdc2inattiva
Cdc2attiva
Cdc25
auxina
citochinine Cdc25 tirosin-fosfatasi
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Recentemente è stato dimostrato che le citochinine incrementano l’espressione del gene CYCD3 (negli animali le cicline di tipo D regolano il passaggio in fase G1)
In Arabidopsis CYCD3 è espresso in tessuti proliferativi come i meristemi dei germogli
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Skoog e Miller(1957): alti livellidi citochinine ebassi libelli diauxina inducevanola formazione digermogli in callidi tabacco incoltura
concentrazione di IAA (mg/L)
0 0,005 0,03 0,18 1,08 3,0
0
0,2
coltura
concentrazione di chinetina (mg/L) 1,0
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auxina auxina + citochinina
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+ citochinine
Callo
Sviluppo del germoglio dal callo
questo processo è abbastanza semplice per le dicotiledoni sviluppo del germoglio
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AUXINA CITOCHININA
alta bassa
formazione di radici su espianti
induzione callo nelle monocotiledoni
I stadio embriogenesi
formazione radici avventizie su callo
altabassa
su callo
induzione callo nelle dicotiledoni
formazione germogli avventizi
proliferazione di gemme ascellari in colture di germogli
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IBA (acido 3-indolbutirrico)
IAAAUXINE
NAA (acido 1-naftalenacetico)
2,4 D (acido 2,4-diclorofenossiacetico)
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CITOCHININE
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Come si propagano le piante
Riproduzione Riproduzione Riproduzione sessuale
Riproduzione asessuale
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PROPAGAZIONE VEGETATIVA
riproduzione asessuale
cactusopuntia bigelovii
kalanchoela progenie è costituitada “cloni” geneticamenteidentici alla piantamadre
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stoloni
fragola
patate
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Specie propagate vegetativamente
bananaalberi da frutto (mele, pere, agrumi)maniocapatatamaniocapatatafragolecacaocanna da zucchero
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INNESTO
portainnesto
il portainnesto determina l’altezza dell’albero da frutto
selezionati per la resistenza a malattie
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propagazione mediante TALEA
auxina per indurre la formazione delle radici
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PROPAGAZIONE IN VITRO (MICROPROPAGAZIONE)
Permette di ottenere un elevato numero diPermette di ottenere un elevato numero dipiantine identiche sia genotipicamente chefenotipicamente alla pianta madre
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Materiale di partenza per la
micropropagazionefoglia
gemma apicale
gemma
internodo
gemma ascellare
radici
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moltiplicazione di germogli da gemme ascellari
formazione di germogli avventizi
formazione di embrioni somatici avventizi
micropropagazione
formazione di embrioni somatici avventizi
direttamente su espianti della pianta madre
indirettamenteda colture in sospensione o calli
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la crescita e la proliferazione di gemme ascellari è indotta in seguito alla diminuzione di
dominanza apicale
rimozione dell’apice
aggiunta di citochinina nel terreno di coltura
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impatiens
ciclamino
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orchidea
pino
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VANTAGGI della micropropagazione
spazi ristretti
condizioni asettiche: assenza di batteri, funghi e altri microorganismimetodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee)
specie che non si possono propagare altrimenti
metodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee)
produzione indipendentemente dalla stagione vegetativa
maggiore possibilità di variare i fattori che influenzano la crescita
acquisizione di nuove caratteristiche (es. stoloni fragole)
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le piantine hanno bisogno di un periodo di adattamento per diventare autotrofe
cresciute in alta umidità sono più suscettibili alla perdita di acqua
SVANTAGGI della micropropagazione
suscettibili alla perdita di acqua
variazione somaclonale
epigenetica
ereditabile
transiente non si eredita
perdita della richiesta di ormoni e vitamine
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Aberrazioni cromosomali
- alterazioni nel numero e nella struttura dei cromosomi
VARIAZIONE SOMACLONALE
- riarrangiamenti cromosomici
- differenze nel numero di copie di sequenze di DNA (amplificazione o diminuzione di sequenze ripetute)
- metilazione del DNA
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camera climatica
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Spesso la limitazione maggiore alla trasformazione delle piante non è la piante non è la metodica di trasferimento del DNA, quanto la rigenerazione della pianta
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Quando si effettua una trasformazione, sia conAgrobacterium che con il sistema biolistico, vista labassa efficienza della rigenerazione, sarà necessarioutilizzare un numero elevato di espianti per esserecerti di ottenere piantine trasformate
I cloni trasformati ottenuti vengono poi MICROPROPAGATI
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E’ possibile evitare la coltura dei tessuti e la rigenerazione della pianta?
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Trasformazione “in planta”
non richiede coltura di tessuti e rigenerazione della pianta
Esclusivamente per Arabidopsis thaliana
- trasformazione di semi
- inoculazione DNA in pianta Agrobacterium- inoculazione DNA in pianta
- infiltrazione nel fiore(floral dip)
Agrobacterium
co-coltivazione dei semi con Agrobacterium
rimozione del germoglio apicale e infiltrazione con Agrobacterium del tessuto meristematico ferito5% dei nuovi germogli sono trasformati
immersione dei fiori nella sospensione batterica o infiltrazione sotto vuoto nel periodo della fecondazione
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Floral dip
immersione delle infiorescenze nella sospensione batterica
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Si produrranno semi transgenici da cui si otterranno le piante trasformate senza dover passare per la fase di rigenerazione e coltura in vitro dei tessuti
Le piante possono essere poi propagate da seme
Floral dip
seme
sistema per recuperare i semi daArabidopsis
i semi si raccolgono nel cono