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Lezione 15 - 16mercoledì 20 aprile 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
PCR “polymerase chain reaction”
Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili, strumenti = termociclatori
Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente)
DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi) - salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente.
Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica e medicina forense (legale)
Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).
La reazione a catena della DNA polimerasi
Come si fa la PCR, in cosa consiste
- amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di DNA da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus- definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi.
La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ?- del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?) - dei primers (inneschi)- dei nucleotidi per la sintesi- del tampone - del Magnesio
Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP PCR
1 denaturazione del DNA a 94°C
2 appaiamento (“annealing”) dei primers al ssDNA templato, temperatura misurata sulla t° di denaturazione dei primers
3 temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerase 72°C che eviti rinaturazione e amplificaz. aspecifiche
alla fine del ciclo prima si doveva riaggiungere la polimerasi
ogni fase del ciclo può durare da 30” ad 1’ o più minuti secondo la lunghezza del frammento da amplificare(oltre 1’ per più di 2 kb fino a 10’ per 10 kb)
le tre temperature
applicazione del sistema naturale
la sintesi del DNA è semiconservativa (duplicazione)
le DNA polimerasi e anche le RNA pol sintetizzano tutte sullo stesso modello di funzionamento:
con il verso 5’- 3’ su uno stampo (templato) antiparallelo 3’-5’partendo dal 3’ libero di un innesco (primer) appaiato sul templato
3’ 5’
5’ 3’primer neosintesi
anche in vitro si può sfruttare il metodo naturale di sintesi
l’invenzione genialedalla amplificazione lineare a quella esponenziale:
la sintesi in vitro di DNA già era stata usata anche per le reazioni di sequenziamento, ma solo per una delle due eliche
3’ 5’
5’ 3’primer neosintesi
se aggiungiamo un primer sulla catena complementare:
3’5’
5’3’neosintesi
otteniamo una amplificazione di tutte e due le eliche, e poi ? se la reazione coninua è esponenziale !
attenzione al verso dei primersla doppia elica di DNA ha i due filamenti antiparalleli dovuti al sistema che è stato selezionato in origine con le polimerasi degli acidi nucleici che sintetizzano tutte nello stesso verso 5’ 3’ da un 3’ libero e su un templato 5’ 3’
5’
5’ 3’
3’
5’3’
5’3’sintesi
3’
sintesi5’ 3’
5’
dopo la sintesi si otterrano 2 doppie eliche identiche alla prima
denaturazione
se la reazione in vitro continua
5’ 3’denaturazione
5’3’sintesi
3’
sintesi5’ 3’
5’
5’ 3’
5’3’
5’ 3’5’3’
5’ 3’5’3’
1 doppia elica
2 doppie eliche
diventa una reazione esponenziale
2 x 2 = 4 4 x 2 = 81 x 2 = 2
ma come è possibile fare avvenire la reazione senza farla fermare ? da sola una doppia elica non si duplica se non si ha la separazione (denaturazione) delle due eliche neosintetizzate !
la tabellina del 2
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’ 5’
5’
5’
Denaturazione
Extension (Polimerizzazione)
Annealing a ~ 50°- 60° C
Denaturazione
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
Primer frw.
Primer rev.
I CICLO
2 eliche
4 eliche
5’3’
3’5’
pr. rev.
pr. frw.
= seq ++_= seq -
Il ciclo (non il
velocipede)
Annealing Extension (Polimerizzazione)
La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio di DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione, molte variabili da ottimizzare
- senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA (famtogrammi o singole cellule)
- genoma diploide 2 doppie eliche di templato in interfase
II CICLO 4 eliche
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
5’
5’5’
5’
3’
3’3’
3’
5’
5’5’
5’
3’
3’3’
3’
5’
Denaturazione
III CICLO
8 eliche
16 eliche
5’3’
5’3’
3’5’
3’5’
32 eliche…..IV ciclo
Ciclo continuo
vanno determinate per i tempi, temperature e quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi)I passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione)
II passaggio appaiamento dei primers (annealing)
III passaggio di sintesi del DNA, estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi)
Fine del ciclo
Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di 5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati
Le condizioni di reazione di ogni passaggio
l’enzima sarà una Taq polimerasi (ne esistono diverse ottenute da mutanti che aumentano la specificità, efficienza e lunghezza del frammento amplificato
il DNA templato sufficientemente purificato se genomico ad alto peso molecolare
i primers di sintesi prodotti da ditte specializzate (15-25 bp)
la concentrazione del Mg di solito 1,5 mM
il Buffer ottimale per la polimerasi
H2O per portare al volume finale di reazione ~ 50 microlitri
i reagenti della reazione enzimatica
Volume di reazione: da 10 a 50 l (max 100 l) per una preparativa.Il DNA (templato), abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’ puo’ essere molto poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma eucariotico, più di 500 ng possono inibire della reazione
La Taq polimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti, 26 x10- 6, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity 8.5 x10- 6, e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U, ma se si fanno molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla
dNTPs: conc. standard 100 M per ognuno
Il tampone: sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM, ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali
I primers: scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi, sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili,
H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale
Le componenti per la reazione:
la PCR si utilizza per amplificare i frammenti random da sequenziare a cui sono stati attaccati dei primers tramite ligasi e che fanno da inneschi, prima per la PCR e poi per la reazione di pirosequenziamento delle palline collocate nelle celle in cui entra una pallina solamente.La reazione è colorimetrica tramite un metodo che vedremo più avanti
nel caso del pyrosequencing
applicazioni della PCR
RT-PCR, nested PCR
PCR inversa
RACE 3’ e RACE 5’
variazioni sul tema PCR multiplex
Real Time PCR abbreviata = RT-PCR da non confondere
AFLPs (uso di adapters anche col random sequencing e PCR)
Mutagenesi
Pcr quantitativa e semiquantitativa competitiva
3C = chromosome conformational capture e varianti
Ricerca di un vettore
Per inserzione random nel genoma
Per inserzione sito specifica nel genoma
Cosa cambia?
Cambia la regione limitrofa
Gene targeting deve avere regioni limitrofe note a)
Random recombination ha regioni limitrofe ignote b)
Due tipi di PCR per poter fare l’analisi delle regioni limitrofe
a) PCR classica con primers interni ed esterni alla regione che ricombina col vettore
b) PCR inversa per identificare le regioni limitrofe
Altre possibilità di analisi tramite PCR - perfezionamenti delle tecniche e degli enzimi
- nuove macchine con determinazione in tempo reale (real-time PCR) tramite laser (light-cycler) del DNA o cDNA amplificato proporzionale al templato iniziale presente nel campione in analisi.
Questa è la PCR quantitativa, diversa dalla PCR semiquantitativa o competitiva.
La PCR quantitativa da un valore assoluto rispetto ad un amplicone di riferimento a quantità nota con la così detta curva di taratura da cui si ricava un c/t value (threshold cycle)
Altre possibili applicazioni della PCR
- abbiamo visto RT-PCRtramite reverse transcriptase da mRNA
RT-PCR è il metodo per determinare l’espressione o meglio la trascrizione di un gene
- alternativa all’analisi Northern ma non determina la lunghezza del mRNA, solo la presenza e volendo la quantità trascritta
applicazione RT-PCR
nuovo esercizio: se devo retrotrascrivere un mRNA per ottenere un un cDNA
devo fare prima una retrotrascrizione con random priming con esanucleotidi
e poi la PCR per vedere se il gene è espresso (trascritto)esperimento sostitutivo di un Northern, ma non dice la lunghezza del messaggero
i primers come li scelgo ? : sulla sequenza coding che è quella depositata in banca dati e che non è il cDNA che sarebbe il DNA complementare all’mRNA dopo retrotrascriz.
quindi si selezionano i primers come per una normale PCR purchè si abbia la sequenza corrispondente a quella coding = al mRNA = sequenza codificante (quella in banca dati)
La reverse trascrittasi RT
L’uso della reverse trascrittasi risale a quando furono scoperti i meccanismi molecolari con cui i virus ad RNA si replicavano all’interno delle cellule infettate.
Le più utilizzate sono quelli della Murine Moloney leukemia virus MMLV, Avian myeloblastosis virus AMV che poi sono state anche trasformate per resistere meglio ad alta temperatura per fare la “one step RT-PCR”
Oltre alle RT anche le Taq polimerasi sono state migliorate per efficienza ed affidabilità (riduzione di errori di sintesi).
RT-PCR: cosa si analizza = analisi della trascrizione di un gene o isolamento di un cDNA senza Northern blot o screening di una cDNA library (si deve avere una sequenza nota).
La RT-PCR: da RNA totale di cellule per verificare che sia trascritto quel particolare gene. Basta una quantità di RNA molto piccola a differenza di un northern dove per ogni corsa ci occorrono 2-3 g di poly A mRNA o 7-10 g di RNA totale. Nel caso di una cDNA library la quantita’iniziale di RNA e di lavoro e’assai maggiore.
RT-PCR classica:- Primo filamento o con primer di oligo dT o random priming con esanucleotidi. - L’enzima funziona a 37°C; mutanti resistono fino a 60°C.- Si retrotrascrive tutto l’mRNA o tutto l’RNA, nel caso in cui i trascritti siano molto lunghi e l’enzima potrebbe non completare la retrotrascrizione a partire dal polyA. - Dall’RNA va eliminato il DNA genomico.- Dopo la sintesi del primo filamento di DNA si puo’ far partire una normale PCR, ma si fa un trattamento di RNase per eliminare l’RNA, gli esanucleotidi e l’oligo dT; ci sono protocolli in cui si fa un’unica reazione perche’ la temperatura della PCR e’ selettiva e la Taq hot-start non si attiva prima di essere portata oltre 70°C.
stratagemmi della RT-PCRAccorgimento: quando si estrae l’RNA si deve evitare il DNA e si puo’ fare un trattamento di DNAse, e/o scegliere i primers a cavallo di due esoni
I filamento con rev transcript. a bassa temp.
II filamento con Taq polymerase, I coppia di primers (sulla sequenza del mRNA). Non si vede tutto il trascritto, come in un Northern, non se ne puo’ valutare il peso, ma solo se quel frammento e’ trascritto (cioe’ se c’e’ quel mRNA), non si vede lo “splicing” alternativo salvo scelta dei primers su esoni diversi
Valgono tutte le cose che si sanno per la PCR compreso rischio di amplificazioni aspecifiche, la reazione va messa a punto ogni volta.A differenza del Northern la buona amplificazione del frammento (amplicone) puo’ dipendere non solo dal fatto che c’e’ molto mRNA, ma anche dall’efficienza della PCR, quindi così non e’ quantitativa.
la retrotrascrizione
Per RT si intende reverse transcriptase su templato di RNA
Per avere un cDNA (DNA complementare ad un RNA messaggero) si deve retrotrascrivere l’mRNA cioe’ farlo diventare DNA
I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA complementare al loro cromosoma ad RNA tramite una DNA polimerasi specifica che usa come templato RNA anziche’ DNA.
Pero’ sempre con la sintesi in direzione 5’-3’come ogni polimerasi.
L’enzima “reverse transcriptase” o trascrittasi inversa che si utilizza non e’ termoresistente, ma deriva da un retrovirus eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche altri. Piu’ recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a temperatura piu’ alta di 37°C fino a 60°C per aumentare specificità.
Le tecniche precedenti per lo studio della trascrizione erano l’analisi Northern e l’isolamento dei cDNA da libraries clonate in vettori vari.
vantaggi della RT-PCR
Analisi della trascrizione tramite PCR
Analisi della trascrizione e non determinazione del PM dei trascritti (Northern)
Analisi dei livelli di trascrizione più fine per la sensibilità del metodo, se si vedessero tramite Northern le stesse quantità il Northern sarebbe più informativo (anche PM)
Ampliconi possibilmente a cavallo di introni, perché ?
Analisi a partire da piccole quantità di RNA totale,
svantaggio: non si sa la lunghezza del cDNA o mRNA
come si fa una RT-PCR
Si deve ottenere il retrotrascritto cioè il cDNA ( DNA complementare all’ mRNA)Si parte da estratti di RNA totali o arricchiti per poly +(A) su resina con oligo dTLa retrotrascrizione può avvenire con primers di esanucleotidi random o con poly T, a seconda della lunghezza dei trascritti e se si vogliono tutte le regioni trascritte o sempre a partire dal 3’ poliadenilato.RNA è molto instabile e vanno usati degli inibitori delle Rnasi per evitare che si degradino. Il cDNA è molto più stabile e si conserva meglio e più a lungo.
Il cDNA si utilizza per la PCR però c’è un solo filamento complementare al trascritto con senso 5’-3’ inverso.
RT-PCR dal II filamento in poi
Accorgimenti e controlli della RT-PCRPrima di retrotrascrivere il cDNA si tratta l’RNA con DNAse per eliminare ogni traccia di DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi.Ottenuto il cDNA dalla reverse trascrittasi si passa alla PCR vera e propria con i primers specifici della regione del messaggero che vogliamo amplificare.Come accorgimento si può (si deve quando è possibile) amplificare un amplicone che comprende due porzioni di due esoni diversi e così non si amplifica il frammento di DNA genomico che è molto più lungo in quanto contiene l’introne.Naturalmente la lunghezza dell’amplicone è sempre ragionevole e non c’è nessun bisogno di amplificare esoni interi, ma sequenze dalle 150 alle 500 pb.
genomic & coding sequence, mRNA, cDNA
coding sequence, solo esoni (gene bank)5’ 3’
mRNA = coding sequence5’ 3’
cDNA primo filamento5’3’
RT
5’3’5’ 3’
PCR su cDNA a due filamenti
genomic sequence con esoni ed introni 5’ 3’
Correzione parametri di una PCR
La PCR deve dare dei prodotti che corrispondono agli attesi
Quando i prodotti non sono gli attesi:
Smear - poca specificità nonostante i primers specifici
- si gioca sulla temperature di “annealing”, temp. su
- cicli troppo lunghi rendono aspecifica l’amplificazione
Bassa amplific. - stringenza “annealing” alta, temp. giù
- ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension
Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,
sequenza di un cDNA dalla banca dati
per aumentare specificità?
facciamo una doppia PCR : la seconda interna alla prima = nested PCR
se abbiamo provato ad ottimizzare in ogni modo la nostra PCR e vediamo che si amplificano altri frammenti si prova a fare una seconda PCR sul primo prodotto con nuovi primers
amplificazioni aspecifiche, peso molecolare diverso dall’amplicone prescelto
la sequenza 5’- 3’ di un cDNAGGATCCCTGT TCCTGATCAC TGATCTCTGG TTCTTTTATT ATGCATATTC 50ATTTTGAAAT CTGATTCCTT TTCTGAGCAT GTATCAGTCT GACTAGACACTGAGTCCTGT CTGATTTCTG AGCCTTGGCC CTCATGAGTA AGTGACCTGCAGTGGTGGAG GGAGCTCCAG GGGAGCCGAG ACCCTCTCAG TGCATGTACTCACTGGTAGA TGAAGAAATG ACCCCAATGA TTGCTCCATT CTTCCAGGCTCAGAGGGGTG TGTAGGCCCC AGGAGGACTT GGTGGGGAGA AGACCAGCCCAGGCCCTGTG AGTACACCCA GCCCCAGCCC CTAAGGGGTC GCCAGGTCTCGACTTAGCAC TGGGGAGGGG GTACAGTACA GGAGTGGGGA CAGGAAGGTGAGGGGAGGCC ATGCCGTTTG TATTCTCTTG CTTTTCTCTC TCTCCTGAAGCCTCTTGAAT AGACCTGCAG AAATACCCAA AATAGCCCTG TGGGGTGGCT 500GAGTCATTGT GAACACAGCC CAGGTCAGGT GTTCCAGCCA GAGAACTGCTGTTCTGAGAA ACATGCCCCA AAACCGAGAC CTGGCCAGGT GTGCCTGGGGCCTGAGCGAG GGGCTGCAGC CACAGGTAGG CCCAGCCCCA ACCAGCCCAGAGTCAGCTAG GGCTTTCCAG GTCCAGGGTT AGGCAGAGGT CAGCCAGGGTCAACCACGGT CTATCTGAGG GGAGAGACAA GAGACACAGA GACATAGAGAGAGAGAGACA GGGATGGGGA GAGACAAGAG AGACAGGAAA GGAGAGACAAAGACAGACAC AGAGAGAGAG ATGGGGATGG AGAGAGATAA GAGACAGGGACAGGGAGGGA CAGAGGCGAG GCCAGTGACA GAGACAGAGT TACAAGAGACAGAAAGAGAG AGAGATGAGA TGAGAGAGAT CAGAAGAAAC GGAGACACAGATGGGAGAAA AAGAGAGGAG ATGGGAACAG GAAAAAGAGA CATGGAGACA 1000
I coppia rossa amplicone + lungoII coppia celeste nested amplicone + corto
calcolate: la T°C e lunghezzaampliconi da bp a bp
scrivete i primers da 5’ a 3’
una nested PCR 1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 61 cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 1frw 121 gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 2frw 181 acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 241 acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 301 aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa 361 aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc 421 acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta 481 atctcatcaa tacaaccccc gcccatccta cccagcacac acacaccgct gctaacccca 541 taccccgaac caaccaaacc ccaaagacac cccccacagt ttatgtagct tacctcctca 601 aagcaataca ctgaaaatgt ttagacgggc tcacatcacc ccataaacaa ataggtttgg 661 tcctagcctt tctattagct cttagtaaga ttacacatgc aagcatcccc gttccagtga 721 gttcaccctc taaatcacca cgatcaaaag ggacaagcat caagcacgca gcaatgcagc 2rev 781 tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc agtgattaac ctttagcaat 841 aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg tcaatttcgt gccagccacc 901 gcggtcacac gattaaccca agtcaataga agccggcgta aagagtgttt tagatcaccc 1rev 961 cctccccaat aaagctaaaa ctcacctgag ttgtaaaaaa ctccagttga cacaaaatag 1021 actacgaaag tggctttaac atatctgaac acacaatagc taagacccaa actgggatta
determinare lunghezza posizione T melting dei primerslunghezza ampliconi = da bp n.x a bp n.y e posizione
i controlli essenziali
Controlli, negativi, positivi,(i controlli ci fanno capire se l’esperimento è venuto bene)
Cosa è il controllo negativo? E quello positivo?A cosa servono?
Rischio contaminazione (il DNA templato potrebbe essere presente nell’ambiente dove si esegue l’esperimento)
Perché si ha contaminazione ?
procedure
la Rev Transcript virale a 37°C, mutanti max 65°C
oligo dT, random priming con esanucleotidi,
dal cDNA in poi PCR
sistemi onnicomprensivi con entrambe le reazioni
PCR con primers esonici
Primers: le stesse condizioni di scelta di PCR diretta
a differenza del Northern si può usare quantità minime di RNA
precauzioni
estrarre RNA eliminando DNA genomico che falsifica il risultato
cosa si vuole vedere con RT-PCR: la trascrizione di un gene
come eliminare il DNA: con estrazioni specifiche con gradiente in ClCs o con solventi specifici (Guanidina)
dopo l’estrazione trattamento con DNAse
scelta di primers su esoni diversi: il DNA contaminante ha peso molecolare maggiore (introni)
può essere quantitativa?
la RT-PCR può essere quantitativa
l’amplificazione è proporzionale alla quantità di templato
l’amplificazione è proporzionale alla quantità iniziale
dopo un certo numero di cicli c’è saturazione
saturazione = impossibilità di rilevazione delle differenze o di crescita lineare del prodotto di amplificazione, si perde la proporzionalità di amplificazione e quindi una risposta di tipo quantitativo, resta solo una indicazione qualitativa.
perchè quantitativa ?
l’amplificazione è proporzionale al templato iniziale,
perchè si conserva la proporzionalità anche dopo molti cicli di amplificazione ?
rispondete perchè già lo sapete!
la rivelazione su gel
dopo elettroforesi su gel di agarosio si rivela il DNA amplificato come intensità di banda
QuickTime™ and aTIFF (LZW) decompressor
are needed to see this picture.
controllo di RT-PCR
altro controllo negativo :
assenza di amplificazione sui campioni di RNA non retrotrascritti
se si amplifica cosa vuol dire?
altro controllo positivo nel caso che il trascritto sia assente o debolissimo:
amplificazione con primers per un gene house-keeping
Controlli della PCRControlli di estrazione: quali?- ripetibilità della amplificazione- ripetibilità su campioni indipendenti- univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato
Controlli di contaminazione: quali?- a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione- assenza di amplificazione su a.- b. assenza di amplificazione
su tutti i prodotti di reazione della PCR: primers
taq polimerase
nucleotiditamponeacqua di
diluizione
R.A.C.E.
Rapid amplification of cDNA ends 5’ or 3’ unknown
-I) retrotrascrizione fatta con primers random o con poly T -quale è la differenza nella scelta di una strategia o dell’altra?-se si cerca il 5’ si userà il random priming (esanucleotidi)-se si cerca il 3’ si usaerà oligo dT
a meno che non si voglia usare un primer specifico anche per la RT
mRNAAAAAA5’ 3’
Con la RT-PCR si amplifica solo un frammento del cDNASe si vuole identificare l’intero cDNA e non si conosce e si vuole evitare lo :screening” di una “library” si può ricorrere alla RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends)
La RACE è una tecnica per l’amplificazione di sequenze nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben definita regione interna ad esso ed una sua estremità (3’ o 5’).Questa tecnica, nota anche come “one-sided”
PCR o “anchored” PCR, puo’ essere considerata una variante della più classica PCR.
La RACE richiede almeno una regione a sequenza nota e interna all’mRNA che si vuole tipizzare.
LIMITE PRINCIPALE
Principi della RACE
Differenze nella ricerca di 5’ o 3’ ignoti
mRNAAAAAA5’ 3’
poly TTTTT 5’3’oligo esa nucleotidi random
cDNA primo filamento prodotto dalla RT (completi e non)
5’
5’TTT
3’
3’
3’ 5’
I cDNA ottenuti possono avere estremità diverse a secondo dell’efficienza della RT, e dei primers usati
Cerchiamo il 3’ sconosciuto
In questo caso si usa un oligo dT per sintetizzare il cDNA-Prima della RT si può effettuare una reazione di DNase per eliminare il DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi perché contamina l’ RNA e successivamente il cDNA
-Dopo la reazione di RT si può fare una reazione di RNase per eliminare RNA
RT = reverse transcriptase / trascrittasi inversa
cDNA5’3’
TTTTT
regione nota regione ignota
Dalle banche EST (expressed sequence tags);
Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER
TRAPPING);
Un aiuto non indifferente è dato:
Dall’IBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente
e/o funzionalmente.
Cosa serve per fare la RACE
mRNA poly A5’ noto 3’ ignoto
sintesi del I filamento di cDNA con RT con primer oligo dT
TTTTTT5’
3’
trattamento con RNase
PCR con primer frw. noto e primer rev. con coda aggiunta
TTTTTT
5’ noto3’
5’
prim rev.
prim.frw
TTTTTT3’
5’3’ ignoto
Race ricerca del 3’ ignoto
Scelta dei primers per la RACE 3’
Il primo primer obbligato è quello per la RT (poly T) Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve essere specifico
cDNA5’3’
TTTTT
regione nota regione ignota
primer specifico
Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare dei prodotti anche aspecifici.Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?
RACE 3’
TTT…..TTT 5’
5’ AAA….AAA nmRNA poly(A) tail
1 - Annealing tra la coda di polyA dell’mRNA e un primer contenente una coda di oligo(dT) all’estremità 3’ e retrotrascizione
5’ AAA….AAA n
TTT…..TTT 5’3’
Alla facile degradabilità dell’RNA;All’alta probabilità di avere un RNA con strutture secondarie;Alla bassa specificità di questa fase;
Nested PCR o PCR interna
cDNA5’3’
TTTTT
regione nota regione ignota
I primer specifico
II primer specifico
Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella regione nota dell’ mRNA (coding sequence)
La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo primer, -si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione, -probabilità alta di avere un frammento specifico - probabilità bassa che due sequenze omologhe siano limitrofe
due volte nel genoma. - in casi estremi si può ricorrere ad un terzo primer interno.
un trucco che inganna la polimerasi
3’ 5’
5’ 3’primer la polimerase estende da un 3’ libero su un templato
la polimerase estende da un 3’ libero purchè appaiato 5’
3’
3’ 5’
poco importa se ha una parte al 5’ non appaiata, verrà inglobata lo stesso nell’amplicone e ne farà parte dalla amplificazione successiva in cui serve da templato
2 - Degradazione del templato di RNA
TTT…..TTT 5’3’
3 - Amplificazione per PCR usando un primer specifico del gene (GSP) ed uno specifico alla nuova estremità 5’(AUAP o UAP)
TTT…..TTT 5’3’
GSP
AUAP
UAP…e la specificità???
gsp = gene specific primerUap = universal amplification primerAuap = abridget univ.ampl. primer
Race fasi successive
GSP 2
TTT…..TTT
5’
3’
AUAP
UAP
3’
5’
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un secondo primer gene specifico (GSP2)
- SEQUENZIAMENTO DIRETTO;- CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO;- STUDI FUNZIONALI;
Specificità GSP2
I primers UAP e AUAP servono per avere delle T melting su cui disegnare i GSP
PCR nested RACE 3’Nel caso di una RACE 3’ cambia solo il verso dei primers interni alla regione nota ed il primer del 3’ ignoto può essere anche un poly T con una coda per avere una T° melting più consona ai primers interni
Solammente il primer della seqnota si può cambiare con un secondo più interno
mRNA5’ 3’AAAA
RT reverse trascrittasi
cDNA3’ TTTT 5’RACE 3’
I filamento
I filamento 5’TTTT3’
seq nota
amplicone finale contenente il 3’ ignoto
I primII prim
II filamentoAAAA 3’5’
prim esterno con coda eventuale
TTTT
RACE 5’ Cerchiamo il 5’ ignoto
Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del 3’ ignoto. C’è anche la possibilità di fare la RT direttamente con un primer noto. L’unico problema è che pochi sono gli enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è possibile che il primer specifico non faccia una RT molto specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i messaggeri (retro-trascrittoma).Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei primers con una coda che possono aumentare l’efficienza rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3’.
5’ AAA….AAA nmRNA poly(A) tail
1 - Annealing tra una regione interna dell’mRNA e un primer gene specifico (GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random).
GSP1
GSP1
NON deve essere interno o sovrapposto ad introni;NON deve avere una Tm molto alta (lavora circa a 42°C);
NON deve avere una bassa specificità o omologia con altri geni;
Race 5’ fase I
2 - Retrotrascrizione e tailing all’estremità 3’ del cDNA
5’ AAA….AAA n5’3’
GSP1
Degradazione mRNA
5’3’
GSP1
Purificazione del cDNA
3’5’
GSP1 CCC….CCC
Race 5’ fase II
3 - Amplificazione per PCR usando un secondo primer specifico al gene (GSP2) ed uno contenente una coda di oligo(dC) all’estremità 3’
3’5’
GSP1 CCC….CCCGIG…..GGI
5’
GSP2
La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un altro primer gene specifico (GSP2)
GSP2 GSP3
5’3’ CCC….CCC5’ GIG….GGI 3’
UAP
AUAP
Race 5’ fase III
I inosina
mRNA poly A
Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript.
primer rev. specifico
5’ 3’
5’ 3’
5’3’cDNA singolo filamento
rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH-
trattamento con RNase
5’
3’cDNA singolo filamento
trattamento con terminal transferase
CCCC
primer frw di poly G
5’
3’cDNA singolo filamentoCCCC
sintesi secondo filamento
PCR selettiva
cc cc c
cc
ccc
primer rev. specif.
race 5’ignoto riepilogo
dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno
5’3’CCCC
I primer rev. specif.
5’ 3’
II primer rev. spec. interno (nested)
GGGGG
CCCCCC
5’ sconosciuto
II primer rev. spec. interno (nested)
Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita’ coesive per restrizione dell’adattatore o con A-T
Race 5’ ricapitolazione
Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR
con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuriTAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.
Esistono in vendita: - plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi
Clonaggio dei prodotti PCR