LEUCEMIAS AGUDAS CLASIFICACION, DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y APORTACION DE LAS NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS

Carolina Martínez Laperche

FIR 3 Año de Análisis Clínicos

LEUCEMIAS AGUDASLEUCEMIAS AGUDASEN LA INFANCIAEN LA INFANCIA

NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS

CITOMETRIA DE FLUJO

CITOGENETICA

BIOLOGIA MOLECULAR

CITOMETRIA DE FLUJOFUNDAMENTOS:� Análisis celular multíparamétrico.

Tamaño(FSC)

Complejidad(SSC)

� Se analizan dos tipos de parámetros:

1.Características intrínsecas de la célula: tamaño y complejidad de núcleo y citoplasma, mediante dispersión.

� 2.Características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo):

Se determina mediante fluorescencia, esta procede de uniones Ag-Ac unido a un fluorocromo

CD 10

fluorescente

anti-CD 10

IMPORTANCIA DE LA CFM EN LAS LEUCEMIAS

� Permite el diagnostico mas completo y una mejor tipificación de las leucemias.

� Permite predecir determinadas alteraciones genéticas.

� Identifica marcadores que implican peor pronóstico.

� Identifica fenotipos patológicos que permiten seguimiento y detección de enfermedad mínima residual.

CFM: LEUCEMIA AGUDA

BLASTOS

LINFOCITOS

MONOCITOS

POBLACIONMIELOIDE

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

� Análisis de múltiples parámetros en una misma célula.

� Rapidez: 5000 células /segundo.

� Específico: distingue distintas poblaciones celulares.

� Cuantifica la intensidad antigénica.

� Sensible ( 1 célula / 10000) y objetivo.

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA:

1.Detección y cuantificación de Ag celulares:

2.Cuantificación de ácidos nucleicos.

• Estudio de subpoblaciones linfocitarias

• Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas.

• Inmunodeficiencias.

• Trasplante: subpoblaciones de linfocitos y recuento de progenitores hematopoyéticos (CD34).

• Inmunofenotipaje de plaquetas.

• Enfermedades autoinmunes.

CD4 T cellsCD4 T cells

CD8 T cellsCD8 T cells

Cuantificación del número de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV

CITOGENÉTICA

� Estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas

� Causadas por una alteración en el número y/o estructura de los cromosomas

� Tiene interés diagnóstico y pronóstico

ANALISIS CITOGENETICO� Citogenética convencional:Estudio de alteraciones cromosomicas en las

metafases de las células tras el cultivo “in vitro”Se suele teñir con Banda G ( Tripsina- Giemsa)Detecta alteraciones en todo el genoma

� Citogenética molecular : FISHHibridación de una sonda de DNA marcada con una

sustancia fluorescente sobre la secuencia complementaria del genoma

Metafase poca calidad o alteraciones cromosomicascrípticas

CITOGENETICA CONVENCIONAL Y FISH

Citogenética convencional

Ventajas•Permite análisis de todo

el genoma•Técnicamente sencillo

•Bajo coste

Inconvenientes

•Cromosomas metafasicos•Requiere material fresco•Interpretación personal

experimentado

FISHVentajas

• Permite la localización de secuencias especificas•Técnicamente sencillo•No necesita material fresco•No necesita metafases, puede analizar nucleos en interfase •Detecta alteraciones pequeñas con cromosomas de mala calidad

Inconvenientes•Coste•Solo aporta información de la región estudiada, no sirve como técnica de screening

NUMERICAS

ESTRUCTURALES

numéricas

estructurales

PRINCIPALES ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LAL

�50 cromosomas�Mas frecuente

�Pronostico favorable

GENES INVOLUCRADOS EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS

Pronostico desfavorable

Mas frecuentePronostico desfavorable

LEUCEMIA AGUDAS LINFOBLASTICAS

CASI-HAPLOIDE *t (9;22)t (4;11)

DESFAVORABLE

HIPERPLOIDIA (47-50)CARIOTIPO NORMALdel (6q)t (1;19)t (8;14), t (2;8), t (8;22)

INTERMEDIO

HIPERPLOIDIA (>50)t (12;21) y del (12p) en niños

FAVORABLE

UTILIDAD DE LA CITOGENETICA EN LA

� DIAGNOSTICO:1. La clasificacion de la OMS(2001) incluye algunas

anomalias geneticas

� PRONOSTICO:1. Asociacion emtre anomalias citogeneticas y grupos

pronosticos

� TRATAMIENTO:1. Algunas anomalías genéticas condicionan el tratamiento

LMA con t (15;17) ATRALAL con t(9;22) GLIVEC

BIOLOGIA MOLECULAR

NUEVAS MUTACIONES

INTERMEDIAALTO++SECUENCIACION

CUANTIFICACION

EXPRESION

TRASLOCACION

MUTACION PUNTUAL

ALTAINTERMEDIO

GRAN AVANCE DIAGNOSTICO DE LEUCEMIAS

++++

PCR TIEMPO REAL

TRASLOCACIONES

MUTACION PUNTUAL

EXPRESION

ALTABAJO+++PCR convencional

TRASLOCACIONBAJABAJO-SOUTHERN BLOT

UsoDisponibilidadCosteAplicabilidad

clínica

Técnicas

Análisiscualitativos

Análisis cuantitativos

Investigación

�TRATAMIENTO

CONDUCTA ANTES DE QUIMIOTERAPIA

� Tratamientos de soporte: para minimizar efectos tóxicos inmediatos del tto.

-profilaxis y tratamiento de infecciones.

-corrección de desequilibrios metabólicos.

-prevención de síndrome de lisis tumoral (SLT) con hiperhidratacioncon solución glucosalina para aumentar la diuresis.

SLT

-prevención y tratamiento de la nefropatia urática con Rasburicasa ivde 3-7 días con suero salino fisiológico.

Solo excepcionalmente será necesario hemodiálisis.

-HIPERURICEMIA.

-HIPERPOTASEMIA.

-HIPERFOSFATEMIA

-HIPOCALCEMIA

PRIMEROS TRATAMIENTOS

� Antes años 50: supervivencia 5 meses

� Años 50: Mercaptopurina, Ciclofosfamida, corticoides

� 60-70: Antraciclicos, Asparraginasa, Epipodofilotoxinas

� 70: Skipper: Poliquimioterapia

Se empezaron a aplicar protocolos de quimioterapia

� 80: Tratamientos cada vez mas individualizados (según el riesgo)

� Supervivencia: 70% a los 7 años

SITUACION ACTUAL

� Y el 30%?????

� Elegir tratamiento estándar o supraintensivo

� Nuevos tratamientos para las recaídas

� Analizar factores de peor pronostico

Factores que conllevan alto riesgo: 10% No alcanzan RC tras 4-5 semanas de tto>25% blastos en MO +14< 1 Año>200000/ul leucocitosPortadores de t (9;22) t (4;11)EMR > 1% en MO después 5 semanas de tratamientoUso de tratamientos supraintensivos

PROTOCOLOS DE QUIMIOTERAPIA

DOS PROTOCOLOS: PETHEMA Y SHOP.

� FASE DE INDUCCION:3 drogas que intentan conseguir una remisión completa (< 5% blastos en MO).

� -FASE DE CONSOLIDACION/INTENSIFICACION .� -FASE DE MANTENIMIENTO.� -QUIMIOTERAPIA INTRATECAL

RC: Recuperacion de la actividad medular con:-Hb > 10 g/dl.-granulocitos > 1.5 x 109/l.-plaquetas > 120 x 109/l.-MO NORMOCELULAR o < 5% blastos.-LCR sin blastos.-EMR< 1 % después del tratamiento de inducción.

TRASPLANTE DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS

El TPH alogénico en LAL se reserva solo a pacientes de muy alto riesgo que:

1.Día +14 MO :> 10% blastos en el examen citomorfológico.

2.Día +35 MO :≥5 % blastos y/o EMR (punto 1)≥1% células de fenotipo leucémico.

3.Después 1 ciclo tratamiento CI si EMR (punto 2) >0.1%.

4.Después 2 ciclo tratamiento CI si EMR >0.01%.

Hasta encontrar donante sigue una pauta de tratamiento: REINDUCCION CON INTENSIFICACION

MANTENIMIENTO CON REFUERZO.

TRASPLANTE DE CPH

1.Pasos para decidir TCPH:

• Selección del receptor.

• Estudio D-R compatibilidad HLA.

• Tipo de trasplante y fuente de CPH.

• Régimen de acondicionamiento

• Ejecucción del trasplante .

• Seguimiento paciente trasplantado.

2.Tipos de trasplante

� Alogénico: HLA compatible familiar o no.

Eliminar hematíes y plasma (ABO) y linfocitos T ( EICH).

� Singénico: donante y receptor gemelos homocigotos.

� Autólogo o autotrasplante MO.

3.Fuentes de CPH

.

Ventajas de SP como fuente de CPH:-Disminuye morbilidad y mortalidad.-Recuperación hematológica mas precoz.-Coste económico menor.

EN 90% T AUTOLOGOS

EN 30% T ALOGENICOS.

Medula óseaCordón umbilicalHígado fetal

Sangre periférica

AFERESIS: Recolección de CPH

Administración de fármacos al donante que movilicen precursores a la circulación (G-CSF) 5 días

Pre-Aféresis: contaje CD34 en SP

Aféresis: Se usan separadores

celulares de flujo continuo

por selección positiva de CD34+

usando AC monoclonales contra Ag CD34+.

LABORATORIO: CONTAJE CD34 POR CITOMETRIA

� Recuento rápido y reproducible de (CD34).

� Mínimo de células CD34+ que garantice repoblación de MO

� 2 x 106/Kg células CD34: injerto estable.

� Relación directa CD34+ infundidas y recuperación hematológica postrasplante.

PERSPECTIVAS FUTURAS:� Detectar resistencias celulares a citostáticos

� Características farmacológicas de citostáticos

� Disminuir toxicidad de transplantes de progenitores hematopoyéticos

� Disminuir toxicidad de quimioterápicos sin perder eficacia

� Nuevos tratamientos biológicos

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

� Persistencia de un clon anormal de células en niveles bajos, durante o tras finalizar tratamiento de inducción, consolidación o mantenimiento.

� Estas células residuales deben tener un inmunofenotipo y/o citogenética igual al de las células al diagnostico.

� Esto ha llevado a un cambio en el concepto de remisión completa la cual se realiza en función de EMR y no de el numero de blastos en MO.

� La presencia de EMR postinducción es uno de los factores pronósticos mas importantes por su asociación a las recaídas.

EMR. TECNICASEMR. TECNICAS

Sensibilidad: 1 - 5/102

• Morfología

• Citogenética convencional

Sensibilidad: 1/103

• FISH

Sensibilidad: 1/104 - 1/105

• PCR : Reordenamientos específicos

TCR/ IgH (LLA)

• CFM (Citometría de flujo multiparamétrica)

EMR. CITOMETREMR. CITOMETRÍÍA DE FLUJOA DE FLUJOMULTIPARAMMULTIPARAMÉÉTRICATRICA

PASOS:

• En el momento del diagnóstico:

1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL)

2. Diseñar paneles de seguimiento específicos

• Durante el seguimiento:

3. Obtención de muestras adecuadas

4. Aplicación de los paneles de seguimiento

5. Adquisición: Live gate

Características de la muestra

• Aspirado medular

• Debe ser representativo de médula ósea

aspirado enérgico

1,5 mL de muestra

evitar la dilución con sangre medular

• Procesar en < 24 horas

Evitar pérdidas selectivas de células

EMR. CFMEMR. CFM

EMR. CMF

Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-

EMR .CMF

Post-Inducción : 0,14% de células CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2).

Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD13+.

Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).

Normal

IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B)

EMR: 1,43%

CD

19-P

C5

CD

20-P

C5

CD

20-P

C5

SSC CD10-FITC CD10-FITC

EMR. LLAEMR. LLA --B MLL+B MLL+

PROTOCOLO LAL-RA

Inducción

DIA + 14MO >10% BLASTOS

MO < 10% BLASTOS

TCPH?

DIA + 35MO >5% Y EMR >1%

MO< 5% y EMR <1%

TCPH?

ConsolidaciónIntensificación1 ciclo

RC Y EMR< 0,01%

No RC O EMR>0,01%

ReinducciónMantenimiento

ConsolidaciónIntensificación2 ciclo

C+I

2 Ciclo

EMR<0,01%

EMR>0,01%

TCPH?

Estudio EMR 2 objetivos:

1. Conocer velocidad de destrucción de la masa leucémica, factor pronostico fundamental para cambiar decisiones terapéuticas

2. Predecir cualquier recaída antes de la aparición de manifestaciones clínicas

EMR en LLA. ConclusionesEMR en LLA. Conclusiones

• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables

• Cantidad de EMR significativa:

Post-tratamiento de Inducción: ≥ 0,1%

Durante el resto del tratamiento: ≥ 0,01%

• Muy mal pronóstico:

Pacientes con EMR ≥ 1% post-Inducción

EMR persistente

• Muy buen pronóstico:

EMR- post-Inducción y post-Consolidación

EMR- precozmente (d. 19)

EVOLUCION DE LA EMR

Día + 1

Día + 35….

MUCHAS GRACIAS