legionella kolonizáció diverzitása...

LegionellaLegionella kolonizáció diverzitása kolonizáció diverzitása

ivóvízhálózatbanivóvízhálózatban

Barna Zsófia

Eötvös Loránd Tudományegyetem - Természettudományi KarKörnyezettudományi Doktori Iskola

Barna Zsófia

Témavezetı: Dr. Vargha Márta

Országos Környezetegészségügyi Intézet

Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly

ELTE Mikrobiológiai Tanszék

A A Legionella Legionella baktériumbaktérium

� Gyakran vízzel asszociált kórokozó – nedves

meleg környezetben fordul elı

� Vízi egysejtő eukarióta szervezetekben

intracellulárisan is szaporodik

� Szaporodásának optimális hımérséklete: 25-45°C

� Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris � Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris

csillós pálca

� A Legionella genusnak > 50 ismert faja van

� Eddig 21 fajról derült ki, hogy képes humán

megbetegedést okozni

� A jelentett fertızések 80-90 %-a a Legionella

pneumophila-ra vezethetı vissza

� L. pneumophila-nak 16 szerotípusa ismert

� L. pneumophila 1 okozza a legtöbb megbetegedést

A legionellosisA legionellosis

A Legionella által okozott

humán megbetegedések

összefoglaló neve

� Pontiac-láz

(nem pneumóniás forma)

� Legionárius betegség

(pneumónia)

Kockázatot jelentı közegekKockázatot jelentı közegek

� hőtıtornyok

� légkondícionáló berendezések

� épületek nedves hőtési technológiával üzemelı légkondicionáló berendezései (hőtıtornyok)

� rosszul kialakított felületi hőtık (pl. split-klíma)

� (nagy) épületek hideg- és melegvíz-rendszerei

� Kórházak

� Szállodákban/irodaházak

� Oktatási intézmények

� szökıkutak

� légnedvesítı berendezések

� pezsgıfürdık

� kerti locsolók

� talaj

Bejelentett legionellosis esetek számaBejelentett legionellosis esetek számaMagyarországon Magyarországon (1998(1998--2008)2008)

60

80

100

120

Esetszám [fı]

nem halálos kimenetelő

halálos kimenetelő

Egyedi vizsgálati járványügyi lap

bevezetése

A nyilvántartásban

csak pneumoniával

járó megbetegedések

0

20

40

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008

Esetszám [fı]

Morbiditás [fı/millió lakos] 1,3 1,2 2,0 2,7

Letalitás [%] 15,4 8,3 30,0 14,8

Forrás:Dr. Horváth Judit Krisztina

Országos Epidemiológiai Központ, Járványügyi Osztály

CÉLKITŐZÉS:Legionella hazai elterjedésének vizsgálataLegionella hazai elterjedésének vizsgálata

LegionellaLegionella kolonizáció hazai hálózati kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben vízrendszerekben –– objektumokobjektumok

Összes vizsgált objektum: 102102

Legionella-val kolonizált: 66 66 (65 %)(65 %)

15

20

25

objektumok száma [db]

0

5

10

objektumok száma [db]

Szállodák

Egészségügyi Int.

Oktatási int.

Élelmiszereá. üzem

Gyógyszergyár

Üzem - egyéb

Irodaház

Magánház

Áruház

nem kolonizált kolonizált

Mintavételi pontokMintavételi pontok

szállodák

eü. intézmények

oktatási intézmények

élelmiszer eá. üzem

irodaház

üzem - egyéb

gyógyszergyár

150

200

250

300

vízm

inták szám

a [db]

Összes vizsgált minta: 10651065

Legionella kimutatható: 466 466 (44%)(44%)

1 000 CFU/L felett: 267 (25 %)267 (25 %)

LegionellaLegionella kolonizáció hazai hálózati kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben vízrendszerekben –– mintákminták

0

50

100

vízm

inták szám

a [db]

Szállodák

Egészségügyi Int.

Oktatási int.

Élelmiszereá. üzem

Gyógyszergyár

Üzem - egyéb

Irodaház

Magánház

Áruház

< 10 10-1000 > 1000

Hımérséklet hatása a Hımérséklet hatása a LegionellaLegionella--kolonizációrakolonizációra

N=656

Kritikus hımérséklet-tartomány

60

80

100

120

140

160

Vízminták száma [db]

40%

60%

80%

100%

<1000

>1000

75,2 %N=656

� Szaporodási hımérséklet tart.: 20-50°C

� 20°C alatt perzisztál

� 60°C-on 3 perc alatt pusztul el

� 70°C felett azonnal elpusztul

0

20

40

60

Hımérséklet [°C]

Vízminták száma [db]

� Összesen 656 minta

� Minták 75,2 %-a esik a 20-54,9°C-os tartományba

0%

20%

< 10

10-14,9

15-19,9

20-24,9

25-29,9

30-34,9

35-39,9

40-44,9

45-49,9

50-54,9

55-59,9

> 60


CÉLKITŐZÉS: Intézkedések a Legionella csíraszám Intézkedések a Legionella csíraszám

visszaszorítására

Védekezési lehetıségek Védekezési lehetıségek

a legionellák ellena legionellák ellen

� Aktív módszerek: csökkentik a baktériumok számát

� Klóros fertıtlenítés (pl. klór-dioxid)

� Ózonos fertıtlenítés

� UV-sugaras fertıtlenítés

� UV-sugárzás + ultrahang

� "aacheni-módszer"

� Mikrobicidek alkalmazása

� Termikus fertıtlenítés

� Passzív módszerek: megakadályozzák a baktériumok

szaporodását

� A gyár egész területén problémát jelent a Legionella jelenléte

� Kísérleti jelleggel hıfertıtlenítés az egyik – 2004-ben épült – épületben

� Vegyszeres kezeléstıl elzárkóznak

� Választott kezelés: rendszeres hıfertıtlenítés

HıkezelésHıkezelés

10 000

100 000

Legionella [CFU/l]

1. pont

2. pont

3. pont

2009.04.17.

2008.11.01.

2009.03.07.

1

10

100

1 000

2007.07.26

2008.04.07

2008.10.08

2008.11.03

2008.12.11

2009.03.12

2009.04.22

Legionella [CFU/l]

4. pont

Egyszeri vegyszeres fertıtlenítésEgyszeri vegyszeres fertıtlenítés� Egészségügyi intézmény – használati melegvíz-hálózata a tényleges vízfogyasztáshoz képest

jelentısen túlméretezett

� HMV tartály cseréje az elsı vízvizsgálati eredmények után

� Fertıtlenítés:

� A használati melegvízhez nagy koncentrációban klór-dioxid oldatot adagoltak

� 100 l 0,3%-os klór-dioxid oldat (kb. 600 mg/l végkonc.)

� 24 órát maradt a rendszerben a fertıtlenítıszer (10 mg/l végkonc.)

� Csapok kifolyatása 0 mg/l szabad-klór koncentrációig49

46 4646 4644 43

10 000

100 000

50

60

� 50% hidrogén-peroxid és ezüst: kb. 5-10mg/l (2-58 mg/l) - jelenleg folyamatos4140 40 40

44 4340

1

10

100

1 000

2007.11.06 2009.02.02 fertıtl. elıtt

2009.02.02 -fertıtl. után

2009.05.05

0

10

20

30

40

HMV tartály

3. emelet

1. emelet

Legionella csíraszám [CFU/l]


CÉLKITŐZÉS: CÉLKITŐZÉS: Legionella-törzsgyőjtemény

létrehozása és jellemzése létrehozása és jellemzése

Pozitív vízmintákból 3-3 izolátumTörzsgyőjtemény:

864 Legionella törzs

Faj alatti szintő azonosítás Faj alatti szintő azonosítás

szerológiai vizsgálattalszerológiai vizsgálattal

N=520

3,5%9,0% 0,6% 21,3%

17,7%

2,1%

nem aggl.

L. pn. 1

L. pn. 2

L. pn. 3

L. pn. 4

L. pn. 5

L. pn. 6

1,3%14,0%27,5%

1,5%1,3%

L. pn. 6

L. pn. 8

L. pn. 9

L. pn. 10

L. pn. 12

L. pneumophila 3: 14,0 %



Kérdések:

• Miért kizárólag Legionella pneumophila?

• 21,3 %-ban L. pn. 2-14 szerocs. (=nem aggl.)

→ további vizsgálatok

Denka Seiken Ltd.

A A L. pneumophilaL. pneumophila 22--14 szerocsoportú 14 szerocsoportú

törzsek molekuláris vizsgálataitörzsek molekuláris vizsgálatai

rpoB PCR-RFLP is – probléma a PCR optimalizálásával

� cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása

ARDRA1 csoport1 faj

Hinf I

Alu I

Genus specifikus PCR – minden izolátum pozitív

� cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása

� csoportosítás REP-PCR-rel (11 csoport)

� reprezentánsok → szekvencia-analízis

� mip gén – 16S rDNS-nél variábilisabb régió

� faji szintő azonosítás 95% hasonlóság felett

� 6 törzs > 95% hasonlóság → Legionella pneumophila

� nagy hasonlóság több Legionella pneumophila szerotípussal is

Szekvencia-analízis

Megoldás: MLST beállítása

� REP-PCR vizsgálat (ERIC primerekkel)

� 377 vizsgált izolátum (+ típustörzsek):

� Egy-egy dendrogram a kül. intézményekbıl izolált törzsek hasonlósági viszonyait ábrázolja

� Összevetettük a kül. intézményekbıl izolált jellemzı törzsek mintázatait egymással

� Különbözı mintavételi helyekrıl is lehet hasonló REP-PCR mintázat1

� Összes izolátum: 12 nagyobb REP-PCR csoport

Ismert szerotípusú Ismert szerotípusú L. pneumophilaL. pneumophila

törzsekkel végzett vizsgálatoktörzsekkel végzett vizsgálatok

� REP-PCR-rel kapott csoportosítás összevetése a szerotípusokkal

szerotípusok alatti felbontás

szerotipizálás kiváltására közvetlenül nem alkalmas

1 REP-PCR csoport – több szerotípus

1FPQuestTM Software (verziószám: 4.5)

Dice hasonlósági index, UPGMA távolságszámítás

0

1

2

3

4

5

6

7

1.eü

.*2.eü

.4.eü

.8.eü

.10

.eü.*

11.eü.

12.eü.*1.sz

.2.sz

.3.sz

.4.sz

.5.sz

.*7.sz

.*8.sz

.

szerotípusok

REP-PCR csoportok

Célkitőzés: Célkitőzés:

Real-time PCR beállításaReal-time PCR beállítása

DNS kivonásDNS kivonás� Feltételezett elıny: csak az élı sejtek

� Alátámasztás: Pseudomonas aeruginosa-val elölt Legionella

� További elıny: Alacsony csíraszámnál is reprodukálhatóan mőködik

� Módszer beállítása: 1. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-104 CFU/l)

2. Legionella-val + P. aeruginosa-val inokuált steril deszt. víz minta (mátrix: 10 és 103 CFU/L)

3. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-104 CFU/l) + összcsíra (104CFU/L)

y = -1,0945x + 9,1293

R2 = 0,8248

y = -0,51x + 3,9136

R2 = 0,9492

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2

minták

értékek

DNS konc. [ug/ml]

log 10 Legionella csíraszám[CFU/100ml]

Lineáris (DNS konc. [ug/ml])

Lineáris (log 10 Legionellacsíraszám [CFU/100ml])

RealReal--time PCRtime PCR

102 kópia

� 16S rDNS és mip gén alapú egyidejőleg

� Alacsony csíraszámnál is

� Elızetes eredmények: 100 kópia – számunkra elégséges érzékenység

� Eddig csak inokuált vízmintán teszteltük (Legionella pneumophila 1)

Célkitőzés: Célkitőzés:

FISH technikán alapuló módszer beállítása

Fluorescens Fluorescens in situin situ hibridizálás (FISH)hibridizálás (FISH)

CÉL: FISH-technika alapú módszer kidolgozása a

legionellák megtelepedésének és túlélésének

közvetlen vizsgálatára biofilmekben

1. A legionellák megtelepedésének nyomon-

követése tárgylemezen növesztett biofilmben

Kérdés: amıbák nélkül képesek-e szaporodni?

2. Legionellák vízmintából történı kimutatására 2. Legionellák vízmintából történı kimutatására

alkalmas FISH technika kidolgozása

Terv:

� A vízmintát membránszőrın szőrjük

� A filtert néhány órán át elıinkubáljuk

� Közvetlenül a filteren végezzük a hibridizációt

Beállítás alatt – eddig beállítva tárgylemezen

Célkitőzés: Célkitőzés: Bevezetett módszerek alkalmazása

járványügyi kivizsgálásoknáljárványügyi kivizsgálásoknál

Járványügyi kivizsgálásokJárványügyi kivizsgálások

� A bevezetett vizsgálati módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál

� Szerotipizálás (pontos szerotípus meghatározás)

� Törzsek elızetes vizsgálata: REP-PCR

� PFGE (pulse field gel electrophoresis)

� Esetek� Esetek

� Nosocomiális eset I. – ø humán izolátum

� Nosocomiális eset II. (két kórház érintett) – ø humán izolátum

� Területen szerzett legionárius megbetegedés – ø humán; økörnyezeti izolátum

� Utazással összefüggı legionárius megbetegedés

Utazással összefüggı legionárius Utazással összefüggı legionárius megbetegedés kivizsgálásamegbetegedés kivizsgálása

Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]Legionella_9812

100

90

80

70

60

Legionella_9812

�

�

�

�

�

.

.

.

.

.

1251/1/1

1258/2/1

1251/1/2

1254/2/2

1253/2/2

.

.

.

.

.

1

1

1

1

1

Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követı PFGE (pulzáltatott mezejő gél elektroforézis)

Lpn001

N=27

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1253/2/2

1258/1/08

198

1256/1/1

1250/1/1

732/1/08

723/1/08

725/1/08

726/1/08

716/2/08

734/2/08

711/2/08

.

.

.

.

.

1

1

1

3

3

1

1

1

1

1

1

1

Lpn001

Lpn002

ÖsszefoglalásÖsszefoglalás� Az összesen vizsgált 102 objektum 65 %-a legionellával kolonizált

� Az összes vizsgált minta (1 065) 25%-nak Legionella-csíraszáma haladja meg az 1 000 CFU/l-t

� A rendszeres hıfertıtlenítés megfelelı védelmet biztosít; a vegyszeres fertıtlenítésnél elengedhetetlen a megfelelı méretezés

� 864 törzsbıl álló törzsgyőjtemény összeállítása

� Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3� Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3

� REP-PCR nem alkalmas a szerotipizálás kiváltására, de járványügyi kivizsgálásoknál elıszőrésre kiválóan alkalmazható

� Beállított módszerek sikeres alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál

� További feladatok:

1. Real-time PCR alkalmazása valós vízmintákon

2. FISH beállítása (és FISH beállítása biofilm-vizsgálatokra)

3. MALDI-TOF MS eredmények kiértékelése

4. MLST beállítása és alkalmazása a járványügyi szempontból releváns törzseken

PublikációkPublikációkCikk referált folyóiratban:

Zs. Barna, K. Antmann, R. Bánfi., M. Németh., A. Szax, M. Vargha: Role of drinking water system in the transmission of Pseudomonas aeruginosa and Legionella ssp. in an intensive care unit. in: Journal of Water and Health – folyamatban

Nemzetközi konferencia részvételek:

� Vargha, M.; Barna, Zs.; Illés, E.; Varga, D.; Kádár, M.: Tracing Legioneallae in a hospital’s hot water system by rep-PCR and intact cell MALDI-TOF MS. International Symposium on Microbial Ecology, Bécs, Ausztria, 2006. 08

� Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Horváth, K.; Kalácska, J.; Kádár, M.; Vargha, M.: Prevelance of Legionella types in Hungarian water samples by different typing methods. 22nd Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Stockholm, Svédország, 2007.06

� Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Kádár, M.; Kalácska J.; Szax, A.; Vargha, M.: Current status of environmental Legionella prevalence in Hungary. 23th Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Madrid, Spanyolország, 2008.05

� Zs. Barna, K. Antmann, J. Pászti, M. Németh, R. Bánfi, M. Vargha Tap water as a potential source of nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections in an intensive care unit, 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finnország, 2009.05

Témavezetés:

� Szax Anita (ELTE TTK): Legionella környezeti elıfordulásának jellemzése, Budapest, 2009

legionella kolonizáció diverzitása...

Documents