LE COLTURE “ IN VITRO”

Per coltura in vitro s’intende l’applicazione biotecnologica in cui cellule, tessuti ed organi sono coltivati in un ambiente sterile ed

artificiale ed in condizioni chimico­fisiche controllate.

La tecnica delle colture in vitro nei vegetali ebbe inizio nei primi anni del 1900 ad opera di Haberlandt il quale, basandosi

sul concetto di TOTIPOTENZA, riprese e ampliò la teoria

cellulare formulata da Schwann e Schleiden 60 anni prima.

“ Totipotenza delle cellule vegetali” Le basi delle tecniche di

coltura in vitro

capacità di rigenerare un individuo completo partendo da cellule e/o tessuti differenziati.

Le cellule mature, altamente specializzate, mostrano la capacità di

regressione verso uno stato meristematico, indifferenziato.

Processo di “ dedifferenziazione” .

Processo di “ ri­differenziazione” . Pianta completa

In adeguate condizioni colturali, la cellula vegetale

embrionale può sviluppare la pianta intera

• Specifici terreni di coltura

• Fonti di carbonio

• Vitamine

• Sorgenti di azoto

• pH

• Luce

•Temperatura

In condizioni asettiche

Processo di “ ri­differenziazione” .

La coltura in vitro ha contribuito

1. A far luce sui processi biochimici, fisiologici e genetici

che regolano lo sviluppo e la riproduzione delle piante

2. alla messa a punto di numerose tecniche, definite

tecniche di colture “ in vitro” , che hanno permesso degli

avanzamenti eccezionali nei processi della produzione

vegetale

Tecniche di Coltura in vitro

S’intendono tutte quelle tecniche utilizzate per mantenere e crescere tessuti e organi

vegetali in coltura sterile. Tali tecniche sono integrative e non alternative alle tecniche

tradizionali di propagazione clonale

coltivazione in vitro tessuti vegetali indifferenziati

Micropropagazione

Embriogenesi somatica

Coltura di protoplasti

Coltura di cellule

Coltura di callo

Tecniche di rigenerazion e “ in vitro”

schema sintetico

delle tappe che

caratterizzano le

colture in vitro sia su terreno solido che

liquido

La tecnica delle colture “ in vitro” si caratterizza:

•per le piccole dimensioni degli espianti;

• la coltivazione in ambienti asettici;

•le condizioni ambientali controllate;

• il rispetto di alcuni fattori chimici come gli elementi minerali

nutritivi e sostanze ormonali;

La tecnica delle colture “ in vitro” consente

1. riprodurre sistemi biologici complessi in ambienti ristretti e tempi limitati, in condizioni ambientali (luce, temperatura,

umidità ecc.) e nutrizionali (composizione dei terreni di coltura) strettamente controllati.

2. avere sempre materiale vegetale disponibile, svincolando le osservazioni dalla stagionalità e dalla durata del ciclo

vegetativo

3. Ottenere uno screening veloce di selezione del germoplasma

4. Manipolare il corredo genetico, favorendo l’introduzione di geni e ottenendo cloni transgenici resistenti

5. realizzare e gestire collezioni clonali garantendo la conservazione di prezioso patrimonio genetico

Clone Insieme di individui

geneticamente identici propagati esclusivamente attraverso via vegetativa da

una singola pianta

“… l’arte e la scienza di

moltiplicare le piante in vitro...”

Micropropagazione

Tecnica propagazione asessuata che permette, partendo da una pianta madre, di ottenere un numero elevato di cloni identici alla pianta di

partenza

Si basa sulla capacità di un meristema (apice proliferativo di un

germoglio o di una gemme dormiente) di accrescersi

continuamente e di produrre un germoglio (1 apice 100­370 piante)

Vantaggi •Ottenere in tempi relativamente brevi un numero elevato di piante, capaci di essere

stoccate in piccoli spazi

•Ottenere materiale vegetativo esente da patogeni quali funghi

e batteri

•Ottenere materiale vegetativo uniforme e con una crescita più

rapida e vigorosa

• Svincolarsi dalle variazioni stagionali e dal tempo

• Intenso e complesso lavoro manuale

• Non esistono protocolli standard per tutte le specie

• Alcune specie sono recalcitranti

• I cloni possono avere ancora costi eccesivi (5 volte rispetto a pianta convenzionale)

•Applicare questa tecnica all’industria vivaistica per quelle specie che sono difficili da propagare

• Risanare materiale da virus e allevare materiale virus­esente

Limiti

La micropropagazione si sviluppa in quattro fasi successive:

1)raccolta del materiale vegetale della pianta madre;

2)Induzione e stabilizzazione della coltura

3) moltiplicazione del materiale vegetale;

4) radicazione;

5) acclimatazione.

L’espianto può essere una gemma, un piccolo

apice di germoglio di pochi centimetri, oppure

quando si vogliono produrre piantine virus­

esenti, un meristema apicale di pochi mm (0.2­

0.5 mm), prelevato con l’aiuto di uno stereo­

microscopio.

RACCOLTA

Germogli apicali

Induzione e stabilizzazione Ottenere e stabilizzare una coltura asettica a partire da un espianto

primario ex vitro, raccolto da una pianta coltivata in pieno campo o

in serra.

1. Il materiale raccolto è sterilizzato con soluzioni di ipoclorito di sodio o di calcio, lasciandolo in immersione per un tempo differente a seconda del tipo di tessuto e/o di pianta 2. il materiale vegetale sterile è posto in un terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti e di regolatori di crescita quali auxina (IBA, 6­BA) e citochinina (NAA, 2,4­ D), che permettono all’apice del germoglio di allungarsi e di sviluppare delle gemme laterali da cui si originano germogli avventizi. 3. La coltura è effettuata in camera di crescita in condizioni di temperatura ed illuminazione controllate

Che cosa significa terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti?

I mezzi di coltura sono costituiti da macro­ e microelementi e vitamine.

Agar è un agente gelificante che conferisce al substrato la compattezza necessaria per sostenere verticalmente le colture.

I mezzi di coltura più utilizzati sono:

MS (Murashige and Skoog),

GD (Greshoff y Doy),

H53 o Hm (Heller o Heller modificato)

WPM (Woody Plant Medium).

Gli ormoni hanno la funzione di regolare e indirizzare i processi organogenetici o di differenziamento e la crescita

degli espianti.

Moltiplicazione

Ottenere da un germoglio in vitro (coltura “ in vitro” iniziale) numerosi

germogli (sub­colture). Produzione esponenziale del materiale

vegetale

Il mezzo colturale è generalmente lo stesso di quello utilizzato

per stabilizzare la coltura nella fase iniziale

Radicazione La radicazione è quella fase della micropropagazione in cui si induce

il processo di rizogenesi in un germoglio “ in vitro”

la radicazione è spontanea in alcune specie

La radicazione deve essere indotta in altre specie. L’induzione avviene tramite l’esposizione della parte basale del germoglio a concentrazioni variabili di auxina ed in assenza di citochinina che ne inibisce la formazione

È il processo attraverso il quale le “ plantule” ottenute in vitro sono trasferite in condizioni di coltura ex vitro.

Acclimatazione

Stato di semi­eterotrofia → stato di assoluta autotrofia.

minore umidità maggiore intensità luminosa oscillazione termica mancanza di condizioni asettiche.

Bassa percentuale di sopravvivenza

Per evitare l’alta mortalità delle piantine

Le piantine, trasferite in apposti vasi contenenti torba e perlite, sono mantenute con la parte aerea coperta da un tunnel plastico (tunnel di acclimatazione), capace di garantire un’elevata umidità.

1. Le prime foglie si adattano a questo ambiente;

2. le foglie vecchie provvedono a costruirsi una cuticola cerosa

superficiale che le protegge dalle perdite di acqua e dalla

disidratazione

Terminata questa fase, le piante possono essere trasferite in pieno campo

Germogli apicali Fase di sterilizzazione

Micropropagazione di castagno

Fase di induzione

Fase di stabilizzazione

Sopravvivenza plantule

Ottimizzazione della

concentrazione di citochinina, del periodo e della

porzione di espianto (apicale, mediano e basale)

Inizio della radicazione

Radicazione con carbone attivo

Fase di moltiplicazione

Fase di radicazione

Fase di Acclimatazione

E’ un processo per il quale cellule somatiche possono produrre strutture simili ad embrioni,

sviluppando tutti gli stadi embriologici, senza che si abbia fusione di gameti

L’embriogenesi somatica

Un embrione vegetale zigotico, ottenuto attraverso la gamia è caratterizzato da due poli meristematici, rispettivamente radice e fusto,

uniti mediante un sistema vascolare continuo

Gli embrioni somatici sono morfologicamente e fisiologicamente identici agli embrioni zigotici (polo radicale e caulinare uniti da un sistema vascolare chiuso). Differiscono dagli embrioni zigotici dal punto di vista genetico. Presentano le stesse caratteristiche o corredo genetico della pianta donatrice, in quanto non è avvenuta la ricombinazione dei caratteri maschili e femminili che si realizza attraverso il processo di meiosi o gamia.

Differenze tra embrioni zigotici ed embrioni somatici

In natura, l’esempio migliore di embriogenesi somatica è rappresentato dall’apomissia sporofitica a localizzazione nocellare come la poliembrionia del genere Citrus.

60 famiglie di vegetali tra cui vanno menzionate sicuramente le Leguminose, le Crucifere, le Cucurbitacee, le Graminacee, le Rosacee, ecc.

L’embriogenesi somatica può essere indotta in modo artificiale attraverso l’espianto e la coltura in vitro di tessuti, organi o singole cellule.

L’embriogenesi somatica può manifestarsi attraverso uno schema di sviluppo diretto o indiretto

Diretto: le nuove strutture morfogenetiche si differenziano dalle cellule somatiche dell’espianto

Esistono nell’espianto di partenza cellule pre­embriogeniche (“ PEDC, Pre­embryogenic determined cells” ), cioè cellule che hanno acquisito la competenza embriogenica.

l’embriogenesi diretta si attiva con il solo stimolo della divisione cellulare ed in assenza di apporto ormonale attraverso il semplice trasferimento dell’espianto in vitro

Espianti Cellule poco differenziate Embrioni zigotici immaturo

ovulo preferenziale di un frutto dopo 40 giorni dall’antesi

Placenta con 8­10 ovuli vitali

Indiretto: gli embrioni si originano soltanto dopo una fase intermedia di proliferazione cellulare di tipo non organizzato, il

callo.

Durante la callogenesi, alcune cellule acquisiscono la competenza embriogenia (“ IEDC, Induced embryogenic determined cells” ) mediante un processo di riprogrammazione epigenetica del destino cellulare

Callo: cellule non differenziate ottenute da organi con tessuti ben differenziati (porzioni d foglia, di

cotiledoni, ecc.)

Comparsa in coltura di masse proembriogeniche (“ PEM Pro­ Embryogenic Masses” )

Appropriati stimoli fisico­chimici: composizione ormonale

La micropropagazione mediante embriogenesi somatica avviene in diverse tappe

1) Raccolta dell’espianto

2) Induzione all’embriogenesi

3) mantenimento o proliferazione delle colture embriogeniche,

4) maturazione,

5) germinazione e conversione a plantula

6) Acclimatazione

Il tipo di espianto maggiormente utilizzato per l’induzione

all’embriogenesi somatica sono gli embrioni zigotici maturi o

immaturi, o parti di giovani piante che presentano una minor

differenziazione dei suoi tessuti

Raccolta dell’espianto

Fase di induzione Si tratta di indurre un cambio di direzione nel programma di sviluppo morfologico delle cellule dell’espianto che produrranno gli embrioni

somatici

1. Induzione minore o permissivo: le cellule sono poco differenziate e si induce una risposta dello sviluppo già predeterminata

terreno di coltura semplice, senza regolatori di crescita

2. Induzione maggiore o direttivo: cellule presentano un elevato grado di differenziazione e quindi si richiede un cambio della

competenza

Periodo di esposizione a una auxina esogena, che promuova la crescita del callo

L’auxina più utilizzata è il 2,4­diclorofenoxiacetico (2,4 D), seguito da NAA, e in alcuni casi anche AIB e IAA

Sia per l’induzione diretta sia per quella indiretta (callo), la fonte di

azoto svolge un ruolo importante nell’induzione di embrioni

somatici poiché questi non presentano un sistema enzimatico

attivo per ridurre il nitrato ad ammonio.

Idrolizzato di Caseina

Fase di mantenimento o proliferazione Le cellule indotte all’embriogenesi mediante via diretta (ovuli o

cellule non differenziate) o indiretta (masse pro­embriogeniche da callo), sono allevati (mantenuti) in un sistema colturale “ in vitro” per

la produzione e la proliferazione degli embrioni

Via diretta •Numero embrioni dipende dalle dimensioni dell’espianto

•Embrioni non maturi producono nuovi embrioni (embriogenesi ripetitiva) •Tale processo si favorisce aggiungendo auxina al mezzo colturale

Via indiretta •Insieme di embrioni somatici derivano dalla massa pro­

embriogenica •Tali masse proembriogeniche, coltivate in un terreno

addizionato con auxina, non sviluppano embrioni somatici maturi.

Fase durante la quale avviene l’espansione cellulare e l’accumulo delle sostanze di riserva negli embrioni non maturi.

Fase di maturazione

Processo chiave per il normale

sviluppo degli embrioni, poiché i

composti di riserva saranno utilizzati

dall’embrione durante la germinazione

per passare ad uno stato di autotrofia

Trattamenti con acido abscissico (ABA) per ridurre la

germinazione precoce degli embrioni

Fase di germinazione e di conversione a plantula

Fase durante la quale gli embrioni maturi allungano la radice e l’ipocotile

Gli embrioni, apparentemente maturi e ben formati, possono avere difficoltà a

germinare (periodo prolungato di esposizione all’ABA)

Screening de visu degli embrioni maturi per individuare quelli capaci di

sviluppare una pianta.

I criteri di scelta si basano su: 1. Grandezza

2. definita e chiara bipolarità 3. colore opaco che indica la presenza

di riserva di amido 4. cotiledoni ben definiti di colore verde

5. radichetta pronunciata

Per superare la dormienza ad opera dell’ABA, gli embrioni maturi sono

sottoposti ad un trattamento prima della germinazione: disseccamento,

esposizione a 2­4°C

La fase di germinazione

prevede l’aggiunta al mezzo

colturale di gibberellina

Maturazione Conversione Proliferazione

Induzione

1. L’embrione somatico essendo un propagulo completo caratterizzato da un meristema radicale e caulinare, elimina la necessità di una tappa del processo di micropropagazione che è la fase di induzione al radicamento e il successivo allungamento del fusto 2. La frequenza di rigenerazione è molto elevata (alto numero di piantine) 3. L’embriogenesi somatica rappresenta uno dei metodi di ringiovanimento completo di alberi maturi

Vantaggi dell’embriogenesi somatica

4. Gli embrioni somatici sono un materiale ideale per gli studi dei processi biochimici e molecolari implicati nella embriogenesi

5. L’embriogenesi somatica permette l’applicazione di tecniche di crioconservazione, creazione di semi artificiali e trasformazione genetica

Svantaggi della rigenerazione per via “ embriogenesi somatica”

1. Gli embrioni somatici presentano frequenti anomalie morfologiche (numero, dimensioni e forma dei cotiledoni), e fisiologiche che limita il loro normale sviluppo in piante complete .

2. La difficoltà di iniziare la coltura embriogenetica a partire da materiale maturo.

3. La difficoltà di controllare la sincronizzazione della coltura embriogenetica che non permette una manipolazione ottimale degli embrioni

Applicazioni future dell’embriogenesi somatica

1. Propagazione in massa di specie legnose­forestali Grazie all’enorme potenziale di rigenerazione (Olivo, noce, conifere)

2. Conservazione del germoplasma tramite tecnica di frigo­consevazione in vitro e la crioconservazione

•Mantenimento in azoto liquido (­196oC) di cellule o di embrioni somatici permetterà la loro conservazione per un lungo periodo senza che si abbia

la perdita della capacità embriogenica; •Creare banche di germoplasmi ad alto rischio di estinzione

3. Produzione di semi sintetici (embrioni somatici incapsulati in alginato di sodio o di calcio)

4. Gli embrioni somatici rappresentano un ottimo materiale per la trasformazione genetica

Fattori che influenzano le tecniche di micropropagazione e di embriogenesi somatica

1. Età della pianta

La capacità di propagazione (capacità di moltiplicazione e radicazione per la micropropagazione; induzione all’embriogenesi

per e.s.) decresce all’aumentare dell’età della pianta.

quanto più è giovane la pianta madre, tanto più facile sarà la sua micropropagazione e l’induzione all’embriogenesi somatica

2. Condizioni generali della pianta donatrice

Lo stato di nutrizione, stato fitosanitario, esposizione al sole o all’ombra) della pianta donatrice possono influire sulla risposta

morfogenica

Espianti prelevati da piante cresciute in pieno campo hanno una minore capacità di propagazione rispetto a quelli prelevati da

piante allevate in camere di crescita

3. Stadio fenologico della pianta

Piena attività vegetativa della pianta, in cui è massima l’attività di divisione e distensione cellulare degli apici vegetativi

(micropropagazione)

Raccolta dei “ frutti” subito dopo l’antesi (embriogenesi somatica)

4. Composizione chimica ed ormonale dei mezzi di coltura

Auxine e citochinine sono i più importanti regolatori della crescita e dello sviluppo nella coltura di tessuti e organi vegetali