Le basi genetiche delle malattie

nascita pubertà età adulta

Anomalie cromosomiche Malattie

multifattoriali

Malattie monogeniche

Analisi del cariotipo:Numero e struttura

dei cromosomi

Analisi molecolare:Ricerca di mutazioni puntiformi

ANALISI GENETICA PER LA FIBROSI CISTICA

FIBROSI CISTICA

MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA

INCIDENZA1:2500 CAUCASOIDI

1:17000 AFRICANI1:90000 ASIATICI

ITALIA 1:2600-1:3170

FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25ITALIA: 1/27

1 2

1 2 3 4

FIBROSI CISTICA

MALATTIA AUTOSOMICA RECESSIVA

INCIDENZA1:2500 CAUCASOIDI

1:17000 AFRICANI1:90000 ASIATICI

ITALIA 1:2600-1:3170

FREQUENZA PORTATORI CAUCASOIDI: 1/25ITALIA: 1/27

1 2

1 2 3 4aa

Aa Aa

AA AA AAAa Aa Aa

ALTERAZIONI TRASPORTO ELETTROLITICO

ALTERAZIONE DELLE SECREZIONI MUCOSE

INFEZIONE INFIAMMAZIONE

ALTI LIVELLI DI Cl- NEL SUDORE

SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE

ALTERAZIONE DI UN CANALE DEL CLOROCFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator)

SECREZIONI ESOCRINE MUCOSE DENSE

MALATTIA POLMONARE CRONICA OSTRUTTIVAINSUFFICIENZA PANCREATICA ESOCRINAEPATOPATIADIABETEAZOOSPERMIA DA ATRESIA BILATERALE CONGENITA VASI DEFERENTI (CBAVD)ILEO DA MECONIO ALLA NASCITA

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

Struttura del gene CFTR• Il gene è presente sul braccio lungo del cromosoma 7

• E’ formato da 250 kb e 27 esoni

Proteina CFTR

• Costituita da:

- 6 TMD

- 2 ATP binding-cassette

- una regione citoplasmatica centrale (R) con funzione regolatoria

• Formata da 1480 aminoacidi• Sintetizzata sul RER e glicosilata nell’apparato di Golgi• Espressa come proteina integrale di membrana nella parte apicale delle cellule epiteliali dell’intestino, delle vie aeree e delle ghiandole sudoripare, vasi deferenti

Funzioni di CFTR

• Attiva il canale per il cloro tramite la fosforilazione del dominio R

• Stimola ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel) a secernere cloro

• Inibisce EnaC (canale del Na+ epiteliale) riducendo il riassorbimento di sodio

• Regola il PH

Membrana plasmatica

Lisosomi e apparato di Golgi

CFTR Protein Structure

CFTR Gene and Mutations

http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/1300 mutazioni diverse

MUTAZIONI NEL GENE CFTR

Mutazioni CFTR

Severe mutations– F508del

– R117H + 5T in cis

– I148T + 3199del6?

Mild mutations

– R117H

– I148T?

Mutations of unknown significance

Effetto sul fenotipo:

FIBROSI CISTICA CLASSICA < 1% CFTR

FIBROSI CISTICA CON 5% CFTR SUFFICIENZA PANCREATICA

FORME ATIPICHE 10% CFTR

CORRELAZIONE GENOTIPO FENOTIPO

La diagnosi di malattia si basa sulla presenza di manifestazioni cliniche o biochimiche compatibili in associazione alla positività di almeno uno tra i test diagnostici validati. 1- il test del sudore (Cloro e Sodio sono aumentati nel sudore degli affetti)

2- lo studio della differenza di potenziale elettrico transepiteliale a livello delle mucose respiratorie o intestinali

3- l’analisi genetica. Per positività all’analisi genetica si intende l’identificazione di due mutazioni note per causare malattia

DIAGNOSI

DIAGNOSI CF

-TEST DEL SUDORECl- NA+CF>60 mmol/lnormale<40 mmol/lbordeline 40-60 mmol/l

-TEST DELLA DIFFERENZA DI POTENZIALE ELETTRICO TRANSEPITELIALE DELLE MUCOSE RESPIRATORIO E INTESTINALI

CF> 35mVnormale< 20mV

- TEST GENETICO2 MUTAZIONI CF

TEST GENETICO

INDIVIDUI CON SINTOMI CLINICI DI FC

• CONFERMA DI DIAGNOSI

• IDENTIFICAZIONE DELLE MUTAZIONI DEL

PAZIENTE

DIAGNOSI GENETICA CF

ANALISI DI I LIVELLO

Proposta di Linee guida: Castellani et al. 2004

RICERCA DELLE MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI NELLA POPOLAZIONE

F508del 51,07N1303K 4,84G542X 4,842183AA->G 2,66R1162X 2,421717-1G->A 2,11W1282X 1,23R553X 1,15T338I 0,69R347P 0,61711+5G->A 0,57G85E 0,40621+1G->T 0,39R334W 0,30R352Q 0,24S549N 0,24R347H 0,18L1077P 0,16R1158X 0,16541del C 0,16R1066H 0,16E585X 0,16Q552X 0,14D1152H 0,112790-2 A -> G 0,113132del TG 0,113667ins 4 0,11I507del 0,101898+3 A->G 0,10G1244E 0,101784 del G 0,10

FREQUENZA CUMULATIVA % 75,69

MUTAZIONI CF IN ITALIA (Analisi di 3492 alleli)Mutazione %

F508: Mutazione CFTR più frequente

506 507 508 509 510

Ile Ile Phe Gly Val

ATC ATC TTT GGT GTT

ATC AT- - -T GGT GTT

3 bp delezione codone 508 (esone 10)

Delezione di una Phe, ma viene conservato reading frame

La mutazione deltaF508 è presente in tutti i Paesi del continente. La sua frequenza varia notevolmente nelle diverse popolazioni: dal 50% degli alleli FC nell’Europa meridionale al 80% circa nelle popolazioni del Nord Europa, secondo un gradiente di frequenza decrescente da Nord verso Sud-Est.

-Test di I livello: ricerca delle mutazioni più frequenti nella popolazione.

Consentono, quindi, l’identificazione di mutazioni note.

In Italia utilizzando i kit commerciali che includano una trentina di

mutazioni si ha una detection rate di circa il 75%. In queste condizioni

entrambe le mutazioni possono essere identificate, e quindi consentire la

diagnosi, solo in poco più della metà degli affetti; nel 37% dei casi verrà

individuato un solo allele malato, addirittura nessuno in 6 affetti su 100.

In realtà locali favorite da una distribuzione allelica più omogenea, e dove

si possa giungere con un’analisi genetica di I livello ad una copertura del

90%, nel 18% dei pazienti verrebbe comunque identificata una sola

mutazione, nessuna in un malato su 100.

Pertanto, la sensibilità diagnostica di questo tipo di analisi è limitata.

DIAGNOSI GENETICA CF

• METODI DI TIPIZZAZIONE MUTAZIONI NOTE

– presenza/assenza di un sito di restrizione

– ARMS

– ASO

– OLA

– Primer Extension (PEX)

Test di II livello: “scanning” del gene volto a individuare variazioni di sequenza in definite porzioni codificanti e nelle regioni di splicing del gene CFTR.

Permettono una miglior “detection rate”.

Il risultato può essere di difficile interpretazione in quanto si possono individuare sia mutazioni causanti malattia che varianti fenotipicamente non patologiche (difficile precisare se si tratti di una mutazione o di una variante normale).

DIAGNOSI GENETICA CF

•METODI DI SCANNING: ricerca di tutte le possibili mutazioni presenti in un frammento di DNA.

– sequenziamento automatico

– SSCP (single strand conformation polymorphism)

– DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)

– CCM (chemical cleavage of mismatch)

– DHPLC (denaturing high pressure liquid chromatography)

Analisi di III livello: ricerca di riarrangiamenti genomici (inserzioni o delezioni nel gene CFTR). In circa il 10-15% dei soggetti affetti, dopo analisi di tutte le porzioni codificanti e regioni di splicing del gene, non si riesce ad identificare la/e mutazioni responsabili della malattia.

Una ricerca estesa di riarrangiamenti in una popolazione selezionata ha consentito di individuare 16% di alleli precedentemente non identificati (Audrezet 2004). Studi preliminari su popolazione italiana sembrano confermare il dato, e sottolineare l’opportunità di considerare, in casiselezionati, questo tipo di analisi.

DIAGNOSI GENETICA CF

Audrezet 2004

Possono comunque esistere forme classiche di fibrosi cistica nelle quali, anche dopo un’analisi di III livello, non viene individuato un genotipo CFTR compatibile.

Si tratta di situazioni rare, che hanno fatto ipotizzare che anche in fibrosi cistica possa essere presente il fenomeno dell’eterogeneità genetica di locus, e che sottolineano come la diagnosi di malattia sia prevalentemente clinica (Groman 2003).

DIAGNOSI GENETICA CF

Queste considerazioni sull’uso dell’analisi genetica per la diagnosi di fibrosi cistica si applicano alle forme classiche di malattia.

Nella forme atipiche è possibile seguire un percorso analogo, rammentando che le mutazioni presenti in questi casi sono spesso diverse da quelle classiche, rappresentate nei kit convenzionali, per cui un’analisi di I livello ha sensibilità ancora minori, e che un approfondimento con scanning del gene trova spesso una specifica indicazione in questo contesto.

DIAGNOSI GENETICA CF

E’ preferibile utilizzare l’analisi diretta delle mutazionipresenti nella famiglia.E’ quindi giustificato, quando vi sia un progetto di gravidanza, indagare il nucleo familiare con ogni livello di analisi che possa consentire l’identificazione del genotipo completo.

In alternativa, analisi di linkage con marcatori genetici

DIAGNOSI PRENATALE

SCREENING NEONATALE

Primo livello: dosaggio in tutti i neonati del tripsinogeno immunoreattivo (IRT).

Secondo livello: analisi molecolare, basata su un pannello di mutazioni più rappresentate localmente .Viene eseguita nei neonati con alti valori di IRT, abitualmente superiori al 98° centile. La presenza di due mutazioni consente di porre diagnosi di malattia

Terzo livello: test del sudore, qualora si individui una sola mutazione

Un effetto collaterale è l’individuazione di portatori (IRT positivo, una mutazione, test del sudore negativo)

Alcuni di questi neonati sono eterozigoti composti per seconde, rare, mutazioni, e, pur negativi al test del sudore, possono risultare affetti da forme atipiche di fibrosi cistica, o comunque da patologie correlata ad anomalie del gene CFTR.

Per questo, come anche per le incertezze che la comunicazione in epoca neonatale su tali mal definite patologie possono suscitare, è indicato analizzare nel secondo step dello screening neonatale solamente mutazioni note per causare forme classiche di malattia. Eventuali approfondimenti di analisi genetica vanno riservati a casi mirati, di difficile definizione diagnostica (ipertripsinemia persistente, test del sudore dubbio).

SCREENINING NEONATALE

DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI

Il test genetico può essere richiesto da individui della popolazione generale, con rischio standard di eterozigosi (1/27). L’analisi genetica indicata è quella di I livello.

In caso di negatività all’analisi, la probabilità di eterozigosi è intorno all’un per cento (1/105). Non è indicato un test di II livello, un’eventuale richiesta di approfondimento può essere gestita testando il partner e calcolando il rischio di coppia.

Se viceversa il soggetto risultasse portatore, va proposta l’analisi del partner.

I familiari di un malato o di un eterozigote hanno una

probabilità maggiore di essere portatori.

In questo contesto è essenziale conoscere la mutazione

che interessa il ramo familiare a cui appartiene chi richiede

l’analisi.

Al fine di individuare tale mutazione è giustificato, previo

informato consenso dell’interessato, approfondire quando

necessario con accertamenti di II od eventualmente anche

III livello il genotipo dell’affetto o del genitore dell’affetto

parente del consultando.

DIAGNOSI DI ETEROZIGOSI

In breveAnalisi di I livello: kit, commerciale o home-made, che includa le più frequenti mutazioni dell’area di riferimento del laboratorio. Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni e regioni limitrofe. Analisi di III livello: ricerca delezioni e/o inserzioni.

· Il test del sudore, e non l’analisi genetica, è il goldstandard per la diagnosi di malattia. Se il test del sudore non è eseguibile o risolutivo, un’analisi genetica di I livello, ed eventualmente su giudizio clinico di II o III livello possono essere indicate.

· Il testing fetale è da scoraggiare e va sostituito con la ricerca di mutazioni sulla coppia

· L’utilizzo di analisi genetica di I livello può essere integrato nello screening neonatale di malattia.

· La probabilità individuale di eterozigosi può essere efficacemente calcolata con un test di I livello, o, in caso di familiarità, con ricerca della mutazione specifica. Non è indicato un test di II livello.

· Il rischio riproduttivo di coppia è di solito significativamente ridotto dai test di I livello. L’approfondimento con test di II livello è possibile in una minoranza di casi, e deve sempre essere preventivamente discusso con la coppia in sede di consulenza genetica.

COREA DI HUNTINGTON

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-Autosomica Dominante

- Penetranza dipendente dall’età

- 50% si ammalano entro 45 anni

HUNTINGTONINA

COREA DI HUNTINGTON

Le malattie da espansioni poliglutaminiche

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Correlazione tra eta’ di insorgenza e numero di ripetizioni

COREA DI HUNTINGTON: anticipazione

DIAGNOSI PREDITTIVA

PROBLEMI ETICI

PRINCIPI GENERALI

- Consenso Informato

- Scelta Informata

- Autonomia

- Confidenzialità

Diagnosi delle sindromi da espansionipoliglutaminiche con la PCR

Alleli normali

Alleli mutanti