lc-ms/ms klİnİk kİmya uygulamalari nelerdİr?katekolaminler ve metanefrinler … vs) doğumsal...

28
KLİNİK BİYOKİMYA UZMANLARI DERNEĞİ ULUSLARARASI KATILIMLI KONGRE VE LAB EXPO KÜTLE SPEKTROMETRESİ VE KLİNİK LABORATUVARLARDA KULLANIMI KURSU, İZMİR 16-20 EYLÜL 2014 LC-MS/MS KLİNİK KİMYA UYGULAMALARI NELERDİR? Dr. Erdim Sertoğlu

Upload: others

Post on 11-Jan-2020

24 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

KLİNİK BİYOKİMYA UZMANLARI DERNEĞİ ULUSLARARASI KATILIMLI KONGRE VE LAB EXPO

KÜTLE SPEKTROMETRESİ VE KLİNİK LABORATUVARLARDA KULLANIMI KURSU, İZMİR

16-20 EYLÜL 2014

LC-MS/MS KLİNİK KİMYA UYGULAMALARI NELERDİR?

Dr. Erdim Sertoğlu

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

http://www.impublications.com/mass-spectrometry-events http://www.globaleventslist.elsevier.com/events/2014/09/msacl-2014-eu-clinical-mass-spectrometry/

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Örnek-KAH

http://ltd.aruplab.com/Search/ApplyRefiner

Hastaların > %90’ı 21-hidroksilaz gene (CYP21A2) gen mutasyonu → 17-

hidroksiprogesteron ve androstenedion↑, kortizol↓

Nadir formları→ 3-β-hidroksisteroid dehidrogenaz ve 11-hidroksilaz eks

Serum veya plazmada 17-hidroksiprogesteron, androstenedion, pregnenolon,

17-hidroksipregnenolon, deoksikortizol ve deoksikortikosteron ölçümü→ RIA

LC-MS/MS→ Gold standart

Pregnenolone by LC-

MS/MS, Serum or Plasma

17-Hydroxypregnenolone

Quantitative by LC-

MS/MS, Serum or Plasma

Adrenal Steroid

Quantitative Panel by

HPLC-MS/MS, Serum or

Plasma

11-Deoxycortisol

Quantitative by HPLC-

MS/MS, Serum or Plasma

17-Hydroxyprogesterone

Quantitative by HPLC-

MS/MS, Serum or Plasma

Congenital Adrenal

Hyperplasia Treatment

Panel

Congenital Adrenal Hyperplasia Panel

11-Beta Hydroxylase

Deficiency

21-Hydroxylase Deficiency

Pregnenolone 17-Hydroxypregnenolone 11-Deoxycortisol 11-Deoxycortisol 17-Hydroxyprogesterone Testosterone Testosterone 17-Hydroxyprogesterone

17-Hydroxyprogesterone 17-Hydroxyprogesterone 11-Deoxycortisol 17-Hydroxypregnenolone

17-Hydroxypregnenolone Androstenedione 17-Hydroxyprogesterone Androstenedione

Pregnenolone Androstenedione Dehydroepiandrosterone

Dehydroepiandrosterone

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

http://ltd.aruplab.com/Search/ApplyRefiner

Mass Spectrometry (117) Toxicology (93) Therapeutic Drug Monitoring (50) Therapeutic Drug Management (49) Endocrinology (38) Drugs of Abuse (36) Pain Management (34) Steroids (27) Liver Disease (18) Metabolic Disorders (18) Hormones (12) Biochemical Genetics (11) Genetics (11) Oncology (11) Opiods (11) Meconium (10) Neonatal Drug Testing (10) Toxicology Screening (9) Chemistry (8) Benzodiazepines (6)

.

.

.

Drug Testing (28) Monitoring of Drugs (28) Opioids (18) Meconium Drug Screening (16) Newborn Drug Screening (16) Umbilical Cord Drug Screening (16) Amenorrhea (11) Congenital Adrenal Hyperplasia (8) Polycystic Ovarian Syndrome (8) Schizophrenia (8) Hypogonadism, Male (6) Immunosuppresive Drugs (6) Organ Transplantation (6) Infertility (5) Epilepsy (4) Seizure Disorders (4) Adrenal Hyperfunction (2) Adrenal Insufficiency (2) Cushing Syndrome (2) Hypopituitarism (2) Megaloblastic Anemia (2) Nicotine & Metabolites (2) Pheochromocytoma (2) Tumor Markers (2) Vitamins (2) IBD (1) Inflammatory Bowel Disease (1) RA (1) Rheumatoid Arthritis (1) TPMT (1) Thiopurine Methyltransferase Activity (1)

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Örnek-KAH

Dehydroepiandrosterone Testosterone,

Females or Children 17-Hydroxypregnenolone 17-Hydroxyprogesterone Androstenedione

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed(24.08.2014)

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

11,114 10,674 7,737 1,587

0

500

1000

1500

2000

2500

20042005

20062007

20082009

20102011

20122013

2014

16% 16%

12% 15% 15%

17%

20%

18%

19%

20%

21%

LC-MS/MS

LC-MS/MS + Clinical

(+) (-) Yüksek sensitivite Yüksek cihaz maliyeti

Yüksek spesifite Sınırlı örnek hacmi (verimlilik)

Immunoassay lere kıyasla yeni testlerin daha düşük

maliyetle ve daha hızlı geliştirilebilmesi

Yöntem geliştirme, validasyon, kullanım ve sorun giderme

için uzman personel ihtiyacını

Numune başına daha düşük maliyet (reaktifler açısından) Otomasyon uyumsuzluğu

Aynı numunedeki birden fazla analiti eşzamanlı ölçme

imkanı

Onaylanmış/geliştirilmiş kitlerin azlığı/yokluğu (Referans

metod yokluğu)

Çok yönlülük Analizin kompleksliği

Matrikse bağımlı olmaması (tükrük, BOS, idrar vb)

Otomasyona uyum?

Fırsatlar Engeller

Giderek MS teknolojinin daha da benimsenmesi (kit

üreticileri tarafından)

LC-MS/MS dışı yeni cihazların ve kitlerin geliştirilmesi ve

hızla rutine sokulmaları

Daha kullanıcı dostu araçlara doğru gelişim Gittikçe artan yetişmiş personel ihtiyacı

LC-MS/MS analizi için onaylanmış/geliştirilmiş kitlere olan

ilgi

Kit üreticilerinin ilgisi?

Peptidlerin ve proteinlerin kantitatif ölçümü Immünoassay'lerdeki yeniliklerle rekabet zorluğu

Birbiri ile ilişkili metabolitlerin analizi

van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;883-884:18-32.

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Yaygın Kullanılan Yöntemlerin Karşılaştırılması

Viette V, et al. Current role of liquid chromatography coupled to mass spectrometry in clinical toxicology screening methods. Clin Chem Lab Med. 2011;49(7):1091-103. Review. Wu AH, et al. Role of liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology. Clin Toxicol (Phila). 2012;50(8):733-42. Review.

Örnek Hazırlama Yöntemlerin Karşılaştırılması

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Örnek Çeşitliliği

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Kaynak Çeşitliliği

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Yetişkin insan serumundaki düşük molekül ağırlıklı biyobelirteçlerin dinamik ağırlıkları. MMA, metilmalonik asit; DHEA (-S), dehidroepiandrosteron (-sülfat); 25 (OH) D, 25-hidroksivitamin D; 17OHP, 17-hidroksiprogesteron; 11-DOC, 11-deoksikortizol; DHT, dihidrotestosteron; 1,25 (OH)2, 1.25-dihidroksivitamin D; T4, tiroksin; T3, triiodotironin; T, total; F, serbest; Lut, luteal; ♂, erkek; ♀, kadın

van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;883-884:18-32. Kushnir MM et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry applications in endocrinology. Mass Spectrom Rev. 2010;29(3):480-502.

Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı

Steroid ölçümleri (Endojen steroidler, vitamin D,

katekolaminler ve metanefrinler … vs)

Doğumsal Metabolizma Hastalıkları (amino asit bozuklukları,

yağ asitleri ve bozuklukları, organik asidüriler)

Toksikoloji analizleri

Teröpatik ilaç düzeyi analizleri

Safra asidi analizleri

Porfirialar

Karbonhidratlar

Fosfolipitler

Endokrinoloji Uygulamaları Steroid Hormon Metabolizması

Koal T, et al. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile-analysis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012;129(3-5):129-38.

Bir defada bir analit ölçümü

Özellikle düşük konsantrasyonlarda, düşük antikor spesifitesi

Sınırlı dinamik aralık=Sensitivite ↓

Matriks interferansları

Farklı immünolojik kitler=yüksek varyabilite (farklı referans

aralıklar)

Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler

Steroid hormonların analizinde immunoassay'lerin dezavantajları:

Fizyolojik ve patolojik hormon durumunu ayırt etmede →

Geniş steroid panellerinin eş zamanlı, hızlı ve güvenilir ölçümleri

ÇÖZÜM ???

Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler

Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler

Recovery

LLOQ = 0.01–32 ng/mL, ULOQ= 5–8000 ng/mL

Intra-day validation: <8.8%, Inter-day validation: <18.6%

A) Kortizol

B) Kortikosteron

C) 11-deoksikortizol

D) Androstenedion

E) Deoksikortikosteron

F) Testosteron

G) 17-OH progesteron

H) DHEA

I) Progesteron

Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler

Fanelli F, et al. Serum steroid profiling by isotopic dilution-liquid chromatography-mass spectrometry: comparison with current immunoassays and reference intervals in healthy adults. Steroids. 2011;76(3):244-53.

Primer hiperaldesteronizm →

Sekonder hipertansiyon

Tanı → Serum, plazma veya idrar

aldosteron ölçümü

GC-MS → Referans yöntem →

Rutin kullanımı?

Rutinde en yaygın → RIA →

standardizasyonu ve

harmonizasyonu?

Sonuç?

Endokrinoloji Uygulamaları 1) Primer Aldosteronizm

Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2):113-8.

A patient serum with 704 pmol/L aldosterone

60 pmol/L calibrator Linearity= 60–3000 pmol/L

LLOQ= 30 pmol/L

Recovery= 88 - 109%

Within run ve between-run

imprecision= <5.8% ve

<7.5%

LC-MS/MS aldosterone concentrations in normotensive subjects ranged from <69.4 to 635.2 pmol/L (<2.5 to 22.9 ng/dL)

Endokrinoloji Uygulamaları 2) Addison Hastalığı

Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2):113-8. Taylor PJ, et al. Measurement of aldosterone in human plasma by semiautomated HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Chem. 2009;55(6):1155-62.

After addition of aldosterone (69.4 pmol/L; 2.5 ng/dL)

Before

Sample collected midmorning from a seated

normotensive subject (147.0 pmol/L; 5.3 ng/dL)

Linearity= 69.4–5548.0 pmol/L (2.5–200 ng/dL)

LLOQ= 69.4 pmol/L (2.5 ng/dL), with inter- and

intraday recovery and imprecision of 91.4%–

94.5% and <9.5%

Tanı → 1) Hiperkortizolizmin

tespiti (plazma tükrük ve idrar

serbest kortizol, ACTH seviyesi)

2) LDDS

Immunoassay yöntemleri → (-)

GC-MS → LOD ~30 nmol/L (1

µg/dL) + derivatizasyon + ~ 45 dk

Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu

Turpeinen U, et al. Determination of cortisol in serum, saliva and urine. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2013 Dec;27(6):795-801. Turpeinen U, et al. Determination of salivary cortisol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Scand J Clin Lab Invest 2009;69:592–7.

Linearity = 0.5–20 nmol/L

Interassay CVs= 4.3–11%

LLOQ= 70 pmol/L

Recovery = 95–106%

The upper limit of the reference

range= 3.0 nmol/L

LDDS: Düşük doz deksametazon supresyon testi

Serumda, gece yarısı tükürükte ve 24 saatlik idrarda farklı yöntemlerle kortizol ölçümleri

NSC= Night-time Salivary Cortisol. aUrine quantity is expressed as nmol/24 h

Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu

1. Baid SK, et al. Radioimmunoassay and tandem mass spectrometry measurement of bedtime salivary cortisol levels: a comparison of assays to establish hypercortisolism. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:3102–7. 2. Gatti R, et al. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin Biochem. 2009 Aug;42(12):1205-17. 3. Inder WJ, et al. Measurement of salivary cortisol in 2012–laboratory techniques and clinical indications. Clin Endocrinol (Oxf) 2012;77:645–51.

The upper limit for late-night salivary cortisol using LC–MS/MS has varied between 2.7

and 3.0 nmol/L [3].

LC–MS/MS LLOD → 0.07–0.11 nmol/L [1] < Immunoassay LLOD → 0.4–5.8 nmol/L [2].

E2 → fertilite, oligo-amenore, menopoz, ovulasyon indüksiyonu

takibi, IVF hazırlığı

E2 ve E1 eş zamanlı ölçümü → seks-steroid metab. bozuklukları,

erkeklerde östrojen eks., ted. takibi, meme kanseri, erkek

osteoporozu…

İmmunoassayler yeterli mi?

Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen

Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen

Jaque J et al. Deficiencies in immunoassay methods used to monitor serum Estradiol levels during aromatase inhibitor treatment in postmenopausal breast cancer patients. Springerplus. 2013;2(1):5.

Percent agreement of E2 values obtained by the 6 different immunoassay

methods with the corresponding values measured by LC-MS/MS.

Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen

Ray JA, et al. Direct measurement of free estradiol in human serum by equilibrium dialysis–liquid chromatography–tandem mass spectrometry and reference intervals of free estradiol in women. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 1008–1014

- E2 LLOQ ve LOD → 0.5 ve 0.25 pg/mL (1.8 ve 0.9

pmol/L)

- E2 ULOL → 60 pg/mL (220.2 pmol/L)

-Recovery → % 88-98

-Within run ve between-run imprecision= <9.21%

ve <5.38%

Premenopozal kadınlarda ≤0.5 pg/mL; 1.8 pmol/L

Premenopozal kadınlarda referans aralıklar

0.5–2.4 pg/mL; 1.8–8.8 pmol/L

0.5–3.1 pg/mL; 1.8–11.4 pmol/L

0.5–2.6 pg/mL; 1.8–9.5 pmol/L

Testosteron replasmanı veya

anti-androjen ted. takibinde

Immünoassaylarin

doğruluğu? → <1.73 nmol/L

(<50 ng/dL)

Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron

Savolainen K, et al. High-throughput analysis of testosterone in serum samples by on-line solid phase extraction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem Lab Med. 2011;49(11):1845-8.

Within-run ve between-run=

<12.1% ve <4.3%

Total variation <10%

Linearity= 0.25-33.6 nmol/L

LLOD= 0.15 nmol/L

LLOQ= 0.25 nmol/L with a

coefficient of variation 12.1%.

Standard 5.0 nmol/L

Hasta= 6.7 nmol/L (MRM 289.2/97.1)

İnternal Standard dideuterated testosterone (291.1/98.7)

Serum referans aralık:

0.4–2.0 nmol/L

10–38 nmol/L

15 farklı immunoassay ve LC-MS/MS yönteminin karşılaştırılması

Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron

Mean F, et al. Study on the binding of dihydrotestosterone, testosterone and oestradiol with sex hormone binding globulin. Clin Chim Acta 1977; 80:171–180

Dolaşımdaki Testosteronun Dağılımı

Endokrinoloji Uygulamaları 6) Konjenital Adrenal Hiperplazi

Endokrinoloji Uygulamaları 7) Katekolaminler ve Metanefrinler

HPLC-EC LC-MS/MS

Lagerstedt SA, et al. Measurement of plasma free metanephrine and normetanephrine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for diagnosis of pheochromocytoma. Clin Chem. 2004;50(3):603-11.

Inter-assay imprecision → NMN <13% ve MN <9.8% NMN ve MN recovery → 100% ve 96% Linearite → 0.20-10.0 nmol/L