lc-ms/ms klİnİk kİmya uygulamalari...
TRANSCRIPT
KLİNİK BİYOKİMYA UZMANLARI DERNEĞİ ULUSLARARASI KATILIMLI KONGRE VE LAB EXPO
KÜTLE SPEKTROMETRESİ VE KLİNİK LABORATUVARLARDA KULLANIMI KURSU, İZMİR
16-20 EYLÜL 2014
LC-MS/MS KLİNİK KİMYA UYGULAMALARI NELERDİR?
Dr. Erdim Sertoğlu
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
http://www.impublications.com/mass-spectrometry-events http://www.globaleventslist.elsevier.com/events/2014/09/msacl-2014-eu-clinical-mass-spectrometry/
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Örnek-KAH
http://ltd.aruplab.com/Search/ApplyRefiner
Hastaların > %90’ı 21-hidroksilaz gene (CYP21A2) gen mutasyonu → 17-
hidroksiprogesteron ve androstenedion↑, kortizol↓
Nadir formları→ 3-β-hidroksisteroid dehidrogenaz ve 11-hidroksilaz eks
Serum veya plazmada 17-hidroksiprogesteron, androstenedion, pregnenolon,
17-hidroksipregnenolon, deoksikortizol ve deoksikortikosteron ölçümü→ RIA
LC-MS/MS→ Gold standart
Pregnenolone by LC-
MS/MS, Serum or Plasma
17-Hydroxypregnenolone
Quantitative by LC-
MS/MS, Serum or Plasma
Adrenal Steroid
Quantitative Panel by
HPLC-MS/MS, Serum or
Plasma
11-Deoxycortisol
Quantitative by HPLC-
MS/MS, Serum or Plasma
17-Hydroxyprogesterone
Quantitative by HPLC-
MS/MS, Serum or Plasma
Congenital Adrenal
Hyperplasia Treatment
Panel
Congenital Adrenal Hyperplasia Panel
11-Beta Hydroxylase
Deficiency
21-Hydroxylase Deficiency
Pregnenolone 17-Hydroxypregnenolone 11-Deoxycortisol 11-Deoxycortisol 17-Hydroxyprogesterone Testosterone Testosterone 17-Hydroxyprogesterone
17-Hydroxyprogesterone 17-Hydroxyprogesterone 11-Deoxycortisol 17-Hydroxypregnenolone
17-Hydroxypregnenolone Androstenedione 17-Hydroxyprogesterone Androstenedione
Pregnenolone Androstenedione Dehydroepiandrosterone
Dehydroepiandrosterone
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
http://ltd.aruplab.com/Search/ApplyRefiner
Mass Spectrometry (117) Toxicology (93) Therapeutic Drug Monitoring (50) Therapeutic Drug Management (49) Endocrinology (38) Drugs of Abuse (36) Pain Management (34) Steroids (27) Liver Disease (18) Metabolic Disorders (18) Hormones (12) Biochemical Genetics (11) Genetics (11) Oncology (11) Opiods (11) Meconium (10) Neonatal Drug Testing (10) Toxicology Screening (9) Chemistry (8) Benzodiazepines (6)
.
.
.
Drug Testing (28) Monitoring of Drugs (28) Opioids (18) Meconium Drug Screening (16) Newborn Drug Screening (16) Umbilical Cord Drug Screening (16) Amenorrhea (11) Congenital Adrenal Hyperplasia (8) Polycystic Ovarian Syndrome (8) Schizophrenia (8) Hypogonadism, Male (6) Immunosuppresive Drugs (6) Organ Transplantation (6) Infertility (5) Epilepsy (4) Seizure Disorders (4) Adrenal Hyperfunction (2) Adrenal Insufficiency (2) Cushing Syndrome (2) Hypopituitarism (2) Megaloblastic Anemia (2) Nicotine & Metabolites (2) Pheochromocytoma (2) Tumor Markers (2) Vitamins (2) IBD (1) Inflammatory Bowel Disease (1) RA (1) Rheumatoid Arthritis (1) TPMT (1) Thiopurine Methyltransferase Activity (1)
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Örnek-KAH
Dehydroepiandrosterone Testosterone,
Females or Children 17-Hydroxypregnenolone 17-Hydroxyprogesterone Androstenedione
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed(24.08.2014)
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
11,114 10,674 7,737 1,587
0
500
1000
1500
2000
2500
20042005
20062007
20082009
20102011
20122013
2014
16% 16%
12% 15% 15%
17%
20%
18%
19%
20%
21%
LC-MS/MS
LC-MS/MS + Clinical
(+) (-) Yüksek sensitivite Yüksek cihaz maliyeti
Yüksek spesifite Sınırlı örnek hacmi (verimlilik)
Immunoassay lere kıyasla yeni testlerin daha düşük
maliyetle ve daha hızlı geliştirilebilmesi
Yöntem geliştirme, validasyon, kullanım ve sorun giderme
için uzman personel ihtiyacını
Numune başına daha düşük maliyet (reaktifler açısından) Otomasyon uyumsuzluğu
Aynı numunedeki birden fazla analiti eşzamanlı ölçme
imkanı
Onaylanmış/geliştirilmiş kitlerin azlığı/yokluğu (Referans
metod yokluğu)
Çok yönlülük Analizin kompleksliği
Matrikse bağımlı olmaması (tükrük, BOS, idrar vb)
Otomasyona uyum?
Fırsatlar Engeller
Giderek MS teknolojinin daha da benimsenmesi (kit
üreticileri tarafından)
LC-MS/MS dışı yeni cihazların ve kitlerin geliştirilmesi ve
hızla rutine sokulmaları
Daha kullanıcı dostu araçlara doğru gelişim Gittikçe artan yetişmiş personel ihtiyacı
LC-MS/MS analizi için onaylanmış/geliştirilmiş kitlere olan
ilgi
Kit üreticilerinin ilgisi?
Peptidlerin ve proteinlerin kantitatif ölçümü Immünoassay'lerdeki yeniliklerle rekabet zorluğu
Birbiri ile ilişkili metabolitlerin analizi
van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;883-884:18-32.
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Yaygın Kullanılan Yöntemlerin Karşılaştırılması
Viette V, et al. Current role of liquid chromatography coupled to mass spectrometry in clinical toxicology screening methods. Clin Chem Lab Med. 2011;49(7):1091-103. Review. Wu AH, et al. Role of liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology. Clin Toxicol (Phila). 2012;50(8):733-42. Review.
Örnek Hazırlama Yöntemlerin Karşılaştırılması
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Yetişkin insan serumundaki düşük molekül ağırlıklı biyobelirteçlerin dinamik ağırlıkları. MMA, metilmalonik asit; DHEA (-S), dehidroepiandrosteron (-sülfat); 25 (OH) D, 25-hidroksivitamin D; 17OHP, 17-hidroksiprogesteron; 11-DOC, 11-deoksikortizol; DHT, dihidrotestosteron; 1,25 (OH)2, 1.25-dihidroksivitamin D; T4, tiroksin; T3, triiodotironin; T, total; F, serbest; Lut, luteal; ♂, erkek; ♀, kadın
van den Ouweland JM et al. The role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;883-884:18-32. Kushnir MM et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry applications in endocrinology. Mass Spectrom Rev. 2010;29(3):480-502.
Klinik ve Araştırma Laboratuarında LC-MS/MS Kullanımı
Steroid ölçümleri (Endojen steroidler, vitamin D,
katekolaminler ve metanefrinler … vs)
Doğumsal Metabolizma Hastalıkları (amino asit bozuklukları,
yağ asitleri ve bozuklukları, organik asidüriler)
Toksikoloji analizleri
Teröpatik ilaç düzeyi analizleri
Safra asidi analizleri
Porfirialar
Karbonhidratlar
Fosfolipitler
Endokrinoloji Uygulamaları Steroid Hormon Metabolizması
Koal T, et al. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile-analysis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012;129(3-5):129-38.
Bir defada bir analit ölçümü
Özellikle düşük konsantrasyonlarda, düşük antikor spesifitesi
Sınırlı dinamik aralık=Sensitivite ↓
Matriks interferansları
Farklı immünolojik kitler=yüksek varyabilite (farklı referans
aralıklar)
Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler
Steroid hormonların analizinde immunoassay'lerin dezavantajları:
Fizyolojik ve patolojik hormon durumunu ayırt etmede →
Geniş steroid panellerinin eş zamanlı, hızlı ve güvenilir ölçümleri
ÇÖZÜM ???
Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler
Recovery
LLOQ = 0.01–32 ng/mL, ULOQ= 5–8000 ng/mL
Intra-day validation: <8.8%, Inter-day validation: <18.6%
A) Kortizol
B) Kortikosteron
C) 11-deoksikortizol
D) Androstenedion
E) Deoksikortikosteron
F) Testosteron
G) 17-OH progesteron
H) DHEA
I) Progesteron
Endokrinoloji Uygulamaları Steroidler
Fanelli F, et al. Serum steroid profiling by isotopic dilution-liquid chromatography-mass spectrometry: comparison with current immunoassays and reference intervals in healthy adults. Steroids. 2011;76(3):244-53.
Primer hiperaldesteronizm →
Sekonder hipertansiyon
Tanı → Serum, plazma veya idrar
aldosteron ölçümü
GC-MS → Referans yöntem →
Rutin kullanımı?
Rutinde en yaygın → RIA →
standardizasyonu ve
harmonizasyonu?
Sonuç?
Endokrinoloji Uygulamaları 1) Primer Aldosteronizm
Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2):113-8.
A patient serum with 704 pmol/L aldosterone
60 pmol/L calibrator Linearity= 60–3000 pmol/L
LLOQ= 30 pmol/L
Recovery= 88 - 109%
Within run ve between-run
imprecision= <5.8% ve
<7.5%
LC-MS/MS aldosterone concentrations in normotensive subjects ranged from <69.4 to 635.2 pmol/L (<2.5 to 22.9 ng/dL)
Endokrinoloji Uygulamaları 2) Addison Hastalığı
Turpeinen U, et al. Determination of aldosterone in serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008;862(1-2):113-8. Taylor PJ, et al. Measurement of aldosterone in human plasma by semiautomated HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Chem. 2009;55(6):1155-62.
After addition of aldosterone (69.4 pmol/L; 2.5 ng/dL)
Before
Sample collected midmorning from a seated
normotensive subject (147.0 pmol/L; 5.3 ng/dL)
Linearity= 69.4–5548.0 pmol/L (2.5–200 ng/dL)
LLOQ= 69.4 pmol/L (2.5 ng/dL), with inter- and
intraday recovery and imprecision of 91.4%–
94.5% and <9.5%
Tanı → 1) Hiperkortizolizmin
tespiti (plazma tükrük ve idrar
serbest kortizol, ACTH seviyesi)
2) LDDS
Immunoassay yöntemleri → (-)
GC-MS → LOD ~30 nmol/L (1
µg/dL) + derivatizasyon + ~ 45 dk
Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu
Turpeinen U, et al. Determination of cortisol in serum, saliva and urine. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2013 Dec;27(6):795-801. Turpeinen U, et al. Determination of salivary cortisol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Scand J Clin Lab Invest 2009;69:592–7.
Linearity = 0.5–20 nmol/L
Interassay CVs= 4.3–11%
LLOQ= 70 pmol/L
Recovery = 95–106%
The upper limit of the reference
range= 3.0 nmol/L
LDDS: Düşük doz deksametazon supresyon testi
Serumda, gece yarısı tükürükte ve 24 saatlik idrarda farklı yöntemlerle kortizol ölçümleri
NSC= Night-time Salivary Cortisol. aUrine quantity is expressed as nmol/24 h
Endokrinoloji Uygulamaları 3) Cushing Sendromu
1. Baid SK, et al. Radioimmunoassay and tandem mass spectrometry measurement of bedtime salivary cortisol levels: a comparison of assays to establish hypercortisolism. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:3102–7. 2. Gatti R, et al. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin Biochem. 2009 Aug;42(12):1205-17. 3. Inder WJ, et al. Measurement of salivary cortisol in 2012–laboratory techniques and clinical indications. Clin Endocrinol (Oxf) 2012;77:645–51.
The upper limit for late-night salivary cortisol using LC–MS/MS has varied between 2.7
and 3.0 nmol/L [3].
LC–MS/MS LLOD → 0.07–0.11 nmol/L [1] < Immunoassay LLOD → 0.4–5.8 nmol/L [2].
E2 → fertilite, oligo-amenore, menopoz, ovulasyon indüksiyonu
takibi, IVF hazırlığı
E2 ve E1 eş zamanlı ölçümü → seks-steroid metab. bozuklukları,
erkeklerde östrojen eks., ted. takibi, meme kanseri, erkek
osteoporozu…
İmmunoassayler yeterli mi?
Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen
Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen
Jaque J et al. Deficiencies in immunoassay methods used to monitor serum Estradiol levels during aromatase inhibitor treatment in postmenopausal breast cancer patients. Springerplus. 2013;2(1):5.
Percent agreement of E2 values obtained by the 6 different immunoassay
methods with the corresponding values measured by LC-MS/MS.
Endokrinoloji Uygulamaları 4) Seks Steroidleri-Östrojen
Ray JA, et al. Direct measurement of free estradiol in human serum by equilibrium dialysis–liquid chromatography–tandem mass spectrometry and reference intervals of free estradiol in women. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 1008–1014
- E2 LLOQ ve LOD → 0.5 ve 0.25 pg/mL (1.8 ve 0.9
pmol/L)
- E2 ULOL → 60 pg/mL (220.2 pmol/L)
-Recovery → % 88-98
-Within run ve between-run imprecision= <9.21%
ve <5.38%
Premenopozal kadınlarda ≤0.5 pg/mL; 1.8 pmol/L
Premenopozal kadınlarda referans aralıklar
0.5–2.4 pg/mL; 1.8–8.8 pmol/L
0.5–3.1 pg/mL; 1.8–11.4 pmol/L
0.5–2.6 pg/mL; 1.8–9.5 pmol/L
Testosteron replasmanı veya
anti-androjen ted. takibinde
Immünoassaylarin
doğruluğu? → <1.73 nmol/L
(<50 ng/dL)
Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron
Savolainen K, et al. High-throughput analysis of testosterone in serum samples by on-line solid phase extraction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem Lab Med. 2011;49(11):1845-8.
Within-run ve between-run=
<12.1% ve <4.3%
Total variation <10%
Linearity= 0.25-33.6 nmol/L
LLOD= 0.15 nmol/L
LLOQ= 0.25 nmol/L with a
coefficient of variation 12.1%.
Standard 5.0 nmol/L
Hasta= 6.7 nmol/L (MRM 289.2/97.1)
İnternal Standard dideuterated testosterone (291.1/98.7)
Serum referans aralık:
0.4–2.0 nmol/L
10–38 nmol/L
15 farklı immunoassay ve LC-MS/MS yönteminin karşılaştırılması
Endokrinoloji Uygulamaları 5) Seks Steroidleri-Testosteron
Mean F, et al. Study on the binding of dihydrotestosterone, testosterone and oestradiol with sex hormone binding globulin. Clin Chim Acta 1977; 80:171–180
Dolaşımdaki Testosteronun Dağılımı
Endokrinoloji Uygulamaları 7) Katekolaminler ve Metanefrinler
HPLC-EC LC-MS/MS
Lagerstedt SA, et al. Measurement of plasma free metanephrine and normetanephrine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for diagnosis of pheochromocytoma. Clin Chem. 2004;50(3):603-11.
Inter-assay imprecision → NMN <13% ve MN <9.8% NMN ve MN recovery → 100% ve 96% Linearite → 0.20-10.0 nmol/L