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LAS LEVADURAS DELLAS LEVADURAS DEL TERROIR

Dra. Laura MERCADOLaboratorio de MICROBIOLOGÍALaboratorio de MICROBIOLOGÍACentro de Estudios de Enología

Estación Experimental Agropecuaria Mendoza-INTAEstación Experimental Agropecuaria Mendoza-INTA

INTRODUCCIÓN

Saccharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN

LEVADURAS:

h i l l R i F iModelo de estudio

hongos unicelulares - Reino Fungi


INTRODUCCIÓN

LEVADURAS:

h i l l R i F i

MODELO de estudio

P i i i dhongos unicelulares - Reino Fungi Primer eucariota secuenciado


BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA:

Producción alimentos y bebidas

VINO

VINO f t ió t d

INTRODUCCIÓN

VINO: fermentación mosto de uva Fermentación

alcohólicaalcohólica

C6H12O6 → 2 CO2 + 2 CH3CH2OH

NICHO ECOLÓGICO Fermentación inoculada

Saccharomyces Fermentación espontánea

INTRODUCCIÓN

Fermentación inoculada Adición inóculo (LSA)

Fermentación espontánea “Flora nativa”

Origen:g

• UVA

• BODEGA

INTRODUCCIÓN

MENDOZA Principal provincia productora de vid y vinoMENDOZA Principal provincia productora de vid y vino

ECOSISTEMAECOSISTEMA

LEVADURAS (biota)

Catania y col. (2007). MALBEC

¿Interrogantes….?INTRODUCCIÓN

Falta de información procesos microbiológicos:• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por

i i t l t bié t ib i imicroorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?,

• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo ¿ g qde las fermentaciones, incluso en años sucesivos?,

• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarseen la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?

•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica y cuál es

en la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?

una determinada región geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?•¿Existen levaduras propias de una zona iti i í l d t i d T i ?vitivinícola determinada o Terroir?,

•¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?

OBJETIVO GENERALConocer la diversidad poblacional de cepas de Saccharomyces cerevisiae

b d i d l ió i í l Z Al d l Rípresentes en bodegas, uvas y vinos de la región vitícola Zona Alta del Río Mendoza.

PARTE 1

O i d l l d bl

PARTE 2

BIODIVERSIDAD DE SaccharomycesOrigen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos.

BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”Mendoza

PARTE 1

Origen de las levaduras responsables de la fermentación g pespontánea de los mostos

OBJETIVOSHIPOTESIS OBJETIVOS-Conocer la distribución de cepas de Saccharomyces cerevisiae sobre equipamientos de una bodega

población de levaduras

HIPOTESIS

equipamientos de una bodega.Saccharomyces cerevisiae.

PERMANENCIA

- Determinar la contribución a la fermentación espontánea de cepas de S. cerevisiae aisladas desde

i i t d b dPARTICIPACION DE FERMENTACIÓN

equipamientos de una bodega

- Evaluar el grado de relación genética entre las cepas de S. cerevisiae aisladas desde equipamientos de bodega y

FERMENTACIÓN

RELACIÓN É fermentación, y su relación a cultivos

comerciales.GENÉTICA

PARTE 1 Origen de las levaduras responsables de la fermentación espontánea de los mostos

MATERIALES Y MÉTODOS

MUESTRAS

2 etapas

IDENTIFICACIÓN

Saccharomyces

AISLAMIENTOEQUIPOS BODEGA

2 etapas

-AV

DV

ycerevisiaeAEM + RB

WL-DV

A i

SelMedUVA

Arrivo a bodega Recuentos

AislamientosCARACTERIZACIÓN

Fermentación espontánea

Conservación FERMENTACIÓN

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

PCR interdeltap

3 etapasRFLP ADNmit

“CEPAS”

Patrones de PCR interdelta (arriba) y RFLP ADNmit (abajo) obtenidos paraS h i i i l d d i d b d iñ d Saccharomyces cerevisiae aislados de equipos de bodega, viñedos y fermentaciones espontáneas


RESULTADOS POBLACIONES TOTALESRESULTADOS POBLACIONES TOTALES

-Equipos población levaduras

-Población residente

-Incremento durante vendimia

Equipamientos de Número de levaduras totales (Log ufc/cm2 ± SD)

Temporada 2001 Temporada 2002q pbodega

p pAntes de vendimia

Durante vendimia

Antes de vendimia

Durante vendimia

Lagar 0.7 ± 0.1 6.7 ± 5.7 1.9 ± 1.0 5.7 ± 5.1 Moledora 2.7 ± 2.1 4.7 ± 4.1 2.0 ± 1.3 4.4 ± 4.2 Caño de traslado 4.8 ± 3.9 4.3 ± 3.7 4.0 ± 3.9 nmCaño de llenado nm 3.7 ± 3.2 1.7 ± 1.3 nmTanque (interior) 2.2 ± 1.6 2.3 ± 1.3 < 1 3.0 ± 2.9 Tanque 2.1 ± 1.3 4.2 ± 3.7 < 1 5.1 ± 4.6

PARTE 1

Resultados S. cerevisiae - diferenciación intraespecífica


2002ANTES VENDIMIA DURANTE VENDIMIA FERMENTACIÓN

PatrónLagar Moledora Caño

trasladoCaño

llenado ACaño

llenado B Lagar Moledora Tanque interior

Tanque salidas

Uva Mosto Principio Medio Final

I02 18.75II02 42.8 7.14 5III02 8.33IV 8 33 5 5IV02 8.33 5.5V02 20 21.4 5VI 02 12.5 14.3VII 02 20VIII02 5

XLII 12.5 7.14 5.5 10XLIII 5XLIII 5LII 5LV 33LVI 5.5 7.7LXIV 14.3 11 15.4 5LXV 5LXVII 20

Cepas perennes

LXVIII 7.7LXIX 7.7LXX 7.7LXXII 8.33 5LXXIII 8.33LXXIV 7.14 7.7

Patrones únicos

LXXV 5.5LXXVI 7.14LXXIX 7.14 23.1 7.7LXXX 5.5 7.7LXXXI 7.7LXXII 7.7LXXXIV 67

Diferente diversidad en cada equipo y etapa

LXXXIV 67LXXXV 20LXXXVI 20LXXXVIII 11 7.7 10LXXXIX 15.4 7.7XCI 23.1 5XCIII 5

Participación en fermentación Cepas comerciales (13)

Perfiles únicos*XCVI 5XCVIII 5IX02 5.5 20C 8.33 5.5 15.4CI 10CII 5

coincidencias


• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por• ¿Las fermentaciones vínicas son llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos presentes en la uva, o también contribuyen microorganismos presentes en las superficies del equipamiento de la bodega?

ÁFERMENTACIONES ESPONTÁNEAS EN BODEGA:Muy polimórficas

ió d dif t S i i P

NO hallaron cepas de uva (límites de muestreo y aislamiento)30 % 60% l fi l d lsucesión de diferentes cepas S. cerevisiae. Pocos

patrones en más de una etapa de la fermentación. incremento en la diversidad a lo largo del proceso

30 % y 60% al final de la fermentación: origen bodega

• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?sucesivos?

• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en la bodega y participar en otrasla bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?



• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años sucesivos?

•Población de S. cerevisiae residentescarácter dinámico: fluctuando año a año y a lo largo de la temporadacepas estables a lo largo de la temporada y en años consecutivoscepas estables, a lo largo de la temporada y en años consecutivos. 30 - 60% cepas al final de la fermentación

• población de levaduras de bodega fue diversa y numéricamente importante : sólo algunas de estas cepas participaron en la p g p p pfermentación.

• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en la bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?



• ¿Existe en la bodega una biota de levaduras residente que actúa como inóculo de las fermentaciones, incluso en años

i ?sucesivos?

• Si se inoculan los mostos con levaduras comerciales ¿pueden éstas instalarse en co e c a es ¿puede és as s a a se ela bodega y participar en otras fermentaciones no inoculadas?

Cepas comerciales:

•No parte de biota “perenne”•No parte de biota perenne

•Coincidencias cepas fermentación y bodega

RESULTADOS


f f ?

INTERROGANTE

• ¿la no-identidad significa que son totalmente diferentes?• ¿hay algún tipo de relación entre ellas?

C ál l d d l ió l i l• ¿Cuál es el grado de relación con las cepas comerciales que masivamente se han utilizado desde hace aproximadamente 25 años en nuestra zona?p

ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES

ESTUDIO DE RELACIONES MOLECULARES

PCR

Diferente agrupamiento por marcador

Tres clusters fueroninterdelta

SSR

Tres clusters fueron conservados (cepas bodega)

SSR

RFLP ADNmit

cepas comerciales mayoría separó, cierta relación cepas fermentación

PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”

HIPOTESIS POBLACIÓN de S cerevisiae

OBJETIVOS

S. cerevisiaepropia y característica.

-Caracterizar las poblaciones de S.

cerevisiae en los viñedos ubicados

en la región vitícola Zona Alta del Río

Mendoza (ZARM).

-Determinar la contribución de las

cepas de S. cerevisiae de viñedos a PERMANENCIAla población levuriana responsable de

la fermentación espontánea de los

t di i i d t i l

PARTICIPACION DE FERMENTACIÓN mostos en condiciones industriales.

-Evaluar el grado de relación

FERMENTACIÓN

RELACIÓN É genética entre estas poblaciones y

en relación con su origen geográfico.

GENÉTICA

PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE Saccharomyces cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”


8 viñedos -6 Bodegas

Bodega N: viñedos NL y NPC: viñedos CB y CR

VIÑEDO

PanquehuaC: viñedos CB y CRT: viñedo TS: viñedo SI: viñedo ID

800

9001000 MaipúCarrodilla

CZ: viñedo CZ

1000 p

Luján

Barrancas

Carrodilla

Vistalba NL

CR

TID

FERMENTACIONES Barrancas

PerdrielCB

NPINDUSTRIALES

Agrelos

PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae NATIVAS EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”


VIÑEDO

10 sectores autoenriquecimiento

aislamientoFERMENTACIONES

Identificación1 tanque (cada 3 etapas

FERMENTACIONES INDUSTRIALES

Caracterización molecular

1 tanque (cada parcela)

3 etapas


RESULTADOSCB

CR

ab

b

Nº levaduras uva de cada viñedo fue muy diferente

Viñe

do

CR

CZ

ID

NL

b

b

c

b

POBLACIÓN

diferente NP

S

T

0 1 2 3 4 5 6

a

c

b

6

POBLACIÓN TOTAL DE LEVADURAS

log ufc/mL

distribución no homogénea dentro de los mismos

ufc/

mL

3

4

5

Log

u

0

1

2

3

Viñedo

CB CR CZ ID NL NP S T0

PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN VITÍCOLA “Zona Alta del Río Mendoza”

RESULTADOS

10

11

12

6

7

8

9

atro

nes

S cerevisiae 2

3

4

5nº p

a

S. cerevisiae

1020 aislados 0

1

P L T CB CR CZ S ID

DISTRIBUCIÓN NO HOMOGÉNEA:

-nº diferente cada sector,

Caracterización:

-PCR Interdelta

-1 a 12 patrones en cada sitio

-4 viñedos no S. cerevisiae en algún punto

DIFERENTE DIVERSIDAD 9 h t 36 t dif t

-RFLP ADNmit

Patrón: combinación -DIFERENTE DIVERSIDAD: 9 hasta 36 patrones diferentes por viñedo

DOS TIPOS: Alto / Bajo polimorfismo

Patrón: combinación patrones amplificación + restricción


RESULTADOS Sector del viñedo

P t ó 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

viñedoTRESULTADOS

S. cerevisiae

Patrón 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 75 2 25 3 7,14 4 7,14 5 7 14

VIÑEDOS DE ALTO POLIMORFISMO

5 7,146 14,3 7 7,14 8 7,14 9 7,14 25,3 75

10 7 14

•distintas poblaciones de S cerevisiae

• 6 viñedos (CR, L, P, ID, CZ y T) población muy variada: + 20 patrones.

10 7,1411 7,14 12 14,3 7,14 13 7,14 14 7,14 15 7,14 14,3 •distintas poblaciones de S. cerevisiae

cada viñedo

• una distribución irregular

16 21,43 8,3 50 17 21,43 25 37,5 NS1 18 21,43 19 8,3 37,5 20 8,3 21 8 3

g• Sitios + o - polimorficos

Algunos patrones más distribuidos

21 8,322 16,6 23 8,3 24 16,6 25 12,5 26 50

90 % patrones únicos: sólo presentes en un único sector en toda la región evaluada

26 5027 12,5 28 12,5 29 25 30 25 31 12,5 32 12,5 33 12,5 34 33,3 35 66,7 36 7,14

Participación en fermentación


RESULTADOS S. cerevisiae

VIÑEDOS DE BAJO POLIMORFISMO

Punto de muestreo en viñedo

drástica disminución en la biodiversidad

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Patrón1 Viñedo S

1 49,9

2

16,7 100

3 16,7 100 61,5 85,7 60

•drástica disminución en la biodiversidad → 10 y 9 patrones

4 23,1 NS1 16,76 NS1 NS1

5

7,7

6 16,7 7,7

7 14,3

8

33 34

• sectores no aisló S.cerevisiae

•Algunos patrones estuvieron muy distribuidos

8 33,34

9

33,3 20

11

16,76 20

Punto de muestreo en viñedo

•Presencia diferentes sectores

•Población única por sector

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Patrón Viñedo CB

1

100 80

2

55,6 100 100 100

3

11,1

•presencia de cepas comerciales

4 11,1 NS1 NS1 1

5

22,2

6

42,9

7

57,1

8

208 20

9

100

• próximos a bodega


S

RESULTADOS S. cerevisiae

VIÑEDOS BAJO POLIMORFISMO

CB

C S

S

BAJO POLIMORFISMO

Transferencia de cepas de Sbodega a viñedos:

disminuyen la biodiversidad

EfluentesAlmacenamiento de orujos fuera de la bodega A d i ( i )Agua de riego (acequias)Abono con orujosVectores: moscas - vientos


S

RESULTADOS

CB

C S

S

Transferencia de cepas de bodega a viñedos: afecta la biodiversidad Safecta la biodiversidad

P bl ió i d ióPoblación propia de región:

Viñedos cercanos CZNL

RESULTADOS

Viñedo Patrón P M F 13 5 9

FERMENTACIONES 13 5,9

20 33 26 33 27 33 28 11

C O SINDUSTRIALES

poblaciones diferentes en su mayoría carácter altamente polimórfico y variable

29 22 17,5 30 11 31 11 32 11

NL 33 34 11 75p y

5 a 21 patrones en cada una de ellas.

En cada etapa: 1 a 13 patrones diferentes.

NL 33 34 11,75 34 5,9 35c 5,9 36 5,9 37 5,9

sustitución de poblaciones

dinámica diferente en cada fermentación

38 5,9 39 11,75 40 5,9 41 5,9 42 5,9

no predominios: fermentaciones múltiples cepas

, 43 5,9 3 20 71,4 37,5 9b 60 14,3 12,5

S 10 20 14,3 12,5 11 25

La participación de las cepas del viñedo: escasa .

11 25 12 12,5

Presencia cepas comerciales: transferencia bodega Relaciones

moleculares

PARTE 2 BIODIVERSIDAD DE S. cerevisiae EN LA REGIÓN “Zona Alta del Río Mendoza”

RESULTADOS PCR

RELACIONES

interdelta

MOLECULARES

Agrupan diferente de acuerdo al marcador

RFLP ADNmit

RELACIONES COMPLEJAS


RESULTADOS RELACIONES MOLECULARES

Agrupan diferente 1-4 clusters mantienen: =

sector o contiguo)

La mayor relación genética entre aislados de un

mismo sector o sectores contiguos de un mismo

viñedo.

Clusters viñedo/fermentación

Mayoría clusters combinados

Cepa de viñedo en fermentación: asocian a

viñedo o fermentación

Cepa comercial: separada /no

Se observó una estrecha relación molecular con

aisladas de viñedo y/o fermentación.


RESULTADOS

RELACIONES MOLECULARES

Población de POBLACIONES MUY RELACIONADAS la ZARM

¿Interrogantes….?•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada regiónCuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?

Los viñedos de la ZARM presentaron diferentes poblaciones de S. cerevisiae, tanto en número como en diversidad de patrones aislados, evidenciándose la existencia de viñedos de alto y bajo polimorfismoDentro de un mismo viñedo se observó una distribución muy heterogénea de l d

•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,

levaduras

N d id i l i t i dNo pudo evidenciarse la existencia de cepas distribuidas representativas de la región vitivinícola estudiada

Sólo población común a nivel área más pequeña

Población de MUCHAS cepas diferentes estrechamente relacionadasestrechamente relacionadas

¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad decolonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?

¿Interrogantes….?•Cuál es la biodiversidad de las levaduras de una determinada región geográfica c ál es la relación con s origen geográfico?geográfica y cuál es la relación con su origen geográfico?

•¿Existen levaduras propias de una zona vitivinícola determinada o Terroir?,

•¿Pueden las levaduras comerciales colonizar el viñedo y afectar la diversidad de levaduras nativas?

En general se evidenció una escasa presencia de levaduras comerciales en los viñedos, las cuales fueron más frecuentes en las fermentacionesfueron más frecuentes en las fermentaciones espontáneas conducidas en bodega.

Se evidenció una drástica disminución de la diversidad de levaduras en viñedos ubicados muy próximos a bodegas y una elevada y distribuida presencia de cepas comerciales en los mismos.p p

CONCLUSIONES

Las superficies de la bodega

albergan una población de S. cerevisiae tanto antes del inicio de las actividades de la temporada de vendimia como durante el transcurso de la misma y en temporadas consecutivas.

muestra una amplia diversidad y un comportamiento dinámico.

estas levaduras de bodega participan en las fermentaciones, siendo la contribución dependiente de las condiciones del mosto

CONCLUSIONES

Los viñedos de la ZARM presentan una población de S. cerevisiae muy polimórfica y p p y p y

aleatoriamente distribuida dentro de cada viñedo.

Cada viñedo alberga una población de S. cerevisiae única, sin

di t ib ió bi d t d t ió ló iuna distribución ubicua dentro de esta región agroecológica.

Los viñedos muy próximos a bodegas presentan una reducción

en la diversidad de las cepas de S. cerevisiae encontradas y

presencia de levaduras comerciales.

CONCLUSIONES

Las fermentaciones espontáneas conducidas en bodega se

d ll ú i bl d di á i ddesarrollan con un número variable de cepas y una dinámica de

sustitución de las mismas a lo largo de todo el proceso.

Sól l d l iñ d ti i d lSólo algunas cepas del viñedo participaron del proceso

fermentativo en diferentes proporciones.

Las poblaciones de S. cerevisiae presentes en cada viñedo

mostraron una estrecha relación genética.

Carrera de Doctorado en Ciencias Biológicas PROBIOLUniversidad Nacional de Cuyo

2009

Biodiversidad deBiodiversidad de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae en viñedos yen viñedos yBiodiversidad de Biodiversidad de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae en viñedos y en viñedos y bodegas de la región vitícola “Zona Alta del Río bodegas de la región vitícola “Zona Alta del Río

Mendoza”Mendoza”

Doctorando: Lic Laura Analía Mercado

MendozaMendoza

Doctorando: Lic. Laura Analía Mercado

Director: Dra. Mariana Combina

Co-Director: Dr. Ricardo W. MasuelliCo Director: Dr. Ricardo W. Masuelli

[email protected]

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