Christophe Depierre u x*, EmmanuelP é*, Agnès Paquet*, Olivier R a i m o n d* e tT h i e r ry Leclipteux*

* Coris BioConcept, rue Marcel Lecomte 199, 5100Namur (Wépion), Belgique http://www. c o r i s b i o . c o m

I n t ro d u c t i o nChez les immunocompétents, la cryptosporidiose

est responsable de 5 % des diarrhées dans les payschauds en voie de développement. Dans les régionstempérées, environ 2 % des diarrhées résultent de cettepathologie. Le parasite responsable de cette pathologieest le C ry p t o s p o r i d i u m p a rv u m, protozoaire présentdans les voies gastro-intestinales (O’Donoghue, 1995).Ce dernier, reconnu comme étant un pathogèneentérique extrêmement infectieux, se transmetessentiellement par voie anale ou orale comme lesRotavirus et Adénovirus. Les oocystes peuvent êtreingérés avec l’eau (Wi l l o c k s et al., 1998; Furtado et al.,1998; Kramer et al., 1996) et/ou les aliments.

Cette pathologie est particulièrement importante eten forte augmentation chez les personnesimmunodéprimées sans traitement thérapeutiquee fficace (spécialement la population sidéenne). Dansces populations, le C ry p t o s p o r i d i u m p. induit entre 20et 30 % des entérites dans les pays en voie dedéveloppement et 20 % dans nos régions. La périoded’incubation varie de 2 à 14 jours. Les symptômes dela cryptosporidiose se déclinent sous forme de diarrhéeaqueuse et sanglante, de crampes abdominales, de pertede poids, de nausées le tout parfois accompagné delégère fièvre. La maladie peut être fatale lorsqu’elletouche les personnes les plus fragilisées (souventindicatrice du stade III du SIDA), mais évolueg é n é r a l e m e n tfavorablement enquelques semaines (1 à3 semaines). Des dosestrès basse,probablement inférieureà 100 oocystes, sontcapables d’initierl’infection. Ces dernierssont remarquablementrésistants à beaucoupde désinfectant et

restent viable pendant près de 18 moisdans un environnement frais et humide.

Ce parasite a un cycle direct qui sedéroule à la surface des entérocytes. La succession desévénements est comparable au cycle des I s o s p o r a. Lessporozoïtes libérés dans la lumière du tube digestifpénétrent dans les cellules épithéliales. Ensuite,plusieurs cycles de reproduction asexuée se déroulentdans les entérocytes en fournissant des mérozoïtes deforme allongée. Puis, à l’intérieur de nouveauxentérocytes, les mérozoïtes subissent la diff é r e n c i a t i o nsexuelle (macrogamétocytes et microgamètocytes) etles macrogamètes seront fécondés par lesmicrogamètes. Le résultat de la fécondation seral’oocyste qui est expulsé de la cellule hôte et libérédans le milieu extérieur dans les fèces. Les oocysteséliminés dans les matières fécales sont directementi n f e c t i e u x .

Le diagnostic de cette pathologie est réalisé parmicroscopie optique couplé à une coloration (méthodede Ziehl-Neelsen modifiée) (Garciaet al., 1983) ou parimmunofluorescence (Deng and Cliver, 2000) sur desétalements de matières fécales. La coloration de Ziehl-Neelsen présente le risque de confondre les oocystesavec les cryptosporidies. De nombreux test ELISA(Chapman et al., 1990; Dagan et al., 1995; Garcia andChimizu, 1997; Graczyket al., 1996; Rosenblatt andSloan, 1993) sont également disponibles pour détecterspécifiquement la présence d’antigènes provenantd’oocystes de C ry p t o s p o r i d i u m p a rv u m. Acôté de cestechniques, des méthodes PCR (Leng et al., 1996;M o rgan et al., 1996, 1998; Rochelle et al., 1997; Monisand Saint, 2001) permettent de détecter le parasite dansl’eau de distribution ou chez des porteursasymptomatiques. Toutes ces méthodes, quoiquesensibles, nécessitent une main d’oeuvre importante etq u a l i f i é e .

Dans le but de rendre cette détection plus facile,plus rapide et tout aussi efficace, Coris BioConcept adéveloppé un test immunochromatographiquepermettant la détection des antigènes des oocystes duCryptosporidium Parvum dans les matières fécalesendéans les 10 minutes.

Afin de valider ce nouveau test, deséchantillons en provenance d’un hôpital pédiatrique

FOCUS DIAGNOSTICA

L’immunochromatographie, techniquealternative à la microscopie et à l’ELISA, pourla détection rapide, simple, efficace etperformante du Cryptosporidium parvum

Vol.9 (1) - 2001 - p.

Figure 1 : schéma et image d’unoocyste de C ry p t o s p o r i d i u m

p a rv u m

de nitrocellulose sensibilisée avec un immunoréactifdirigé contre les antigènes des oocystes deCryptosporidium Parvum (Figure 1). La spécificité desréactions immunologiques est assurée par l ‘utilisationd ‘un anticorps monoclonal, dirigé contre des antigènesspécifiques des oocystes et conjugué avec desparticules d ‘or colloïdal de 20 nm.

Les matières fécales testées avec l’ELISA s o n tdiluées 3 fois dans le tampon de dilution fourni avec lekit. Les tigettes sont ensuite incubées dans 500 µl decette solution pendant 5 à 10 minutes à températureambiante pour détecter la présence de CryptosporidiumParvum dans l’échantillon testé.

M i c roscopie optiqueL’analyse par microscopie optique a été eff e c t u é e

par le laboratoire anglais de “Preston Public HealthLaboratory” (Royal Preston Hospital, PO BOX 202,Sharoe Green Lane, Preston PR2 9HG, United-K i n g d o m ) .

La technique de microscopie optique est réaliséepar coloration spécifique des oocystes, méthodeutilisant du phénol-auramine et du permanganate depotassium sur un étalement de matières fécales. Lesoocystes apparaissent sous forme de disques jaunesclairs avec une apparence d’érythrocyte sur fond rougefoncé quand l’observation est réalisée par microscopieaux ultra-violets.

FOCUS DIAGNOSTICA Vol.9 (4) - 2001 - p. 91

( G u y ’s and T h o m a s ’ Hospital, Londres) ont étéanalysés par immunochromatographie et ces résultatscomparés avec ceux de deux méthodes de référence.Les mêmes échantillons ont été testés en parallèle avecle test “Crypto-Strip” développé par Coris BioConceptet l’ELISA ( Techlab Inc., USA) d’une part et unetechnique de microscopie optique d’autre part. Lesrésultats obtenus avec le “Crypto-Strip” sont comparésrespectivement avec ceux provenant de “l’ELISA” etceux de la microscopie optique. Cette comparaison aété réalisée pour déterminer le niveau de sensibilité etde spécificité de cette nouvelle trousse de diagnosticpar rapport à ces deux méthodes de référence. De plus,le protocole de validation a permis, d’une part, devérifier si d’éventuelles interférences avec d’autrespathogènes existaient et, d’autre part, de déterminer leseuil de détection.

Matériels et méthodes

E c h a n t i l l o n s

103 matières fécales humaines ont été testées pourévaluer le test immunochromatographique « Crypto-Strip » par rapport à l ‘ELISA et à la microscopieoptique. Ces échantillons proviennent de patientss o u ffrant d’entérites. Les paramètres de sensibilité etde spécificité tels que définis par Bouyer (Bouyer J; e ta l, 1995) ont été déterminés pour le test immuno-chromatographique par rapport à l ‘ELISAet à lamicroscopie optique. Les matières fécales ont étéprédiluées approximativement 5 fois dans du tamponP B S - Tween (0,1%) avant leur évaluation avec les troistechniques à comparer.

E L I S A

Des microplaques à 96 puits ont été sensibiliséesavec un anticorps monoclonal dirigé contre lesantigènes de surface des oocystes de CryptosporidiumParvum. 100 µl d’une dilution 1/5 de la préparation dematières fécales prédiluées dans la solution de lavagesont incubés 60 minutes à température ambiante surles plaques sensibilisées. Elles sont ensuite lavéesquatre fois avec la solution de lavage. L’anticorps dedétection (un anticorps de lapin dirigé contre lesantigènes de surface du C ry p t o s p o r i d i u m p.) estdistribué dans les 96 puits de la plaque sensibiliséeavant une incubation de 20 minutes suivie de quatrerinçages avec la solution de lavage. Le conjugué (unanticorps anti-IgG Lapin couplé à HRP) est distribuéet incubé pendant 10 minutes. La procédure de lavageest répétée (cfr. ci-dessus) avant d’ajouter le substrat etde lire à 450 nm. Un control négatif est réalisé pourchaque échantillon testé.

Test immunochro m a t o g r a p h i q u eLe kit « Crypto-Strip » est constitué d’une tigette

Figure 1 : représentation schématique d’une tigetteen vue de face (gauche) et en vue latérale (droite). Lamembrane de nitrocellulose est collée sur un supportplastique. De part et d’autre de celle-ci est disposé dupapier absorbant, papier permettant à l’échantillon de

migrer efficacement depuis la base de la tigette (flèche)jusqu’à son sommet. Entre l’absorbant inférieur et la

membrane de nitrocellulose est disposée une membranede polyester imprégnée avec un anticorps couplé à l’orcolloïdal. Cet anticorps est dirigé contre les antigènes

des oocystes du C ry p t o s p o r i d i u m p a rv u m. Unéchantillon est considéré comme négatif lorsque la lignecontrôle est révélée et positif lorsque deux lignes sont

v i s i b l e s .

Les résultats obtenus avec cette technique ont étécomparés avec les tests réalisés avec la trousse“ C r y p t o - S t r i p ” .

I n t e r f é rences avec d’autre spathogènes et limite de détectionA) Le kit « Crypto-Strip » a été testé avec diff é r e n t e smatières fécales positives pour au moins un desm i c r o o rganismes repris dans la liste ci-après.

Liste des pathogènes testés : Acinetobacter lwoff i ,Campylobacter jejuni, Giardia lamblia, A e r o m o n a shydrophila, E. Coli O157:H7, Salmonellathyphimurium, Salmonella enteritidis, Enterobactercloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonasaeruginosa, Proteus mirabilis, Serratia marescens,Shigella flexneri, Stenotrophomonas maltophilia,Yersinia enterolitica, Rotavirus, Adenovirus (groupes Aà F).

B) La limite de détection a été déterminée grâce à laquantification des oocystes dans un échantillon positifpour le Cryptosporidium Parvum. Cet échantillon avaitété coloré par la méthode de Ziehl-Neelsen avant lecomptage. La trousse “Crypto-Strip” a ensuite étéutilisée sur cet échantillon dilué de 2 en 2 en dilutionl i m i t e .

Résultats et discussionsComparaison ELISA - Cry p t o - S t r i p

L’ensemble des 103 matières fécales a été testéavec les trois techniques décrites dans “matériels etméthodes”. La comparaison des résultats observés avecle test Crypto-Strip et avec le test ELISA s p é c i f i q u epour le Cryptosporidium Parvum est reprise dans letableau 1.

L e sparamètres despécificité etde sensibilitéont étédéterminés enappliquant lesformules suivantes :

Spécificité = VN/(VN+FP)*100 = 85/85 = 100 %

Sensibilité = VP/(VP+FN) *100 = 17/18 = 94,4 %

Fiabilité = (VN+VP)/total*100 = 102/103 = 99 %

Suivant les résultats issus de la comparaison dansle tableau 1, la probabilité de se tromper endiagnostiquant comme sain un patient souffrant dediarrhée à Cryptosporidiose est de 5,6 %. De la mêmemanière, la probabilité d’émettre un diagnostic positifsur un échantillon sain est de 0 %.

Comparaison Microscopie Optique - Crypto-Strip

La comparaison des résultats observés avec le testCrypto-Strip et avec la microscopie optique spécifiquepour le Cryptosporidium Parvum est reprise dans letableau 2.

Les para-mètres despécificité etde sensibilitéont étédéterminés enappliquant lesformules suivantes :

Spécificité = VN/(VN+FP)*100 = 84/84 = 100 %

Sensibilité = VP/(VP+FN) *100 = 17/19 = 89,5 %

Fiabilité = (VN+VP)/total*100 = 101/103 = 98,1 %

Suivant les résultats issus de la comparaison dans letableau 2, la probabilité de se tromper endiagnostiquant comme sain un patient souffrant dediarrhée à Cryptosporidiose est de 10,5 %. De lamême manière, la probabilité d’émettre un diagnosticpositif sur un échantillon sain est de 0 %.

La sensibilité est définie comme étant la proportionde patients identifiés comme malades avec le testimmunochromatographique parmi une population desujet réellement malades.

La spécificité est définie comme étant la proportionde sujets identifiés sains avec le testimmunochromatographique parmi une population desujet indemnes.

Les valeurs de spécificité et de sensibilité obtenuesen comparant les techniques de référence ELISA e tmicroscopie optique avec notre test Crypto-Stripvalident notre technique. Le Crypto-Strip donne desvaleurs très proches de celle observées avec les deuxt e c h n i q u e s .

Cependant, par rapport à l’ELISA ou à lamicrocopie qui reste les tests les plus sensibles, leCrypto-strip présente plusieurs avantages : c’est un testhomogène qui s’effectue en une seule étape sanslavage, sans révélation enzymatique ni coloration. Il nenécessite aucun appareillage et une réponse fiable estobtenue en 5 minutes.

I n t e r f é rences avec d’autre spathogènes et limite de détectionA) Tous les tests réalisés avec les diff é r e n t séchantillons positifs pour les pathogènes cités ci-dessusont montré un résultat négatif. Nous pouvons doncconclure que la trousse “Crypto-Strip” est bienspécifique au C ry p t o s p o r i d i u m p a rv u m. .

FOCUS DIAGNOSTICA Vol.9 (4) - 2001 - p. 100

Tableau 1 : comparaison entre les résultatsobtenus avec le test ELISAet le test Crypto-

Strip pour les 103 matières fécales.

Tableau 2 : comparaison entre les résultatsobtenus avec la microscopie optique et le test

Crypto-Strip pour les 103 matières fécales.

Crypto-Strip

ELISA Positif Négatif

Positif 17 1

Négatif 0 85

Microscopie Crypto-Strip

optique Positif Négatif

Positif 17 2

Négatif 0 84

B) L’expérience couplant d’une part la quantificationdes oocystes dans un échantillon et d’autre part le testde cet échantillon en dilution limite avec le “Crypto-Strip” a permis de déterminer la limite de détection dece kit entre 50 et 100 oocystes dans 100 µl.

C o n c l u s i o n sEn conclusion, la simplicité du test “Crypto-Strip”

est son atout principal, tout en présentant une assurancequant au diagnostic posé qui est proche de celle del ’ E L I S A et de la microscopie.

B i b l i o g r a p h i e- Bouyer J. et al. 1995

In : Epidemiologie : Principes et méthodes quantitatives.Edition Inserm : ISBN : 2-85598-640-0

- Chapman, P., Rush, B. and McLauchlin, J., 1990.An enzyme immunoassay for detecting Cryptosporidium infaecel and environmental sample.J. Med. Microbiol. 32, pp.233-237.

- Dagan, R., Fraser, D., El-on, J., Kassis, I., Deckelbaum, R. andTu r n e r, S., 1995.Evaluation of an enzyme immunoassay for the detection ofCryptosporidium spp. in stool specimens from infants andyoung children in field studies.Am. J. Trop. Med. Hyg. 52, pp. 134-138.

- Deng, M.Q. and Cliver D.O., 2000.Comparative detection of Cryptosporidium parvum oocystsfrom apple juice Int. J. of food Microbiology 54, pp.155-162.

- Furtado, C., Adak, G.K., Stuart, J.M., Wall, P.G., Evans, H.S.and Casemore, D.P., 1998.Outbreaks of waterborne infectious intestinal disease inEngland and Wales, 1992-5.Epidemio. and Infect. 121 1, pp. 109-11 9 .

- Garcia, L. and Shimizu, R., 1997.Evaluation of nine immunoassay kits (enzyme immunoassayand direct fluorescence) for detection of Giardia lamblia andCryptosporidium parvum in humal fecal specimens.J. Clin. Microbiol. 35, pp. 1526-1529.

- Garcia, L.S., Breckner, D.A., Brewer, T.C. and Shimizu, R.Y. ,1 9 8 3 .Techniques for the recovery and identification ofCryptosporidium oocysts from stool specimens.J. Clin. Microbiol. 18, pp. 185-190.

- Graczyk, T., Cranfield, M. and Fayer, R., 1996.Evaluation of commercial enzyme immunoassay (EIA) andimmunofluorescent antibody (IFA) test kits for detection ofCryptosporidium oocysts of species other thanCryptosporidium parvum.Am. J. Trop. Med. Hyg. 54, pp. 274-279.

- K r a m e r, M.H., Herwaldt, B.L., Craun, G.F., Calderon, R.L.and Juranek, D.D., 1996.Surveillance for waterborne-disease outbreaks ¯¯ United States,1 9 9 3 ̄ 1 9 9 4 .Morbidity and Mortal Weekly Report CDC SurveillanceSummary 45 1, pp. 1-33.

- Leng, X., Mosier, D. and Oberst, R., 1996.Simplified method for recovery and PCR detection ofCryptosporidium DNAfrom bovine fexes.Appl. Environ. Microbiol. 62, pp.643-647.

- Monis, P. T. and Saint, C.P., 2001.Development of a nested-PCR assay for the detection ofcryptosporidium parvum in finished water

Wat. Res. Vol 35, N°7, pp.1641-1648.- M o rgan, U.M., O’Brian, P.A. and Thompson, R.C.A., 1996.

The development of diagnostic PCR primers forCryptosporidium using RAPD¯PCR.Mol. Biochem. Parasitol. 77,pp. 103-108.

- M o rgan, U., Pallant, L., Dwyer, B., Forbes, D., Rich, G. andThompson, R., 1998.Comparison of PCR and microscopy for detection ofCryptosporidium parvum in human fecal specimens: clinicalt r i a l .J. Clin. Microbiol. 36, pp. 995-998.

- O’Donoghue, P.J. 1995.Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals.Int. J. Parasitol. 25(2), 139-195.

- Rochelle, P.A., De Leon, R., Stewart, M. and Wolfe, R.L.,1 9 9 7 .Comparison of primers and optimization of PCR conditions fordetection of Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia inw a t e r.Appl. Environ. Microbiol. 63, pp. 106-11 4 .

- Rosenblatt, J. and Sloan, L., 1993.Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay fordetection of Cryptosporidium spp. in stool specimens.J. Clin. Microbiol. 31, pp.1468-1471.

- Willocks, L., Crampin, A., Milne, L., Seng, C., Susman, M.,G a i r, R., Moulsdale, M., Shafi, S., Wall, R., Wiggins, R. andLightfoot, N., 1998.A l a rge outbreak of cryptosporidiosis associated with a publicwater supply from a deep chalk borehole.Outbreak Investigation Team. Communic. Dis. Public Health 14, pp. 239-243.

FOCUS DIAGNOSTICA Vol.9 (1) - 2001 - p.