LABORATORUL NR. 1Elemente celulare cu rol geneticMorfologia cromozomilor metafaziciBenzile cromozomiale i cariotipul n seria animalNucleul celular organit celular,specific celulelor eucariote conine materialul genetic coordoneaz toate proceseleintracelulare reprezinta o treime din volumul total al celuleiElemente celulare cu rol genetic Membrana nuclear o membran dubl, prezentlatoateceluleleeucariote, cu rol de protecie a nucleoplasmei i a informaiei genetice dinnucleu. este prevazutcu numeroi pori, curol ntransportul substanelor necesarennucleu, i a ARN-ului. Nucleolulcomponenta subnuclear ale celulelor; are o form sferic rol in pstrareaunei pri amaterialului genetic, genezaribozomilor, diviziuneacelular. Poate fi observat n nucleu numai n perioada dintre dou diviziuni celulare. este aezat central sau periferic, ataat de membrana nuclear. Dinpunctul devedereal compoziiei chimice, el esteformatdinARN, proteine,enzime i alte substane. Nucleoplasma (carioplasma) substana fundamental care coninesruri minerale, substane organice, enzime i o reea de filamente care idau nucleoplasmei aspectul reticulat. Nucleoplasma const din 60% 70% ap, 15% 25% substane organice. n nucleoplasm este prezent ADN si ARN Este o soluie coloidal n care faza dispersant este cariolimfa, iar faza dispersateste cromatina nuclear.NUCLEULnuclear poreschromatinnucleolusnuclear envelope CROMATINAEucromatina: este puin condensat i slab colorat prezint mult ADn nerepetitiv bogat n perechi de baze G-C iproteine nonhistonice reprezint partea activ genetic a cromatinei se replic precoce la nceputul fazei S Alctuiete benzile R din cromozomiHeterocromatina este puternic condensat i intens colorat prezint ADN repetitiv bogat n A-T i histone Dei inactiv genetic ndeplinete anumite funcii celulareprecum : stabilizeaz centromerul i telomerele cromozomului, Intervine n desfurarea meiozei ( n sinapsa cromozomilor omologi) i probabil n diferenierea celular este de doua feluri : constitutiv i facultativ ( clasificarefacuta de S.Brown in 1975).Heterocromatina constitutiv- Se gseste constant sub forma condensat- Nu conine gene funcionale i este format din AND naltrepetitiv ( AND satelit)- Se gseste n regiunea centromerului, pe bratul lung al cromozomului Y, pe braele scurte ale cromozomiloracrocentrici i n constriciile secundare- Alctuiete benzile C din cromozomiHeterocromatina facultativ- Variaz la celule diferite si chiar la organisme diferite : in unelecelule, anumite parti sau gene din cromozomi pot fi active, inalte celule, aceleasi structuri pot sa nu functioneze fiind subforma de heterocromatina- Aceastaheterocromatinizarepoatefi limitatalaunanumitsegment din cromozom sau poate cuprinde tot cromozomul (exemplu tipic la sexul feminin cand unul din cei doicromozomi X este inactiv formand corpusculul sexual X). Cromozomii sunt structuri permanente alecelulei, dar ei apar mai clar in timpul diviziuniicelulare, indeosebi in metafaza. Examinai la microscopul fotonic e observ cei au forma unor bastonae, fiind alctuii dindoufilamenteparalele, alipite, omogenecastructur, care se numesc cromatide.CROMOZOMIIStructura cromozomilor metafazici 2 cromatide unite printr-un centromersister chromatidscentromerekinetochoreReplicated chromosomeP arm Q arm chromatidcentromerechromosomeP arm Q arm Cromozomii se studiaz n timpul metafazei, cnd prezint ocondensare maxim. n aceast etap, cromozomii sunt bineindividualizi, au braele ngroate, cromatidele fiind distanate. nstructura cromozomilor metafazici deosebim urmtoarelecomponente: cromatidele,cele dou subuniti longitudinalealecromozomuluimetafazic, alctuitedinncteo moleculdeADNdublu catenarnentrerupt, rezultatenprocesul dereplicareaADN. Astfel c,fiecare cromatidare aceeai cantitatedeADNca i cromozomuloriginal dincares-aformat i devineuncromozomfiucuexactaceleai gene; centromerul, realizeaz legtura ntre cele dou cromatide pn nanafaz, el apare ca o constricie cnd cromozomii se condenseazn timpul diviziunii celulare.STRUCTURA CROMOZOMILOR braele cromozomiale, care apar n urma mpririi cromatidelor dectrecentromern dou subuniti: braul lung(q) i braul scurt(p). Braele pot fi aproximativ egale sau de lungimi diferite; telomerele, regiunile terminale ale cromatidelor determin imenin individualitatea cromozomilor, prevenind unirea capetelor iastfel asigurnd stabilitatea lor. Se crede c diferenele individualen longevitate indic diferene n lungime a telomerelor; sateliii, elemente terminale rotunde la nivelul braelor scurte aleunorcromozomi aconcentrici (prezeni pecromozomii umani 13,14, 15, 21, 22). Sateliii sunt legai de corpul cromozomului printr-unfilament subirede heterocromatin(ADN neinformaional)ceconin genele care codific ARN-ribozomal.STRUCTURA CROMOZOMILOR Dup poziia centromeruluicromozomii pot fi: metacentrici ( cucentromerul n la mijloculcromozomului i braeleaproximativ egale ); submetacentrici ( cucentromerul nafarazoneicentrale i braele delungimi diferite ); acrocentrici (cucentromerul spreun captal cromozomului ).STRUCTURA CROMOZOMILOR OM- 46 MAIMUTA - 42 CIMPANZEU - 48 BOVINE - 60 CAINE - 78 PISICA- 38 CAL - 64 SOARECE- 40 DROSOPHILA- 8CROMOZOMIIDiferena dintre celulele diploide i celulelehaploide Majoritatea celulelor eucariote coninperechi de cromozomi i sunt astfel denumite diploide. Celulele care conin cromozomi neperechesunt denumite haploide. Prin cariotip se nelege o aranjare sistematic a cromozomilor unei singurecelule, cromozomi obinui prin fotografiere i dispui pe baza unor criteriiprecis stabilite prin standarde internaionale pentru fiecare specie. Cariotipul esteunindicatorgeneticreprezentativpentruo celul, darnneles lrgit, cromozomii acestei singure celule reprezint cromozomii unuiindivid i, n acelai timp, cromozomii caracteristici speciei creia i aparineindividul analizat. n scopul cariotiprii cromozomii sunt fotografiai la microscop cu obiectiv deimersie90xsau100x, decupai i aranjai nperechi.Apoi, sunt aezai nordine descrescnd a mrimii lor,pe grupe morfologice, lsndu-se spaiimici ntre perechi i mai mari ntre grupe. Cromozomii sexului se plaseaz dup ultima pereche de autozomi, alctuindo grup separat.CARIOTIPUL nvederea cariotiprii, este necesar identificarea cromozomilor utilizndmaimulte criterii: lungimea cromozomului, poziia centromerului, numrul i succesiunea benzilor cromozomale. prezena constriciilor secundare i a sateliilor, dar aceste particulariti morfologie fiindvariabile, au o importan secundar n prezent. Lungimea cromozomului - Se poate exprima ca: mrime absolut, n micrometri (La) lungime relativ, notat pe scurt Lr i exprimat n procente % sau %o. Masurarea precisalungimii reale, absoluteaunui cromozomsefacefiepeobservaii lamicroscopul opticdotat cumicrometruocular, fieprinmasurareaimaginii fotografice, ncarecaz trebuiecunoscut precis raportul de mrirelafotografiere i copiere. Lungimea absolutaunui cromozom variaznlimitefoartelargi, n funciedestadiul mitozei i de gradul de despiralizare cromatidic sub aciunea colchicinei i aocului hipotonic.CARIOTIPUL De aceea a fost necesar alegerea unui parametru relativ independent de aceste 2 variabile i acest parametru este lungimea relativ, adic lungimea absolut a unui cromozom raportat la lungimea total a setului haploid normal (lungimea total a autozomilor A-, mprit a 2, la care se adaug lungimea cromozomului X).CARIOTIPULPoziia centromerului Rezult din calcului indicelui centromeric (Ic) care reprezint raportul dintre dimensiunea braului scurt, notat cu p i dimensiunea total a cromozomului, adic braul scurt p + braul lung q, nmulit cu 100. Se observ imediat c acest raport variaz ntre 0 i 0,5. Ic = 0,5- centromer situat median (la jumtatea cromozomului). Ic = 0,25- centromer situat la sfertul lungimii cromozomului, Ic= 0,1- centromer situat aproape terminal.CARIOTIPUL n acest fel, n funcie de poziia centromerului,cromozomii se pot deosebi morfologic. Cnd centromerul este plasat:la mijlocul cromozomului metacentricn vecintatea punctului median submetacentricn regiunea subterminal acrocentricO a patra categorie morfologic (telocentrici), adic cei cucentromerul plasatchiarterminal, s-adovedit dupanul1980 cnupoateexista, cromozomii telocentrici nefiindstabili. Prezena lor la organismele superioar este rar, iarcromozomii pecaresuntem tentai s-i clasificmdrepttelocentrici, ci acrocentrici.CARIOTIPULNumrul i succesiunea benzilor cromozomale Cel mai important criteriu de identificare a cromozomilor este numrul isuccesiunea benzilor cromozomale. Tehnici specialedecolorareaupermis obinereapecromozomi aunor benzitransversalecuintensitatedecolorare diferit i n numrdiferit, n funciedecromozomi i de specie. Banda cromozomal partea cz net distinct de segmentele transversale vecine,aprnd mai ntunecat sau mai puin colorat, mai strlucitoare sau mai opac. Denumireabenzilorsefacen funciedemetoda folosit. Celemai importantesunt:CARIOTIPUL- benzile cromozomale Benzile Q vizibile prin colorare cu derivai acridinici fluoresceni dintre care chinacrina este cel mai desutilizat. Deoarece chinacrina se scrie n limba englez quinacrine, benzile obinute sub aciunea acestuicolorant s-au numit Q i se pot observa numai la microscopul cu fluorescen. clorhidratul de quinacrina manifesta afinitate fata de ADD bogat in A-T care maresc intensitatea fluorescentei intimp ce G-C o reduc. Benzile G rezult prin folosirea colorantului Giemsa, dup tratarea cz cu alcali, soluii saline concentratesau enzime proteolitice (tripsina). Benzile G au pe cz aceeai dispoziie ca i benzile Q, dar pot fi vizualizate la microscopul optic obinuit. Benzile R se obin prin denaturare termic i prin colorare Giemsa sau cu fluorocromul acridine orange. n ceea ce privete intensitatea de colorare, benzile R au dispoziie inversfa de benzile Q i G (R engl. reverse). Benzile C localizate n regiunea centromerului, se obin prin tratare cu soluie concentrat de hidroxid de bariu i colorare Giemsa. Benzile T identific telomereleCARIOTIPULCARIOTIPUL- benzile cromozomale Benzile care se coloreaz intens cu Giemsa sau sunt strlucitoare sub aciunea coloranilor fluoresceni se numesc benzi pozitive. Benzile care se coloreaz slab cu Giemsa i sunt slab fluorescente sub aciunea fluorocromilor se numesc benzi negative. Aceeai band poate fi pozitiv sau negativ, n funcie de tehnica de colorare utilizat.CARIOTIPUL- benzile cromozomale n afardebenzilesimple, peczsemai distingnmod convenional, benzilereper sau reperele i regiunile. Benzile bine delimitate au fost denumite benzi reper. Braelecromozomiloraufostdivizatenregiuni (zonecromozomalecuprinsentre 2 benzi reper vecine). Rol de repere n delimitarea regiunilor l au centromerii i telomerele. Pe fiecare bra, regiunea cea mai apropiat de centromer este identificat ca nr.1, iar celelalte regiuni, dac exist, sunt numerotate n continuare spre telomere. Terminologia benzilor i dispoziia lor pe fiecare cromozom au fost standardizatela majoritatea animalelor domestice i de laborator. Orice band sau segment decz poate fi uor identificat utiliznd numai 4 semne ntre care nu exist spaierisausemnede punctuaie.Primul semn reprezint numrul cz,aldoileasemndesemneaz braul cz(psauq),al treileasemn indic numrul regiunii,iaralpatrulea semn corespunde numrului benzii.CARIOTIPUL- benzile cromozomale Figure 12.12G-banding is due to differential staining along the length of each chromosome.Prezena constriciilor secundare i a sateliilor Unii cromozomi prezint, n unele regiuni ale braelor scurte, zone necolorabilecu anumii colorani, sub forma unor strangulri denumite constriciisecundare, spre deosebire de centromeri care sunt constricii primare. Atunci cnd constriciile secundare sunt deosebit de accentuate i se gsesc pebraele scurte ale unor cromozomi acrocentrici sau submetacentrici, eledeterminseparareafragmentelor terminaleale braelor scurtesubformaunor satelii. Prinurmare, sateliii suntmasemici de cromatin,localizatelaextremitateaterminala braelorscurtealeunorcromozomi, aparentindependente, darlegate printr-un filament foarte fin de poriunile bazale. De form rotund sau oval, diametrul lor corespunde, uneori cu cel alcromatidelor, alteori este mai mic sau mai mare.CARIOTIPUL Idiograma - reprezentarea schematic a cz dintr-un cariotip, bazat pe msurtori ale acestora din mai multe celule (10-25) i dispunerea lor n ordine descrescnd, potrivit mrimilor medii calculate. Caracteristicile morfologice ale cromozomilor unor specii de animale oarecele de laborator (mus musculus domesticus) 2n = 40 cz toi cz sunt acrocentrici Vaca (Bos taurus) 2n = 60 cz autozomii (29 perechi) sunt acrocentrici, gonozomul X este submetacentric mare, gonozomul Y este metacentric mic Porcul domestic 2n = 38 cz autozomii (29 perechi) sunt metacentrici, acrocentrici i submetacentrici, gonozomul X este metacentric mare, gonozomul Y este metacentric mic obolanul de laborator 2n = 42 cz autozomii (29 perechi) sunt acrocentrici i metacentrici,gonozomul X este acrocentric mare, gonozomul Y este acrocentric mic De subliniat c gonozomii X i Y nu prezint morfologia literelor al cror nume l poart.CARIOTIPULCARIOTIPUL BOVIN (BOS TAURUS)58 de autozomiacrocentrici2 cz sexualisubmetacentriciCARIOTIPUL OVIN (OVIS ARIES)52 de autozomi :1-3 metacentrici(fuziune)4-26 - telocentrici2 cz sexuali:X telocentricY - metacentrici58 de autozomitelocentrici2 cz sexualisubmetacentriciCARIOTIPUL CAPRIN (CAPRA HIRCUS)EQUUS CABALLUSNr de cz variz n limite largi, de la 2n=32, la 2n=66La calul domestic 2n-6462 de autozomi:Grupa I 1-4 submetacentriciGrupa II 5-9 - metacentriciGrupa III 10-12 metacentrici miciGrupa IV 13 - subtelocentricGrupa V 14-31 - acrocentrici2 cz sexuali :X submetacentriciY - telocentricCARIOTIPUL LA PORCUL DOMESTIC 36 de autozomi:Grupa I 1-5 submetacentriciGrupa II 6-7 -subtelocentriciGrupa III 8-12 metacentriciGrupa IV 13 -subtelocentricGrupa V 13-18 -acrocentrici2 cz sexuali :X submetacentriciY - telocentricCariotipul la iepurele domesticOryctolagus cuniculus42 de autozomi Grupa I 1-5 submetacentriciGrupa I 1-6 metacentriciGrupa II 7-11 -submetacentriciGrupa III 12-17 submetacentriciGrupa IV 18 21 acrocentrici2 cz sexuali :X, Y submetacentriciCARIOTIPUL LA PSRI 2n = 80 Macrozomii dimensiuni mari (6-8 perechi de cz), inclusiv cz sexuali Z i W Sexul mascul este homogametic ZZ Sexul femel este heterogametic ZW Cz W este constituit din cromatin constitutiv, fiind inactiv genetic Microzomii Gin 2n=78 Curc - 2n=82 Bibilic - 2n=78 Raa comun 2n=80 Raa leeasc 2n=78 Gsc 2n=82