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La risposta immunitaria di tipo umorale

Linfociti B, Plasmacellule ed Anticorpi

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L’IMMUNITA’ UMORALE(mediata da anticorpi)

Questo tipo di immunità protegge dagli antigeni circolanti, quali:

• batteri extracellulari

• esotossine microbiche

• virus nella fase extracellulare

ANTICORPI

Gli anticorpi, o immunoglobuline, sono glicoproteine che

possono esistere sia in forma legata alla membrana dei linfociti

B, dove fungono da recettori per l’antigene (BCR), che in forma

solubile.

Gli anticorpi solubili circolano nel sangue e sono presenti nelle

secrezioni dove svolgono la funzione effettrice dell’immunità

umorale neutralizzando ed eliminando i microbi e le loro tossine.

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Migrazione elettroforetica dei componenti del siero(albumina e globuline , e )

la linea tratteggiata è il profilo elettroforetico prima dell'immunizzazione;

la linea continua rappresenta la migrazione elettroforetica del siero ottenuta dopo l'immunizzazione.

STRUTTURA DEGLI ANTICORPI

L’anticorpo è costituito da due catene pesanti e da due catene

leggere.

Sia le catene pesanti che le catene leggere possiedono alcune

regioni simili in molti anticorpi (regioni costanti) ed una regione

che è propria di ciascuna molecola di anticorpo (regione

variabile).

Le regioni variabili conferiscono all’anticorpo la specificità per

l’antigene e legano direttamente l’antigene.

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Esistono cinque tipi di catene pesanti diverse per la regione

costante.

Gli anticorpi che contengono catene pesanti differenti

appartengono ad un diverso isotipo o classe: i cinque isotipi

sono denominati IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.

I vari isotipi si differenziano per le caratteristiche biologiche e le

funzioni effettrici.

Isotipo di IgG: tipo di catena pesante in essa presente

Idiotipo: porzione dei frammenti Fab della immunoglobulina cheinteressa la reattività con l'epitopo dell'Ag.

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ANTICORPI CHIMERICI e UMANIZZATI

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IgM : ca 5% caratteristici della risposta primaria; nel siero sono sotto forma

pentamerica; fissano efficacemente le proteine del complemento, agglutinazione

di batteri, opsonine.

IgD : <1% espresse come immunoglobuline di membrana

IgG : 85% indicano (anche) riesposizione all’antigene; nel siero sono in forma

monomerica; antitossine, opsonine, fissano efficacemente il complemento;

neutralizzazione dei virus nel sangue; possono attraversare la barriera

placentare (protezione del feto e del neonato); sono suddivise in sottotipi.

IgE : mediano le risposte allergiche (ipersensibilità di tipo I) e asmatiche,

antiparassitarie (induzione della degranulazione dei mastociti e opsonizzante per

gli eosinofili).

IgA: 10-15% dimeriche; si trovano in elevata concentrazione nelle secrezioni

mucose, prevengono l'adesione batterica alle membrane mucose, antivirali,

antitossine.

Alcune caratteristiche e ruolo delle classi Ig nella difesa dell'ospite

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CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE

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CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE VERSO ANTIGENI TD

Risposta immunitaria primariaIn seguito a una prima immunizzazione con un antigene, si osserva unalag fase, durante la quale non si riscontrano, nel siero di un soggetto,anticorpi specifici per quell’antigene. Dopo questa fase, l’antigene vienericonosciuto, processato e presentato alle cellule T appropriate, che aloro volta, sono state attivate, hanno proliferato e si sono differenziatein linfociti TH maturi e attivati. Tali linfociti TH possono allora aiutare lacompleta attivazione dei linfociti B in plasmacellule producenti anticorpi.Solitamente dopo 7-10 giorni nel siero è possibile riscontrare anticorpispecifici per l’antigene.

Nella prima fase della risposta primaria compaiono nel siero le IgM,successivamente le IgG. La produzione di Ig decresce in seguito allascomparsa dell’antigene.

Risposta immunitaria secondaria

Quando un soggetto incontra nuovamente lo stesso antigene, lasua risposta immunitaria risulta più efficace e più veloce.

I livelli anticorpali nel siero incrementano rapidamente e laquantità di anticorpi totali prodotti è maggiore.

Inoltre, gli anticorpi presentano:

una maggiore affinità per l’antigene;

i vari isotipi (IgG, IgA, IgE) in quanto si è

verificato lo switch isotipico;

un’ampia gamma di funzioni effettrici.

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FUNZIONI EFFETTRICI DEGLI ANTICORPI

Neutralizzazione di microbi e tossine bloccando il loro legame alle cellule.

Attivazione della via classica del complemento da parte delle IgM e delle IgG.

Opsonizzazione dei microbi come stimolo per la fagocitosi.

Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente mediata da cellule NK

Immunità a livello delle mucose mediata da IgA.

Immunità neonatale mediata da IgG materne che attraversano la placenta e l’epitelio intestinale nel circolo del feto e del neonato

Ipersensibilità mediata da IgE.

Immunità delle mucose mediata dalla secrezione di IgA

Dosaggio Radioimmunologico

E.L.I.S.A.Enzyme Linked Immunosorbent Assay

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Principi del dosaggio radioimmunologico

• Principi: reazione immunologica [reazione Antigene –Anticorpo] per dosare qualsiasi composto immunogenico

Ag + Ag* + Ab AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab*

– Ag* non legato e Ag libero– Radioattività rilevata del residuo legato– Concentrazione ligando è inversamente propozionale

alla radioattività

Vantaggi e Svantaggi del RIA

• Vantaggi– Alta specificità: le reazioni immunologiche sono

specifiche– Alta sensibilità: le reazioni immunologiche sono sensibili

• Svantaggi – Pericoli radiologici: collegati all’uso dei reagenti radioattivi– Richiesta di personale qualificato– Laboratori con specifiche licenze in campo radiologico– Richieste speciali per lo smaltimento e la conservazione

del materiale radioattivo

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Requisiti per il RIA

1. Preparazione e Caratterizzazione dell’Antigene

2. Radiomarcatura dell’Antigene

3. Preparazione dell’Anticorpo Specifico

4. Sviluppo dei Sistemi di Rilevazione

Preparazione e Radiomarcatura dell’Antigene

• Antigeni preparati da…– Sintesi delle molecole

– Isolazione da sorgenti naturali

• Radiomarcatura [Procedura di marcatura]– 3 H 14 C 125 I sono utilizzati come tag

– Gli antigeni sono marcati 3 H 14 C 125 I

– La marcatura non disturba la Specificità Antigenica e L’Attività Antigenica!

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Preparazione dell’Anticorpo specifico

• L’Antigene iniettato in maniera intradermica in conigli o maialini di Guinea produzione anticorpi

• Anticorpi recuperati dal siero

• Non sono Antigeni:– Ormoni, Steroidi, Farmaci APTENI

– Es: Gastrina, Morfina,

– Gli Apteni coniugati all’albumina antigeni

Sviluppo del Sistema di Rilevazione

• Un punto cruciale è la separazione degli antigeni non legati

• Questo è dipendente dal legame degli anticorpi alla fase solida

• Gli Antigeni legati agli anticorpi fissati restano fortemente adesi

• Rimuovere lavando o decantando gli antigeni non legati

• Altre tecniche di separazione: Centrifugazione

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Procedura

• Aggiungere campioni noti + antigene marcato nei pozzetti

• Incubare attendere la formazione del complesso

• Decantare e lavare il contenuto dei pozzetti rimuovere tutti gli antigeni non legati

• Radioattivtà emessa è misurata con un Contatore [GM Contatore, Scintillatore etc]

• L’INTESITA’ della radioattività è inversamente proporzionale alla concentrazione degli antigeni nel campione noto

• Sensibile anche a concentrazioni basse di Antigeni

E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• Principi: – Usa una reazione immunologica come RIA

– Differisce dal RIA per il metodo di rilevazione

– La rilevazione è basata su• Reazione catalizzata da un enzima

• Sonda Fluorescente

• No Radioattività [grande vantaggio!]

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E.L.I.

S.A.

Vantaggi dell’ ELISA

• Sensibile: nell’ordine di nanogrammi o ancora meno

• Riproducibilità

• Reagenti minimi

• Qualitativa e Quantitativa – Qualitativa Es Test HIV

– Quantitativa Es Rilevazione concentrazioni Farmaci

• Lo scopo: I pozzetti possono essere ricoperti con Antigeni o Anticorpi

• Automatica alta velocità

• NO Pericoli radiazioni

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Tipi di ELISA

1. Metodo Noncompetitivo o a Sandwich1. Sistema per misurare l’antigene [Pozzetti coperti

con Anticorpi; Anticorpi marcati con enzima]

2. Sistema per misurare gli anticorpi [Pozzetti coperti con antigeni; AntiAnticorpi marcati con Enzima]

2. Metodo Competitivo [Pozzetti coperti con anticorpi; Antigeni marcati con enzima]

Metodo Noncompetitivo o Sandwich• Sistema misurazione Antigene

– Pozzetti coperti con anticorpi– Aggiunta di campioni – Incubare: attendere l’interazione antigene-anticorpo– Lavare rimuovere l’antigene non legato– Aggiungere l’Anticorpo marcato con l’enzima– Incubare e attendere che l’anticorpo marcato sia legato – Lavare rimuovere l’Anticorpo marcato non legato– Aggiungere il substrato; incubare – Enzima + Substrato Prodotto Misurazione

fluorescenza– Fluorescenza proporzionale all’Anticorpo nel campione

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• Sistema per la misurazione dell’Anticorpo– Pozzetti coperti con l’antigene– Aggiunta campione da analizzare contenente l’anticorpo– Incubare: attendere la formazione del complesso antigene

anticorpo– Lavare rimuovere l’Anticorpo non legato– Aggiungere Antianticorpo marcato con l’Enzima– Incubare con antianticorpi marcati complesso anticorpo-

antigene– Lavare rimuovere antianticorpo marcato non legato– Aggiungere il substrato; incubare – Enzima + Substrato Prodotto fluorescenza– Fluorescenza proporzionale all’anticorpo presente nel

campione

Metodo Noncompetitivo o Sandwich

Sistema Competitivo

• Pozzetti coperti con anticorpi

• Quantità note di campione contente antigene + antigene marcato con l’enzima

• Incubare: reazione antigene e anticorpo

• Lavare rimuovere l’antigene non legato

• Aggiungere il substrato; incubare

• Enzima + Substrato Prodotto fluorescenza

• Fluorescenza inversamente proporzionale all’antigene presente nel campione

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Marcatori Enzimatici

Marcatori enzimatici: • un’alta specificità• Facilmente complessati ai ligandi e al complesso

marcato • La reattività deve avvenire dopo che si è legato l’enzima

antigene/anticorpo• Gli enzimi scelti devono essere presenti normalmente

nel campione • Esempi di enzimi marcati

– Perossidasi, Fosfatasi Alcalina, Glucosio ossidasi

Applicazioni dei dosaggi Immunologici[RIA e ELISA]

• Analisi di ormoni, vitamine, metaboliti, diagnosi di marcatori– Es. ACTH, FSH, T3, T4, Glucagone, Insulina, Testosterone,

vitamin B12, prostaglandine, glucocorticoidi,

• Monitoraggio Farmaci ad uso terapeutico: – Barbiturici, morfina,

• Diagnosi per malattie infettive– HIV, Epatite A, B etc

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Le determinazioni vengono effettuate su sieriopportunamente criopreservati a -20°C.

I sieri sono processati per la valutazione didiverse proteine circolanti dotate di attivitàbiologica impiegando come sistema di detezioneil sistema Multiplex (Bio-Plex suspension array)della Bio-Rad.

Esso permette di determinare quantitativamentei livelli sierici circolanti fino a 18 citochine sullostesso campione di siero (50-100 microlitri disiero).

Multiplex- Cytokine array

Determinazione di diverse citochine allo stesso tempo: ad ogni citochina è assegnato una beads di dimensione diversa

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Il secondo anticorpo fluorescente si lega alla citochina e l’intensità di fluorescenza viene assegnata attraverso il colore delle beads alle diverse citochine.

A cavallo della citofluorimetria e dell’ELISA: le beads vengono lette una alla volta attraverso un sistema fluidico

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Studio Biologico: determinazioni su siero (2)

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