La luce polarizzataLa luce è un'onda elettromagnetica che consiste in un campo elettrico E ed uncampo magnetico H oscillanti, che possono essere rappresentati da vettoriperpendicolari tra loro, e perpendicolari alla direzione di propagazione.

Il piano di polarizzazione è il piano su cui oscilla il campo elettrico E, ma poichéuna sorgente di luce è di solito composta da un insieme di emettitori disposti inmaniera casuale, la luce emessa è un insieme di onde con tutte le possibiliorientazioni del vettore E. La luce polarizzata linearmente, invece, è unaradiazione elettromagnetica in cui il vettore E oscilla in un solo ben precisopiano di polarizzazione.Può sembrare strano che la luce polarizzata possa essere considerata unaradiazione asimmetrica, in grado di interagire con due enantiomeri in manieradifferente. In realtà la direzione di propagazione della radiazione, quella delvettore elettrico E e quella del vettore magnetico H costituiscono una terna divettori ortogonali non sovrapponibile alla sua immagine speculare.

La seguente animazione mostra come in una luce linearmentepolarizzata il vettore campo elettrico oscilla lunga una e unasola direzione (quella z, nella figura) e perpendicolare all’asse dipropagazione (quello x).

Un osservatore situato sull’asse x vedrà ilvettore campo elettrico raggiungere unmassimo e poi diminuire fino a passare perlo zero, cambiare verso, raggiungere unminimo e poi ricrescere di nuovo. L’ondasinusoidale rimane sempre confinata nelpiano xz e l’osservatore vedrebbe un vettoreoscillare lungo z.

Quando due onde piano polarizzate sono presenti simultameamente indue piani perpendicalari, le proprietà dell’onda che ne risulta dipendonodall’intensità e dalle fasi delle due onde componenti. La seguenteanimazione mostra l’onda risultante dalla somma di due onde di stessaintensità, frequenza, lunghezza d’onda e in fase ma polarizzate secondodue piani perpendicalari (orizzontale per quella rossa e verticale per laverde)

Il risultato della somma tra le due onde, èun’altra onda piano polarizzata (quella azzurra)con il piano di polarizzazione spostato di 45rispetto ai piani di polarizzazione delle due ondeoriginarie

Se le due onde non sono in fase (c’è una differenza di 90 tra le loro fasi)l’onda elettromagnetica che ne risulta è circolarmente polarizzata. Inpratica il vettore campo elettrico E ruota con frequenza pari alla frequenzadella radiazione: il risultato è che la punta del vettore percorre unatraiettoria a spirale. L’onda si propaga quindi come una funzione chedescrive una traiettoria a spirale e non più sinusoidale

Se l’osservatore si pone lungo l’asse di propagazione.

Cosa succede quando due onde circolarmente polarizzate sonosommate?

Se le due onde hanno la stessa intensità, frequenza e lunghezza d’onda masono rispettivamente circolarmente polarizzate destra e sinistra la luce chene risulterà sarà linearmente polarizzata.

Una radiazione polarizzata linearmenteva vista come la somma di due ondepolarizzate circolarmente, unasinistrorsa e una destrorsa.

Cosa succede quando una radiazione elettromagnetica interagisce con la materia?

parte della radiazione può essere assorbita

Può variare la velocità della radiazione(tutti i materiali hanno un indice dirifrazione!!!)

Assorbimento

Luce piano-polarizzata in unmezzo che l’assorbe ma non larallenta. Come si può vederevaria solo l’intensità delvettore campo elettrico

Luce circolarmente-polarizzatain un mezzo che l’assorbe ma non la rallenta. Anche in questo caso varia solo l’intensità del vettore campo elettrico

Luce polarizzata in un mezzo rifrangente

Luce piano-polarizzata inun mezzo in grado dirallentarla. La luce che nerisulterà ha la stessaintensità di quellaincidente ma varierà nella

lunghezza d’onda (ln=c)

Stesso discorso per la lucecircolarmente-polarizzata

Cosa succede se la materia assorbepreferenzialmente una delle due componenti(destra o sinistra) della luce linearmentepolarizzata?

Nella figura la le due componenti circolarmente polarizzate della lucelinearmente polarizzata sono assorbite differentemente: lacircolarmente polarizzata destra (rossa) non è assorbita mentre la

circolarmente polarizzata sinistra (verde) è assorbita.

I vettori campo elettrico esconodal mezzo con intensità differentie il vettore somma descrive unatraiettoria ellittica. La luce èdetta ellitticamente polarizzata.

Cosa succede se la materia rallentapreferenzialmente una delle due componenti(destra o sinistra) della luce linearmentepolarizzata?

Nella figura le due onde si propagano con velocità differenti nelmezzo e quindi usciranno dal campione l’una in ritardo rispetto all’altracioè fuori fase (nell’esempio la componente circolarmente polarizzata

sinistra (verde) è più rallentata.

Sommando vettorialmente le due componenti si ottiene sempre una lucelinearmente polarizzata ma la direzione di polarizzazione sarà ruotata di unangolo f rispetto alla direzione originale.La differenza tra i due indici di rifrazione (nL-nR) è detta birifrangenzacircolare e l’angolo di deviazione è chiamato rotazione ottica.

F= 180 l (nL-nR) /l

F= F 100/clPer poter paragonarecampioni a differenteconcentrazione è statadefinita la rotazionemolare.

Il dicroismo circolare è una tecnica di analisi strutturale simile allaspettrofotometria in quanto è basata sull'assorbimento da parte delcampione di una radiazione UV o visibile. La differenza è che laradiazione usata in questo caso è polarizzata circolarmente, e quella cheviene misurata è la differenza tra le assorbanze (De) riscontrate usandocome radiazioni incidenti radiazioni polarizzate circolarmente nei duepossibili versi orario e antiorario.Il CD permette di trarre importanti informazioni su molecole chirali. Puòessere usato per determinare la configurazione assoluta di una molecola,ma anche configurazioni relative e conformazioni. È inoltre una tecnicamolto più sensibile della polarimetria, e, diversamente che perquest'ultima, il segno del De può essere sufficiente a trarre conclusionisulla configurazione assoluta della molecola per specifiche classi dicomposti.

Il Dicroismo circolare

Lo spettro CD

Un cromoforo chirale, ma anche un cromoforo non chirale che si trovi in unintorno chirale, può assorbire le luci polarizzate circolarmente destra esinistra in maniera diversa, cioè con assorbanze AD ed AS (e quindi ancheassorbanze specifiche molari eD ed eS) diverse. Uno spettro CD è un graficodel dicroismo circolare, DA:

o del dicroismo circolare molare, De:De =eR-eS

in funzione della lunghezza d'onda. Uno spettro CD assomiglia quindi ad unnormale spettro UV, ma DA e De possono anche assumere valori negativi.Naturalmente la relazione tra DA e De è ancora la legge di Lambert-Beer:

DA = De.l.d

dove l è espresso in cm e c è la concentrazione molare.

DA= AS-AD

In generale ogni transizione elettronica che dà origine ad un assorbimentoUV/visibile dà anche origine ad una banda nello spettro CD, chiamata effettoCotton, il cui massimo (o il minimo per bande con segno negativo) si trova più omeno alla stessa lunghezza d'onda del massimo di assorbimento UV/visibile. Lospettro CD è dato dalla sovrapposizione di bande positive e negative di questogenere. Un esempio di spettro CD è mostrato in Figura. Come ci si puòaspettare da considerazioni di simmetria, gli spettri CD di enantiomeri sonouguali, ma hanno segni opposti.

A volte il dicroismo circolare è espresso sotto forma di ellitticità molare. Se laradiazione incidente sul campione è polarizzata linearmente, all'uscita delcampione le due componenti hanno intensità diverse e la radiazione diventapolarizzata ellitticamente.L'ellitticità y è definita come un angolo la cui tangente è uguale al rapporto tral'asse minore ed asse maggiore dell'ellisse, e va da 0 per una luce polarizzatalinearmente a 45 per una luce polarizzata circolarmente.tangy=b/aTuttavia poiché la differenza di assorbanza è sempre molto piccola, anchel'angolo y assume sempre valori piccoli (si possono misurare ellitticità di 1/1000di grado), ed è quindi approssimativamente proporzionale alla concentrazione. Sipuò allora definire una ellitticità molare [q]:

dove l è espresso in dm e c è la concentrazione decimolare, ossia espressa inmoli per 100 ml (o dmol/l; si notino ancora una volta le insolite unità di misura).L'ellitticità molare [q] è legata al dicroismo circolare molare dalla relazione:

eDq 3300

cl

y=q

Lo spettrofotometro CDSi usa invece una radiazione polarizzata linearmente prodotta da una lampada aXeno (a), molto potente (150-450 W). La radiazione passa poi attraverso ilmonocromatore (b), che seleziona la lunghezza d'onda desiderata, e attraversoil filtro polarizzatore (c), che la polarizza linearmente. Il cuore dellospettropolarimetro CD è il cosiddetto modulatore elettro-ottico (d), costituitoda un cristallo capace di far passare alternativamente la componente destra osinistra della luce polarizzata linearmente a seconda del campo elettrico a cui èsottoposto. Il modulatore elettro-ottico è sottoposto ad un campo elettricoalternato, per cui il campione (e) è attraversato alternativamente dallecomponenti destra e sinistra. Se le due componenti sono assorbite in manieradiversa, il rivelatore (f) origina un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza diquesta oscillazione permette di misurare il dicroismo circolare.

Può accadere che due cromofori, non chirali e non coniugati tra loro, sianotuttavia disposti nello spazio in maniera chirale. In questo caso i duecromofori generano un intenso spettro CD, caratterizzato da due bande disegno opposto, una a lunghezza d'onda maggiore ("primo effetto Cotton")ed una a lunghezza d'onda minore ("secondo effetto Cotton"). In questocaso si parla di "bisignate CD" o "split CD" . Inoltre, per convenzione, ilsegno dello split CD è definito dal segno del primo effetto Cotton: peresempio se il primo effetto Cotton è positivo (e quindi il secondo ènegativo) la curva nel suo complesso è definita come positiva. Il fenomenoin sé è chiamato con l'espressione inglese "exciton coupling" (chetradurremo accoppiamento tra i cromofori) e l'insieme di regole che mettein relazione la stereochimica della molecola con lo spettro CD è detto"metodo dell'exciton chirality".

Exciton chirality

Se i due cromofori sono uguali,il centro delle due bande (doveil De si annulla) corrispondeapprossimativamente al massimodi assorbimento del cromoforomentre se i due cromoforiassorbono a lunghezze d'ondanettamente diverse le duebande (sempre di segnoopposto) compaiono ognuna incorrispondenza di un cromoforo.

L'utilità del metodo dell'exciton chirality deriva dal fatto che il segno dellosplit CD è collegato in maniera molto semplice alla disposizione nello spazio deidue cromofori. In un cromoforo, per ogni transizione elettronica può esseredefinito un "momento di transizione" m, un vettore che descrive lo spostamentodi carica elettrica in seguito alla transizione. Consideriamo due cromofori i cuivettori m non siano paralleli e non siano sullo stesso piano. In questo caso ladisposizione nello spazio dei due vettori è chirale (non è sovrapponibile alla suaimmagine speculare), ed possibile definire una elicità del sistema di duevettori. La elicità è definita come positiva, se andando dalla punta del vettorepiù vicino all'osservatore alla punta del vettore più lontano ci si sposta in sensoorario, e negativa se ci si sposta in senso antiorario.

m1

m2

m1

m2

split CD positivo

split CD negativo

Il CD è una tecnica molto usata per lo studio conformazionale di peptidi eproteine. Una catena polipeptidica è formata da tanti amino acidi legatiattraverso il legame peptidico. L’unico cromoforo presente è quelloassociato al legame peptidico, cioè quello ammidico. Le due transizionipossibili sono la n-p* a 210-230 nm e la p-p* a 180-200 nm. La primanon è permessa per simmetria e quindi è caratterizzata da valori di e

molto piccoli (<100) mentre la seconda è più intensa.La struttura secondaria di una catena polipeptidica può esserefondamentalmente di 3 tipi: a-elica, foglietto b e b-turn. Gli spettri CDconsentono di distinguere tra queste tre differenti conformazioni .

CD di polipeptidi

Wavelength, nm

190 200 210 220 230 240 250

[ q] X

10- 3

, deg

. cm

2 .dm

ol- 1

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

a-helixb-sheet

Type 1 turnRandom coil

Poly-L-proline (P2)

La conformazione ad a-elica è la più comune in molte proteine soprattuttoquelle globulari. Uno spettro CD di un polipeptide ad a-elica è tipicamentecaratterizzato da una banda negativa a 222 nm dovuta alla transizione n-p* e da una banda negativa a 208 nm e una positiva a 198 nm relativaall’exciton coupling delle transizioni p-p* del peptide.

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

[q]

l

a-elica

Le misure CD di polipeptidi con struttura secondaria di tipo b sonocomplicate dalla scarsa solubilità del peptide stesso nel solvente solitamenteutilizzato per la misura e dalla possibilità che esistano catene parallele oanti parallele.In genere lo spettro CD mostra due assorbimenti uno positivo a 195 nm e

uno negativo a 216 nm, di comparabile intensità.

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

[q]

l

A causa però della maggiorevariabilità conformazionaledella b struttura rispettoalla a, i CD di polipeptidi astruttura b sono moltomeno riproducibili di quellirelativi a peptidi astruttura secondaria a edipendono fortemente dallalunghezza della catena edal solvente.

Foglietto b

Le strutture secondarie definite b-turn sono quelle in cui la catenapeptidica va incontro ad una inversione della sua direzione. Le strutture diquesto tipo sono tipicamente presenti in polipeptidi ciclici ricchi di residuidi prolina. Gli spettri CD di queste strutture secondarie sono molto menoinformativi dei precedenti e possono essere a secondo dei casi simili aquelli dei peptidi a conformazione di foglietto pieghettato o ad a-elica

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

b-turn

Influenza delle catene laterali

E’ E’ chiaro che il cromoforo peptidico non è l’unico cromoforo presentein una proteina. Ci sono infatti le catene laterali degli amminoacidiaromatici (Phe, Try, Tyr) che mostrano i caratteristici assorbimenti delcromoforo benzenico tra 250 e 300 nm.LLa Phe mostra un picco di assorbimento intorno a 250 nm.

y La Tyr ha un gruppo fenolico che assorbe a 280 nm per il ben notoeffetto auxocromo del gruppo OH. Un fattore caratteristico èovviamente la dipendenza dal pH del valore del massimo di assorbimento.Infatti a pH basici si osserva un notevole effetto batocromico (295nm).

I Il Trp ha il cromoforo indolico che è responsabile di spettri CD ancora più complessi, infatti sono presenti differenti transizioni nella zona tra 250-300 nm.

B-DNA o modello a nastro: 3.4 Å tra le basi dieci coppie per ogni giro d’elica 34 Å per ogni giro Solco maggiore largo 22 Å Solco minore largo 12 Å

Proprietà delle Molecole Chirali:

Attività Ottica

Una sostanza è attiva otticamente se ruota

il piano della luce polarizzata

Affinchè una sostanza esibisca attività ottica,

essa deve essere chirale e un enantiomero deve

essere in eccesso rispetto all’altro.

Gli enantiomeri si differenziano per il senso di

rotazione del piano della luce polarizzata

Attività Ottica

Rallentamento di una delle componenti di una luce piano polarizzata

Polarizzazione della Luce

prisma di Nicol

Polarizzazione della Luce

Polarizzazione della Luce

prisma di Nicol

Rotazione della luce polarizzata

Rotazione della luce polarizzata

Rotazione della luce polarizzata

a

Rotazione della luce polarizzata

Polarimetro

Rappresentazione schematica di un polarimetro.

La luce piano-polarizzata

passa attraverso una

soluzione di molecole

otticamente attive, che

ruotano il piano di

polarizzazione.

.

la rotazione osservata (a) dipende dal numero

di molecole che il raggio incontra ed è proporzionale:

al cammino ottico (l), e

alla concentrazione (c)

Rotazione specifica

a

C l

concentrazione = g/ mL

lunghezza del tubo 1

decimetro

[a] =

pertanto (a) si può esprimere come:

Rotazione specifica

la rotazione osservata (a) dipende dal numero

di molecole che il raggio incontra ed è proporzionale:

al cammino ottico (l), e

alla concentrazione (c)

una miscela che contiene uguale quantità

di due enantiomeri si chiama miscela racemica

una miscela racemica è otticamente inattiva

(a = 0)

un campione otticamente inattivo

può contenere sia una sostanza achirale

che una miscela racemica

Miscela racemica

Una sostanza otticamente pura constaesclusivamente di un solo enantiomero

purezza enantiomerica percentuale = [(moli di un enantiomero – moli dell’altro enantiomero)/moli

di entrambi gli enantiomeri] x 100

purezza ottica percentuale o eccesso enant= (potere rotatorio specifico misurato/ potere rotatorio specifico dell’enantiomero puro)

X 100

Purezza Ottica

Esempio

(S)-(+)-2-butanolo puro a = +13.52°

Il nostro campione a = + 8.42°

Purezza ottica del campione o eccesso

enantiomerico

= (+8.42°/+13.52°) x 100 = 62.3%quindi il nostro campione è costituito per il 62.3%da (S)-(+)-2-butanolo e per il 37.7% da miscela racemica (+)-2-butanolo