La diagnosi della malattia di Chagas

Dr. Andrea AnghebenCentro per le Malattie Tropicali Ospedale

Classificato Equiparato Sacro Cuore - Negrar

andrea.angheben@sacrocuore.itwww.tropicalmed.eu

Conflitti di interesse

Dichiaro di non avere alcun conflitto di interesse riguardo all’argomento trattato né di aver ricevuto alcun compenso per la presentazione odierna

Vie di trasmissione e

clinica

Modalità di trasmissione

�Rischio di trasmissione da:

�contatto con Triatomina infetta: 0,1%

�singola trasfusione di sangue (500 ml): 12-20%

�trapianto renale da donatore in fase indeterminata: 35%

�riattivazione in corso di immunodepressione: 30%

�materno-fetale: 0,1-12%

�Rassi, The Lancet 2010

Storia naturale della malattia di

Chagas

Note epidemiologiche

Il tasso di sottodiagnosi èinaccettabile (99%)

Diagnosi

A chi dovrebbe essere offerto/fatto il test per Chagas?

A chi:

� Abbia rischio epidemiologico.

Screening e Diagnosi

� Voglia donare sangue/tessuti.

� Sia gravida.

� Sia donatore di organo.

� Abbia una clinica compatibile con malattia di Chagas

� Possa andare incontro a immunodeficienza (HIV!) o immunodepressione.

+

Diagnosi

� Parassitologica diretta (MHT, QBC, goccia spessa e

striscio sottile, coltura, xenodiagnosi)

� Sierologica (due tecniche diverse che sfruttino

diversi antigeni; 3° test di conferma)

� PCR

Rassi et

al. 2012

Ricerca Trypanosoma in provetta da

microematocrito (MHT)

�L’esame tramite capillare da ematocrito si basa sul principio della forza

centrifuga la quale fa in modo che, un corpo che si ponga in movimento

circolare è sottoposto ad una forza che lo allontana dal centro del circolo.

�Le stratificazioni degli elementi dovute alla forza centrifuga sono in

funzione della densità e del volume degli stessi e della viscosità del liquido

di sospensione.

� In un sangue centrifugato in capillare la concentrazione degli eventuali

tripanosomi è tra il buffy–coat e il plasma.

Microematocrito (MHT)

�12.000 giri per 5 minuti �Scotch bi-adesivo �Fisiologica�Vetrino coprioggetto

Sensibilità 80-90% nel Chagas acuto: Rassi & Luquetti, 2000

Aspetto in goccia spessa

Aspetto al QBC™

Diagnosi sierologica

� Test convenzionali (IHA; IFAT; ELISA basati su ag crudi)

� Test non convenzionali (ELISA basati su ag ricombinanti, PCR)

Sierologie a confronto

Sierologie a confronto

� Tre pannelli di sieri

� - un pannello da impresa esterna: 38 siero+ per Chagas endemici, 2 controlli non reattivi

� - un II pannello di 128 sieri: 28 pts con Chagas cronico diagnosticato in Spagna, 73 LA sani e 22 spagnoli sani

� - un III pannello di 60 soggetti spagnoli, non viaggiatori in LA, 30 siero+ per leishmania e 30 per malaria

Sierologie a confronto: risultati

Sierologie a confronto: risultati

2010

Il problema dei discordanti

o Si possono avere meno del 2% di risultati

discordanti appaiando 3 test...

o Test di conferma o terzo test → quale?

o WB? � in house, futuro Novatec

- TESA (immuno blot con ag escretorio-secetorio)?

Biomerieux Brasil, non CE

- RIPA (radioimmunoprecipitation assay)? CDC

Atlanta

1 2 3 4

1 – Positive

2 – Negative

3 – Positive, séroconversion

4 – Negative (non specific)

5 – Equivocal

Dominant band 160 kDa

120 kDa

200 kDa

5

TESAcruzi - Parameters

Serum panel bioMérieux + serum from blood banks

S e n s it iv ity 1 0 0 %

S p e c if ic ity 9 9 ,5 %

P P V 9 8 ,7 %

P N V 1 0 0 %

E ff ic ie n c y 9 9 %

K a p p a in d e x 0 ,9 9

N p o s it iv e s 7 9 5

N n e g a t iv e s 1 9 4 6

The TESA-blot (Y strain of T.cruzi) showed that a 150-160 kDa band was recognised in the serum of 100% of chronic Chagas disease patients and did not cross-react in case of leishmaniasis (Umezawa et al. 1996).

1 2 3 4

1 – Positive

2 – Negative

3 – Positive, séroconversion

4 – Negative (non specific)

5 – Equivocal

Dominant band 160 kDa

120 kDa

200 kDa

5

The TESA-blot was also evaluated by Nakazawa et al. (2001) using TESA from T. cruzi strains of different biodemes (WSL, Colombiana and 12SF). A 150-170 kDa polypeptide was recognised in 100% of chronic Chagas disease patients tested (with cardiac, asymptomatic, digestive and mixed forms). Cross-reactions with visceral and cutaneous leishmaniasis serum were observed in the case of some polypeptides below 150 kDa and no reaction was observed with normal human control serum.

1 2 3 4

1 – Positive

2 – Negative

3 – Positive, séroconversion

4 – Negative (non specific)

5 – Equivocal

Dominant band 160 kDa

120 kDa

200 kDa

5

However, this assay is of no use in monitoring cure, since it does not allow for assessment of serological titre decay (Matsumoto et al. 2002).

1 2 3 4

1 – Positive

2 – Negative

3 – Positive, séroconversion

4 – Negative (non specific)

5 – Equivocal

Dominant band 160 kDa

120 kDa

200 kDa

5

Poster presented at

ECTMIH, Barcelone,

2012

E i test rapidi?

90,1/91%

76,6/79%

92,9/94%

92,9/93,2%

87,2/93,2%

10,6/97%

90,7/94%

84,9/70,7%

94,2/94,7%

97,2/94%88,7/97%

Lineages T.cruzi: primo consenso

1999

I cloni vanno classificati in TC I → TC II

(su base biologica → biodemi, biochimica → zimodemi, biologica molecolare →

miniesoni, RNA ribosomale, DNA, elettroforesi enzimatica)

Lineages T.cruzi: nuovo consenso 2009

I cloni vanno classificati in TC I → TC VI

(su base delle Discrete Typing Units → a set of stocks that are genetically more similar to each other than to any other

and are identifiable by common genetic, molecular, or immunological markers

Diagnosi nella malattia cronica

� Parassitologica diretta (MHT, QBC, goccia spessa e striscio

sottile, xenodiagnosi) → insufficiente sensibilità (50-70%) →

non raccomandati (Brasile, WHO)

� Sierologica (due tecniche diverse che sfruttino diversi

antigeni; 3° test di conferma) → è considerato il miglior

approccio

� PCR → uso controverso in questa popolazione

PCR nella diagnosi di malattia

cronica

� La PCR è raccomandata in funzione della situazione e delle linee guida

seguite

� PCR: raccomandata dal Consenso brasiliano e cileno nel Chagas cronico solo

quando i test sierologici siano inconcludenti.

� Raccomandata solo come test di conferma sul donatore, nelle linee guida di

El Salvador.

� E' raccomandata solo per i casi acuti, congeniti e per il follow-up dopo

infezione acuta (WHO, USA guidelines)

� Secondo le linee guida spagnole un paziente è affetto da Chagas quando ha

due sierologie positive oppure una PCR+.

� La PCR ha una sensibilità del 50-90%

� Una specificità praticamente del 100%

� Allo stato attuale la sierologia ELISA ha una performance migliore

Campione Genesig PrimerDesign (Ct) Progenie Molecular (Ct)

1* neg neg

2 neg pos (29)

3 pos (33.51) pos (26)

4 neg pos (20.99)

5 neg pos (31)

6 neg pos (34)

7 neg pos (34.43)

8 neg pos (34.13)

9 neg neg

10 neg neg

11 neg neg

12 neg neg

13 neg pos (38.90)

14 neg pos (33.54)

Evaluation of two commercial real-time PCR kit for in blood T. cruzi detection.Author: Formenti F., Angheben A., Bisoffi Z. e Perandin F.

Centro per le Malattie Tropicali, Ospedale Sacrocuore, Negrar, Verona

Introduzione: La malattia di Chagas […]

Metodi: Nello studio sono stati presi in considerazione 14 campioni di sangue positivi per T. cruzi. 13 sono stati conservati in Guanidina 6M ed uno in EDTA a -80°C. Dei 13 campioni, 3 sono

stati forniti da CAEDES, Cochabamba, Bolivia, i rimanenti 10 sono stati forniti dal Centro Nazionale di Microbiologia Carlo III, Madrid. Il campione conservato in EDTA proviene da un paziente

ricoverato presso il Centro Malattie Tropicali di Negrar.

Tutti i campioni sono stati estratti con il sistema automatico MaGnaPure LC.2 (Roche) utilizzando il KIT DNA-I. In ciascun campione è stato messo un controllo esogeno di estrazione/presenza di

inibitori (PhHV). L’eluato (100 ul) è stato utilizzato per le reazioni di amplificazioni in Real-Time PCR (TaqMan), seguendo le istruzioni riportate nel kit. Ciascun kit prevede l’amplificazione di

un controllo interno e di un controllo positivo di amplificazione.

I due sistemi commerciali saggiati sono: Quantification of Trypanosoma cruzi (Genesig PrimerDesign, England) e CHAG-U (Progenie Molecular, Valencia).

Risultati: 9 su 14 campioni amplificati con kit Molecular Progenie sono risultati positivi, mentre solo 1 è risultato positivo quando amplificato con kit Genesig-PrimerDesign

*: campione conservato in EDTA a -80°C

Conclusioni: […] Attualmente il panorama commerciale per diagnosi molecolare di Chagas è molto scadente; i pochi kit disponibili peccano di scarsa sensibilità; mentre nel mondo della ricerca

esistono miriadi di differenti approcci (differenti target amplificati) per cui non si riesce a standardizzare un protocollo. Questo scenario e i risultati ottenuti in questo studio preliminare

evidenziano quanto sia necessario unire le forze per trovare un sistema di amplificazione specifico, sensibile e standardizzato.

Poster presentato al Convegno «Dalle malattie tropicali alla salute globale, Verona, 16-18/09/2014

PCR: lavoro da tenere sul comodino

Disponibilità test per Chagas in Italia (oltre a Negrar)

-Microbiologia, Ospedale Papa Giov XXIII, Bergamo

-Microbiologia, Ospedale Sant’Orsola, Bologna

-Unità di Malattie Infettive e Tropicali, AZOSP Careggi – Univ. di Firenze

-Parassitologia, Ospedale IRCCS San Matteo, Pavia

-Microbiologia, Ospedale San Martino, Genova

-Microbiologia, Ospedale Amedeo di Savoia, Torino

-Microbiologia, Ospedale L. Sacco, Milano (Dr. Romualdo Grande)

-Microbiologia, Ospedale Niguarda, Milano

-MIPI, ISS, Roma (dr. Gradoni)

-Parassitologia, Università La Sapienza, Roma (Prof. Cancrini)

-Microbiologia, Ospedale IRCCS L. Spallanzani, Roma

-Unità Diagnostica Patologie Diffusive, Palermo (Dr.ssa Giustina Vitale)

� Dati epidemiologici migranti LA in Italia: distribuzione a macchia di leopardo.

� Differenti prevalenze inter- e intranazionali (Paesi LA)

� Nuove frontiere per il controllo di questa NTD: congenito, trasfusionale e trapianti, identificazione dei casi (adottati, migranti e viaggiatori)

Perché il Chagas ci deve interessare?

� Dove la malattia viene cercata, emergono i casi

� (Milano Ospedale Sacco prof. Antinori – Dr. Grande; Roma INMI Spallanzani dr. Nicastri e colleghi; Bergamo AO Papa Giovanni XXIII – ASL BG programma di screening materno.infantile dr.ssa Trezzi – dr. Raglio – dr. Goglio – dr.ssa Soavi – dr. Rizzi; Firenze Mal. Infettive e Tropicali Ospedale Careggi prof. Bartoloni dr. Zammarchi; Bologna Mal.Infettive e CSI)

� Difficile organizzazione (outreach activities � MSF � BG, MI, Roma), mantenimento di allerta, sensibilizzazione classe medica, salute pubblica, comunità di migranti.

Perché il Chagas ci deve interessare? (2)

“Livelli”• Ospedali di riferimento (trasfusionale e trapianti):

���� 1 buon ELISA

• Centri di riferimento per malattie parassitarie:

• � 2 ELISA buoni (convenzionale e non, possibilmente), un test di conferma (WB, TESA, IFAT?), parassitologia diretta e con arricchimento, PCR

• Altri ospedali: � test rapido (?)

Thanks

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