YONA OKTA SARI1010413008

Universitas Andalas

Dosen Pembimbing : Prof.DR Sumaryati Syukur

Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy roots production tea leaves [Camellia sinensis

(L) O Kuntze]

Agrobacterium rhizogenes transformation

Investigating agrobacterium rhizogenes mediated transformation

[Camellia sinensis (L) O Kuntze]

ABSTRACTDaun dari the [Camellia sinensis (L) O Kuntze] tanaman yang telah diubah dengan Agrobacterium

Rhizogenes strain (MTCC) dan dengan menginduksikan hairy roots. Diantaranya dengan perbedaan

konsentrasi dari acetosyringone tested 300µM/L yang telah didapatkan untuk meningkatkan frekuensi

pembentukan hingga 70%. Murashige and Skoog (MS) medium tambahan dengan 30g/L maltosa dan

indole-3-asam asetat (IAA) pada 5mg/L yang telah tepat didapatkan untuk jaringan hairy roots danakumulasi dari senyawa fenolik. Untuk mempertegas studi dilakukan analisis PCR menggunakan

rol Cgen primer untuk pembentukan. Proses ampilifikasi (menguatkan) fari gen yang spesifik dibentuk

pada540 bp. Dinyatakan dengan analisis HPLC bahwa katekin mempunyai tingkat yang lebih tinggi dan fraksi-fraksi yang muncul dari jaringan pembentukan. Fraksi-fraksi katekin yaitu EC, ECG, EGC dan EGCG dijumpai pada untransformed leaves dan hairy roots yang dihasilkan oleh sel Agrobacterium

yangtelah terinfeksi.

Persiapan EksplantTea shoot of the clone from tea Experimental

farm of UPASI-9-Remove from the shoot at their base- make 2 cm long segments, and each containing give one node.- The nodal segments were washed under running tap water for 30 min-Disinfected with 70% (v/v) ethanol for 1 min-Surface sterilized with 0.1% (w/v) HgCl2 for 3 min-Rinses in sterile distiled water.

Surface sterilized explants

- Were cultured on Murashige and skoog (MS) basal media suplements with (3% sucrose, 3 mg/L 6-benzyl-adenine (BA) and 0.8% agar)

Sprouting

-Culture dipindahkan ke medium perbanyakan (multiplikasi) dengan menggunakan hormon pertumbuhan BA pada konsentrasi 5 mg/L dan 2 subculture dengan rentang selama 30 hari pada media yang sama.- pH untuk semua media hingga 5.6 sebelum proses autoclave.- Autoclaving selama 15 menit pada suhu 121oC- cultures di inkubasi selama 25± 1oC dibawah cahaya fluoroscent selama 16 jam photoperioda (36 µmol/m2.s) selama 2 bulan.

Fully exposed leaves

- Daun yang telah selesai di kulturkan dipisahkan dari pucuk baru yang telah telah tumbuh secara in vitro yang digunakan sebagai eksplant pembentukan

Persiapan Kultur BakteriA. Rhigozenes strain MTCC 532, yang telah

disimpan didalam glycerol yang telah disterilkan pada suhu -70oC

- Dikulturkan pada YEB, komposisi : (1g/L ekstrak ragi, 5 g/L ekstrak daging. 5 g/L peptone dan 0,5 g/L MgSO4 ) merupakan media padat untuk mengaktifkan strain.-3x subkultur pada media yang sama.- Bakteri tersebut dipindahkan kedalam media YEB cair dan dikultur selama 16 jam pada suhu 25oC.- Shaker 250 rpm.

Suspensi bakteri cair dipindahkan kedalam

sentrifuge steril- Sentrifuge selama 10 menit 5000 rpm

Suspensi endapan bakteri di dalam media MS cair dengan

3% sukrosa

Suspensi ini yang digunakan untuk pembentukan dari eksplan daunSuspensi ini yang digunakan untuk pembentukan dari eksplan daun

Pembentukan Kultur Akar Rambut3-4 potong pucuk daun

-Kokultivasi dengan 25 mL MS cair didalam 100 mL labu.- shaker 200 rpm dalam keadaan gelap selama 3 jam.- eksplan dipindahkan kedalam botol yang berisi tisu steril

Eksplan Tumbuh

-Kokultivasi pada media MS padat konsentrasi acetosyringone berbeda (100,200,300,400,500 µM/L) dengan 0.8% bacto agar.- Kokultivasi selama 48 jam pada suhu 25±1oC dalam keadaan gelap- dicuci dengan 50 mL pada media basal (30 g/L sukrosa dan 250 mg/L cefotaxine)- Kultivasi- Medium padat dicuci dengan 0.8% agar

Subkultur I

- Dipindahkan ke media MS yang mengandung (sukrosa, dextrosa, maltosa, fruktosa) yang berbeda konsentrasi

Subkultur II

- Dipindahkan ke media MS yang mengandung hormon pertumbuhan (IAA-3 dan 2,4-dichlorophenoxy acetic acid)

Kalus yang berkembang dari

eksplan daun hasil transformasi

Konfirmasi PCRDNA plasmid A.rhizogenes

strain

DNA dari daun yang telah di infeksi selama 15 hari

Kalus yang telah diinfeksi selama 20

hari sebagai amplified PCR- Diekstraksi

menggunakan Genelute HP plasmid miniprep kit

- Diekstraksi menggunakan metoda Mariya John

+ 50 ng DNA plasmid-DNA dari jaringan daun non-transformed (+ dan – controls)+ 25 MI campuran pereaksi-Denaturasi selama 4 menit pada suhu 94oC-Diputar (cycles) 30 x selama 45 detik T=94oC- Annealing (proses penempelan primer ke DNA template) selama 60 detik suhu 55oC- Extension/polimerisasi (proses pemanjangan rantai DNA) pada suhu 72oC

Containing of MI :

1x PCR buffer , 3.5 mM

MgCl2 , 25 pmol forward

strain primer + 0.2 mM

dNTPs, 1 U DNA Taq

polumerase

Produk amplified/produk PCR pada 1.2% agarose gel

+ noda ethidium bromida-Dilihat dibawah sinar lampu UV, catat.-Hitung fragment amplified yang terbentuk menggunakan software (Total Lab Ver.1 Amersham Bioscience, USA)

Jumlah fragment amplified

Penentuan Jumlah Polyphenol dan Katekin

Penentuan jumlah

Polyphenol

Using procedure of

Dev Choudhary

and Goswami

Penentuan

fraksi Katekin

HPLC

Hasil dan Diskusi• Perbedaan konsentrasi dari

acetosyringone yang tergabung dalam medium nutrisi dan berpengaruh terhadap transformasi yang diamati.

• Diantara perbedaan konsentrasi yang diuji cobakan (100-500µM/L), acetosyringone pada konsentrasi 300µM/L yang memiliki frekuensi transformasi tertinggi secara signifikan, yang mana pada konsentrasi yang lebih rendah (<300µM/L) atau lebih tinggi (>300µM/L) mengalami penurunan.

• Hubungan kuadrat antara konsentrasi acetosyringone dan frekuensi transformasi pada tingkat 0.5%.

• Acetosyringone merupakan turunan dari asam amino yang berfungsi sebagai sumber nutrisi untuk bakterium invading dan meninggikan tingkatan transformasi.

• Agrobacterium yang diinfeksi digunakan sebagai sumber nutrient

• Analisis PCR dari jaringan yang telah ditransformasi menunujukan amplifikasi pada 540 bp di dalam daun, kalus, dan sampel akar berambut (hairy root) dan didalam plasmid (kontrol positif) mengindikasikan peristiwa transformasi.

• Tetapi dalam kontrol negatif (non transformed tissue) tidak ada amplifikasi (Fig 2)

• Konfirmasi dari semua akar berambut mempunyai perkembangan dari kalus yang telah tertransformasi.

• Diantara berbeda sumber dari karbon organik, maltosa pada tingkat 3% memiliki presentasi jaringan akar berambut yang paling tinggi, yang kemudian diikuti dextrosa, sukrosa dan fruktosa. (Tabel 2)

• Kultur eksplan pada media pendukung dengan fruktosa menunjukan presentasi yang sangat rendah dari kultur akar berambut.

• Yang tidak mengandung sumber karbon, kalus yang tersisa menjadi keras, kering dan berwarna coklat.

• Maltosa merupakan sumber karbon yang paling baik untuk menginduksi akar berambut juga merupakan pengamatan yang lebih cepat.

• Mengatur pertumbuhan tanaman merupakan salah satu bagian yang sangat penting dalam induksi akar berambut dari jaringan eksplan teh.

• Secara umum, auksin mampu membentuk akar.• Waktu yang dibutuhkan untuk menginduksi akar

selama transformasi kalus selama 15 hari (IAA) dan 20 hari (2,4-D) dan 31 hari untuk kedua media (IAA dan 2,4-D).

• Tanpa auksin waktu yang dibutuhkan untuk menginduksi pada kalus transformasi selama 35 gari dan 60 hari untuk kalus yang tidak mengalami transformasi (untransformed).

• Medium yang mengandung IAA merupakan merupakan kecepatan induksi dari akar berambut kemudian diikuti oleh 2,4-D (Tabel 3)

• Kombinasi dari kedua hormon yang ditunjukan tidak mengalami reduksi yang signifikan terhadap waktu hairy root induksi

• Induksi akar tertunda pada kalus untransformed dimana untuk proses terbentuknya terjadi setelah 2 bulan sedangkan untuk membentuk akar pada kalus transformed terjadi selama 35 hari.

• Tingkat fenolik dalam akar berambut ditentukan dan dibandingkan dengan daun non-transformed.

• Sintesis polyphenol dan fraksi katekin yang didapatkan (EC, ECG, EGC, EGCG ) didalam medium hairy root sangat lambat dibandingkan dengan daun unstransformed.

• Jumlah yang paling banyak dari fraksi katekin= EGCG dan fraksi yang paling sedikit=Ec

• Biosintesa metabolit sekunder dalam akar transformed secara genetik telah terpantau, tetapi dipengaruhi oleh nutrisi dan faktor lingkungan.

• Komposisi dari medium jaringan memberikan pengaruh terhadap hasil metabolit sekunder.

• Sumber karbon yang digunakan sebagai komponen basal dalam medium jaringan pertumbuhan tanaman merupakan faktor utama.

Terima Kasih