Kontrola glikolize

►Glikolitički put je strogo kontroliran. Brzina konverzije glukoze u piruvat regulirana je tako da zadovolji dvije osnovne potrebe ćelije:

- nastajanje ATP iz ragradnje glukoze - obezbjeđivanje gradivnih blokova za biosintetske reakcije

►U metaboličkim putevima potencijalna mjesta kontrole su enzimi koji kataliziraju u suštini ireverzibilne reakcije.

■ Reakcije koje su praktično ireverzibilne u glikolizi su one koje kataliziraju heksokinaza, fosfofruktokinaza-1 i piruvat kinaza. Stoga ovi enzimi, pored katalitičke imaju i regulatornu ulogu i svaki služi kao mjesto kontrole.

■ Aktivnosti ovih enzima reguliraju se reverzibilnim vezivanjem alosteričkih efektora ili kovalentnom modifikacijom. Regulacijom transkripcije mogu se mijenjati količine ovih važnih enzima, da bi se udovoljilo izmijenjenim metaboličkim potrebama.

■ Vrijeme potrebno za reverzibilnu alosteričku kontroju enzima obično su milisekunde, za regulacija reverzibilnom fosforilacijom potrebne su sekunde, a regulacija kontrolom transkripcije zahtijeva sate.

■ Fosfofruktokinaza-1 je glavni kontrolni element u glikolitičkom putu sisara.

Fosfofruktokinaza-1 je ključni enzim u kontroli glikolize.

● Fosfofruktokinaza-1 je tetramer koji se sastoji od četiri identične podjedinice (340 kDa).

►Visoki nivoi ATP alosterički inhibiraju fosfofruktokinazu-1 u jetri tako da smanjuju njen afinitet prema fruktoza 6-fosfatu. Visoke koncentracije ATP pretvaraju hiperboličnu krivu vezivanja fruktoza 6-fosfata na enzim u sigmoidnu. ATP izaziva ovaj efekt vezivanjem na specifično regulatorno mjesto na enzimu koje se razlikuje od onog katalitičkog.

►AMP poništava ovo inhibitorno djelovanje ATP. AMP je pozitivni regulator fosfofruktokinaze-1 i stimulira glikolizu. Sa sniženjem količnika ATP/AMP, što indicira pad energetskog naboja ćelije, aktivnost fosfofruktokinaze-1 se povećava.

Struktura fosfofruktokinaze 1 (PFK- 1). Fosfofruktokinaza jetre je tetramer četiri identične podjedinice. Označene su pozicije katalitičkih i alosteričkih mjesta.

Trakasti model PFK-1. Prikazane su dvije od četiri podjedinice PFK-1. Svaka podjedinica ima katalitičko mjesto u kome su ADP (plavo) i fruktoza 1,6-bisfosfat (žuto) gotovo u kontaktu i mjesto za alosterički aktivator AMP (plavo) locirano u interfazi između podjedinica.

Alosterička regulacija PFK-1 mišića sa ATP.

● Visoki nivoi ATP alosterički inhibiraju enzim i smanjuju njegov afinitet prema fruktoza 6-fosfatu.

● Visoke koncentracije ATP pretvaraju hiperboličku krivu vezivanja fruktoza 6-fosfata u sigmoidnu.

Prikaz regulatora koji utiču na aktivnost PFK-1.

X označava alosteričku inhibiciju

▲ označava alosteričku aktivaciju

Fruktoza 2,6-bisfosfat (F-2,6-BP) je snažan aktivator fosfofruktokinaze-1.

● Fruktoza 2,6-bisfosfat aktivira fosfofruktokinazu-1 tako što povećava afinitet enzima prema supstratu (fruktoza 6- fosfatu) i umanjuje inhibitorni efekt ATP.

● Fruktoza 2,6- bisfosfat je alosterički aktivator koji mijenja konformacijsku ravnotežu ovog tetramernog enzima sa T u R stanje.

Na koji način se regulira odgovarajuća koncentracija fruktoza 2,6-bisfosfata?

■ Fruktoza 2,6-bisfosfat sintetizira i razgrađuje bifunkcionalni enzim fosfofruktokinaza 2 (PFK-2).

► Kinazna domena PFK-2 (6-fosfofrukto-2-kinaza) katalizira fosforilaciju fruktoza 6-fosfata sa ATP i nastajanje fruktoza 2,6-bisfosfata.

► Domena sa fosfataznom aktivnošću, fruktozabisfosfataza 2 (FBPaza 2), hidrolizira fruktoza 2,6-bisfosfat u fruktoza 6-fosfat.

○ Obje enzimske aktivnosti nalaze se na jednom polipeptidnom lancu.

Bifunkcionalni enzim vjerovatno je nastao fuzijom gena koji koji kodiraju kinaznu i fosfataznu domenu.

Bifunkcionalni enzim (fosfofruktokinaza 2; PFK-2)

Shematski prikaz primarne strukture izoenzima PFK-2 ( 6-fosfofrukto-2-kinaza / fruktoza-2,6-bisfosfataza) prisutnih u jetri (a) i srcu (b).

● Domena sa kinaznom aktivnošću locirana je na N-terminalnoj polovini lanca, a domena sa fosfataznom aktivnošću na C-terminalnoj polovini. Slovo P označava mjesto na kome protein kinaza A fosforilira PFK-2.

(a) (b)

□ Bifunkcionalni enzim postoji u pet izozimskih (izoenzimskih) oblika koji se razlikuju po veličini, kinetici, imunološkim i regulatornim svojstvima.

● L oblik dominantno prisutan u jetri i M oblik prisutan u mišićima, nastaju alternativnim splajsingom produkta transkripcije jednog gena.

■ L (jetreni) izooblik PFK-2 pomaže održanju homeostaze glukoze u krvi.

Šta određuje kada će na bifunkcionalnom enzimu dominirati katalitička aktivnost PFK 2, a kada aktivnost FBPaza 2?

■ Aktivnosti PFK 2 i FBPaza 2 su recipročno kontrolirane fosforilacijom specifičnog serinskog ostatka.

Kada se nivo glukoze u krvi snizi, u krvi se povećava nivo hormona glukagona, koji putem 7TM receptora i Gsα pokreće kaskadu cikličkog AMP (cAMP), a protein kinaza A fosforilira bifunkcionalni enzim. Ova kovalentna modifikacija aktivira FBPazu 2 i inhibira PFK 2, pri čemu se snižava nivo fruktozo 2,6- bisfosfata, što inhibira glikolizu.

■ Kada je koncentracija glukoze u krvi visoka, u jetri se povećava koncentracija fruktoza 6- fosfata. Izobilje fruktoza 6 - fosfata dovodi do viših koncentracija fruktoza 2,6- bisfosfata, koji potom stimulira fosfofruktokinazu-2.

□ Kada je glukoza prisutna u izobilju, dolazi do defosforilacije bifunkcionalnog enzima.

Ova kovalentna modifikacija aktivira kinaznu aktivnost enzima (PFK 2), a inhibira fosfataznu (FBPazu 2).

Nivo fruktoza 2,6- bisfosfata se povećeva, a glikoliza ubrzava.

● Ukljanjanje fosfatne grupe sa enzima vrši protein fosfataza, koju aktiviraju povišeni nivoi fruktoza 6 - fosfata.

■ Heksokinaza – tačka kontrole glikolize

Heksokinazu, enzim koji katalizira prvi stupanj glikolize, inhibira njegov proizvod glukoza 6- fosfat. - Visoke koncentracije glukoza 6- fosfata signaliziraju da ćelija više ne treba glukozu za dobivanje energije, skladištenje u obliku glikogena ili kao preku- sora za biosintetske procese i da glukoza može biti prepuštena krvi.

Inhibicija fosfofruktokinaze-1 dovodi do inhibicije heksokinaze.

- Kada je fosfofruktokinaza-1 inaktivna povećava se koncentracija fruktoza 6- fosfata. Time se povećava i koncentracija glukoza 6- fosfata pošto je u ravnoteži sa fruktoza 6- fosfatom.

● Zašto fosfofruktokinaza, a ne heksokinaza, određuje ritam glikolize? - Glukoza 6- fosfat nije intermedijat samo glikolitičkog puta. Glukoza 6- fos- fat se može prevesti u glikogen, ili se oksidirati u putu pentoza fosfata da bi se dobio NADH.

Prva ireverzibilna reakcija u glikolizi je prevođenje fruktoza 6- fosfata ufruktoza 1,6- bisfosfat i stoga je mnogo pogodnije da fosfofruktokinaza-1 bude primarno mjesto kontrole.

■ Piruvat kinaza (tetramer 57 kDa podjedinica) –

enzim koji katalizira treći ireverzibilni stupanj u glikolizi, kontrolira izlaz iz ovog metaboličkog puta.

● U finalnom stupnju glikolize, koji katalizira piruvat kinaza, nastaju ATP i piruvat, centralni metabolički intermedijat, koji se može dalje oksidirati ili koristiti kao gradivni blok.

■ Nekoliko izozimskih oblika piruvat kinaze, koje kodiraju različiti geni, nalazi se u sisara.

L oblik preovladava u jetri, a M oblik u mišićima i mozgu.

● L i M oblik piruvat kinaze imaju više zajedničkih svojstava. Oba kooperativno vezuju fosfoenolpiruvat.

►Fruktoza 1,6 - bisfosfat, proizvod predhodnog ireverzibilnog stupnja glikolize, aktivira oba izoenzima i omogućava im da održe korak sa visokim nadolazećim tokom intermedijata.

►ATP alosterički inhibira L i M oblike piruvat kinaze, što kod visokog energetskog naboja usporava glikolizu.

►Alanin, koji se u jednom stupnju sintetizira iz piruvata također alosterički inhibira piruvat kinazu – u ovom slučaju signalizira izobilje gradivnih blokova.

Piruvat kinaza kao kontrolna tačka glikolize.Aktivnost L izooblika piruvat kinaze kontrolira se alosterički i kovalentnom modifikacijom enzima.

■ Izozimski (izoenzimski) oblici piruvat kinaze razlikuju se po osjetljivosti na kovalentnu modifikaciju.

►Katalitička svojstva L oblika piruvat kinaze kontroliraju se reverzibilnom fosforilacijom. Kada je nivo glukoze u krvi nizak, glukagon pokreće kaskadu cAMP što dovodi do fosforilacije ovog enzima. Fosforilacijom aktivnost piruvat kinaze se smanjuje.

● Hormonom pokretane fosforilacije sprječavaju jetru da koristi glukozu ako je mnogo hitnije trebaju mozak i mišići.

►Katalitička aktivnost M oblika piruvat kinaze, koji je prisutan u mišićima i mozgu, ne kontrolira se reverzibilnom fosforilacijom.

○ Ovo je primjer načina na koji izoenzimi doprinose metaboličkoj raznolikosti različitih organa.