Kliniczne zastosowania komórek macierzystych w neonatologii

Jacek Rudnicki prof.nadzw.PAMZabrze 2010

Powikłania wcześniactwaWcześniaki mogą doznać uszkodzenia wielonarządowego; mózgowia (encefalopatia), oczu (retinopatia wcześniaków), jelit (martwicze zapalenie jelit), płuc (dysplazja oskrzelowo-płucna) skutkującego zaburzeniami rozwoju psychomotorycznego i niemożnością osiągnięcia pełni ludzkich

Matka najlepszą klinikąDzieci będące w tym samym wieku postkonceptualnym lecz przebywające w warunkach wewnątrzmacicznych osiągają dojrzałość do życia zewnątrzmacicznegoNie doznają uszkodzeń narządów oraz ich funkcjiI rozwijają się prawidłowo w dalszym życiu osobniczym

Komórki macierzystephoto by Wellcome Trust

Rozwój badań nad biologią komórek macierzystych daje szanse na poznanie mechanizmów ich działania w warunkach prawidłowego rozwoju człowieka, jak również w sytuacjach patologicznychPojawiają się doniesienia, iż uszkodzenia wielonarządowe i zaburzenia rozwoju u wcześniaka mogą być naprawiane przez jego własne niezróżnicowane komórki macierzyste. (Minoru Tomita et al., 2002. Hong J Lee et al. 2007)

Mniejszy wiek płodowy, więcej komórek macierzystych

Wiele danych przemawia za tym, że na wcześniejszych etapach życia płodowego stężenie komórek macierzystych pluripotencjalnych krążących w krwi obwodowej, a zatem także i w pępowinie, jest większe niż u noworodków donoszonych.Z drugiej strony w pierwszym tygodniu po porodzie ilość komórek macierzystych zmniejsza się o ok. 50%, a w tym czasie zwykle zaczynają się powikłania takie jak encefalopatia, NEC, ROP, BPD (Bizzarro MJ 2007)

HipotezaUwzględniając powyższe wysunięto hipotezę, że autohemotransfuzja pełnej krwi własnej wcześniaka uzyskanej z pępowiny może przyczynić się do zmniejszenia uszkodzenia narządów z powodu podjęcia funkcji naprawczych przez jego własne komórki macierzyste. (Hong J.Lee., Kwang S.Kim., Eun J.Kim et al. 2007), (Minoru Tomita, Yasaushi Adachi, Haruhiko Yamada et al. 2002)

• Obserwacje kliniczne wskazują, iż objętość pozyskanej od wcześniaka w trakcie porodu krwi pępowinowej może stanowić nawet 50% całej jego krwi obwodowej. Utrata tak dużej ilości komórek macierzystych pluripotencjalnych (VSEL) może mieć znaczący ujemny wpływ na dalszy rozwój wcześniaka w warunkach zewnątrzmacicznych.

Autohemotransfuzja po operacjach chirurgicznych

Pojawiły się również prace, w których użyto do autohemotransfuzji pełnej krwi pępowinowej u noworodków wymagających pilnych zabiegów chirurgicznych po urodzeniu, a zdiagnozowanych przed spodziewanym porodem (Tomoaki T, Sachiyo S, Masatochi N et al 2003)

Autohemotransfuzja

bezpieczeństwo

Autohemotransfuzja krwi pępowinowej jest interwencją medyczną znacznie bezpieczniejszą od transfuzji krwi allogenicznej.Jest procedurą medyczną stosowaną od lat.Novum jest wiedza jaką posiadamy o komórkach pluripotencjalnych.

Czy terapia komórkam

i m

acierzystymi m

oże zaszkodzić?Obawa, czy nie spowodują one ewentualnych niepożądanych skutków ubocznych jak np. rozwój nowotworu, nie ma uzasadnienia w przypadku komórek macierzystych nieembrionalnych, a tylko takie obecne są we krwi pępowinowej.Także nie występuje w tym przypadku reakcja „przeszczep przeciwko gospodarzowi”. (Sun X et al. 2005)

Operacja naprawcza splotu ramiennego.Prof. A.Gilbert ParisSzczury z uszkodzonym rdzeniem kręgowym leczone były komórkami macierzystymi z dobrym efektem w rezonansie magnetycznym. Może można tak leczyć przerwanie splotu barkowego? (Chen et al. 2001)

Derived from human embryonic stem cells, precursor neural cells grow in a lab dish and generate mature neurons (red) and glial cells (green).Photo: courtesy Su-Chun Zhang, University of WisconsinKomórki macierzyste z krwi pępowinowej są zdolne do pobudzania wzrostu tkanek hematopoetycznych, nabłonkowych,wyściółkowych u neurologicznych in vivo i in vitro.Są zdolne do leczenia chorób naczyniowych, ocznych, ortopedycznych, neurologicznych i endokrynnych. Badania pokazały, że krew pępowinowa zawiera mieszaninę wielopotencjalnych komórek macierzystych zdolnych do spowodowania wzrostu komórek endodermalnyh, mezodermalnych i ektodermalnych. (David T. Harris 2009

Różnice pomiędzy komórkami embrionalnymi a macierzystymiBritish Journal of Hematology, 147, 177-184, 2009 David T. Harris

• Komórki embrionalne mają duży potencjał rozwojowy, wysoką proliferatywność, małe ryzyko zakażenia wirusem.

• Komórki krwi pępowinowej są młodsze, z doskonałą zdolnością proliferacji, różnicowania się, z niskimi wymaganiami zgodności tkankowej HLA, niskim ryzykiem choroby GVHD (przeszczep przeciwko biorcy), niskim ryzykiem infekcji, możliwość autohemotransfuzji.

Czy komórki m

acierzyste mają

znaczenie w zakażeniach?

Dysfunkcja i zmniejszenie liczby progenitorowych komórek macierzystych endotelialnych może odgrywać ważną rolę w inicjacji dysfunkcji narządów w przypadku urazu i sepsy (Tian Hang Luo et al. 2009)W naszych obserwacjach autohemotransfuzja nie zapobiegła zakażeniom szpitalnym u dwóch wcześniaków, ale nie miały sepsy

Komórki nerwowe niedotlenioneEfekt niedotlenienia komórek nerwowych w 3 dobie. Widoczna redukcja dendrytów, utrata połączeń komórkowych. Złogi komórkowe i komórki w fazie apoptozy. (Susann Hau†1, Doreen M Reich*†1, et al. 2008)

Komórki nerwowe normoksemiczneKomórki nerwowe bez epizodu niedotlenienia wykazują bardzo małą liczbę komórek w fazie apoptozy (Susann Hau†1, Doreen M Reich*†1, et al. 2008)

Mezenchymalne komórki macierzysteW obecności mezenchymalnych komórek macierzystych apoptoza komórek nerwowych po niedotlenieniu legała redukcji. (Susann Hau†1, Doreen M Reich*†1, et al. 2008)

Szpik vs krew pepow

inowa

Krew pępowinowa dostarcza hematopoetycznych komórek zdolnych do vaskulogenezy. Wytwarzano martwicę uda u myszy po czym podawano komórki szpiku i z krwi pępowinowej. Skuteczniejsza była krew pępowinowa w rewaskularyzacji. Finney MR et al. 2009

Komórki macierzyste •Niektórym chorobom noworodków można

zapobiec, w innych pozostaje ograniczać negatywne skutki

•Neonatologia upatruje szansy w medycynie regeneracyjnej

•Przy użyciu komórek macierzystych i czynników wzrostu można próbować ograniczać negatywne skutki wcześniactwa i intensywnej terapii

Nadzieje•Medycyna regeneracyjna

jest postrzegana jako współczesny kielich Graala

•Ma dokonywać cudu uzdrowienia

•Obok święty Graal wg Dantego Gabriela Rossetti

Nadzieje i obawy•Daleka jest do tego droga i pełna

niebezpieczeństw•Nie można przeceniać tej idei•Zanim nie stworzymy genetycznie

modyfikowanych, w nieograniczonej liczbie komórek macierzystych

•Bezpiecznych

Obawy•Komórki macierzyste mogą przemienić się w

każdą inną komórkę naszego organizmu•Również w komórki macierzyste

nowotworowe odpowiedzialne za wzrost i rozprzestrzeniane się guzów

•Ekspansja normalnych komórek macierzystych jest pod ścisłym genetycznym i epigenetycznym nadzorem

•Nowotworowe komórki macierzyste nie poddają się tym ograniczeniom

Obawy i nadzieje•Mechanizm reprogramowania komórek

macierzystych•Nowe markery dla normalnych komórek

macierzystych i nowotworowych komórek macierzystych

•Są aktualnym celem prowadzącym do zwalczania nowotworów

Nadzieja kolejna•Dr SM Janes i współpracownicy zmienili

ekspresję komórek i otrzymali białko zabijające komórki nowotworowe zwane TNF-related apoptosis-inducing ligand or Trial

•Przez złączenie tych dwóch zdolności możemy mieć komórki mające zdolność krążenia po całym organizmie, znajdowania i niszczenia guzów (Loebinger)

Very small embryonic like (VISEL) stem cells(Leukemia 2007, 21,297-303)Mogą różnicować się do wszystkich komórek niemal jak komórki progrnitorowe.

1 mm

1 mm

1 mm

Omnia vitae ab ovo •Cały człowiek bierze swój początek z

komórki jajowej totipotencjalnej•Nawet jeżeli w pierwszej fazie rozwoju, w

fazie blastocysty, kiedy człowiek składa się z ośmiu komórek zarodkowych usunie się jedną dla innych celów np. klonowania

•To z pozostałych siedmiu rozwinie się prawidłowo zbudowany i dobrze funkcjonujący organizm

Różnicowanie

Zapłodniona komórka jajowa

(Zygota)Komórki węzła zarodkowego blastocysty Ukierunkowane

tkankowo komórki macierzyste

krew

mięśnie

nerwy

naskórek

wątroba

inne

Ektodermalne KM Mezodermalne KM Endodermalne KM

TotipotencjalnePluripotencjalne

Multipotencjalne

Unipotencjalne

Komórki em

briolaneTerapia komórkami emrionalnymi wiąże się z pcznymi, biologicznymircznymi, politoblemami et

Krew pępowinowa•Komórki macierzyste fizjologicznie znajdują

się w dużej ilości w krwi pępowinowej•Tym większej im wcześniej urodzi się dziecko•W momencie porodu wcześniaka istnieje

jedyna szansa uzyskania krwi pępowinowej i zastosowania w leczeniu powikłań wcześniactwa zawartych w niej komórek macierzystych

•Jest ich 99 w mikrolitrze krwi pępowinowej w 24 tyg. ciąży

Stem cell

Komórki macierzyste w neonatologii•Retinopatia•Encefalopatia•Dysplazja oskrzelowo-

płucna•Martwicze zapalenie

jelit

RDS43%

BPD11%

NEC7%

ROP19%

NN3%

Uszk. Skóry7%

Zgon9%

Liczba noworodków, u których wystąpiły powikłania wcześniactwa

M.Długołęcka

Zastosowanie krwi pępowinowej•Aktualnie krew pępowinowa jest

bankowana w głębokim zamrożeniu •Czeka na „czarną godzinę” życia swojego

właściciela lub innej osoby (zjawisko immunoprivilage)

•A można jej użyć dla ratowania wcześniaków i noworodków chorych

Autohemotransfuzja•Świeża krew pępowinowa może znaleźć

zastosowanie w pierwszych dobach życia w formie autohemotransfuzji pełnej krwi z hemoglobiną płodową, komórkami macierzystymi i czynnikami hemotaktycznymi

•W kolejnych tygodniach życia jej użycie musi być połączone z jej zamrażaniem aby komórki macierzyste i krwinki płodowe nie uległy degradacji

Autohemotransfuzja u wcześniaków•Kiedy zatem zamrażać krew pępowinową?•Jaki odsetek wcześniaków będzie wymagał

transfuzji uzupełniającej w pierwszych dobach życia?

•Napewno wszystkie wcześniaki będą wymagały leczenia krwią, własną, od jednego dawcy,

z konieczności od wielu dawców•Dla, których wcześniaków korzystne będzie

przetoczenie komórek macierzystych, a dla których pełnej krwi?

Doba 0 3% Doba 1

6%

Doba 2 7%

Doba 34%

Doba 46%

Doba 55%

Doba 6 do 1014%

Doba 11 do 20 24%

Powyżej 2133%

Liczba noworodków u których była wykonywana transfuzja krwi w poszczególnych dobach życia

M.Długołęcka

Czy możliwa jest reperacja mózgu?

•Aktualnie możliwe jest uzyskanie dużej liczby wyselekcjonowanych populacji neuronów lub komórek glejowych

•Z rosnących ciągle NSCs – neural stem cells przez wprowadzenie właściwych sygnałów dla molekół lub genów regulatorów NSCs. (Seung U.Kim Geneticallyengineered human neural stem cells for brain repair in neurological diseases. Brain & Development 29(2007)193-201)

Komórki wielopotencjalne• To z nich płody ludzkie

przed ukończeniem 24 tygodnia życia mogą regenerować uszkodzony mózg

• Czy pozwolą na regenerację chorych narządów?

• Czy potrafimy to samo co płazy, którym odrastają ogony?

Encefalopatia wcześniaków•Encefalopatia niedokrwienno-

niedotlenieniowa może być leczona przez podawanie In situ lub dożylnie wielopotencjalnych dojrzałych komórek macierzystych (multipotent adult progenitor cells – MAPCs)

•Jeżeli leczenie to zostanie zastosowane do siódmej doby od wystąpienia przyczyny uszkadzającej mózg. (Yasuhara T, Hara K, Maki M, Mays RW, Deans RJ, Hess DC, Caroll JE, Borlongam CV, J Cereb Blood Flow Metab, 2008 Nov; Vol 28 (11), pp. 1804-10)

Mała scena dramatu

Reperacja ogniska zawału w mózgu•Mesenchymal stem cells (MSCs) podane do

miejsca zawału indukowanego przez zamknięcie na 2 godziny tętnicy środkowej mózgu w 3 dni po zdarzeniu spowodowały;

•Zwiększoną proliferację endogennych komórek nerwowych oraz

•Szybsza migrację komórek w miejsce uszkodzenia. (Yoo SW et al 2008)

Komórki macierzyste i nośnik•Autorzy podawali jednocześnie w obszar

uszkodzenia mózgu nerwowe komórki progenitorowe (neural stem/progenitur cells – NSPCs) i condrotinase ABC (ChABC)

•Kiedy podawano razem komórki progenitorowe i nośnik obszar nieuszkodzony był większy niż leczonych osobno komórkami lub samym nośnikiem. (Sato Y, Nakanishi K, Hayakawa M, et al 2008)

Hematopoetic stem and progenitor cells (HPSC)•Mają zdolność do różnicowania się w komórki

pneumocyty typu II w uszkodzonych płucach myszy

•W 1 dobie życia jest ich 99 komórek w mikrolitrze u wcześniaków w 24 hbd

•Ta ich zdolność czyni możliwym reperację tkanek u wcześniaków w przypadku dysplazji oskrzelowo płucnej (MJ Bizzarro o wsp. „Circulating stem cells in extremely preterm neonates” Acta Paediatrica 2007. 96 pp. 521-525)

Murphy! Nareperują CiebieFrankenstainJepetto i Pinokio

Gekon

Utracony ogon odrastaJest trochę mniejszyJak one to robią?

W przyrodzie organizmy potrafią dokonać samouzdrowieniaUSC-ISI

•Możliwa jest regeneracja narządów

•Ten proces jest dla nas niezbadaną tajemnicą

•Ale jest możliwy, również w zakresie układu nerwowego

Pobranie krwi pępow

iny

Pobieranie krwi pępow

inowej z

łożyskaMożna uzyskać z łożyska wcześniaka ponad 30 ml krwi, co wystarczy nawet na dwa przetoczenia

Pobieranie krwi pępow

inowej z

łożyskaPobiera się w taki sam sposób jak do banków krwi i do zamrożenia. Trzeba jednak odlać 10 ml płynu konserwującego bo krwi jest mniej niż od noworodków donoszonych.

Worki do krw

i pępowinow

ej

Prawdopodobny biorca krw

i pępow

inowej

Jeśli człowiek nie m

oże czegoś robić napraw

dę, to nie trzeba tego robić w

cale! Stanisław LEM