kinetics of cell detachment_ peeling of discrete receptor clusters.pdf

7/28/2019 Kinetics of Cell Detachment_ Peeling of Discrete Receptor Clusters.pdf

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B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 6 7 D e c e m b e r 1 9 9 4 2 5 2 2 - 2 5 3 4K i n e t i c s o f C e l l D e t a c h m e n t : P e e l i n g o f D i s c r e t e R e c e p t o r C l u s t e r sM i c h a e l D . W a r d , * M i c a h D e m b o , * a n d D a n i e l A . Hammer** S c h o o l o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g , C o r n e l l U n i v e r s i t y , I t h a c a , Ne w Y o r k 1 4 8 5 3 , and * MS K - 7 1 0 , T 1 0 T h e o r e t i c a l B i o l o g y , L o s AlamosN a t i o n a l L a b o r a t o r y , L o s A l a m o s , Ne w M e x i c o 8 7 5 4 5 USAABSTRACT C l u s t e r i n g o f c e l l s u r f a c e a d h e s i o n r e c e p t o r s i s a n e s s e n t i a l s t e p i n t h e d e v e l o p m e n t o f f o c a l c o n t a c t s , s p e c i a l i z e dc e l l - s u b s t r a t e a t t a c h m e n t s i t e s w h e r e r e c e p t o r s a r e s i m u l t a n e o u s l y l i n k e d t o e x t r a c e l l u l a r l i g a n d a n d c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s .P r e v i o u s l y , we e x a m i n e d t h e e f f e c t o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g o n a t t a c h m e n t s t r e n g t h . H e r e , we e m p l o y t h e n u m e r i c a l m e t h o d o l o g yd e v e l o p ed b y Dembo a n d c o l l e a g u e s ( D e m b o , M . , D . C . T o r n e y , K . S a x m a n , a n d D . Hammer. 1 9 8 8 . P r o c . R . S o c . L o n d . B .2 3 4 : 5 5 - 8 3 ) t o i n v e s t i g a t e t h e k i n e t i c s o f c e l l d e t a c h m e n t when r e c e p t o r s a r e c l u s t e r e d i n t o d i s c r e t e p a t c h e s . We show t h a t t h emembrane p e e l i n g v e l o c i t y d e c r e a s e s i f r e c e p t o r s are c l u s t e r e d w i t h i n a p a t c h l o c a t e d i n s i d e t h e c o n t a c t r e g i o n . P e e l i n g o fc l u s t e r s i s i n f l u e n c e d b y t h e c h e m i s t r y a n d m e c h a n i c s o f r e c e p t o r - l i g a n d b o n d s w i t h i n t h e p a t c h . D e t a c h m e n t i s a l s o p r o h i b i t e di f t h e a p p l i e d t e n s i o n e q u a l s t h e c r i t i c a l t e n s i o n o f t h e p a t c h , u n l e s s t h e p a t c h l e n g t h i s s m a l l c o m p a r e d w i t h t h e b o u n d a r y l e n g t hover w h i c h membrane b e n d i n g o c c u r s , i n w h i c h case t h e p a t c h w i l l p e e l . P e e l i n g o f t h e s e s h o r t p a t c h e s o n l y occurs when t h em e c h a n i c a l s t i f f n e s s o f c l u s t e r e d b o n d s i s w i t h i n a n o p t i m a l r a n g e .We c o m p a r e o ur m o d e l p r e d i c t i o n s w i t h e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s o f T l y m p h o c y t e d e t a c h m e n t f r o m I C A M - 1 s u b s t r a t e s .We d e m o n s t r a t e t h a t i f d i s c r e t e p a t c h e s o f r e c e p t o r s are p r e s e n t , d e t a c h m e n t occurs t h r o u g h i n t e r v a l s o f s l o w a n d f a s t p e e l i n g ,s i m i l a r t o t h e d y n a m i c s o f T l y m p h o c y t e p e e l i n g , i n d i c a t i n g t h a t c l u s t e r i n g o f L F A - 1 r e c e p t o r s i s o n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o rt h e o b s e r v e d d e t a c h m e n t k i n e t i c s i n t h i s s y s t e m .INTRODUCTIONMany c e l l t y p e s p o s s e s s s u r f a c e a d h e s i o n r e c e p t o r s t h a t b i n ds e l e c t i v e l y t o e x t r a c e l l u l a r l i g a n d m o l e c u l e s . R e c e p t o r -l i g a n d b i n d i n g a n d t h e r e s u l t i n g a d h e s i o n i n f l u e n c e s c e l lg r o w t h ( I n g b e r a n d F o l k m a n , 1 9 8 9 ; I n g b e r , 1 9 9 0 ) , d i f f e r -e n t i a t i o n ( B e n - Z e ' e v e t a l . , 1 9 8 8 ; W a t t e t a l . , 1 9 8 8 ; M o o n e ye t a l . , 1 9 9 2 ) , a n d m o t i l i t y ( C o u c h m a n a n d R e e s , 1 9 7 9 ) . D u r -i n g a t t a c h m e n t a n d s p r e a d i n g , c e r t a i n a d h e s i o n r e c e p t o r s a s -s o c i a t e w i t h b o t h l i g a n d a n d c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s i n d i s c r e t es i t e s o f c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t , k n o w n a s f o c a l c o n t a c t s o rf o c a l a d h e s i o n s , w h i c h c o n t a i n many r e c e p t o r s a n d a r et i g h t l y c o u p l e d ( s 1 5 n m s e p a r a t i o n ) t o t h e s u b s t r a t e ( I z z a r da n d L o c h n e r , 1 9 7 6 ; B u r r i d g e e t a l . , 1 9 8 8 ; D e j a n a e t a l . , 1 9 8 8 ;F a t h e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e c y t o s k e l e t o n l i k e l y s t r e n g t h e n s t h es t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f t h e f o c a l a d h e s i o n , m a k i n g t h e c o n t a c te x t r e m e l y r e s i s t a n t t o r e m o v a l f o r c e s ( R e e s e t a l . , 1 9 7 7 ) .H o w e v e r , c o n s i d e r a b l e i n c r e a s e s i n c e l l u l a r a d h e s i v es t r e n g t h may o c c u r b e f o r e c o m p l e t e c y t o s k e l e t a l l y d r i v e nr e i n f o r c e m e n t o f f o c a l c o n t a c t s a s a r e s u l t o f r e c e p t o r c l u s -t e r i n g , i n c l u d i n g w i t h i n s t r u c t u r e s r e s e m b l i n g p r e c u r s o r f o -c a l c o n t a c t s ( L o t z e t a l . , 1 9 8 9 ; W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) .F o c a l a d h e s i o n s a r e n o t t h e o n l y p h y s i o l o g i c a l l y i m p o r t a n te x a m p l e o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g . P o i n t c o n t a c t s a r e p a t c h e s o fa d h e s i o n r e c e p t o r s t h a t a r e m u c h s m a l l e r t h a n f o c a l c o n t a c t s( 0 . 1 - 0 . 3 , u m v s . 2 - 1 0,m i n l e n g t h ) a n d a r e r a r e l y c o n n e c t e dt o a c t i n f i l a m e n t s , y e t c o n t r i b u t e t o a t t a c h m e n t a n d s p r e a d i n g

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 9 J u n e 1 9 9 3 a n d i n f i n a l f o r m 2 9 A u g u s t 1 9 9 4 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o D r . D a n i el A . H a m m e r , S c h o o l o f C h e m i c a lE n g i n e e r i n g , C o r n e l l U n i v e r s i t y , 3 6 2 O l i n H a l l , I t h a c a , NY 1 4 8 5 3 - 5 2 0 1 .T e l . : 6 0 7 - 2 5 5 - 8 6 8 1 ; F a x : 6 0 7 - 2 5 5 - 9 1 6 6 ; E - m a i l : h a m m e r @ c h e m e . c o r n e l l .e d u . 1 9 9 4 b y t h e B i o p h y s i c a l S o c i e t y0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 4 / 1 2 / 2 5 2 2 / 1 3 $ 2 . 0 0

o n l i g a n d - c o a t e d s u b s t r a t e s ( S t r e e t e r a n d R e e s , 1 9 8 7 ; T a w i le t a l . , 1 9 9 3 ) . T o u n d e r s t a n d b e t t e r how a d h e s i o n i s r e g u l a t e d ,i t i s t h e r e f o r e e s s e n t i a l t o e x a m i n e t h e r o l e o f r e c e p t o r c l u s -t e r i n g o n c e l l - s u b s t r a t e a d h e s i o n a n d d e t a c h m e n t .

L o t z e t a l . ( 1 9 8 9 ) m e a s u r e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h ea r e a o f c l o s e ( ' 1 5 n m ) c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t - a n i n de x o fc y t o s k e l e t a l r e o r g a n i z a t i o n - a n d t h e a t t a c h m e n t s t r e n g t h o fg l i o m a c e l l s o n f i b r o n e c t i n . A l t h o u g h g l i o m a c e l l s w e a k l yb o u n d t h e f i b r o n e c t i n s u b s t r a t e a t 4 C , a d r a m a t i c ( > 1 0 - f o l d )e n h a n c e m e n t i n a d h e s i v e s t r e n g t h o c c u r r e d a t 3 7 C . T h i ss t r e n g t h e n i n g r e s p o n s e c o i n c i d e d w i t h i n c r e a s e d f o r m a t i o no f ' 1 5 n m c o n t a c t s a n d w a s a b o l i s h e d b y a d d i t i o n o f c y t o -c h a l a s i n B , s u g g e s t i n g t h e i n v o l v e m e n t o f c y t o s k e l e t a l p o -l y m e r i z a t i o n . When v i e w e d u n d e r i n t e r f e r e n c e r e f l e c t i o n m i -c r o s c o p y , t h e s e ' 1 5 n m c o n t a c t s d i d n o t r e s e m b l e f o c a la d h e s i o n s , b u t w e r e m o r e d i f f u s e r e g i o n s o f c l o s e c e l l -s u b s t r a t e s e p a r a t i o n t h a t o n l y l a t e r d e v e l o p e d i n t o f u l l yf o r m e d f o c a l c o n t a c t s . A d h e s i v e s t r e n g t h e n i n g may p r e c e d et h e a p p e a r a n c e o f f o c a l c o n t a c t s , b e c a u s e we f o u n d t h e r e -p o r t e d i n c r e a s e i n g l i o m a c e l l a d h e s i o n s t r e n g t h c o u l d b ea t t r i b u t e d t o c y t o s k e l e t a l l y d r i v e n c l u s t e r i n g o f a d h e s i o n r e -c e p t o r s , w i t h o u t t h e s u b s t a n t i a l e n h a n c e m e n t i n m e c h a n i c a lr i g i d i t y o f t h e r e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n c l u s t e r t h a t l i k e l y a c -c o m p a n i e s f o c a l c o n t a c t m a t u r a t i o n ( W a r d a n d H a m m e r ,1 9 9 3 ) .

T o z e r e n e t a l . ( 1 9 9 2 ) u s e d m i c r o p i p e t a s p i r a t i o n t o m e a s -u r e t h e d e t a c h m e n t o f T l y m p h o c y t e s f r o m a p l a n a r m e m-b r a n e c o n t a i n i n g ICAM-1 l i g a n d m o l e c u l e s . A l t h o u g h t h eL F A - 1 r e c e p t o r f o r ICAM-1 i s c o n s t a n t l y e x p r e s s e d o n t h el y m p h o c y t e s u r f a c e , s t r o n g c e l l a t t a c h m e n t t o ICAM-1 w a so n l y o b s e r v e d a f t e r p r e t r e a t m e n t o f t h e T - c e l l s w i t h p h o r b o l1 2 - m y r i s t a t e - 1 3 - a c e t a t e ( P M A ) . B e c a u s e p r e v i o u s s t u d i e sd e m o n s t r a t e d t h a t L F A - 1 a s s o c i a t e s w i t h c y t o s k e l e t a l p r o -t e i n s i n P M A - t r e a t e d c e l l s b u t n o t i n r e s t i n g c e l l s ( B u r n e t a l . ,

2 5 2 2


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K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r s1 9 8 8 ) , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e e n h a n c e d a t t a c h m e n t s t r e n g t h o fl y m p h o c y t e s t o ICAM-1 u p o n a d d i t i o n o f PMA i s a r e s u l t o fc y t o s k e l e t a l c r o s s - l i n k i n g a n d c l u s t e r i n g o f L F A - 1 r e c e p t o r s .S e v e r a l t h e o r e t i c a l a n a l y s e s h a v e b e en d e v e l o p e d t o e x -a m i n e t h e i n f l u e n c e o f r e c e p t o r a n d l i g a n d c h e m i s t r y o n c e l la d h e s i o n a n d s p r e a d i n g . E v a n s ( 1 9 8 5 a , b ) s o l v e d t h e e q u a -t i o n s o f m e c h a n i c a l e q u i l i b r i u m f o r a t h i n , i n e x t e n s i b l e m e m-b r a n e u n d er t h e l o a d i n g o f c o n t i n u o u s o r d i s c r e t e r e c e p t o r -l i g a n d c r o s s - b r i d g e s . B e c a u s e a d h e s i o n i s t r e a t e d a s a p u r e l yc o n s e r v a t i v e p r o c e s s i n t h i s m o d e l , t h e a n a l y s i s i s o n l y v a l i da t e q u i l i b r i u m ; t h u s , E v a n s c o u l d d e r i v e t h e c r i t i c a l t e n s i o nn e c e s s a r y t o i n i t i a t e m e m b r a n e p e e l i n g , b u t c o u l d n o t c o m -p u t e t h e r a t e o f p e e l i n g a t t e n s i o n s g r e a t e r t h a n c r i t i c a l b e -c a u s e n o n c o n s e r v a t i v e d i s s i p a t i o n w a s n o t i n c l u d e d . T o a c -c o u n t f o r d i s s i p a t i o n a n d t o c a l c u l a t e t h e k i n e t i c s o f p e e l i n ga n d s p r e a d i n g , Dembo a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 8 8 ) a d d e d s t r a i n -d e p e n d e n t r a t e c o n s t a n t s f o r r e c e p t o r - l i g a n d b i n d i n g o n t o t h em e c h a n i c a l e n e r g y b a l a n c e s g i v e n b y E v a n s . By i n c l u d i n gc h a r a c t e r i s t i c t i m e s f o r b o n d f o r m a t i o n a n d b r e a k a g e , w h i c hw e r e r e l a t e d t o t h e s t r a i n p l a c e d o n i n d i v i d u a l c r o s s - b r i d g e s ,t h e r a t e o f e n e r g y d i s s i p a t i o n c o u l d b e a s c e r t a i n e d f r o m t h er a t e o f b o n d d e f o r m a t i o n a n d d i s s o c i a t i o n , w h i c h i n t u r n a l -l o w e d c a l c u l a t i o n o f t h e f i n i t e r a t e o f m e m b r a n e p e e l i n g( s p r e a d i n g ) w h e n t h e a p p l i e d t e n s i o n w a s g r e a t e r ( l e s s ) t h a nt h e c r i t i c a l t e n s i o n . U s i n g t h i s m e t h o d o l o g y , Dembo e t a l .( 1 9 8 8 ) d e t e r m i n e d how b o n d c h e m i s t r y a n d b o n d m e c h a n i c si n f l u e n c e t h e d y n a m i c s o f c e l l s p r e a d i n g a n d d e t a c h m e n t .T o z e r e n ( 1 9 8 9 ) f o u n d t h a t c e l l - c e l l d e t a c h m e n t i s r e s t r i c t e db y a c c u m u l a t i o n o f m o b i l e r e c e p t o r - l i g a n d c r o s s - b r i d g e s a tt h e e d g e o f c o n t a c t d u r i n g p e e l i n g , b u t h e i m p o s e d a s i m p l em e m b r a n e g e o m e t r y a t t h e p e e l i n g e d g e , t h e r e b y n e g l e c t i n gm e m b r a n e m e c h a n i c s w i t h i n t h e c o n t a c t r e g i o n . None o f t h ea b o v e m e c h a n i c a l a n a l y s e s c o n s i d e r e d t h e e f f e c t o f d i s c r e t ea c c u m u l a t i o n s o f r e c e p t o r s o n t h e r a t e o f p e e l i n g .I n a n e a r l i e r p a p e r , we e x a m i n e d how r e c e p t o r c l u s t e r i n g ,d r i v e n b y c y t o s k e l e t a l c r o s s - l i n k i n g , a f f e c t s c e l l - s u b s t r a t e a t -t a c h m e n t s t r e n g t h ( W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) . B e c a u s ef r e e l y m o b i l e a d h e s i o n r e c e p t o r s c o u l d s i m u l t a n e o u s l y a s -s o c i a t e w i t h c y t o s k e l e t a l m o l e c u l e s ( d e s i g n a t e d " t a l i n " ) o nc y t o p l a s m i c p l a q u e s a n d e x t r a c e l l u l a r l i g a n d , k i n e t i c e q u a -t i o n s f o r t h e b o n d d e n s i t y r e s u l t i n g f r o m r e c e p t o r - l i g a n d a n dr e c e p t o r - t a l i n b i n d i n g w e r e c o u p l e d t o t h e e q u a t i o n s o f mem-b r a n e m e c h a n i c a l e q u i l i b r i u m t o c a l c u l a t e t h e c r i t i c a l t e n s i o nw h e n r e c e p t o r s w e r e c l u s t e r e d o n t h e c e l l s u r f a c e . A t h i g hl i g a n d a n d t a l i n d e n s i t i e s , e x t e n s i v e a c c u m u l a t i o n o f a d h e -s i o n r e c e p t o r s w i t h i n t h e p l a q u e s r e s u l t e d i n a > 1 0 - f o l d e n -h a n c e m e n t i n t h e a d h e s i v e s t r e n g t h o v e r t h a t o b t a i n e d i n t h ea b s e n c e o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g . I n f a c t , t h e q u a n t i t a t i v e m a t c hb e t w e e n o u r m o d e l a n d d a t a o n t h e s t r e n g t h e n i n g r e s p o n s eo f g l i o m a c e l l a d h e s i o n t o f i b r o n e c t i n ( L o t z e t a l . , 1 9 8 9 )s u g g e s t s t h a t f i b r o n e c t i n i n d u c e s r e c e p t o r c l u s t e r i n g i n t h i sc e l l t y p e .I n t h e p r e s e n t w o r k , we e x t e n d o u r e a r l i e r s t u d y t o i n -v e s t i g a t e t h e i n f l u e n c e o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g o n t h e d y n a m i c so f c e l l d e t a c h m e n t f r o m l i g a n d - c o a t e d s u r f a c e s . E m p l o y i n gt h e m e t h o d o l o g y d e v e l o p e d b y Dembo e t a l . ( 1 9 8 8 ) , we c a l -c u l a t e t h e r a t e o f d e t a c h m e n t o f a m e m b r a n e c o n t a i n i n g a

p a t c h o f h i g h r e c e p t o r d e n s i t y . We f i n d t h a t p e e l i n g i s i n -h i b i t e d b y i n c r e a s e d r e c e p t o r c l u s t e r i n g , w h e r e a s a l t e r a t i o n si n t h e c h e m i c a l o r m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f r e c e p t o r - l i g a n db o n d s w i t h i n t h e p a t c h ( c o m p a r e d w i t h t h o s e o u t s i d e t h ep a t c h ) c a n f u r t h e r s t r e n g t h e n t h e r e c e p t o r c l u s t e r . I n a d d i t i o n ,we s h o w t h a t t h e t e n s i o n r e q u i r e d t o p e e l t h e p a t c h when t h ep a t c h l e n g t h i s l e s s t h a n t h e m e m b r a n e b e n d i n g l e n g t h i sd i f f e r e n t t h a n t h e c r i t i c a l t e n s i o n , w h i c h c o r r e s p o n d s t o am e m b r a n e o f i n f i n i t e e x t e n t . Q u a l i t a t i v e c o m p a r i s o n o f o u rm o d e l r e s u l t s w i t h e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s o f T l y m -p h o c y t e d e t a c h m e n t f r o m a n I C A M - 1 - c o a t e d s u r f a c eu s i n g m i c r o p i pe t a s p i r a t i o n ( T o z e r e n e t a l . , 1 9 9 2 ) s u g -g e s t s t h a t LFA-1 r e c e p t o r c l u s t e r i n g o n t h e T l y m p h o c y t es u r f a c e i s o n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e o b s e r v e dd e t a c h m e n t k i n e t i c s .

M AT HEM ATICA L M ODE LF i g . 1 i l l u s t r a t e s t h e b a s i c f e a t u r e s o f o u r o n e - d i m e n s i o n a lt a p e - p e e l i n g m o d e l . T h e a d h e s i v e c o n t a c t i s d i v i d e d i n t o t w or e g i o n s : a ) a m i c r o s c o p i c r e g i o n w h e r e r e c e p t o r - l i g a n d b i n d -i n g s u p p o r t s a t t a c h m e n t a n d b ) a m a c r o s c o p i c r e g i o n w h e r eb i n d i n g i s n e g l i g i b l e . A t t h e o u t e r e d g e o f t h e m a c r o s c o p i cr e g i o n , a t e n s i o n T m a c i s a p p l i e d a t a n a n g l e o m a c w i t h t h es u b s t r a t e . T h e s e c a l c u l a t i o n s a r e p e r f o r m e d u n d e r c o n -s t a n t e x t e r n a l l o a d , T m a c . T h e m e m b r a n e d e f l e c t i o n i sm e a s u r e d b y t h e C a r t e s i a n c o o r d i n a t e s x a n d y , w h e r e xi s t h e h o r i z o n t a l d i s t a n c e a l o n g t h e s u r f a c e a n d y i s t h ec e l l - s u b s t r a t e s e p a r a t i o n , a s a f u n c t i o n o f m e m b r a n ea r c l e n g t h , s .

A s s u m i n g q u a s i - m e c h a n i c a l e q u i l i b r i u m , a l o c a l b a l a n c eo f n o r m a l f o r c e s o v e r t h e m e m b r a n e g i v e s ( E v a n s a n d

L i g a n d d e n s i t y , N 1 S p r i n g c o n s t a n t , c / U n s t r e s s e d b o n dE q u l i b r i u m a f f i n i t y , K , q l e n g t h , xFIGURE 1 T h e g e o m e t r y o f t h e o n e - d i m e n s i o n a l t a p e - p e e l i n g m o d e l i sg i v e n b y t h e c o o r d i n a t e s x a n d y a n d t h e m e m b r a n e a r c l e n g t h , s . I n t h em a c r o s c o p i c c o n t a c t r e g i o n ( s < 0 ) , b i n d i n g i s n e g l i g i b l e a n d a n a p p l i e dt e n s i o n , T m a c , a c t s a t o r i e n t a t i o n O m a c ' w h e r e a s i n t h e m i c r o s c o p i c r e g i o n( s 2 0 ) , a d h e s i v e c o n t a c t t h r o u g h r e c e p t o r - l i g a n d b i n d i n g b e g i n s a t t h ec o n t a c t p o i n t , s = P c . C e l l s u r f a c e r e c e p t o r s r e a c t w i t h s u b s t r a t e l i g a n dm o l e c u l e s t o f o r m s p r i n g - l i k e b o n d s o f m e c h a n i c a l s t i f f n e s s K a n d l e n g t hA . I n t h e m o d e l , r e c e p t o r s a r e c l u s t e r e d w i t h i n d i s c r e t e p a t c h e s s u c h t h a tr e g i o n s o f l o w r e c e p t o r d e n s i t y ( N t l ) a r e a d j a c e n t t o a r e a s w h e r e t h e r e c e p t o rd e n s i t y i s s u b s t a n t i a l l y h i g h e r ( N , 2 ) .

Ward e t a l . 2 5 2 3


3/13

V o l u m e 6 7 D e c e m b e r 1 9 9 4S k a l a k , 1 9 8 0 ; E v a n s , 1 9 8 5 a , b ) ,

a acdB CT = - ( n o r I ( 1 )a s a sw h e r e a s t h e c o r r e s p o n d i n g b a l a n c e o f t a n g e n t i a l f o r c e s i s

a T +C ( B C ) = _ta I S a s ( 2 ,I n t h e s e e q u a t i o n s , T i s m e m b r a n e t e n s i o n , C i s m e m b r a n ec u r v a t u r e , B i s t h e m e m b r a n e b e n d i n g m o d u l u s , a n d . n o r a n do z J t a a r e t h e n o r m a l a n d t a n g e n t i a l c o m p o n e n t s o f t h e m e m-b r a n e s t r e s s , r e s p e c t i v e l y . F o l l o w i n g t h e f r a m e w o r k o fDembo e t a l . , ( 1 9 8 8 ) , we a s s u m e t h a t t h e b e n d i n g m o d u l u si s c o n s t a n t a n d t h a t m e m b r a n e s t r e s s e s r e s u l t f r o m e x -t e n s i o n o r c o m p r e s s i o n o f s p r i n g - l i k e r e c e p t o r - l i g a n db o n d s . I n t h i s c a s e , O n o r = [ N b K ( y - A ) ( a x / a s ) ] a n d0 t a n = - [ N bK d Y - A ) ( a y / a s ) ] , w h e r e K m e a s u r e s t h em e c h a n i c a l s t i f f n e s s o f t h e b o n d , A i s t h e u n s t r e s s e d b o n dl e n g t h , a n d N b i s t h e l o c a l d e n s i t y o f r e c e p t o r - l i g a n db o n d s .

T h e a r c l e n g t h a n d c u r v a t u r e a r e r e l a t e d t o t h e C a r t e s i a nc o o r d i n a t e s ,( a X \ 2 / a y V2_ 3

s ( a s ) ( 3 )a n d

( x \ ) a (a2X ( d a y \C - a s j k a s 2 / k a S ) / a s f 4S o l u t i o n o f E q s . 1 - 4 u s i n g t h e a p p r o p r i a t e b o u n d a r y a n d

m a t c h i n g c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x A y i e l d s t h em e m b r a n e m o r p h o l o g y w i t h i n t h e c o n t a c t r e g i o n .T h e P e c l e t n u m b e r , L 2 / t p D , w h e r e L i s t h e c o n t a c t r a d i u s ,t p i s t h e t i m e f o r p e e l i n g , a n d D i s t h e r e c e p t o r d i f f u s i v i t y ,m e a s u r e s t h e r e l a t i v e r a t e s o f r e c e p t o r c o n v e c t i o n a n d d i f -f u s i o n d u r i n g p e e l i n g . B e c a u s e t h e P e c l e t n u m b e r i s t y p i c a l l y0 ( 1 0 0 ) ( e . g . , f o r L - 5 , u m , t p - 3 0 s , a n d D -101 c m 2s - ' ) , r e c e p t o r d i f f u s i o n i s m i n i m a l d u r i n g d e t a c h m e n t . ( T h er e c e p t o r s a r e " k i n e t i c a l l y t r a p p e d , " a s E v a n s ( 1 9 8 5 b ) f i r s td e s c r i b e d . ) T h e r e f o r e , we a s s u m e t h a t a d h e s i o n r e c e p t o r s a r el a t e r a l l y f i x e d i n p o s i t i o n d u r i n g p e e l i n g s u c h t h a t t h e t o t a ll o c a l d e n s i t y o f r e c e p t o r s , N t , i s c o n s t a n t a n d e q u a l s ( N f +N b ) , w h e r e N f a n d N b a r e t h e l o c a l d e n s i t i e s o f f r e e a n d l i g a n d -b o u n d r e c e p t o r s , r e s p e c t i v e l y .T h e d e n s i t y o f r e c e p t o r - l i g a n d c r o s s - b r i d g e s i s g i v e n b y am a s s b a l a n c e o n b o n d d e n s i t y ,

a O N = k f ( N 1 - N b ) ( N t - N b ) - k r N b , ( 5 )atb) 9w h e r e t i s t i m e , k f a n d k r a r e t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e b i n d i n gr a t e s , a n d N , i s t h e l i g a n d d e n s i t y . B e c a u s e r e c e p t o r s a r ek i n e t i c a l l y t r a p p e d , t h e d e n s i t y o f a d h es i o n r e c e p t o r s w i l lr em a i n u n i f o r m d u r i n g p e e l i n g , a N / a t = 0 .

A t t h e e d g e o f m o l e c u l a r c o n t a c t b e t w e e n c e l l a n d s u b -s t r a t e , d e f i n e d b y t h e c o n t a c t p o i n t , s = P c , t h e b o n d d e n s i t y

e q u a l s a c r i t i c a l l y l o w v a l u e N b c , e n s u r i n g t h a t b i n d i n gs t r e s s e s a r e n e g l i g i b l e a t v a l u e s o f s b e l o w t h i s p o i n t . T h ev e l o c i t y a t w h i c h t h e c o n t a c t r a d i u s d e c r e a s e s d u r i n g d e -t a c h m e n t , V p , i s g i v e n b y V p = a P c / a t ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) .C h a n g i n g t o a c e l l r e f e r e n c e f r a m e f i x e d a t t h e c o n t a c t p o i n t ,s = s - P c , i n t r o d u c e s a n a p p a r e n t c o n v e c t i v e t e r m i n t h em a s s b a l a n c e e q u a t i o n ,

a N b a N b_ _ _ = V p a b + k f ( N I - N b ) ( N t - N b ) - k r N b . ( 6 )a t p aT h e f i r s t t e r m o n t h e r i g h t h a n d s i d e o f ( 6 ) d o e s n o t r e p r e s e n ta t r u e m e m b r a n e c o n v e c t i o n , b u t r a t h e r a c o - m o v i n g d e r i v a -t i v e c o n t r i b u t i o n c a u s e d b y t h e m o v i n g r e f e r e n c e f r a m e . B e -c a u s e N b a l w a y s e q u a l s N b , a t s = 0 , t h e p e e l i n g v e l o c i t y i se x p l i c i t l y g i v e n b yV p = { [ k f ( N I- N b ) ( N - Nb)- k r N b ] a N } (

F o r s p r i n g - l i k e r e c e p t o r - l i g a n d b o n d s , t h e r a t e c o n s t a n t sf o r b i n d i n g a r e f u n c t i o n s o f c e l l - s u b s t r a t e s e p a r a t i o n ( D e m b oe t a l . , 1 9 8 8 ; Hammer a n d A p t e , 1 9 9 2 ) ,k f = k f , q e x p { - K t s ( y - ) 2 / 2 k b O } ( 8 )

a n dk r = k e q e x p { ( K - K j ( y - ) 2 / 2 k b O } , ( 9 )

w h e r e k f q a n d k r e q a r e t h e r a t e c o n s t a n t s f o r u n s t r e s s e d b o n d s ,K t s i s t h e t r a n s i t i o n s t a t e s p r i n g c o n s t a n t , a n d k b O i s t h e t h e r -m a l e n e r g y . T h e a f f i n i t y b e t w e e n r e c e p t o r a n d l i g a n d , K , i sK = k f / k r = K e q e x p { K ( y - X ) 2 / 2 k b O } , ( 1 0 )

w h e r e K e q i s t h e e q u i l i b r i u m a f f i n i t y f o r a n u n s t r e s s e d b o n d .When e t S = K , b o n d s b r e a k a t t h e s a m e r a t e i r r e s p e c t i v eo f b o n d s t r a i n ( y - A ) . F o r K t , < K , b o n d r u p t u r e i n c r e a s e sw i t h s t r a i n , w h e r e a s i n t h e " c a t c h " - s t a t e ( K t s > K ) , u n s t r e s s e db o n d s a c t u a l l y d i s s o c i a t e f a s t e r t h a n e x t e n d e d o r c o m p r e s s e dc r o s s - b r i d g e s . B e c a u s e c a t c h - b o n d s d o n o t p e r m i t d e t a c h -m e n t ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) , we o n l y c o n s i d e r s l i p - b o n d s( K , , < K ) i n t h i s a n a l y s i s .T h e c e n t e r o f c o n t a c t i s s u b s t a n t i a l l y f a r i n s i d e t h e p e e l i n ge d g e s u c h t h a t t h e m e m b r a n e r e m a i n s f i r m l y c l a m p e d t o t h es u b s t r a t e a t a s e p a r a t i o n e q u a l t o t h e u n s t r e s s e d b o n d l e n g t ha t s = L ( s e e A p p e n d i x A ) . T h e r e f o r e , t h e b o n d d e n s i t y a tt h i s p o i n t i s u n a f f e c t e d b y p e e l i n g ( a N d a s = 0 ) a n d , a t s t e a d ys t a t e ( a N b i a t = 0 ) , o n e c a n d e f i n e a n e q u i l i b r i u m b o n dd e n s i t y , N b , , , , f r o m s o l u t i o n o f a m o d i f i e d f o r m o f E q . 6 ,= K e q ( N I - N b e ) ( N t - ) - N bI n o u r e a r l i e r m o d e l f o r t h e r o l e o f f o c a l c o n t a c t f o r m a t i o no n a d h e s i o n s t r e n g t h , t h e c r o s s - l i n k i n g a n d c l u s t e r i n g o f a d -h e s i o n r e c e p t o r s b y c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s r e s u l t e d i n g r e a t e rd e n s i t i e s o f r e c e p t o r m o l e c u l e s a s s o c i a t e d w i t h c y t o s k e l e t o np l a q u e s ( W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) . T h e r e f o r e , t o m e a s u r er a t e s o f p e e l i n g w h e n r e c e p t o r s a r e c l u s t e r e d w i t h i n p a t c h e s ,we a s s u m e t h a t t h e r e a r e d i s c r e t e r e g i o n s o f t h e c e l l s u r f a c ew h e r e t h e r e c e p t o r d e n s i t y , N a 2 , i s m u c h l a r g e r t h a n t h a t f o u n d

B i o p h y s i c a l J o u r n a l5 2 4

7 )


4/13

K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r si n a r e a s o u t s i d e t h e p a t c h e s , N 1 1 . We a s s u m e t h a t p a t c h e soccupy 10% o f t h e t o t a l c o n t a c t a r e a , c o n s i s t e n t w i t h e s t i -m a t e s o f t h e t o t a l area o f f o c a l c o n t a c t s ( W a r d a n d H a m m e r ,1 9 9 3 ) . D e f i n i n g f N , = N 1 2 / N , 1 , t h e d e n s i t y o f r e c e p t o r s o u t s i d ep a t c h e s i s o b t a i n e d f r o m a b a l a n c e o n r e c e p t o r s ,

N t 1 = RI1NL2(O.9 + O . l f N t ) ] ' ( 1 1 )w h e r e a s t h e r e c e p t o r d e n s i t y w i t h i n p a t c h e s i s N 1 2 = f N l N t l .

I n c e l l r e f e r e n c e f r a m e c o o r d i n a t e s ( s = s -P) t h e t i m e -d e p e n d e n t b i n d i n g e q u a t i o n i s g i v e n b y E q . 6 , w i t h t h e a d -d i t i o n a l c o n s t r a i n t t h a t t h e t o t a l r e c e p t o r d e n s i t y e q u a t i o n i ss i m i l a r l y t r a n s f o r m e d t o a c c o u n t f o r t h e c o - m o v i n g d e r i v a -t i v e c o n t r i b u t i o n t o m o t i o n o f t h e a d h e s i v e p a t c h ,d t t = Vp a N t (12)

F o r p a t c h p e e l i n g , V p i s c a l c u l a t e d f r o m E q . 7 a n d u s e d i nc o n j u n c t i o n w i t h E q . 1 2 t o u p d a t e t h e l o c a t i o n o f t h e p a t c h .F u r t h e r m o r e , two f o r m s o f E q . 6 are r e q u i r e d f o r i n s i d e a n do u t s i d e t h e p a t c h .

D u r i n g c l u s t e r i n g , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e c h e m i c a l or me-c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f a d h e s i o n r e c e p t o r s w i t h i n t h e p a t c h arem o d u l a t e d b y a s s o c i a t i o n w i t h t h e c y t o s k e l e t o n . We d i s t i n -g u i s h b e t w e e n t h e a f f i n i t y , m e c h a n i c a l s t i f f n e s s , a n d r e a c t i v ec o m p l i a n c e f o r r e c e p t o r s t h a t are ( i = 2 ) o r a r e n o t ( i = 1 )c l u s t e r e d u s i n g d i f f e r e n t s u b s c r i p t s .C r i t i c a l T e n s i o nT h e c r i t i c a l t e n s i o n , T < , , t , i s t h e minimum a p p l i e d t e n s i o n t h a te x a c t l y b a l a n c e s a d h e s i o n f o r c e s ( V p = 0 ) . T e n s i o n s a b o v et h i s c r i t i c a l v a l u e i n d u c e c e l l d e t a c h m e n t ( V p > 0 ) ; t e n s i o n sb e l o w i n d u c e s p r e a d i n g ( V p < 0 ) . I n t h i s p a p e r , we us e t h et e r m c r i t i c a l t e n s i o n t o i n d i c a t e t h e t e n s i o n r e q u i r e d t o p e e la m e m b r a n e o f i n f i n i t e e x t e n t , s o t h a t we ca n d i s t i n g u i s h t h er e spo ns e o f f i n i t e p a t c h e s f r o m i n f i n i t e s t r e t c h e s o f mem-b r a n e . T h e r e f o r e , i t w i l l b e p o s s i b l e f o r a f i n i t e m e m b r a n ep a t c h t o p e e l a t t e n s i o n s b e l o w t h e c r i t i c a l t e n s i o n . We f o l l o wt h e p r o c e d u r e o f Dembo e t a l . ( 1 9 8 8 ) t o d e t e r m i n e T c 1 t( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ; Ward a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) . To c a l c u l a t ec r i t i c a l t e n s i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e m a s s b a l a n c e d e s cr i b e db y E q . 6 , w h i c h p e r m i t s t h e d e p l e t i o n o f l i g a n d , we h a d t oe x t e n d t h e r e s u l t s p r e s e n t e d o r i g i n a l l y b y Dembo e t a l .

( 1 9 8 8 ) , wh o r e s t r i c t e d t h e i r a t t e n t i o n t o t h e ex c e s s l i g a n dl i m i t . A c o m p l e t e d e s c r i p t i o n o f how t h e l i g a n d d e n s i t y a f -f e c t s t h e c r i t i c a l t e n s i o n w i l l b e p u b l i s h e d e l s e w h e r e ( H a m -mer e t a l . , 1 9 9 4 ) .M o d e l A n a l y s i sT h e s c a l i n g a n a l y s i s , n o n d i m e n s i o n a l e q u a t i o n s , a n d f i n i t ed i f f e r e n c e a l g o r i t h m u s e d t o s o l v e E q s . 1 - 4 , 6 - 1 0 , a n d 1 2 arep r e s e n t e d i n A p p e n d i x A . I n T a b l e 1 , we l i s t t h e i m p o r t a n td i m e n s i o n a l p a r a m e t e r s i n v o l v e d i n o ur m o d e l a n d p r e s e n tr a n ge s o f t h e s e p a r a m e t e r s b a s e d upon t h e o r e t i c a l e s t i m a t e sor i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s . D i m e n s i o n l e s sgroups a r e s h o w n i n T a b l e 2 . fNt i s t h e i n d e x o f t h e amounto f r e c e p t o r c l u s t e r i n g w i t h i n p a t c h e s . B e c a u s e r e c e p t o r c l u s -t e r i n g t h r o u g h c y t o s k e l e t a l c r o s s - l i n k i n g may a l t e r r e c e p t o rp r o p e r t i e s , we e x a m i n e t h e p e e l i n g d y n a m i c s when r e c e p t o r si n s i d e t h e p a t c h b i n d l i g a n d w i t h h i g h e r a f f i n i t y ( w 2 > w l ) orf o r m b o n d s t h a t h a v e s m a l l e r r e a c t i v e c o m p l i a n c e s ( f K 2 < f K 1 )or h a v e g r e a t e r m e c h a n i c a l s t i f f n e s s ( 4 2 > 4 1 ) f r o m t h o s eo u t s i d e t h e p a t c h .RESULTSI n F i g . 2 , we p l o t t h e d i m e n s i o n l e s s p e e l i n g v e l o c i t y , V p , a sa f u n c t i o n o f d i m e n s i o n l e s s t i m e , t , f o r d i f f e r e n t v a l u e s o fT m p , t h e a p p l i e d t e n s i o n s c a l e d t o t h e c r i t i c a l t e n s i o n c a l c u -l a t e d b a s e d o n t h e d e n s i t y i n t h e p a t c h . I n t h i s c a l c u l a t i o n , t h ep a t c h l e n g t h ( 8 p ) i s g r e a t e r t h a n t h e l e n g t h o ve r w h i c h mem-b r a n e b e n d i n g occurs ( E v a n s , 1 9 8 5 a ) . F o r a l l v a l u e s o f T m p ,a n i n i t i a l s t e a d y - s t a t e v e l o c i t y i s r e a c h e d t h a t c o r r e s p o n d s t op e e l i n g o f t h e m e m b r a n e r e g i o n o u t s i d e t h e p a t c h . B e c a u s ep e e l i n g s l o w s as T m p d e c r e a s e s , t h e p a t c h r e a c h e s t h e c o n t a c tpoint at l o n g e r times for lower Tmp ( t 75 when T m p =0.5t 35when T m p=2 ) . The adhesive patch inhibitsmem-b r a n e p e e l i n g , b e c a u s e V p i s s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d as t h ep a t c h n e a r s t h e c o n t a c t p o i n t . I f T m p > 1 , m e m b r a n e p e e l i n gp r o c e e d s , a l b e i t a t a s l o w e r r a t e . I n t h i s c a s e , V p d i s p l a y si n t e r e s t i n g d y n a m i c b e h a v i o r , i n c l u d i n g a n o v e r s h o o t , a n un -d e r s h o o t , a n d d a m p e d o s c i l l a t i o n s as t h e s t e a d y - s t a t e v e l o c -i t y o f t h e p a t c h i s r e a c h e d . A l t h o u g h t h e i n i t i a l o v e r s h o o t( o c c u r r i n g f o r t ' 1 0 ) i s l i k e l y a n a r t i f a c t c a u s e d b y t h en u m e r i c a l a l g o r i t h m a n d i d e a l i z e d i n i t i a l s t a t e o f t h e mem-b r a n e , t h e d y n a m i c b e h a v i o r d i s p l a y e d as t h e e d g e o f c o n t a c t

TABLE I E s t i m a t e s f o r d i m e n s i o n a l p a r a m e t e r s o f t h e m o d e lP a r a m e t e r D e f i n i t i o n P h y s i o l o g i c a l r a n g e S o u r c e

A c e l l C e l l a r e a 1 0 2 _ 1 0 4 P m 2 B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 )B B e n d i n g m o d u l u s 0 . 4 - 4 X 1 1 - 1 2 e r g s E v a n s ( 1 9 8 3 ) ; E n g e l h a r d t e t a l . ( 1 9 8 5 ) ; Duwe e t a l . ( 1 9 9 0 )k b e T h e r m a l e n e r g y 3 . 8 - 4 . 3 X 1 0 - 1 4 e r g sk r R e v e r s e r e a c t i o n r a t e 1 0 - 5 _ 1 0 1 S - i P e c h t a n d L a n c e t ( 1 9 7 7 ) ; B e l l ( 1 9 7 8 )K e q R e c e p t o r - l i g a n d a f f i n i t y 1 0 - 1 0 - 1 0 - 5 c m 2 B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 ) ; Dembo e t a l . ( 1 9 8 8 )L C o n t a c t r a d i u s 5 - 3 0 g l m B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 )L P a t c h l e n g t h < 0 . 1 - 1 0 J i m I z z a r d a n d L o c h n e r ( 1 9 7 6 ) ; S t r e e t e r a n d R ee s ( 1 9 8 7 ) ; T a w i l e t a l . ( 1 9 9 3 )W . : L i g a n d d e n s i t y 1 0 6 - 1 0 1 2 c m - 2 M a s s i a a n d H u b be l l ( 1 99 1 )R e c e p t o r n u m b e r 1 0 4 _ 1 0 6 B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 ) ; A k i y a m a e t a l . ( 1 9 9 0 )A R e c e p t o r - l i g a n d b o n d l e n g t h 1 0 - 1 0 0 n m B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 )K , K t s S p r i n g c o n s t a n t 1 0 2 1 0 1 d y n c m - 1 B e l l e t a l . ( 1 9 8 4 ) ; Dembo e t a l . ( 1 9 8 8 )

W a r d e t a l . 2 5 2 5


5/13

V o l u m e 6 7 D e c e m b e r 1 9 9 4TABLE 2 D i m e n s i o n l e s s p a r a m e t e r sS y m b o l * E x p r e s s i o n D e f i n i t i o na 2 i r L 2 / A c 1 1 D i m e n s i o n l e s s c o n t a c t a r e a3 i K j A 2 / 2 k b O B o n d e n e r g y / t h e r m a l e n e r g y8 A l L B o n d l e n g t h / c o n t a c t a r e a r a d i u sS p L p / L P a t c h l e n g t h / c o n t a c t a r e a r a d i u sE N 1 4 A 1 / R t L i g a n d d e n s i t y / r e c e p t o r d e n s i t yc R P L 2 / A e l l D i m e n s i o n l e s s r e c e p t o r d e n s i t y

i I K 1 L 2 / B B o n d e n e r g y / b e n d i n g e n e r g ye K q i R V A C 1 1 D i m e n s i o n l e s s r e c e p t o r - l i g a n d a f f i n i t yK i ( K j - K . i ) / K i R e a c t i v e c o m p l i a n c ef N t N t 2 / N t , C l u s t e r i n g f a c t o rN i J N j , q i C r i t i c a l b o n d d e n s i t y* T h e s u b s c r i p t i d e n o t e s t h e p r o p e r t i e s o f r e c e p t o r s o u t s i d e ( i = 1 ) or i n s i d e( i = 2 ) t h e r e c e p t o r c l u s t e r .

3..

3 . 0 -

2.5-

2.0 -~ ~ ~ ~ T m p2

1.5Tm-=1.0 T t p= 0 . 50.5 -

0. 0 - -0 20 40 60 80 1 00

t

FIGURE 2 T h e t i m e dependence of t h e d i m e n s i o n l e s s p e e l i n g v e l o c i t y ,v w h e n a p a t c h of h i g h r e c e p t o r d e n s i t y is located just inside t h e c o n t a c tp o i n t i s examined for three values of T M P n the r a ti o of the applied tensions cal ed to the c r iti c a l tension of t h e p a t c h . The patch is s u b s t a n t i a l l y l o n g e rt h a n the length overwhich membrane b e n d i n g occurs( Ev a n s, 1 9 85 a ). Pa-rameter values area=0.628, P ,=t 9 2=8.8, 8=2 X 10-3 , S p ,=.2,E=1, ~=iOn, 4 p l=4~2=1 0 6 , U i J =ft2= 1 , f K l 4 =f42=0 O fNt=10, andn c= 10.The p a t c h is i n i t i a l l y located at t h e d i m e n s i o n l e s s arclength=Pbg=0.05.

movesinto the patch is more likely observable. The patchdoes not p e e l ( ' V P=0) if T - p -- 1.Whenadhesion occurs in the presence of cytoskeletal

p l aq u e s that are c ap ab l e of cro s s -l i n ki ng adhesion receptors,increases in l i g a n d d en s ity promote r e c e pt o r clusteringw i t h i n t h e s e p l a q u e s c o m p a r e d w i t h o t h e r r e g i o n s o f t h e c e l ls u r f a c e ( s e e F i g . 6 A i n Ward a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) . To e s -t a b l i s h t h e e f f e c t o f l i g a n d d e n s i t y o n t h e p e e l i n g o f r e c e p t o rc l u s t e r s , we show h ow V p d e p e n d s on d i m e n s i o n l e s s l i g a n dd e n s i t y , E, f o r a f i x e d a p p l i e d t e n s i o n ( 0 . 0 1 2 d y n c m - ' ) ( F i g .3 ) . B e c a u s e f N & i s c o n s t a n t , c h a n g e s i n e d o n o t a l t e r t h en u m b e r o f r e c e p t o r s l o c a t e d e i t h e r i n s i d e or o u t s i d e t h e p a t c h .H o w e v e r , t h e f r a c t i o n o f t h e s e r e c e p t o r s b o u n d t o l i g a n d

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0t

FIGURE 3 E f f e c t o f t h e d i m e n s i o n a l l i g a n d d e n s i t y , E , o n t h e p e e l i n gv e l o c i t y , V p . P a r a m e t e r v a l u e s a r e i d e n t i c a l t o F i g . 2 e x c e p t t h a t T m a c =0 . 0 1 2 d y n c m - ' .

i n c r e a s e s a s E i n c r e a s e s , r e s u l t i n g i n d i m i n i s h e d r a t e s o fm e m b r a n e p e e l i n g a t h i g h E . F o r E = 1 , V -- 2 . 7 5 X 1 0 - 3a n d V,s 1 . 9 X 1 0 - 3 w h e n p e e l i n g n o n - p a t c h a n d p a t c hr e g i o n s , r e s p e c t i v e l y . B o t h v e l o c i t i e s d e c r e a s e a s E i s i n -c r e a s e d , u n t i l a c r i t i c a l l i g a n d d e n s i t y ( E = 2 0 ) i s r e a c h e d , a tw h i c h p o i n t V p s s = 0 f o r t h e p a t c h ; h e n c e , d e t a c h m e n t o f t h ep a t c h i s p r o h i b i t e d . N o t e a l s o t h a t l a r g e r o s c i l l a t i o n s i n Vo c c u r a t l o w E .We e x a m i n e t h e e f f e c t o f f N t o n V p w h e n E i s h i g h i n F i g . 4 .T h e l i g a n d d e n s i t y i s c o n s t a n t i n t h i s c a s e , b u t g r e a t e r c l u s -t e r i n g ( i n c r e a s e d f N l ) r e s u l t s i n t h e a c c u m u l a t i o n o f r e c e p t o r sw i t h i n t h e p a t c h a t t h e e x p e n s e o f n o n - p a t c h r e g i o n s . Whenf N & = 1 , t h e r e c e p t o r d e n s i t y i s u n i f o r m t h r o u g h o u t t h e c e l l -s u b s t r a t e c o n t a c t a n d t h e m e m b r a n e p e e l s a t a s i n g l e s t e a d y -s t a t e r a t e , V p s s 1 . 2 X i 0 ' ( F i g . 4 a ) . A 1 0 - f o l d c l u s t e r i n g( f N t = 1 0 ) l e a d s t o a s i m i l a r f a c t o r o f d e c l i n e i n t h e p e e l i n gr a t e o f t h e p a t c h ( V p S S 1 . 2 X 1 0 - 4 ) , w h e r e a s m o d e s t l yi n c r e a s i n g t h e p e e l i n g v e l o c i t y o f r e g i o n s o u t s i d e t h e p a t c h( V p s s - 1 . 7 X 1 0 - 3 ) . I n t e g r a t i n g V p ( t ) o v e r t i m e , we c a l c u l a t et h e f r a c t i o n o f t h e e n t i r e a d h e s i v e c o n t a c t r e m a i n i n g a t t a c h e dt o t h e s u b s t r a t e , L , a s a f u n c t i o n o f t h e d i m e n s i o n l e s s t i m e( F i g . 4 b ) . A f t e r a n i n i t i a l l a g p h a s e , L c d e c r e a s e s r a p i d l y u n t i lt h e p a t c h i s r e a c h e d , a t w h i c h p o i n t p e e l i n g s l o w s . T h e i n i t i a ld r o p i n L c , c o r r e s p o n d i n g t o p e e l i n g o f r e g i o n s o u t s i d e t h ea d h e s i v e p a t c h , i s m o s t s e v e r e a t h i g h f N t b e c a u s e V p s s o fn o n - p a t c h r e g i o n s i s g r e a t e s t w h e n f N & i s l a r g e . H o w e v e r ,b e c a u s e V p s s o f t h e p a t c h i s s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d a s c l u s t e r i n g( f N t ) i n c r e a s e s , p e e l i n g o f t h e e n t i r e i n t e r f a c e w i l l r e q u i r em u c h l o n g e r t i m e s w h e n f N t i s h i g h . F o r e x a m p l e , a l t h o u g hc e l l d e t a c h m e n t ( L , = 0 ) o c c u r s a t t 8 4 0 f o r f N t = 1 , t h ep a t c h V p s s e q u a l s z e r o w h e n f N & = 2 0 , s u c h t h a t m e m b r a n ep e e l i n g s t o p s w h e n L c = 0 . 9 5 ( i . e . , t f o r p e e l i n g i s i n f i n i t e ) .

B i o p h y s i c a l J o u r n a l5 2 6


6/13

K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r s2 . 5

_ s nC )1 2 -

X t

3 0t

FIGURE 4 E f f e c t o f c l u s t e r i n g f a c t o r , f N t , o n m e m b r a n e p e e l i n g . ( a ) V P ,as a f u n c t i o n o f d i m e n s i o n l e s s t i m e . ( b ) D i m e n s i o n l e s s c o n t a c t r a d i u s , L C ,as a f u n c t i o n o f d i m e n s i o n l e s s t i m e . T h e p a r a m e t e r v a l u e s are t h e same asF i g . 2 , e x c e p t t h a t E = 2 0 a n d T , a c = 0 . 0 2 d y n c m - ' .

F i g s . 3 a n d 4 d e m o n s t r a t e t h a t c e l l d e t a c h m e n t i s d e l a y e d ,or e v e n p r e v e n t e d , when r e c e p t o r c l u s t e r s are p r e s e n t . A l -t h o u g h c h a n g e s i n l i g a n d d e n s i t y ( E ) o r t h e c l u s t e r i n g i n d e x( f N t ) a f f e c t t h e d e n s i t y o f r e c e p t o r - l i g a n d b o n d s w i t h i np a t c h e s , w h i c h c o n s e q u e n t l y i n f l u e n c e s t h e a t t a c h m e n ts t r e n g t h a n d d e t a c h m e n t d y n a m i c s o f t h e m e m b r a n e , p e e l i n go f a n a d h e s i v e p a t c h may b e a l t e r e d b y m o d u l a t i o n o f t h ec h e m i c a l o r m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f i n d i v i d u a l b o n d s w i t h i nt h e p a t c h when t h e l e v e l o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g r e m a i n s con-s t a n t . F o r e x a m p l e , b i o c h e m i c a l m o d i f i ca t i o n o f a d h es i o nr e c e p t o r s a f t e r c y t o s k e l e t a l l y d r i v e n c l u s t e r i n g may e n h a n c et h e a f f i n i t y b e t w e e n r e c e p t o r a n d l i g a n d , or s t r e n g t h e nr e c e p t o r - l i g a n d b o n d s , t h e r e b y e n a b l i n g t h e b o n d s t o w i t h -s t a n d g r e a t e r l e v e l s o f s t r a i n b e f o r e r u p t u r i n g . T h e r e f o r e , wee x a m i n e h ow c h a n g e s i n t h e a f f i n i t y ( W 2 ) a n d r e a c t i v e com-p l i a n c e ( f K 2 ) o f b o n d s w i t h i n t h e p a t c h a f f e c t m e m b r a n e p e e l -i n g when t h e p r o p e r t i e s o f r e c e p t o r - l i g a n d b o n d s o u t s i d e t h ep a t c h ( w c a n d f K l ) r e m a i n f i x e d .When t h e r e c e p t o r - l i g a n d a f f i n i t y f o r b o n d s o u t s i d e t h ep a t c h , wp i s c o n s t a n t , c h a n g e s i n t h e a f f i n i t y , 2 9 between

l i g a n d a n d c l u s t e r e d b o n d s d o n o t c h a n g e t h e p e e l i n g v e -l o c i t y , V p , o f n o n - p a t c h r e g i o n s ( F i g . 5 , t < 2 5 ) . I n c r e a s e s i nW 2 r e d u c e t h e s t e a d y - s t a t e p e e l i n g v e l o c i t y o f t h e p a t c h , a l -t h o u g h c o n s i d e r a b l e ( 1 0 0 - f o l d ) e n h a n c e m e n t s g i ve o n l y as l i g h t ( < t w o f o l d ) d e c r e a s e i n V p s s , . T h e w e a k d e p e n d e n c e o fV p s s o n a f f i n i t y i s b e c a u s e t h e maximum b o n d d e n s i t y w i t h i nt h e p a t c h i s l i m i t e d b y a v a i l a b l e l i g a n d ( E = 1 ) i n t h i s c a s e .T h u s , a l t h o u g h a 1 0 - f o l d i n c r e a s e i n l i g a n d d e n s i t y p r o p o r t i o n -a l l y r e d u c e s V p s o f t h e p a t c h ( F i g . 3 ) , l a r g e c h a n g e s i n w 2 h a v ea m i n o r i n f l u e n c e o n m e m b r a n e p e e l i n g i n t h i s r e g i m e .F i g . 6 s h o w s t h e p e e l i n g v e l o c i t y , V p , a s t h e r e a c t i v e c o m -p l i a n c e o f b o n d s i n s i d e t h e p a t c h ( f K 2 ) i s v a r i e d f o r a f i x e dr e a c t i v e c o m p l i a n c e o f n o n - p a t c h b o n d s ( f K l ) . V a r i a t i o n i nt h e r e a c t i v e c o m p l i a n c e , k e e p i n g a l l o t h e r d i m e n s i o n l e s s p a -r a m e t e r s f i x e d , i s t a n t a m o u n t t o v a r y i n g K t s i , w h i c h h a s t h ea d d i t i o n a l e f f e c t o f a l t e r i n g t h e f o r w a r d r e a c t i o n r a t e . N e v -e r t h e l e s s , i n c r e a s i n g f K 2 h a s t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g t h e r a t eo f b r e a k a g e u n d e r a f i x e d s t r a i n . I n c r e a s e s i n t h e s t r e n g t h o fp a t c h b o n d s ( d e c r e a s i n g f K 2 ) l e a d t o s l o w e r r a t e s o f m e m b r a n ep e e l i n g ( l o w e r V p ) a n d s i g n i f i c a n t l y a f f e c t t h e t r a n s i e n t b e -h a v i o r o f V p a s t h e p a t c h a p p r o a c h e s t h e e d g e o f c o n t a c t .B e c a u s e c h a n g e s i n r e a c t i v e c o m p l i a n c e a l t e r t h e p e e l i n gv e l o c i t y w i t h o u t i n f l u e n c i n g t h e c r i t i c a l t e n s i o n ( D e m b oe t a l . , 1 9 8 8 ) , m e m b r a n e p e e l i n g i s a l w a y s p o s s i b l e ( V p s s > 0 )f o r t h i s l e v e l o f a p p l i e d t e n s i o n ( T m p = 2 ) p r o v i d e d f K 2 2 0 .C a t c h - b o n d s ( f K < 0 ) p r e v e n t p e e l i n g e v e n w h e n t h e a p p l i e dt e n s i o n e x c e e d s t h e c r i t i c a l t e n s i o n ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) ,s u g g e s t i n g t h a t b i o c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n s o f c l u s t e r e dr e c e p t o r - l i g a n d c r o s s - b r i d g e s t h a t r e d u c e f K 2 t o w a r d t h ec a t c h - s t a t e w i l l s u b s t a n t i a l l y i n h i b i t c e l l d e t a c h m e n t .I n p r e v i o u s f i g u r e s , t h e a b i l i t y t o r e a ch a n a s y m p t o t i c p e e l -i n g v e l o c i t y i s a f u n c t i o n o f t h e s i z e o f t h e p a t c h c o m p a r e dw i t h t h e l e n g t h o f a b o u n d a r y r e g i o n , T , w h i c h d e p e n d s i n -

3 . 5 . - 2 5 1 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0 =3 . 0 -2 . 5 -

2 . 0 - ( 0 2 1x ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ( 0 21 0

1 . 5 02= 1 0 01 . 0

0 . 5 -

0 . 0 ~0 1 0 2 0 3 0 4 0

tFIGURE 5 E f f e c t o f a f f i n i t y o f r e c e p t o r s i n t h e p a t c h , ( 1 2 , o n p e e l i n gv e l o c i t y V P . P a r a m e t er v a l u es a r e g i v e n i n F i g . 2 , e x c e p t t h a t T m a c = 0 . 0 1 2d y n c m - ' .

Ward e t a l . 2 5 2 7


7/13


8/13

K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r si s a l t e r e d i n t h e s e s i m u l a t i o n s , a s t h e b o n d s t i f f n e s s . When4 2 = 1 0 6 , t h e p a t c h p e e l s e v e n t h o u g h T m p = 1 b e c a u s e t h ep a t c h l e n g t h , 6 p , i s m u c h s m a l l e r t h a n t h e b o u n d a r y l e n g t h ,T , o v e r w h i c h m e m b r a n e b e n d i n g i s o b s e r v e d . I n t h i s c a s e ,t h e t i m e , t p , t o c o m p l e t e l y p e e l t h e p a t c h i s - 1 8 0 . F i g . 7 ar e v e a l s t h a t a l t h o u g h s m a l l d e c r e a s e s i n t h e r e l a t i v e b o n ds t i f f n e s s ( 0 2 = 9 X 1 0 ' ) d e l a y t h e p e e l i n g o f t h e p a t c h ( t p2 1 5 ) , p e e l i n g i s c o m p l e t e l y a b o l i s h e d i f t h e r e l a t i v e s t i f f n e s si s t o o s m a l l ( t p -> o o w h e n 4 2 = 8 X 1 0 5 ) . F a s t e r p e e l i n g i so b s e r v e d w h e n b o n d s t i f f n e s s i s i n c r e a s e d ( 4 2 = 2 x 1 0 6 ) .H o w e v e r , w h e n t h e s t i f f n e s s i s f u r t h e r i n c r e a s e d ( 0 2 = 5 X1 0 6 ) , p e e l i n g i s o n c e a g a i n p r e v e n t e d ( F i g . 7 b ) . T h u s , d e -t a c hm en t o f a p a tc h o f l e n g t h B P w h e n 8 p < T o c c u r s i n a f i n i t et i m e ( 1 / t p > 0 ) o n l y w h e n t h e s p r i n g c o n s t a n t i s w i t h i n a ni n t e r m e d i a t e r a n g e ( F i g . 7 c ) ; w h e n 4 2 i S t o o l o w o r t o o h i g h ,m e m b r a n e p e e l i n g i s p r o h i b i t e d . T h i s d e p e n d e n c e o f t p o n 4 2c a n n o t b e e x p l a i n e d b y c h a n g e s i n t h e c r i t i c a l t e n s i o n , T c r i t Vo f t h e e q u i v a l e n t i n f i n i t e p a t c h b e c a u s e c h a n g e s i n t h e s p r i n gc o n s t a n t d o n o t a l t e r T T i , ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) . R a t h e r ,i n c r e a s i n g 4 2 h a s t w o o pp o s i n g e f f e c t s : a ) t o i n c r e a s e t h ep e e l i n g v e l o c i t y ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d b ) d e c r e a s e t h eb o u n d a r y l e n g t h ( F i g . 7 d ) ( E v a n s , 1 9 8 5 a ) . When 4 2 = 1 0 6 ,5 p < T a n d t h e p a t c h p e e l s . V p o f t h e p a t c h i n c r e a s e s s l i g h t l yw h e n 4 2 i s r a i s e d t o 2 X 1 0 6 a n d , b e c a u s e T i s s t i l l > 8 ,p e e l i n g o f t h e p a t c h r e q u i r e s l e s s t i m e . O n e w o u l d e x p e c t t pt o b e e v e n s m a l l e r w h e n 4 2 = 5 X 1 0 6 b e c a u s e o f t h e d e -p e n d e n c e o f V p o n t h e s p r i n g c o n s t a n t . H o w e v e r , t h e b e n d i n gl e n g t h d e c r e a s e s ( T = 5 i n t h i s c a s e ) a n d t h e p a t c h p e e l s a si f i t i s i n f i n i t e ; b e c a u s e T m p = 1 , V P = 0 . A l t h o u g h t h e b o u n d -a r y l e n g t h c h a n g e s s l i g h t l y w h e n 4 2 < 1 0 6 , t h e r e d u c t i o n i nt h e p e e l i n g v e l o c i t y o f t h e p a t c h w i t h d e c r e a s i n g 4 2 i S t h em a j o r r e a s o n w h y t p i n c r e a s e s i n t h e s e i n s t a n c e s . T h u s , b i o -c h e m i c a l m o d u l a t i o n o f t h e m e c h a n i c a l s t i f f n e s s o f r e c e p t o r -l i g a n d b o n d s w i t h i n s m a l l c l u s t e r s c a n d r a m a t i c a l l y a l t e r d e -t a c h m e n t k i n e t i c s .

COMPARISON WITH EXPERIMENTT h e r e s u l t s o f t h i s p a p e r i n d i c a t e how r e c e p t o r a n d l i g a n dc h e m i s t r y a n d t h e c l u s t e r i n g o f a d he s i o n r e c e p t o r s i n f l u e n c et h e s t r e n g t h o f c e l l - s u b s t r a t e a t t a c h m e n t a n d a l t e r t h e d y -n a m i c s o f c e l l d e t a c h m e n t . I n t h i s s e c t i o n , we d i s c u s s e x -p e r i m e n t a l m e t h o d s t h a t may p e r m i t v e r i f i c a t i o n o f s p e c i f i cm o d e l p r e d i c t i o n s , a n d q u a l i t a t i v e l y e x a m i n e m e a s u r e m e n t so f t h e k i n e t i c s o f T l y m p h o c y t e d e t a c h m e n t f r o m a n ICAM-1s u r f a c e ( T o z e r e n e t a l . , 1 9 9 2 ) .I t i s p o s s i b l e t o p r o d u c e s u b s t r a t e s o f d i f f e r e n t l i g a n d d e n -s i t y ( C o z e n s - R o b e r t s e t a l . , 1 9 9 0 ; M a s s i a a n d H u b b e l l ,1 9 9 0 ) . A l s o , c e l l l i n e s e x p r e s s i n g a l t e r e d f i b r o n e c t i n r e c e p -t o r s a r e a v a i l a b l e ; t h e s e r e c e p t o r s b i n d l i g a n d b u t d o n o ta s s o c i a t e w i t h t h e c y t o s k e l e t o n ( M a r c a n t o n i o e t a l . , 1 9 9 0 ;R e s z k a e t a l . , 1 9 9 2 ) . T h e s e c e l l l i n e s s h o u l d s h o w a l t e r e dp a t t e r n s o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g t h a t may f a c i l i t a t e t h e o b s e r -v a t i o n o f d e t a c h m e n t d y n a m i c s a s a f u n c t i o n o f r e c e p t o r c l u s -t e r i n g . F i n a l l y , b e c a u s e m i c r o p i p e t a s p i r a t i o n a l l o w s o n e t om e a s u r e t h e m e m b r a n e t e n s i o n d u r i n g d e t a c h m e n t , t h e t o t a lc o n t a c t a r e a , a n d t h e c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t a n g l e , i t s h o u l d

p r o v e p o s s i b l e t o t e s t m o d e l p r e d i c t i o n s c o n c e r n i n g t h e i n -f l u e n c e o f l i g a n d d e n s i t y , r e c e p t o r n u m b e r , a n d r e c e p t o r -l i g a n d a f f i n i t y o n t h e c r i t i c a l t e n s i o n a n d p e e l i n g v e l o c i t y .T o e v a l u a t e q u a n t i t a t i v e l y t h e i n f l u e n c e o f r e c e p t o r c l u s -t e r i n g o n t h e d y n a m i c s o f c e l l d e t a c h m e n t , o n e m u s t f i r s ti d e n t i f y w h e t h e r r e c e p t o r a g g r e g a t e s f o r m a f t e r i n i t i a l a t -t a c h m e n t a n d a s c e r t a i n t h e l o c a t i o n a n d s i z e o f t h e s e p a t c h e s .A l t h o u g h i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l i n g o f a d h e s i o n r e c e p t o r sh a s b e e n s u c c e s s f u l l y i m p l e m e n t e d t o d i s c e r n c l u s t e r s o f a d -h e s i o n r e c e p t o r s ( D e j a n a e t a l . , 1 9 8 8 ; F a t h e t a l . , 1 9 8 9 ) , n oo n e h a s s i m u l t a n e o u s l y o b s e r v e d r e c e p t o r c l u s t e r i n g a n dm e a s u r e d d e t a c h m e n t k i n e t i c s b e c a u s e c o n c u r r e n t m i c r o p i -p e t a s p i r a t i o n a n d c l u s t e r i d e n t i f i c a t i o n r e q u i r e s o b s e r v a t i o na n g l e s t h a t a r e p e r p e n d i c u l a r t o e a c h o t h e r , a n d t h e r e f o r ei n v o l v e s c o m p l i c a t e d d e s i g n c o n s i d e r a t i o n s . A l t h o u g h q u a n -t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f o u r m o d e l i s n o t p o s s i b l e i n t h e a b s e n c eo f s u c h e x p e r i m e n t s , we u t i l i z e o u r t h e o r e t i c a l f r a m e w o r k t od e t e r m i n e w h e t h e r r e c e p t o r c l u s t e r i n g c a n e x p l a i n r e c e n tm e a s u r e m e n t s o f t h e d e t a c h m e n t k i n e t i c s o f T l y m p h o c y t e sf r o m ICAM-1 s u b s t r a t e s ( T o z e r e n e t a l . , 1 9 9 2 ) .

B e c a u s e a n i n t e g r a l c o m p o n e n t o f T l y m p h o c y t e a d h e s i o nt o a v a r i e t y o f c e l l t y p e s i s t h e a s s o c i a t i o n o f t h e L F A - 1r e c e p t o r o n t h e T - c e l l w i t h i t s c o u n t e r r e c e p t o r , ICAM-1( S p r i n g e r , 1 9 9 0 ) , T o z e r e n e t a l . ( 1 9 9 2 ) m e a s u r e d d e t a c h m e n to f P M A - t r e a t e d T l y m p h o cy t es f r o m a p l a n a r l a y e r o fICAM-1 m o l e c u l e s u s i n g m i c r o p i p e t a s p i r a t i o n ( F i g . 8 ) . F o ra l l c e l l s s t u d i e d , c e l l d e t a c h m e n t o c c u r r e d i n t w o d i s t i n c ts t a g e s : a ) a g r a d u a l r e d u c t i o n o f t h e c o n t a c t r a d i u s i n i t i a l l y ,f o l l o w e d b y b ) s u b s t a n t i a l l y h i g h e r p e e l i n g r a t e s t h a t c o n -t i n u e d u n t i l d e t a c h m e n t w a s c o m p l e t e . H o w e v e r , t h e b e h a v -i o r o f i n d i v i d u a l c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t . F o r e x -a m p l e , i n o n e i n s t a n c e ( F i g . 8 , c i r c l e s ) d e t a c h m e n t p r o c e e d e dt h r o u g h " s t o p - a n d - g o " p e e l i n g - i n t e r v a l s o f f a s t p e e l i n g s u r -r o u n d i n g a p e r i o d o f e x t r e m e l y s l o w d e t a c h m e n t . B e c a u s eL F A - 1 r e c e p t o r s o n P M A - s t i m u l a t e d l y m p h o c y t e s a s s o c i a t e

T i m e ( s )FIGURE 8 T h e t i m e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n t h e c o n t a c t r a d i u s d u r i n g m i -c r o p i p e t a s p i r a t i o n o f T l y m p h o c y t e s f r o m a n ICAM-1 s u b s t r a t e ( T o z e r e ne t a l . , 1 9 9 2 ) . I n e a c h o f t h e t h r e e e x p e r i m e n t s s h o w n i n t h i s p l o t , d e t a c h m e n tp r o g r e s s e s f r o m a n i n i t i a l s l o w p e e l i n g t o a m o r e r a p i d r e d u c t i o n i n t h ec o n t a c t r a d i u s u n t i l d e t a c h m e n t i s c o m p l e t e . R e p r o d u c e d f r o m t h e B i o p h y s i -c a l J o u r n a l , 1 9 9 2 , V o l . 6 3 , 2 4 7 - 2 5 8 , b y c o p y r i g h t p e r m i s s i o n o f t h eB i o p h y s i c a l S o c i e t y .

W a r d e t a l . 2 5 2 9


9/13

V o l u m e 6 7 D e c e m b e r 1 9 9 4w i t h t h e c y t o s k e l e t a l p r o t e i n t a l i n ( B u r n e t a l . , 1 9 8 8 ) , a c o m -p o n e n t o f f o c a l c o n t a c t s i n f i b r o b l a s t s a n d o t h e r c e l l t y p e s ,i t i s q u i t e p o s s i b l e t h a t L F A - 1 r e c e p t o r s w e r e c l u s t e r e d o n t h el y m p h o c y t e s u r f a c e t h r o u g h c r o s s - l i n k i n g b y t a l i n . We t h e r e -f o r e e x a m i n e w h e t h e r t h e o b s e r v e d d e t a c h m e n t b e h a v i o r o fT l y m p ho c y t e s o n ICAM-1 s u b s t r a t e s c a n b e e x p l a i n e d b yt h e p r e s e n c e o f d i s c r e t e p a t c h e s o f L F A - 1 r e c e p t o r s .

B e c a u s e o f t h e a b s e n c e o f i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n c e ,s i z e , a n d l o c a t i o n o f L F A - 1 c l u s t e r s , r i g o r o u s q u a n t i t a t i v ec o m p a r i s o n b e t w e e n m o d e l a n d e x p e r i m e n t i s i m p o s s i b l e .H o w e v e r , many o f t h e m o d e l p a r a m e t e r s w e r e m e a s u r e d , o rc a n b e e s t i m a t e d , f o r t h e L F A - 1 / I C A M - 1 s y s t e m , w h i c h a l -l o w s u s t o i m p r o v e s i g n i f i c a n t l y t h e a c c u r a c y o f a q u a l i t a t i v e 1c o m p a r i s o n . F o r e x a m p l e , l y m p h o c y t e s p o s s e s s a s u r f a c ea r e a o f a p p r o x i m a t e l y 2 X 1 0 - 6 c m 2 ( R o i t t e t a l . , 1 9 8 9 ) a n dt y p i c a l l y e x p r e s s 1 0 5 L F A - 1 r e c e p t o r s ( S u n g e t a l . , 1 9 9 2 ) . I nt h e d e t a c h m e n t e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d b y T o z e r e n e t a l .( 1 9 9 2 ) , t h e t i m e - d e p e n d e n t d e c r e a s e i n c o n t a c t r a d i u s w a sd i r e c t l y m e a s u r e d w h i l e t h e ICAM-1 d e n s i t y w a s f i x e d a t1 0 1 l c m - 2 . A d d i t i o n a l l y , a s a n e s t i m a t e , i f Y o u n g ' s e q u a t i o ni s v a l i d i n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e r e p o r t e d a d h e s i v e e n e r g i e sa n d c o n t a c t a n g l e s f o r T l y m p h o c y t e a t t a c h m e n t t o I C A M - 1s u b s t r a t e s s u g g e s t s t h a t t h e m a c r o s c o p i c a p p l i e d t e n s i o n i s- O . 1 d y n c m - ' .I n F i g . 9 , we p r e s e n t m o d e l r e s u l t s f o r t h e d e t a c h m e n tk i n e t i c s o f T l y m p h o c y t e s f r o m a n I C A M - 1 s u b s t r a t e . Wea s s u m e t h a t L F A - 1 r e c e p t o r s a r e c l u s t e r e d w i t h i n a n a d h e s i v ep a t c h l o c a t e d i n t e r i o r ( s = 0 . 3 ) t o t h e c o n t a c t p o i n t . We t h e nd e t e r m i n e t h e r a t e a t w h i c h t h e d i m e n s i o n l e s s c o n t a c tr a d i u s ( L u ) d e c r e a s e s a s t h e a m o u n t o f c l u s t e r i n g , t h ep a t c h s i z e , a n d t h e c h e m i c a l o r m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o fc l u s t e r e d b o n d s i s v a r i e d . A l t h o u g h d e t a c h m e n t i s c o m -p l e t e when L c = 0 , we d o n o t e x t e n d o u r c a l c u l a t i o n sb e l o w L c = 0 . 2 b e c a u s e t h e c e n t e r o f c o n t a c t ( s = L ) c a nn o l o n g e r b e c o n s i d e r e d a c l a m p e d e x t r e m i t y a t t h i s v a l u eo f L c ( A p p e n d i x A ) .S u r p r i s i n g l y , we f i n d t h a t g r e a t e r c l u s t e r i n g ( h i g h e r f N t ) o fL F A - 1 r e c e p t o r s l e a d s t o f a s t e r d e t a c h m e n t ( F i g . 9 a , s o l i dl i n e s ) . I n c r e a s e s i n f N , s i m u l t a n e o u s l y r e d u c e t h e s t e a d y - s t a t ep e e l i n g v e l o c i t y , V P , , , o f t h e p a t c h w h i l e i n c r e a s i n g t h e p e e l -i n g o f n o n - p a t c h r e g i o n s ( F i g . 9 a , i n s e t ) . E n h a n c e d c l u s -t e r i n g o f r e c e p t o r s s e v e r e l y d i m i n i s h e s t h e d e n s i t y o f a d h e -s i v e c r o s s - b r i d g e s i n n o n - p a t c h r e g i o n s , b u t o n l y m o d e s t l yFIGURE 9 A q u a l i t a t i v e c o m p a r i s o n o f o u r m o d e l t o t h e e x p e r i m e n t a lm e a s u r e m e n t s o f T o z e r e n e t a l . ( 1 9 9 2 ) f o r t h e d e t a c h m e n t o f T l y m p h o c y t e sf r o m a n ICAM-1 s u b s t r a t e . ( a - c ) T h e d i m e n s i o n l e s s c o n t a c t r a d i u s d a t a , L 4 ,i s p l o t t e d v e r s u s t h e n o n d i m e n s i o n a l t i m e , t ( a ) G r e a t e r r e c e p t o r c l u s t e r i n g( i n c r e a s e s i n f N , ) r e s u l t s i n f a s t e r m e m b r a n e d e t a c h m e n t ( s o l i d l i n e ) b e c a u s et h e s t e a d y - s t a t e p e e l i n g v e l o c i t y , V , . , o f n o n - p a t c h r e g i o n s ( i n s e t , 0 ) i s m o r es t r o n g l y d e p e n d e n t o n f N , t h a n i s V P . f o r t h e p a t c h ( i n s e t , E l ) . ( b ) F o r ac o n s t a n t l e v e l o f a f f i n i t y ( c l ) b e t w e e n l i g a n d a n d r e c e p t o r s l o c a t e d o u t s i d et h e p a t c h , a s u b s t a n t i a l ( l O O X ) e n h a n c e m e n t i n t h e a f f i n i t y ( W 2 ) o f c l u s t e r e dr e c e p t o r s f o r l i g a n d o n l y s l i g h t l y d e l a y s d e t a c h m e n t . ( c ) E f f e c t o f d e c r e a s i n gf L 2 , o r s i m u l t a n e o u s l y d e c r e a s i n g f K l a n d f 2 on d e t a c h m e n t d y n a m i c s . P a -r a m e t e r v a l u e s a r e a = 0 . 5 0 3 , . l 3 = f 3 2 = 4 8 . 8 , 8 = 5 x 1 0 - , 8 p = 0 . 1 ,e = 2 , C = 8 0 0 0 , 4 l = 4 2 = 1 . 6 X 1 0 , w 0 = w 2 5 0 , f K = f 4 = 0 . 0 5 ,f N t = 5 0 , N b c i t = 1 - 4 , P b e g = 0 . 3 , a n d T m a c = 0 . 1 d y n c m - 1 , e x c e p t w h e r ei n d i c a t e d .

t

t

2 5 3 0 B i o p h y s i c a l J o u r n a l


10/13

K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r ss u p p l e m e n t s t h e b o n d d e n s i t y w i t h i n p a t c h e s b e c a u s e t h emaximum p o s s i b l e b o n d d e n s i t y i s l i m i t e d b y a v a i l a b l e l i -g a n d ( a E < 1 ) . D u r i n g p e e l i n g , V p s s o f t h e p a t c h ( s q u a r e s ) i sm u c h l e s s s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n f N , t h a n i s t h e s t e a d y - s t a t ev e l o c i t y o f r e g i o n s o u t s i d e t h e p a t c h ( c i r c l e s ) . T h e l a r g e d i f -f e r e n c e i n s t e a d y - s t a t e p e e l i n g v e l o c i t i e s s u g g e s t s t h a t t h ed e t a c h m e n t t i m e i s l a r g e l y c o n t r o l l e d b y t h e l e n g t h o f t h ea d h e s i v e p a t c h . I n d e e d , d o u b l i n g t h e p a t c h l e n g t h w h e n

f N t = 5 0 i n c r e a s e s t h e r e q u i r e d t i m e f o r c e l l d e t a c h m e n tn e a r l y t w o f o l d ( d a s h e d l i n e ) .B e c a u s e a c t i v a t i o n o f l y m p h o c y t e s , e i t h e r b y c r o s s - l i n k i n g

o f t h e T - c e l l r e c e p t o r o n t h e l y m p h o c y t e s u r f a c e o r b y p h o r -b o l e s t e r ( e . g . , PMA) a d d i t i o n , i n d u c e s a r a p i d e n h a n c e m e n ti n t h e a f f i n i t y b e t w e e n L F A - 1 r e c e p t o r s a n d ICAM-1 m o l -e c u l e s ( D u s t i n a n d S p r i n g e r , 1 9 8 9 ) , we i n v e s t i g a t e how i n -c r e a s e s i n a f f i n i t y a f f e c t p e e l i n g w h e n t h e a m o u n t o f c l u s -t e r i n g i s f i x e d ( f N t = 5 0 ) i n F i g . 9 b . I n t h i s f i g u r e , r e c e p t o r so u t s i d e t h e p a t c h m a i n t a i n a c o n s t a n t l e v e l o f a d h e s i v e n e s s( W 1 = 1 ) w h i l e t h e a v i d i t y o f c l u s t e r e d r e c e p t o r s ( w 2 ) i s i n -c r e a s e d . A l t h o u g h d e t a c h m e n t r e q u i r e s m o r e t i m e a s W 2 i Sr a i s e d , a 1 0 0 - f o l d c h a n g e i n a f f i n i t y h a s a r e l a t i v e l y m i n o ri n f l u e n c e o n t h e d e t a c h m e n t k i n e t i c s .I n c o n t r a s t t o t h e e f f e c t s o f r e c e p t o r - l i g a n d a f f i n i t y , i n -c r e a s e s i n t h e s t r e n g t h ( d e c r e a s e s i n f K 2 ) o f a d h e s i v e c r o s s -b r i d g e s w i t h i n t h e p a t c h h a v e a s u b s t a n t i a l i m p a c t o n t h e t o t a lp e e l i n g t i m e , t p ( F i g . 9 c ) . When t h e r e a c t i v e c o m p l i a n c e o fb o n d s i n n o n - p a t c h r e g i o n s e q u a l s t h a t o f b o n d s w i t h i n t h ep a t c h a n d i s r a t h e r h i g h ( f K l = 4 2 = 0 . 0 7 5 ) , t p 1 2 . 5 ( s o l i dl i n e ) . Much l o n g e r t i m e s ( t p > 5 0 ) a r e n e c e s s a r y f o r d e t a c h -m e n t i f t h e s t r e n g t h o f a l l r e c e p t o r - l i g a n d c r o s s - b r i d g e s i se q u a l l y e n h a n c e d ( f K l = f K 2 = 0 . 0 2 5 ) . We a l s o c o n s i d e r t h ep o s s i b i l i t y t h a t b o n d s t r e n g t h i s m o d u l a t e d s o l e l y b yr e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n a s s o c i a t i o n a n d , t h e r e f o r e , i s l i m i t e d t oc l u s t e r e d b o n d s . T h i s s c e n a r i o i s e x a m i n e d b y d e c r e a s i n g f . 2f o r f i x e d f K l ( = 0 . 0 7 5 ) . I n g e n e r a l , d e t a c h m e n t o c c u r s a t l a t e rt i m e s a s t h e s t r e n g t h o f b o n d s w i t h i n t h e p a t c h i s a u g m e n t e d .F o r e x a m p l e , a l t h o u g h d e t a c h m e n t o c c u r s a t t 1 2 . 5 w h e nf K 2 = 0 . 0 7 5 , a t h r e e f o l d r e d u c t i o n i n f K 2 ( = 0 . 0 2 5 ) e x t e n d s t h en e c e s s a r y t i m e f o r d e t a c h m e n t t o t p 2 7 . 5 . F i g . 9 c c l e a r l yd e m o n s t r a t e s t h a t b i o c h e m i c a l a l t e r a t i o n s o f r e c e p t o r - l i g a n db o n d s t h a t a l t e r t h e r e a c t i v e c o m p l i a n c e h a v e a s i g n i f i c a n ti n f l u e n c e o n t h e o b s er v e d d e t a c hm en t k i n e t i c s .

A l t h o u g h t h e c o m p a r i s o n b e t w e e n o u r m o d e l a n d t h e e x -p e r i m e n t a l m ea s u r e me n t s o f T l y m p h o c y t e d e t a c h m e n t f r o mICAM-1 s u b s t r a t e s ( T o z e r e n e t a l . 1 9 9 2 ) w a s q u a l i t a t i v e i nn a t u r e , we c a n s t i l l d r a w s o m e i m p o r t a n t c o n c l u s i o n s f r o mt h i s a n a l y s i s . F i r s t , o u r s t u d y s h o w s t h a t r e c e p t o r c l u s t e r sw i t h i n t h e c o n t a c t r e g i o n p e e l s u b s t a n t i a l l y s l o w e r t h a n o t h e ra r e a s . T h e r e f o r e , we f i n d t h a t c e l l d e t a c h m e n t o c c u r s t h r o u g ha c o m b i n a t i o n o f r a p i d a n d s l o w p e e l i n g , c o n s i s t e n t w i t h t h eg e n e r a l d e t a c h m e n t b e h a v i o r o f T l y m p h o c y t e s . T h i s c o m -p a r i s o n a l s o s u g g e s t s t h a t f o r t h e T l y m p h o c y t e / I C A M - 1 s y s -t e m u s e d b y T o z e r e n e t a l . ( 1 9 9 2 ) , c h a n g e s i n t h e s t r e n g t h( i . e . , r e a c t i v e c o m p l i a n c e ) o f r e c e p t o r - l i g a n d b o n d s h a v e am u c h g r e a t e r i m p a c t o n t h e d e t a c h m e n t d y n a m i c s t h a n d oa l t e r a t i o n s i n t h e c h e m i c a l a f f i n i t y b e t w e e n r e c e p t o r s a n d

d i s s o c i a t i o n r a t e o f u n s t r e s s e d b o n d s ( k r e q ) e q u a l s 1 s - 1 , t h en o n d i m e n s i o n a l t i m e e x a c t l y c o r r e s p o n d s t o d i m e n s i o n a lt i m e . I n t h i s c a s e , o u r m o d e l p r e d i c t s d e t a c h m e n t t i m e s( 1 0 - 6 0 s ) t h a t a r e c o m p a r a b l e w i t h t h e r e p o r t e d t i m e s f o r Tl y m p h o c y t e p e e l i n g ( s e e F i g . 8 ) .

DISCUSSIONI n t h i s p a p e r , we p r e s e n t e d a t h e o r e t i c a l f r a m e w o r k t h a t e x -a m i n e s t h e i n f l u e n c e o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g o n c e l l d e t a c h -m e n t d y n a m i c s . O u r m o d e l i n c o r p o r a t e s b o t h t h e c h e m i c a lk i n e t i c s o f r e c e p t o r - l i g a n d b o n d f o r m a t i o n a n d t h e m e c h a n i -c a l r e s p o n s e o f t h e c e l l m e m b r a n e t o s t r e s s e s t o d e t e r m i n e t h er a t e a t w h i c h t h e c e l l - s u b s t r a t e i n t e r f a c e p e e l s w h e n r e c e p t o r sa r e c l u s t e r e d w i t h i n d i s c r e t e p a t c h e s . B e c a u s e a g g r e g a t i o n o fa d h e s i o n r e c e p t o r s i n t o p a t c h e s i s a n e s s e n t i a l s t e p i n t h ed e v e l o p m e n t o f s p e c i a l i z e d a t t a c h m e n t s t r u c t u r e s s u c h a s f o -c a l a n d p o i n t c o n t a c t s ( B u r r i d g e e t a l . , 1 9 8 8 ; T a w i l e t a l . ,1 9 9 3 ) , t h i s a n a l y s i s s h o u l d f u r t h e r o u r u n d e r s t a n d i n g o f c e l -l u l a r m o d u l a t i o n o f a d h e s i v e b e h a v i o r .We d e m o n s t r a t e d t h a t r e c e p t o r c l u s t e r s ( i . e . , p a t c h e s ) s u b -s t a n t i a l l y r e d u c e t h e r a t e o f c e l l d e t a c h m e n t . I n c r e a s e s i n t h ee x t e n t o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g , t h e l i g a n d d e n s i t y , t h e r e c e p t o r -l i g a n d a f f i n i t y , a n d t h e s t r e n g t h o f c r o s s - b r i d g e s ( r e l a t i v e t ot h e b e n d i n g s t i f f n e s s ) w e r e a l l f o u n d t o d i m i n i s h t h e s t e a d y -s t a t e p e e l i n g v e l o c i t y o f t h e p a t c h . I n t e r e s t i n g l y , we f o u n dt h a t t h e c r i t i c a l t e n s i o n , b a s e d o n a m e m b r a n e o f i n f i n i t ee x t e n t , w a s n o t a n a p p r o p r i a t e m e a s u r e o f t h e s t r e n g t h o f

a d h es i o n o f a f i n i t e p a t c h i f t h e p a t c h l e n g t h , 8 p , i s l e s s t h a nt h e l e n g t h o v e r w h i c h m e m b r a n e b e n d i n g o c c u r s , T . I n s u c ha c a s e , t h e s t e a d y - s t a t e p e e l i n g v e l o c i t y i s n o t d e f i n e d . WhenS p < T ( T - - 0 . 0 2 ) , d e t a c h m e n t o f t h e p a t c h i s p o s s i b l e e v e nw h e n t h e a p p l i e d t e n s i o n e q u a l s t h e c r i t i c a l t e n s i o n f o r a ni n f i n i t e p a t c h o f e q u i v a l e n t d e n s i t y , a l t h o u g h t h e p e e l i n g v e -l o c i t y i s n e a r l y z e r o d u r i n g p e e l i n g o f t h e p a t c h . T h i s s u g -g e s t s t h a t r e c e p t o r c l u s t e r s t h a t a r e l e s s t h a n 0 . 2 , u m i n l e n g t h( i . e . , p o i n t c o n t a c t s ; s e e S t r e e t e r a n d R e e s ( 1 9 8 7 ) a n d T a w i le t a l . ( 1 9 9 3 ) ) may a l t e r p e e l i n g k i n e t i c s b y d e l a y i n g , b u t n o tp r e v e n t i n g , c e l l d e t a c h m e n t . B e c a u s e T , , t f o r a n i n f i n i t em e m b r a n e i s a v a l i d d e s c r i p t i o n o f t h e t e n s i o n r e q u i r e d t op e e l w h e n 8 p > > T ( a s i s t h e c a s e f o r f o c a l c o n t a c t s w h i c h a r et y p i c a l l y 2 - 1 0 , g m i n l e n g t h ) , t h i s f i n d i n g v a l i d a t e s o u r e a r -l i e r s t e a d y - s t a t e a n a l y s i s o f t h e a d h e s i v e s t r e n g t h o f f o c a lc o n t a c t s ( W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) .

B e c a u s e L F A - 1 r e c e p t o r s o n P M A - t r e a t e d l y m p h o c y t e smay b e c l u s t e r e d t h r o u g h c y t o s k e l e t o n a s s o c i a t i o n a f t e rp h o r b o l e s t e r ( e . g . , PMA) a d d i t i o n ( B u r n e t a l . , 1 9 8 8 ) , wep e r f o r m e d a q u a l i t a t i v e c o m p a r i s o n b e t w e e n o u r m o d e l a n dr e c e n t e x p e r i m e n t a l m e a s u r e m e n t s ( T o z e r e n e t a l . , 1 9 9 2 ) o ft h e d e t a c h m e n t o f P M A - t r e a t e d T l y m p h o c y t e s f r o mICAM-1 s u b s t r a t e s . T h e i n i t i a l p e e l i n g o f T l y m p h o c y t e s w a ss l o w a n d p r e c e d e d a m u c h m o r e r a p i d p e e l i n g o f t h e m e m -b r a n e t h a t c o n t i n u e d u n t i l d e t a c h m e n t w a s c o m p l e t e ( F i g . 8 )( T o z e r e n e t a l . , 1 9 9 2 ) . A l t h o u g h t h e d e g r e e o f r e c e p t o r c l u s -t e r i n g o n t h e l y m p h o c y t e s u r f a c e wa s n o t a s c e r t a i n e d b yT o z e r e n a n d c o l l e a g u e s , we s h o w e d t h a t t h e o b s e r v e d d e -t a c h m e n t b e h a v i o r ( i . e . , i n t e r v a l s o f s l o w a n d f a s t p e e l i n g )

2 5 3 1a r d e t a l .

l i g a n d m o l e c u l e s . F i n a l l y , b e c a u s e we h a v e a s s u m e d t h a t t h e


11/13

V o l u m e 6 7 D e c e m b e r 1 9 9 4c a n b e e x p l a i n e d b y t h e p r e s e n c e o f r e c e p t o r c l u s t e r s w i t h i nt h e c e l l - s u b s t r a t e i n t e r f a c e a n d f o u n d t h a t t h e d e t a c h m e n tt i m e i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h e r e a c t i v e c o m p l i a n c e o fr e c e p t o r - l i g a n d c r o s s - b r i d g e s ( F i g . 9 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t t h r o u g h c y t o s k e l e t a l r e o r g a n i z a t i o n , t h e T l y m p h o c y t em a y d r a m a t i c a l l y m o d u l a t e i t s a d h e s i v e b e h a v i o r b y s i m u l -t a n e o u s l y c l u s t e r i n g r e c e p t o r s a n d d e c r e a s i n g t h e r e a c t i v ec o m p l i a n c e o f b o n d s t h a t f o r m w i t h i n t h e s e c l u s t e r s . How-e v e r , r e c e p t o r c l u s t e r i n g may r e p r e s e n t o n l y a s i n g l e c o m -p o n e n t a f f e c t i n g t h e d e t a c h m e n t o f T l y m p h o c y t e s f r o mICAM-1 s u b s t r a t e s ; a d d i t i o n a l f a c t o r s t h a t may b e i m p o r t a n tb u t w e r e n o t c o n s i d e r e d i n o u r c o m p a r i s o n i n c l u d e a )c h a n g e s i n t h e b e n d i n g r i g i d i t y o f t h e m e m b r a n e -c y t o s k e l e t o n c o m p l e x i n s i d e t h e a d h e s i v e p a t c h , w h i c hw o u l d r e q u i r e t h e p a t c h t o f r a c t u r e i n s t e a d o f p e e l ( W a r d a n dH a m m e r , 1 9 9 3 ) , b ) a c t i v e e x t e n s i o n o f c y t o s k e l e t a l f i l a -m e n t s , c ) i n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o c e l l d e f o r m a t i o n ( i . e . , mem-b r a n e b e n d i n g ) a s d e t a c h m e n t p r o c e e d s ( T o z e r e n e t a l . ,1 9 9 2 ) , a n d d ) c h a n g e s i n t h e a p p l i e d t e n s i o n a s t h e c e l l d e -f o r m s d u r i n g a s p i r a t i o n .

O n e l i m i t a t i o n o f o u r a n a l y s i s i s t h e a b s en c e o f o v e r a l l c e l ld e f o r m a t i o n d u r i n g d e t a c h m e n t . D u r i n g a t y p i c a l d e t a c h m e n te x p e r i m e n t , t h e a p p l i e d d e t a c h m e n t f o r c e i s t r a n s m i t t e d t ot h e c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t t h r o u g h t h e c e l l m e m b r a n e a n d c e l lb o d y . I f t h e c e l l - s u b s t r a t e a t t a c h m e n t i s v e r y s t r o n g , a s i s t h ec a s e w i t h i n r e c e p t o r c l u s t e r s , s u b s t a n t i a l d e f o r m a t i o n o f t h ec e l l m a y o c c u r b e f o r e a n d d u r i n g d e t a c h m e n t . T h e r e f o r e , t od e t e r m i n e m o r e a c c u r a t e l y t h e d e t a c h m e n t b e h a v i o r o f c e l l sf o r m i n g r e c e p t o r c l u s t e r s , f u t u r e a n a l y s e s s h o u l d c o n s i d e rhow c h a n g e s i n c e l l g e o m e t r y d u r i n g d e t a c h m e n t a f f e c t t h et r a n s i e n t a n d s t e a d y - s t a t e p e e l i n g o f t h e m e m b r a n e .A s e c o n d l i m i t a t i o n c o n c e r n s t h e n u m e r i c a l s c h e m e we

i m p l e m e n t t o c a l c u l a t e t h e p e e l i n g v e l o c i t i e s o f t h e a d h e s i v ep a t c h . B e c a u s e o u r f i n i t e d i f f e r e n c e a l g o r i t h m u s e s e x p l i c i tt i m e - d i f f e r e n c i n g , v e r y s m a l l t i m e s t e p s a n d , t h u s , l o n g c o m -p u t a t i o n t i m e s a r e r e q u i r e d f o r n u m e r i c a l a c c u r a c y a n d s t a -b i l i t y ( A p p e n d i x A ) , e s p e c i a l l y w h e n t h e d i m e n s i o n l e s s f o r -w a r d r a t e c o n s t a n t , k f N I , b e c o m e s l a r g e ( i . e . , h i g h l i g a n dd e n s i t i e s o r a f f i n i t i e s ) .

A l t h o u g h we h a v e i m p l i c i t l y i m b e d d e d t h e a c t i o n o f c y t o -s k e l e t a l c r o s s - l i n k i n g m o l e c u l e s w i t h i n t h e c l u s t e r i n g f a c t o r ,f N t , i n t h i s a n a l y s i s , our f u t u r e w o r k w i l l i n c o r p o r a t e s p e c i f i cr e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n l i n k a g e s i n t o t h i s f r a m e w o r k . We p r e -v i o u s l y i n v e s t i g a t e d h o w r e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n p a t c h e s a f -f e c t c e l l - s u b s t r a t e a t t a c h m e n t s t r e n g t h a n d f o u n d t h a t t h e r e -q u i r e d d e t a c h m e n t f o r c e d e p e n d e d g r e a t l y o n t h e s t r u c t u r a lr i g i d i t y o f t h e r e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n p l a q u e ( W a r d a n d Ham-m e r , 1 9 9 3 ) . B y a d d i n g c y t o s k e l e t a l m o l e c u l e s t h a t e x e r t m e -c h a n i c a l s t r e s s e s o n t h e c e l l m e m b r a n e t o t h e p r e s e n t m o d e l ,we s h a l l e x a m i n e how t h e d e t a c h m e n t k i n e t i c s a r e a l t e r e db y i n c r e a s e s i n t h e r i g i d i t y o f r e c e p t o r - c y t o s k e l e t o n o rc y t o s k e l e t o n - c y t o s k e l e t o n c o n n e c t i o n s w i t h i n r e c e p t o r c l u s -t e r s , a n d a t t e m p t t o b r i d g e t h e g a p b e t w e e n t h e p e e l i n g a n df r a c t u r e m o d e s o f d e t a c h m e n t d e s c r i b e d i n o u r e a r l i e r w o r k( W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e C o r n e l l B i o t e c h n o l o g y P r o -g r a m , w h i c h i s s p o n s o r e d b y t h e Ne w Y o r k S t a t e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g yF o u n d a t i o n , a c o n s o r t i u m o f i n d u s t r i e s , t h e U n i t e d S t a t e s Army R e s e a r c hO f f i c e a n d t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n , a N a t i o n a l S c ie n ce F o u n d a t i o ng r a n t t o D a n i e l A . Hammer ( B C S - 9 0 0 9 5 0 6 ) , a n d a N a t i o n a l I n s t i t u t e s o fH e a l t h g r a n t t o M i c a h Dembo ( R O l A 1 2 1 0 0 2 - 0 7 ) .

APPENDIX AI n t h i s s e c t i o n , we p r e s e n t t h e n o n d i m e n s i o n a l m o d e l e q u a t i o n s g o v e r n i n gt h e d e t a c h m e n t k i n e t i c s o f a m e m b r a n e s e g m e n t w h e n a d h e s i o n r e c e p t o r sa r e c l u s t e r e d w i t h i n d i s c r e t e p a t c h e s . We a l s o d e s c r i b e t h e s o l u t i o n p r o c e -d u r e a n d d i s c u s s t h e a c c u r a c y o f t h e n u m er i c a l m et h o d .

T h e d i m e n s i o n l e s s e q u a t i o n s a r e o b t a i n e d b y d e f i n i n g t h e f o l l o w i n gs c a l i n g s : x = x / L ; y = y / A ; s = s / L ; C = C I L I A ; T = T 7 1 / B ; t = t k , ;N b = N b A W l R t ; A t = N t A . V / R t ; V P = V W k / 1 y q L .T h e e q u a t i o n s o f m e c h a n i c a l e q u i l i b r i u m f o r t h e m e m b r a n e b e c o m ea 2 C a x- w CT= - 4 O ) b ( Y 1 ) a x ( A l )

a n da T (2 ) a C 2 a y- + - = 2 4 ia x 2 / a x i a x ' ( A 2 )

w h e r e we u s e t h e s u b s c r i p t i t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e p r o p e r t i e s o f r e -c e p t o r s t h a t a r e c l u s t e r e d w i t h i n t h e a d h e s i v e p a t c h ( i = 2 ) a n d t h o s e t h a ta r e l o c a t e d o u t s i d e t h e p a t c h ( i = 1 ) .T h e d i m e n s i o n l e s s a r c l e n g t h a n d c u r v a t u r e e x p r e s s i o n s a r e

(ax\ 2( ay28 2 a 9 ) = ( A 3 )a n d

C=(ax,a2) - a 2 ) ( a y ( A 4 )I n t h e c e l l r e f e r e n c e f r a m e , t h e b o n d d e n s i t y a t a n y m e m b r a n e p o s i t i o nw i t h i n t h e c e l l - s u b s t r a t e i n t e r f a c e i s o b t a i n e d f r o m s o l u t i o n o f t h e n o n d i -

m e n s i o n a l c o n t i n u i t y e q u a t i o n ,a t - d a N , ,y N - V P b F + c o i k r K ( I E R O W N t N b ) - k , N b , ( A 5 )

w h e r e k , = e x p { f , , j ( y - 1 ) 2 } a n d k = e x p { - f ( j y - 1 ) 2 } . C o n v e c t i o n o ft h e a d h e s i v e p a t c h i s m e a s u r e d b y t h e t i m e - d e p e n d e n t c h a n g e i n t h e t o t a lr e c e p t o r d e n s i t y ,a N t - N ta t i% ( A 6 )

T h e s o l u t i o n t o E q s . A1-A6 m u s t s a t i s f y c e r t a i n b o u n d a r y a n d m a t c h i n gc o n d i t i o n s ( E v a n s , 1 9 8 5 a , b ; Dembo e t a l . , 1 9 8 8 ; W a r d a n d H a m m e r , 1 9 9 3 ) .B e c a u s e t h e m e m b r a n e i s f i r m l y c l a m p e d t o t h e s u b s t r a t e a t t h e c e n t e r o fc o n t a c t , y = 1 a n d ( a T I / M ) = 0 a t s = 1 . A t t h e c o n t a c t p o i n t ( s = 0 ) , t h eb o n d d e n s i t y , N b , e q u a l s a c r i t i c a l v a l u e , N b 1 , , t o e n s u r e t h a t m e m b r a n es t r e s s e s a r e n e g l i g i b l e a t t h i s p o i n t . P a r t i a l i n t e g r a t i o n o f t h e e q u a t i o n s o fm e m b r a n e m e c h a n i c a l e q u i l i b r i u m w i t h i n t h e m a c r o s c o p i c r e g i o n ( w h e r eN b = 0 ) y i e l d s m a t c h i n g c o n d i t i o n s t h a t r e l a t e t h e m e m b r a n e t e n s i o n , c u r v a t u r e ,a n d t r a n s v e r s e s h e a r a t s = 0 t o t h e m a c r o s c o p i c t e n s i o n , T . , , , c u r v a t u r e , C,a n d c o n t a c t a n g l e , O . , ( E v a n s , 1 9 8 5 a , b ; Dembo e t a l . , 1 9 8 8 ) ,

T= T , , ^ c o s ( 6 . - ,( ( ) 2 = (()2 + ( 2 t / 8 2 ) [ 1-C O S ( O -0)]

( A 7 )( A 8 )

a n da c d ( T, s i n ( O . - .a x f - ( A 9 )

2 5 3 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l


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W a r d e t a l . K i n e t i c P e e l i n g o f R e c e p t o r C l u s t e r s 2 5 3 3S o l u t i o n o f t h i s n o n l i n e a r s y s t e m o f e q u a t i o n s ( A l - A 9 ) y i e l d s t h e c e l l -s u b s t r a t e s e p a r a t i o n , b o n d d e n s i t y , a n d t e n s i o n a s f u n c t i o n s o f m e m b r a n ep o s i t i o n . T h e p e e l i n g v e l o c i t y i s c a l c u l a t e d f r o m E q . A 5 , e v a l u a t e d a t t h ec o n t a c t p o i n t . T h e m i c r o s c o p i c m e m b r a n e r e g i o n i s d i v i d e d i n t o a o n e -d i m e n s i o n a l g r i d w i t h a f i n e r m e s h - s i z e e m p l o y e d n e a r t h e e d g e o f c o n t a c t

b e c a u s e m e m b r a n e b e n d i n g i s g r e a t e s t i n t h i s r e g i o n . T h e i t e r a t i v e p r o c e d u r ei s b e g u n b y p r o v i d i n g a n i n i t i a l e s t i m a t e f o r t h e b o n d d e n s i t y d i s t r i b u t i o n :N b = O f o r s < 0 , N b = N b , f o r s = 0 , a n d N b = N b e q i f o r f > O ( i = 1 , o u t s i d ep a t c h ; i = 2 i n s i d e p a t c h ) . N e x t , t h e d i s c r e t i z e d f o r m s o f t h e c u r v a t u r er e l a t i o n ( A 4 ) a n d t h e m a t c h i n g c o n d i t i o n s o n c u r v a t u r e ( A 8 ) a n d t r a n s v e r s es h e a r ( A 9 ) a r e s u b s t i t u t e d i n t o t h e n o r m a l f o r c e b a l a n c e e q u a t i o n ( A l ) . F o rf i x e d t e n s i o n , x c o o r d i n a t e s , a n d b o n d d e n s i t y , t h e r e s u l t i n g b a n d e d m a t r i xi s s o l v e d t o d e t e r m i n e t h e c e l l - s u b s t r a t e s e p a r a t i o n s u b j e c t t o t h e a p p r o p r i a t eb o u n d a r y c o n d i t i o n s . T h e a r c l e n g t h e x p r e s s i o n ( A 3 ) i s u s e d t o u p d a t e t h ex c o o r d i n a t e s , w h e r e a s t h e m e m b r a n e t e n s i o n i s d e t e r m i n e d f r o m n u m e r i c a li n t e g r a t i o n o f E q . A 2 . T h e b o n d b a l a n c e ( E q . A 5 ) i s s o l v e d f o r t h e b o n dd e n s i t y d i s t r i b u t i o n . W i t h i n e a c h t i m e s t e p , t h i s c y c l e i s r e p e a t e d u n t i l t h em e m b r a n e m o r p h o l o g y c o n v e r g e s . When t h i s o c c u r s , t h e n e w p e e l i n g v e -l o c i t y i s c a l c u l a t e d a n d t h e t i m e i s i n c r e m e n t e d .An a d d i t i o n a l s t e p i s r e q u i r e d t o d e a l w i t h a p a t c h . B e c a u s e o f n u m e r i c a ld i f f u s i o n , t h e i n i t i a l s h a r p d i s c o n t i n u i t i e s i n r e c e p t o r d e n s i t y , N R , a n d b o n dd e n s i t y , N b , a t t h e p a t c h b o u n d a r y b e c o m e s p r e a d o v e r a n u m b e r o f g r i dp o i n t s . T h i s b e h a v i o r r e s u l t s f r o m n u m e r i c a l i n a c c u r a c i e s i n a c c o u n t i n g f o rt h e c o n v e c t i o n o f t h e p a t c h i n t h e c e l l r e f e r e n c e f r a m e . T h e f i r s t o r d e ru p w i n d t r a n s p o r t s c h e m e ( D e m b o e t a l . , 1 9 8 8 ) u s e d w h e n N , a n d N b a r eu n i f o r m i s n o l o n g e r a d e q u a t e . I n s t e a d , we i m p l e m e n t a m o n o t o n i c t r a n s p o r ts c h e m e ( v a n L e e r , 1 9 7 7 ; H a w l e y e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d f i n d t h a t n u m e r i c a l d i f -f u s i o n i s l i m i t e d t o a f e w g r i d p o i n t s i n t h i s c a s e . H o w e v e r , t h i s s c h e m er e q u i r e s e x p l i c i t t i m e d i f f e r e n c i n g , w h i c h p r e s e n t s a d d i t i o n a l p r o b l e m s ( s e eb e l o w ) .S e v e r a l t e s t s w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e a c c u r a c y o f o u r n u m e r i c a l m e t h -o d o l o g y . I n t h e a b s e n c e o f r e c e p t o r c l u s t e r i n g a n d l i g a n d d e p l e t i o n , wec a

kinetics of cell detachment_ peeling of discrete receptor clusters.pdf

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