kinesin und myosin: molekulare schrittmotoren bei der arbeit hauptseminar im ws 2003/2004 martina...
TRANSCRIPT
![Page 1: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/1.jpg)
Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit
Hauptseminar im WS 2003/2004
Martina Leins
![Page 2: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/2.jpg)
Gliederung
• Allgemeines• Motivation für die genaue Erforschung
des Bewegungsablaufes• Aufgaben der Kinesin- und Myosin V-
Moleküle• Kinesin• Myosin V• Vergleich und Zusammenfassung
![Page 3: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/3.jpg)
Allgemeines
• Wandeln chemische in mechanische Energie um
• Viel filigraner als herkömmliche Schrittmotoren
• Messen nur wenige Nanometer• Kann das Tausendfache seines
Gewichtes transportieren
![Page 4: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/4.jpg)
Motivation
• Anwendungen im Nanobereich• Goldman: "What concerned me was
how this little myosin motor can move along the track without letting go and floating off into the cytoplasm of the cell"
![Page 5: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/5.jpg)
Aufgaben in der Zelle
Kinesin:Transport vonMakromolkülen undkleiner Oranellen inder Zelle
Myosin V:Transportiert verschie-dene Substanzeninnerhalb von Nerven-zellen
![Page 6: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/6.jpg)
Struktur von Kinesin
• Kopf: Motor• Stiel: Doppelwendel• Schwanz: kann Last
binden
![Page 7: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/7.jpg)
Kinesin
Bewegt sich entlangeiner Mikrotubuli
![Page 8: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/8.jpg)
Bewegungsmechanismus bei Kinesin
• Aufnahme von ATP• ATP-Hydralisation• Pi-Abgabe• ADP-Abgabe• Erneute ATP-
Aufnahme
![Page 9: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/9.jpg)
Struktur von Myosin V
• Kopf: Motorbereich• Genick: Lichtkette• Schwanz: kann Last binden
![Page 10: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/10.jpg)
Myosin V
Bewegt sichentlang einesActinfilaments
![Page 11: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/11.jpg)
Schrittweite des Myosin V
• Genaue Bestimmung der Schrittweite:• Früher: Bestimmungen mit festem
Actinfilament• Jetzt: Rotationsfreiheit des
Actinfilaments
![Page 12: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/12.jpg)
Versuchsaufbau
• Actinfilament auf zwei Kügelchen
• Aufsetzen der Doppelkugel mit dem Myosin V-Molekül mit optischer Pinzette
• Ausschalten der Laserfalle
![Page 13: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/13.jpg)
Mögliche Bewegungsformen
• Schrittweite ca. 36nm: Rechts- oder linkshändige Spirale um Actinfilament mit großer Ganghöhe
• Kleine Schrittweite: starke rechtshändige Rotation (wie RNA um DNA)
• Entlanggleiten an den Strängen
![Page 14: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/14.jpg)
Bewegung bei maximaler Geschwindigkeit
![Page 15: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/15.jpg)
• Linkshändige Spirale• 2 Umdrehungen über 4.4m• ATP- konzentrationsunabhängig• Nicht alle Moleküle zeigten Rotation: Gründe:
• Zurück gelegter Weg zu kurz ( < 2m)• Zu kurzes Actinfilament• Rotation durch 'Schutt' verhindert
![Page 16: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/16.jpg)
Diagramm
![Page 17: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/17.jpg)
Schrittweite
• Linkshändige Rotation: Schrittweite etwas kleiner als 36nm
• Rechtshändige Rotation: Schrittweite kleiner als 18nm
Schrittweite zwischen 18nm und 36 nm
![Page 18: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/18.jpg)
Berechnung der Schrittweite
• Mittlere Schrittweite: 34,8nm 36nm*(2.200nm-72nm)/(2.200nm) =
34,8nm
• Mittlerer Drehwinkel pro Schritt: 6°
![Page 19: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/19.jpg)
Schrittweite ist konstant
• Unabhängig von ATP-Konzentration• Last unabhängig Realisation: 104 Myosin V Moleküle an einem Doppelkügelchen
![Page 20: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/20.jpg)
Zwei mögliche Bewegungsformen
Hand-over-hand: Beide Köpfe sindabwechselnd führend
Inchworm:Ein Kopf ist immervorn der andereimmer hinten
![Page 21: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/21.jpg)
Hand-over-hand – Inchworm
![Page 22: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/22.jpg)
Voraussagen der beiden Modelle
Hand-over-hand:Abwechselnd Schritte der Weite (37 2x)nm
Inchworm:Immer gleich großeSchritte der Schritt-weite 37nm
![Page 23: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/23.jpg)
Auflösungsvermögen
• Lokalisation: 6nm bei einer Zeitauflösung von 20s
(scanning confocal microscopy)• Ortsauflösung: 2nm bei Objekten der Größe 30 –
150nm bei einer Zeitauflösung von 30ms
![Page 24: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/24.jpg)
Einzel-Molekül-Fluoreszenz
• Lokalisation von 1.5nm in 2d• Zeitauflösung von 0.5s• Photostabilität von bis zu einigen
Minuten
Fluorescence imaging with one- nanometer accuracy: FIONA
![Page 25: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/25.jpg)
FIONA
• Lokalisation: Gaußfit in 2d
• Photostabilität: Sauerstoffreinigungssystem
![Page 26: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/26.jpg)
Test: FIONA
• Probe an ruhender DNA• Bewegung des Spots in definierten
Schritten und definierter Verweilzeit
• Ergebnis: Genauigkeit der Ortsbestimmung: 1.3nm
![Page 27: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/27.jpg)
FIONA mit Mysion V
Mysion V mit Rohdamin versehen:• 50 000 bis 100 000 Photonen pro Spot• Lokalisation: 3nm, helle Spots sogar
1.5nm• 49 verschiedene Moleküle • 552 ganze Schritte
![Page 28: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/28.jpg)
Beobachtete Schrittweiten
• gleichgroße Schritte mit einer Schrittweite von 74nm
• Alternierend zwei verschieden große Schrittweiten:
52nm und 23nm 42nm und 33nm
![Page 29: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/29.jpg)
52-23nm und 42-33nm Schritte
![Page 30: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/30.jpg)
74nm Schritte
1084398S1.mov
![Page 31: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/31.jpg)
74-0nm Schritte
• Zwischen zwei 74nm-Schritten ein 0nm-Schritt versteckt
• Kinetische Überlegungen: bei gleicher ATP-Konzentration halb so große
Schrittrate wie bei 52-23- oder 42-33-Schritten: Experiment: Schrittrate (52-23/42-33): 0.35 s-1
Schrittrate (74-0): 0.17s-1
![Page 32: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/32.jpg)
Ergebnis
• Myosin V bewegt sich nach dem Hand-over-hand Modell
• Mittlere Schrittweite: (74 + 0, 52 + 23, 42 + 33)/2 nm = 37nm
![Page 33: Kinesin und Myosin: Molekulare Schrittmotoren bei der Arbeit Hauptseminar im WS 2003/2004 Martina Leins](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062818/55204d6449795902118ba45d/html5/thumbnails/33.jpg)
Vergleich und Zusammenfassung
Myosin V:• Actinfilament• Hand-over-hand• Schrittweite von
34.8nm
Kinesin:• Microtubuli• 8nm Schrittweite