No Keterangan Kromatografi

Kertas Kolom TLC

1 Prinsip pemisahan - Partisi : perbedaan kelarutan

komponen terhadap fase diam dan fase gerak. Fase diam -> cairan -> air yang terikat dalam struktur selulosa. Fase gerak -> cairan -> eluen. - jika kelarutan komponen tinggi terhadap air maka pergerakkan komponen yang terbawa oleh eluen akan lambat. Komponen seperti ini bersifat polar. - jika kelarutan komponen tinggi terhadap eluen maka pergerakkan komponen akan cepat. Bersifat non-polar. - Rf kecil = polar - Rf besar = non-polar

- Didasarkan pada absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. - Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. - Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.

- KLT menggunakan sebuah lapis silica/ alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas/ tutup kaca. - Jel silica/ alumina merupakan fase diam. - Fase geraknya pelarut/ campuan perlarut yang sesuai (eluen). Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat warna.

2 Proses yang terjadi selama elusi - Pelarut bergerak karena gaya kapilaritas. - sehingga akan melarutkan komponen. - kelarutan komponen tinggi terhadap fase diam (air) pergerakkan komponen tertahan. - kelarutan komponen tinggi terhadap fase gerak (eluen) pergerakkan komponen cepat. - sehingga terjadi pemisahan komponen.

Ikatan Hidrogen. Ikatan Hidrogen

3 Jenis-jenis dan sifat fase diam Syarat-syarat kertas saring: - Kertas selulosa murni yang mempunyai afinitas besar. - arah seratnya lurus. - tidak boleh mengandung lignin (lilin). - inert. - aliran yang baik dan teratur. - tidak berwarna. - tidak larut dalam fase gerak. - cukup aktif.

Padat;Adsorben/Alumina - Silica gel - Alumina - Magnesium - Prisilikat - Kalsium sulfat - Kieselghur - Selulosa

4 Jenis fase gerak 22 ml Etanol 90%+ 3 ml HCl 5 N -Syarat fase gerak : Harus dapat melarutkan semua komponen. -Komposisi pelarut : Non-polar > polar (pelarut non-polar komposisinya lebih banyak dibanding pelarut polar). -komponen yang dipisahkan mempunyai kepolaran yang berbeda sehingga eluen yang digunakan terdiri dari 2/lebih peraksi (terdiri dari polar & non-polar).

Hexane : Aseton = 1 : 4 Butanol : As. Asetat (p) : Air = 2 : 1 : 1

5 Kodisi yang harus diperhatikan selama pemisahan

- Spoting ( penotolan) sampel harus terpisah dan pada garis yang sama. - Kertas harus diletakkan tegak lurus didalam chamber dan

- Jangan terlalu padat saat memasukkan kapas pada bagian dasar kolom, karena jika terlalu padat dikhawatirkan eluen/sampel sulit untuk diserap.

-banyak sedikitnya waktu pada saat menjenuhkan eluen pada chamber. -suhu -silika menyentuh eluen. -posisi plat tegak lurus.

bagian dasar kertas harus tercelup eluen. - suasana chamber harus jenuh oleh uap dari eluen, agar garis eluen setimbang dan mempercepat gerak eluen. Kejenuhan chamber ditandai dengan adanya embun. - T dan P harus tetap.

- Alumina harus dituang secara merata, tidak boleh ada bagian yang kosong karena akan mempengaruhi proses penguraian warna sempel. - Jangan terlalu banyak menambahkan pasir karena akan mempengaruhi kecepatan gerak eluen/sampel. - Tuang sampel sedikit demi sedikit dan merata. - Jangan biarkan kolom kering tanpa eluen. - Jangan sampai eluen menggenang dalam kolom.

-palat tidak terkerik.

6 Pembagian kromatografi Kromatografi cair Kromatografi cair Kromatografi cair 7 Syarat-syarat fase diam Menggunakan kertas saring

sebagai fase diam dengan syarat: -Merupakan selulosa murni -Memiliki afinitas besar fase geraknya.

-Tidak larut dalam fase gerak -Inert -Cukup aktif -Sebaiknya tidak berwarna -Memungkinkan aliran baik dan teratur

-Tidak larut dalam fase gerak -Dapat menyerap fase gerak dengan baik.

8 Syarat-syarat fase gerak -Dapat memisahkan komponen sampel dengan baik -Tidak bereaksi dengan sampel -Dapat menyerap di fase diam dengan baik.

-Tidak melarutkan fase diam yang digunakan -Tidak mengakibatkan aksi yang terlalu cepat atau terlalu lambat.

-Kemurnian yang memadai -Stabil -Viskositas rendah -Tekanan uap sedang -Daya toksik yang rendah.

9 Faktor yang mempengaruhi Rf dan Rs

-Komposisi pelarut -Suhu -Ukuran bejana -Sifat campuran

-Ukuran kolom yang digunakan -Laju elusi -Pemilihan adsorban

-Struktur kimia senyawa yang dipisahkan -Sifat penyerap -Pelarut yang digunakan

-Jenis kertasnya -Kejenuhan uap dalam chamber

-Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai.

-Suhu -Kejenuhan uap chamber.

10 Manfaat kromatografi -untuk memisahkan komponen yang kepolarannya tinggi seperti gula,asam amino,dan pigmen alam. -untuk mengidentifikasi. -untuk melakukan analisis kuantitatif dan kualitatif. -untuk mengisolasi.

Di bid. Bioteknologi Untuk penentuan baik kuantitatif maupun kualitatif senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi objek molekul yang harus di-purified(dimurnikan) tertutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga dapat diaplikasikan dalma pemisahan molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dsb.

Memberikan informasi mengenai berapa banyak komponen yang terdapat dalam suatu campuran dan untuk identifikasi dengan perbandingan RF dan RS

11 Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil pemisahan

-Komposisi pelarut -Suhu -Ukuran bejana -Sifat campuran -Jenis kertasnya -Kejenuhan uap dalam chamber -Kehadiran Ion lain, keasaman sampel, waktu , suhu , ukuran dari bejana, adanya kation lain

Daya serap adsorben , jenis atau siat eluen , suhu kromatografi, pelarut yang digunakan

Pemilihan fase gerak, suhu , kehadiran zat lain

12 Faktor yang harus dipertimbangkan dalam memilih eluen

-stabil -murni -tidak bereaksi -tidak berwarna -mampu melarutkan/ aktif terhadap komponen.

Sistem pelarut dengan kepolaran bertingkat , kemampuan eluen untuk menghasilkan pemisahan, lamanya waktu elusi , kestabilan eluen dan kemudahan penyediaan eluen

Prinsip like dissolve like , kepolaran senyawan , kemampuan eluen untuk menghasilkan pemisahan, lamanya waktu elusi , kestabilan eluen dan kemudahan penyediaan eluen

-kemampuan eluen untuk menghasilkan pemisahan -lamanya waktu elusi -mudah didapat.

13 Teknik dalam kromatografi Ada 3 cara: 1. Ascending

(cara naik/ kapilaritas) 2. Descending

(cara turun/ gravitasi) 3. Diputar 90°/2D->2x elusi

(untuk memisahkan 2 komponen yang sulit dipisahkan)

Dimana campuran komponen yang terlarut pada pelarut akan dituang ke dalam adsorben pada kolom dan dielusi dengan pelarut yang sama atau berbeda. Kromatografi ini menggunakan system “padat-cair” dengan fasa diamnya (adsorben) yang berbentuk solid dan fase geraknya berbentuk cairan.

Pada KLT plat diisi dengan silica gel kemudian dikeringkan. Sampel ditotolkan pada plat dengan jarak-jarak tertentu. Kemudian fasa diam diletakkan nerdiri dalam chamber tertutup yang telah berisi fase gerak (pelarut). Pelarut perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari campuran bergerak pada tingkat yang berbeda. Teknik percobaan menggunakan arah pelarut bergerak di atas plat.

14 Cara analisis kualitatif Berdasarkan warna (visualisasi) Disemprotkan zat yang dapat menghasilkan warna yang spesifik terhadap komponen.

Cu2+ + 2I− -> 2CuI2 (putih) 𝑡𝑎𝑘 𝑠𝑡𝑎𝑏𝑖𝑙→ Cu2I2 + I2 (coklat)

Pb2++ 2I−-> PbI2 (kuning)

Hg2+ + 2I− -> HgI (merah) Nilai Rf khas setiap komponen

Kromatogram dapat menujukkan waktu yang dibutukam untuk elusi suatu pita komponen sampel. Dasar analisis kualitatif untuk kromatografi adalah waktu retensi, waktu retensi ini spesifik. Waktu retensi adalah waktu yang menunjukkan puncak kromatogram.

Sampel akan terpisah menjadi noda-noda yang memiliki warna yang berbeda-beda dan nilai RF yang berbeda pula. Kemudian noda-noda ini diidentifikasi.

15 Cara analisis kuantitatif - Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan area dari bercak. Mengukur transmisi

Mengukur absorbansi masing-masing fraksi sacara spektofotometri untuk menghitung kadarnya.

Menggunakan transmisi cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri.

cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri - Menggunting area dari bercak, kemudian diekstraksi dan ditetapkan kadarnya secara

spektofotometri.