két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára
DESCRIPTION
Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára HEGYESI Orsolya 1 , FÖLDES Anna 1 ,BORI Erzsébet 1 , LŐRINCZ Ádám 2 , RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya 2 , BARABÁS József 2 , Martin C. STEWARD 3 , VARGA Gábor 1 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az Két dimenziós emberi nyálmirigy modell az elektrolit transzportfolyamatok vizsgálatáraelektrolit transzportfolyamatok vizsgálatára
HEGYESI Orsolya1, FÖLDES Anna1,BORI Erzsébet1, LŐRINCZ Ádám2, RÁSONYI-KOVÁCS Orsolya2 ,
BARABÁS József2, Martin C. STEWARD3, VARGA Gábor1
1 Orálbiológiai Tanszék, 2 Arc- állcsont- Szájsebészeti és Fogászati Klinika; Semmelweis Egyetem, Budapest; 3Faculty of Life Sciences, The University of Manchester, UK
HáttérHáttér
Sjögren szindróma
sugárterápia(fej-nyaki tumorok kezelésére)
acinus sejtek pusztulása
csökkent nyáltermelés
hiposzaliváció
Primer sejtkultúrák létrehozásának kidolgozott lehetőségei huSMG – primary human salivary cell culture (primer humán nyálmirigy sejtkultúra) Tran et al. Tissue Eng 2005 11:172
PTHSG – primary total human salivary gland (primer teljes humán nyálmirigy sejtkultúra) Szlavik et al. Tissue Eng 2008 14:1915-26
humán szubmandibuláris nyálmirigyből primer sejtkultúra létrehozása, PTHSG és huSMG tulajdonágainak összehasonlításaoptimális kondíciók meghatározása polarizált epitheliális monolayer létrehozásáhoztranszepitheliális ionáramok vizsgálataaz elektrolit transzportban résztvevő transzporterek meghatározása
CélkitűzéCélkitűzéss
Hepato-STIM medium (BD Biosciences)
MEM medium (Sigma)
10%FBS, antibiotikum- antimycotikum oldat (Sigma)
Disszociáló puffer: 0,04% tripszin (Gibco) és 0,15mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich) DMEM-F12 mediumban (Gibco)
Transwell Clear (Corning Costar)
Membrán ellenállás (TEER) mérés: EVOM (World Precision Instruments)
Warner két csatornás Ussing kamra (U-2500, Warner Instruments Co.)
Sejttenyésztés – primer kultúraSejttenyésztés – primer kultúra
Nyálmirigy minták RNS izolálás: TRI Reagent (Sigma)
Plasztik edényről and Transwell Clearmembránról RNS izolálás: Nucleospin RNA II. Kit (MACHEREY-NAGEL)
RT-PCR: High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystem)
HEPES-puffer oldat, 100% O2; HCO3—puffer oldat, 5% CO2/95% O2 és Cl—
mentes oldat
amilorid (10 µM) , bumetanid (100 µM), forskolin (10 µM), ATP (50 µM), karbakol (100 µM); (Sigma)
PTHSG Hepato-STIM
10x
huSMG
Hepato-STIM 10x
0
400
800
1200
0 2 4 6 8days
TEER
(Ω
cm
2)
MEM 0 nap
Hepato-STIM
MEM 2 nap
MEM 1. nap
gyorsan letapadó sejtek: PTHSG „mesenchimális progenitorok”egy nap utáni felülúszó: huSMG „epitheliális progenitorok”
PTHSG MEM 10
x
huSMG MEM 10xKulcstranszporterek (RT-CR)Kulcstranszporterek (RT-CR)
Funkcionális vizsgálatok rövidzárlati áramFunkcionális vizsgálatok rövidzárlati áram (I (Iscsc)) mérésével mérésével
Módszerek és Módszerek és eredményekeredmények
ENaCNBC1 NHE1NKCC1Pozitív kontroll: K: Vese
Minta jelölések:
Me: membránról izolált
Pl: plasztikról izolált
Ti: nyálmirigy szövetből izolált
Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KKMe, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, Me, Pl, Pl, Me, Ti, Ti, KK
Transzpithelialis rezisztencia méréseTranszpithelialis rezisztencia mérése
*p<0,05
HCO3-
++
0
2
4
6
8PTHSG
4 4I sc (µ
A/c
m2)
ATP carbachol forskolin0
2
4
6
8
118 8 5 4
PTHSG
huSMG
∆I s
c (µ
A/c
m2) *
*p<0,05
vs baseline
*
* *
I sc (µ
A/c
m2) PTHSG
02
4
6
8
*
*p<0,05
*
0
2
4
6
8
∆ I
sc (
µA
/cm
2)
8 388*p<0,05
*
PTHSG huSMG
*
0
2
4
6
8PTHSG
8 85 6∆I s
c (µ
A/c
m2)
HCO3-
Cl-++
--
++
--
huSMG
*
*p<0,05
*
BAZOLATERALIS OLDAL
APIKALIS OLDAL
Na+
CA II
CO2
CO2+H2O H2CO3 H++HCO3-
HCO3-Cl-
CFTR
?
Cl-
CaC
C
NKA
K+ Na+
ATP ADP+PK+
HCO3-
K+Na+ Cl-
NKCC1
H+
Na+ HCO3-Na+Cl-
NBCNHE AE
Na+
ACINI
DUCT +Na
+Na
EN
aC
PKA IIcAM
P
Ca2+
forskolin
ATP
karbakol
bumetanid
10 µM amilorid
∆I s
c (µ
A/c
m2) PTHSG
*
0
2
4
6
8
5 5 99*p<0,05
Bumetanid hatása az ATP stimulált szekrécióra
Apikálisan adott amilorid hatása
Klorid és bikarbonát megvonásának hatása
EredményekEredmények
Vektoriális iontranszport aktiválása
HCO3-Cl-Cl-
++
--
Cl-++
--
HCO3-
Bum+-
-+
--
HCO3-& Cl-
Ami+-
++
-+
HCO3-& Cl-
Ami+-
++
+-
++
*
--
99 3
NKA
K+ Na+
ATPADP+P
++
nem stimulált ATP stimulált szekrécióra
nem stimulált ATP stimulált szekrécióra
Primer sejtkultúra: polarizált epithel monolayer létrejötte mind PTHSG és huSMG kultúrából Hepato-STIM médium alkalmazása kulcsfaktor
Transzepitheliális vektoriális elektrolit mozgás mindkét sejtkultúrában
1. Apikális irányú anionszekréció (Acináris jellemző)
Cl- és HCO3-
Ca2+- aktiválta szabályozási útvonal
2. Bazolateralis irányú Na+ abszorpció (Duktális jellemző)
Végeredmény: kétdimenziós nyálmirigyy kevert acinalis/duktális fenotípust mutatva:
működése genetikai vagy farmakológiai módosításra egyaránt alkalmas
MegbeszélésMegbeszélés
Támogatás: TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KMR-2010-0001; OTKA: NI69008, CK80928 ;
Bazolaterális oldal
Apikális oldal
Cl-;HCO3ˉTranswell
Na+