kesan ekstrak jenis liar dan mutan miselium lentinula ... fileedodes terhadap perkembangan embrio...

Undergrad. Res. J. Biomol. Sci. Biotech. 1, 2017

67

Undergraduate Research Journal

Biomolecular Sciences and

Biotechnology

ISSN 2600-7983

Kesan Ekstrak Jenis Liar dan Mutan Miselium Lentinula edodes

Terhadap Embrio Ikan Zebra

Fatin Qurratu`aini Zaini1, Ibrahim Mahmood 1,2 & Mohd Shazrul Fazry

Sa’Ariwijaya1*

1Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan

Malaysia, 43600 Bangi, Selangor, Malaysia 2Malaysian Nuclear Agency, Bangi 43000, Kajang, Selangor, Malaysia

* mel-e pengarang rujukan: [email protected]

Abstrak: Cendawan Lentinula edodes atau lebih dikenali sebagai ´Shiitake´, telah di komersialkan secara

meluas di samping mempunyai kandungan nutrien yang sangat tinggi. Namun, kajian ekstrak cendawan L.

edodes terhadap perkembangan embrio adalah terhad. Oleh itu, kajian ini dilakukan untuk mengkaji kesan

ekstrak jenis liar dan mutan miselium L. edodes terhadap embrio ikan Zebra. Ekstrak mutan dan jenis liar

telah dibandingkan kesannya terhadap embrio ikan Zebra melalui ujian ketoksikan ikan (FET) dan

kemudiannya di rawat dengan LPS untuk mengkaji kesannya terhadap penghasilan spesies oksigen reaktif

(ROS). Ekstrak jenis liar pada kepekatan 3.0 mg/mL adalah merupakan kepekatan yang paling merbahaya

untuk embrio hidup berdasarkan kadar kelangsungan hidupnya yang sebanyak 0%. Selain itu, embrio yang

telah dirawat dengan ekstrak mutan pada kepekatan 0.7 mg/mL turut mengalami kematian. Hasil juga

menunjukkan embrio telah mengalami proses embriogenesis yang lebih perlahan dan berlaku kekurangan

pigmentasi pada badannya dalam kedua-dua ekstrak mutan dan jenis liar berbanding dengan kawalan negatif

(air suling). Kedua-dua ekstrak juga didapati mampu merangsang penghasilan ROS. Kesimpulannya, hasil

menunjukkan ekstrak mutan mempunyai ketoksikan yang tinggi berbanding dengan ekstrak jenis liar.

Kata kunci: Lentinula edodes; shiitake; ikan Zebra

Abstract: The native East Asia edible mushroom, L. edodes also commonly known as ‘Shiitake’ is widely

used and it has a very high nutrient content. However, research on the effects of shiitake extracts on embryo

development is limited. In this study, the effects of wild type and mutant extracts of mycelium L. edodes on

zebrafish embryos are conducted. The effects of both extracts towards zebrafish embryo were performed via

the fish toxicity test (FET) which later was exposed to LPS to study its effects on reactive oxygen species

(ROS) production. A 3.0 mg/mL of the wild type extract has shown to be the most lethal and dangerous for

the embryo survival due to its 0% of survival rate. Furthermore, the embryos treated with 0.7 mg/mL of the

mutant extracts died. In both of the extracts, the embryos are shown to have undergone slow embryogenesis

proses and to have lacked of pigmentation on its body as compared to the control. The wild type and mutant

extracts seem to induce ROS production. In conclusion, the mutant extracts have shown higher toxicity than

the wild type extracts.

Keywords: Lentinula edodes; shiitake; zebrafish

1. Pengenalan

Cendawan Lentinula edodes atau lebih dikenali sebagai cendawan shiitake merupakan salah satu

cendawan yang boleh dimakan yang paling popular di seluruh dunia selepas cendawan butang putih.

Namanya sebagai “Xianggu” dalam bahasa Cina atau Shiitake dalam bahasa Jepun, telah banyak

diedarkan kepada penduduk di Asia, Australia dan Amerika (Xiao et al. 2016). Pada mulanya, ia

mailto:[email protected]


68

popular di Jepun dan China dan kini berjaya dijual di pasaran Eropah (Boels et al. 2014). Walaupun

L. edodes mula ditanam di China selama lebih daripada 800 tahun yang lalu, hanya sedikit yang

diketahui mengenai sejarah penanamannya (Xiao et al. 2016). Ekstrak miselium cendawan shiitake

dan bahagian yang ditulenkan mempunyai ciri-ciri fisiologi seperti anti tumor, anti-virus,

antioksidan, antikulat, hipoglisemik dan aktiviti immunomodulatori (Llorente-Mirandes et al.

2014).

Kebelakangan ini, ikan Zebra telah muncul sebagai organisma model untuk pelbagai aspek

penyelidikan yang terlibat dengan pembangunan manusia dan penyakit (Lieschke & Currie 2007).

Ikan Zebra mempunyai sistem imun yang lengkap dan mampu untuk menghasilkan tindak balas

keradangan apabila terdedah kepada LPS (Tang et al. 2015). Maka, model ikan Zebra berfungsi

sebagai platform terbaik untuk mengkaji sampel yang berpotensi sebagai ubat anti-keradangan.

Ianya murah, mudah diperoleh, memerlukan ruang yang kurang dan makanan dan sentiasa

menghsilkan anak yang banyak. Haiwan kecil biasanya mempunyai mod penyembuhan yang sangat

cepat berbanding dengan manusia (Thakur et al. 2011).

Objektif bagi kajian ini adalah untuk mengkaji kesan ekstrak jenis liar dan mutan miselium

L. edodes terhadap embrio ikan Zebra.

2. Bahan dan Kaedah

2.1 Penyediaan ekstrak cendawan

Ekstrak miselium jenis liar dan mutan L. edodes atau cendawan shiitake telah diasingkan dan

disediakan oleh Agensi Nuklear Agensi Malaysia. Miselium telah disubkulturkan dalam medium

cecair. Miselium kemudiannya dikeringkan dengan oven dan dikisar. Sekitar 1 g: 39 mL sampel

tersebut direbus selama 2 jam. Residu telah ditapis untuk mengasingkan cecair. Cecair tersebut

kemudiannya telah dihantar untuk beku kering.

2.2 Penentuan kadar ketoksikan ekstrak

Embrio ikan Zebra dari 3 hingga 4 jam pasca persenyawaan (hpf) yang diperoleh dari Universiti

Putra Malaysia, Selangor, Malaysia. Ikan tersebut telah dipindah ke telaga individu (telaga 96- plat),

dan sebanyak 200 µL ekstrak telah diletakkan bersama embrio dalam telaga sehingga 24 hpf. Kadar

kelangsungan hidup serta kadar degupan jantung bagi kedua-dua atrium dan ventrikel diukur pada

embrio ikan Zebra yang terdedah kepada ekstrak ditentukan setiap sehingga 72 hpf. Kadar degupan

jantung dikira dan direkodkan pada setiap 1 minit di bawah mikroskop. Keputusan ditentukan

sebagai peratusan kadar jantung berdegup.

𝑃𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑠𝑎𝑛 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑔𝑢𝑝𝑎𝑛 𝑗𝑎𝑛𝑡𝑢𝑛𝑔 =𝐷𝑒𝑔𝑢𝑝𝑎𝑛 𝑗𝑎𝑛𝑡𝑢𝑛𝑔 (𝑑𝑖𝑒𝑟𝑎𝑚 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘)

𝐷𝑒𝑔𝑢𝑝𝑎𝑛 𝑗𝑎𝑛𝑡𝑢𝑛𝑔 𝑘𝑎𝑤𝑎𝑙𝑎𝑛× 100%

2.3 Asai perpecahan pernafasan embrio ikan Zebra

Embrio diletakkan pada 96- plat telaga microtiter yang telah dirawat dengan metabolit selama 30

minit sebelum pengeraman LPS (selama 1 jam). Selepas itu, embrio telah dirawat dengan 1 μg/mL

H2DCFDA. Kepekatan pendarfluor diukur oleh Multi-Mode Microplate Reader menggunakan

pelepasan penapis 480 ± 10 dan 530 ± 10 nm. Keputusan dinyatakan sebagai peratusan pendarfluor

(% DCF) berbanding dengan kawalan yang tidak dirawat.


69

3. Hasil dan Perbincangan

3.1 Ujian ketoksian ekstrak

Kadar kelangsungan hidup embrio di tentukan pada 72 hpf selepas dirawat dengan ekstrak. Rajah

1(A) menunjukkan kepekatan ekstrak pada 0.1 mg/mL sehingga 0.9 mg/mL tidak memberikan

perbezaan yang ketara dengan kadar kelangsungan hidup bagi kawalan. Namun, bermula pada 1.0

mg/mL, kadar kelangsungan hidup embrio jatuh secara mendadak. Kepekatan pada 3.0 mg/mL

menunjukkan kepekatan paling merbahaya bagi embrio untuk hidup.

Ekstrak mutan pula menunjukkan kadar kelangsungan hidup semakin menurun daripada

kepekatan 0.1 mg/mL hingga 0.6 mg/mL (Rajah 1B). Bermula pada kepekatan 0.7 mg/mL, di dapati

embrio mati. Kepekatan lebih daripada 0.7mg/mL adalah toksik dan merbahaya kepada kadar

kelangsungan hidup embrio.

Rajah 1. Kadar kelangsungan hidup embrio dengan ekstrak selepas 72 jam

(A) Rawatan dengan ekstrak daripada cendawan jenis liar; (B) Rawatan dengan ekstrak daripada

cendawan mutan.

Rajah 2 menunjukkan kadar degupan jantung bagi ekstrak jenis liar dan mutan. Pada

kepekatan 0.1 mg/mL bagi ekstrak jenis liar dan mutan, iaitu pada 24 hpf, embrio mempunyai kadar

0

20

40

60

80

100

120

Kad

ar K

elan

gsu

ngan

Hid

up

(%

)

Kepekatan (mg/mL)

A

0

20

40

60

80

100

120

Kad

ar K

elan

gsu

ngan

Hid

up

(%

)

Kepekatan (mg/mL)

B


70

degupan jantung yang signifikan berbanding dengan kawalan. Hal ini adalah berkemungkinan

kerana pada 24 hpf hingga 48 hpf, embrio sedang mengalami fasa pharingulation di mana, sistem

peredaran darah mula membentuk dan jantung mula berdegup. Maka, ekstrak jenis liar dan mutan

mampu mempengaruhi degupan jantung embrio. Bermula pada kepekatan 0.3 mg/mL bagi ekstrak

jenis liar dan 0.2 mg/mL bagi ekstrak mutan, degupan jantung pada 24 hpf tidak dapat dikesan.

Malah, pada ekstrak jenis liar, bermula pada kepekatan 1.0 mg/mL, kadar degupan jantung pada 24

hpf dan 48 hpf pula tidak dapat dikenal pasti.

Rajah 2. Kadar degupan jantung embrio terhadap rawatan ekstrak cendawan

(A) Rawatan dengan ekstrak daripada cendawan jenis liar; (B) Rawatan dengan ekstrak daripada

cendawan mutan.

Embrio yang dirawat ekstrak cendawan jenis liar pada kepekatan pada 0.3 mg/mL didapati

mengalami proses embriogenesis yang perlahan berbanding dengan kawalan (Rajah 3). Perubahan

yang ketara boleh dilihat pada 24 hpf. Didapati pigmentasi pada badan embrio juga berkurangan,

mungkin di sebabkan dengan kehadiran asid kojik.yang hadir pada cendawan shiitake. Selain itu,

embrio yang ditindakkan dengan ekstrak pada kepekatan 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, dan

0.4 mg/mL sahaja menetas pada 72 hpf. Embrio pada kepekatan 3.0 mg/mL mati pada 72 hpf.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kad

ar D

egup

an J

antu

ng (

%)

Kepekatan (mg/mL)

A

24 JAM 48 JAM

72 JAM

0

20

40

60

80

100

120

Kad

ar D

egup

an J

antu

ng (

%)

Kepekatan (mg/mL)

B

24 JAM

48 JAM

72 JAM


71

Ekstrak Jenis Liar

Kepekatan

(mg/mL)

Jam Selepas Persenyawaan (hpf)

24 48 72

Kawalan

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7


72

0.8

0.9

1.0

1.5

3.0

Rajah 3. Perubahan morfologi embrio ikan Zebra yang dirawat dengan esktrak

jenis liar miselium L. edodes Embrio kawalan dirawat menggunakan air suling.

Embrio yang di rawat dengan ekstrak mutan juga menunjukkan perbezaan yang ketara

berbanding dengan kawalan (Rajah 4). Bermula pada kepekatan 0.1 mg/mL, embrio sudah

menunjukkan ciri- ciri seperti embrio pada fasa 6- somite ataupun 10- somite yang masing-masing

sepatutnya berlaku pada 12 hpf dan 14 hpf. Hal ini memberi maksud ekstrak jenis mutan mampu

mempengaruhi proses embriogenesis ikan Zebra. Namun begitu, pada 72 hpf, kesemua embrio dari

0.1 mg/mL sehingga 0.6 mg/mL menetas sama seperti embrio kawalan. Tiada embrio yang hidup

apabila ditindakkan dengan ekstrak pada kepekatan 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 1.0

mg/mL, 1.5 mg/mL dan 3.0 mg/mL. Kepekatan- kepekatan tersebut dianggap toksik bagi

kelangsungan hidup embrio.


73

Ekstrak Mutan

Kepekatan

(mg/mL)

Jam Selepas Persenyawaan (hpf)

24 48 72

Kawalan

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7 – 3.0 Mati

Rajah 4. Perubahan morfologi embrio ikan Zebra yang dirawat dengan esktrak

mutan miselium L. edodes. Embrio kawalan menggunakan air suling


74

Sebagai kesimpulan kedua-dua ektrak jenis liar dan mutan miselium L. edodes didapati

memberi kesan terhadap embriogenesis ikan Zebra.

3.2 Asai perpecahan pernafasan

Berdasarkan pada Rajah 5, hasil menunjukkan peratusan fluoresen rawatan asid askorbik pada

kedua- dua kepekatan semakin berkurangan pada setiap 5 minit. Seterusnya, ekstrak mutan

mempunyai beza yang tinggi berbanding dengan kawalan sebanyak 10.39% dan 28.76% pada setiap

5 minit bagi kepekatan 0.1 mg/mL, manakala 30.24% dan 27.13% pada kepekatan 0.2 mg/mL.

Ekstrak jenis liar bagi kepekatan 0.9 mg/mL mempunyai peratusan fluoresen yang rendah

berbanding dengan kawalan pada 5 minit pertama kemudian meningkat sebanyak 7.81%. Ekstrak

jenis liar menunjukkan peningkatan dari 5 minit pertama ke minit ke 10 bagi kedua- dua konsentrasi

0.9 mg/mL dan 1.0 mg/mL.

Hal ini menunjukkan asid askorbik mampu mengurangkan ROS yang di aruh LPS

sementara ekstrak jenis ekstrak mutan dan jenis liar mengaruh kadar ROS.

Rajah 5. Peratusan fluoresen pada bacaan setiap 5 minit (DCF %) bagi embrio ikan Zebra

yang dirawat dengan asid askorbik, ekstrak mutan dan ekstrak jenis liar

4. Kesimpulan

Kesimpulannya, kajian ini menunjukkan kedua ekstrak ini mampu meningkatkan kadar ROS di

samping memberi kesan terhadap perkembangan dan pigmentasi embrio ikan Zebra. Kajian ini

membuktikan ekstrak mutan L. edodes menunjukkan kadar ketoksikan yang lebih tinggi daripada

ekstrak jenis liar

Penghargaan

Projek ini telah dibiayai oleh geran Pusat Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan

Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 Bangi, Selangor, Malaysia

Rujukan

Boels, D., Landreau, A., Bruneau, C., Garnier, R., Pulce, C., Labadie, M., de Haro, L. & Harry, P. 2014.

Shiitake dermatitis recorded by French Poison Control Centers– new case series with clinical

observations. Clinical Toxicology 52(6): 625–628.

Lieschke, G.J. & Currie, P.D. 2007. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature

Review Genetics 8(5), 353–367.

Llorente-Mirandes, T., Barbero, M., Rubio, R. & López-Sánchez, J.F. 2014. Occurrence of inorganic arsenic

in edible Shiitake (Lentinula edodes) products. Food Chemistry 158: 207–215.

0

50

100

150

200

Kawalan 8 10 0.1 0.2 0.9 1

Per

atusa

n F

luo

rese

n (

%)

Peratusan Fluoresen Setiap 5 Minit (% DCF) 5 MIN

10 MIN

Jenis Liar (mg/mL)Mutan (mg/mL)Asid Askorbik (µg/mL)


75

Tang, H., Ge, H., Chen, Z.B., Luo, X.M., Su, F.J., Liang, Y.B., Li, Z.Y., Wu, J.G., Yang, Q., Zeng, L.J. &

Ma, Z.F. 2015. Micrometam C protects against oxidative stress in inflammation models in zebrafish

and RAW264.7 macrophages. Marine Drugs 13(9), 5593–5605.

Thakur, R., Jain, N., Pathak, R. & Sandhu, S.S. 2011. Practices in wound healing studies of plants. Evidence-

Based Complementary and Alternative Medicine 2011: 438056.

Xiao, Y., Cheng, X., Liu, J., Li, C., Nong, W., Bian, Y., Cheung, M.K. & Kwan, H.S. 2016. Population

genomic analysis uncovers environmental stress-driven selection and adaptation of Lentinula edodes

population in China. Scientific Reports 6: 36789.

kesan ekstrak jenis liar dan mutan miselium lentinula ... fileedodes terhadap perkembangan embrio...

Documents