Kloning Apoptin dari Chicken Anemia Virus

Kelompok 4

Anissa Permatadietha A.

Fransiska Milaniati P.

Khairu Nuzula

Yunita Florensia

Laksita Utami

Pendahuluan

• Kloning merupakan upaya menganak pinakan suatu organisme mirip dengan induknya.

• Dalam bioteknologi, kloning merujuk pada berbagai usaha yang dilakukan untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau gen, sel, atau organisme.

• Rangkaian proses kloning :1. Isolasi fragmen DNA dari genom organisme

2. Penentuan sekuens atau fragmen DNA

3. Pembentukan molekul DNA rekombinan

4. Ekspresi gen target dalam sel inang.

• Kloning merupakan terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang dibutuhkan keberadaannya bagi kehidupan manusia.

Penelitian dilakukan bertujuan untuk mengkloning gen apoptin dengan menambahkan 10 histidin pada N-Terminal dan 8 Arginin pada C-Terminal

Overview Metode Kloning

Vektor

Gene Apopti

n

DNA Rekombina

nOrganisme

Transformasi

Apoptin• Apoptin adalah protein yang mampu

menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor.

• Apoptin merupakan jenis protein VP3 yang dikodekan oleh Chicken Anemia Virus (CAV)

Persiapan Gen Apoptin

Mengisolasi DNA virus

Mengamplifikasi DNA

Memodifikasi DNA Virus

Isolasi Virus CAV

• CAV adalah virus yang memiliki materi genetik single-stranded DNA

• Virus CAV diambil dari jaringan hati ayam broiler yang terinfeksi

Isolasi DNA Virus

Sampel dipanaskan pada suhu 650C selama 20 menit

Tambahkan Buffer phenol dengan perbandingan 1 : 1

Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM

Didinginkan selama 30 menit pada suhu -200C

Isolasi DNA Virus

Penambahan NaAc 3M sebanyak 1/10 sampel dan etanol 100% sebanyak 2 kali volum sampel.

Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM

Mengamplifikasi DNA

Genom CAV

VP1

VP2

VP3

Ampifikasi dan modifikasi DNA CAV

Untuk mempermudah saat harvesting kita akan menempelkan histidin pada N-terminal apoptin

Metode yang akan digunakan adalah PCR karena mudah dimodifikasi pada primer sehingga penempelan histidin mudah dilakukan

Penempelan histidin pada protein rekombinan dikenal dengan metode histidin-tagging

His-Tag

Desain Primer

• Karena asam amino pada DNA dibaca dari ujung 5’ ke ujung 3’ maka untuk menambahkan histidin pada N-Terminal dilakukan dengan menyisipkan gen pengkode histidin di ujung ke 5’ Primer setelah kodon start

Memasukan ddNTP, DNA Primer, Polimerase dan template DNA ke dalam satu tabung

PCR

Memanaskan pada suhu 940 selama 35 x 1 menit. Untuk mendenaturasi DNA

Memanaskan pada suhu 940C pada suhu 1 menit untuk annealing

Pemanasan pada suhu 720 C untuk

pemanjangan

Penambahan Arginin

Arginin adalah polipeptida yang dapat membantu saat penetrasi DNA kedalam vektor

DNA Hasil amplifikasi direaksikan dengan arginin dan enzim ligase khusus dan direaksikan pada suhu 400C

Hasil reaksi adalah DNA yang mengandung gen apoptin yang mengandung histidin di ujung N-Terminal dan Arginin di C-Terminal

Arginin akan menempel pada ujung 3’ karena pada ujung 5’ cenderung lebih stabil karena adanya gugus fosfat

Isolasi Vektor

Definisi Vektor

Vector adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau

kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi

dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut

Definisi Vektor

• Mempunyai ukuran relative kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya

• Mempunyai sekurang kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang

• Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang kurangnya didalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

• Memiliki titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi didalam sel inangnya

Syarat Utama VektorSyarat Utama Vektor

Ukuran yang cocok

Ada penanda untuk insersi

DNA

Kemampuan tinggi untuk mengcopy

Syarat Tambahan VektorSyarat Utama Vektor

• Origin of replication : sekuen DNA yang mana replikasi dapat diinsiasi

• Promoter : untuk mengontrol ekspresi gen

• Adaptor

• Multiple clone site : insersi DNA kedalam vector

Bagian Penting VektorKomponen Penting Vektor

Kenapa Vektor pUC 19 ?

Dapat membuat

pustaka DNA dengan

panjang gen < 2000bp

menggunakan host E coli

mudah ditransfeksikan kedalam E coli dengan

metode yang sederhana dan relatif

murah seperti heat shock

cepat bereplikasi

amat mudah diseleksi dengan

metode white/ blue color selection

Alasan memilih Vektor

• vector yang memiki circular double stranded DNA• mempunyai 2686 pasang basa• puC 19 paling banyak digunakan sebagai

rekombinan atau pengenalan DNA asing• puC 19 hampir mirip dengan puC 18 namun

wilayah MCS nya dibalik• dapat dengan mudah dibedakan dari non

rekombinannya berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan

Karakteristik Vektor pUC 19

Karakteristik Vektor pUC 19

Perbedaan warna koloni

Karakteristik Vektor pUC 19

Karakteristik Vektor pUC 19 Karakteristik Vektor pUC 19

Komponen Vektor pUC 19

1. Terdapat ori V

2. gen bla yang terdapat ampicilin resistance dan memiliki fragmen DNA special dengan beberapa

perbedaan recognition sites untuk restriksi endonuklease

3. Sekuen Multiple cloning site berada pada bagian 5’

dari lacZ gene

4. N-terminal fragment of β-galactosidase (lac Z) gene of E.

coli.

Komponen Vektor pUC 19

Perbanyakan bakteri

Lisis Sel

Pemisahan Protein dan DNA Kromosom

Pengambilan plasmid

Isolasi pUC 19 Isolasi Vektor pUC 19

Isolasi pUC 19 – Perbanyakan BAKTERI

Bakteri inang ditumbuhkan dalam medium dengan suhu 37o C dan dikocok dengan kecepatan 150 –

250 r/menit

sel E.coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai

densitas maksimum kira kira 2 sampai 3 x 10^9 sel/ml

dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5

menit

Perbanyakan Bakteri

Isolasi DNA plasmid

dilakukan dengan cara isolasi DNA

plasmid pUC 19 yang

terdapat dalam E.coli JM 109.

denaturasi

dengan

alkali

metode

sentrifuge

isopiknat

Lisis Sel

Pilihan metode Isolasi Vektor

LISIS SEL

Buffer P1 + enzim

RNAse A +SDS

+indicator LyseBlue

Bufffer P2

Lisis sel

bakteri

LISIS

Kombinasi RNAse dan SDS inilah yang dapat

merusak dinding dan lisis sel.

rentang pH 12 -12,5 ikatan hydrogen dari DNA

kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua

rantai polipeptida memisah.

Penambahan P2 untuk memastikan apakah

denaturasi telah terjadi.

Jikalau denaturasi telah terjadi, maka suspense pellet sel akan berwarna biru karena adanya reaksi dengan indicator Lyse Blue

penambahan buffer N3 yang mengandung asam

asetat

DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi

mengelompok dalam massa DNA linier yang

kusut.

Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000

selama 10 menit

mengendapkan massa DNA ini didasar tabung

sentrifugasi dan meninggalkan plasmid

murni dalam supernatant.

Pemisahan protein dan kromosom

RENATURASI

Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada

tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris

sel lainnya).

Isolasi pUC 19

Keuntungan metode Sentrifugasi

Karena metode ini menggunakan metode denaturasi alkali maka keuntungannya ialah tidak diperlukan presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein.

Supernatan plasmid murni dicuci 2x

dengan buffer PB dan PE

supernatant plasmid kemudian

dipindahkan ke tabung

mikrosentrifuge baru

sebanyak 2 kali dengan buffer EB (Elution Buffer)

pada 13000 rpm selama satu menit

Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC

19 yang telah berhasil

diisolasikan dari E.coli JM109

Isolasi pUC 19 – Pengambilan Plasmid

Buffer PB mengandung

isopropanol dan buffer

PE yang mengandung

96 – 100% ethanol

PENYISIPAN INSERT KE

VEKTOR DENGAN METODE

LIGASI

MEKANISME

Penambahan alkalin

fosfatase pada larutan

vektor

penambahan insert

penambahan buffer

penambahan air (pelarut)

penambahan DNA ligase

inkubasi campuran

larutan

Penambahan alkalin fosfatase

pada larutan vektor dilakukan

sebelum pencampuran dengan insert

Meminimalisasi terjadinya

kemungkinan vektor

menyambung pada vektor itu

sendiri atau vektor

menyambung dengan vektor

lain

Menghilangkan gugus P pada 5’P sehingga menjadi 5’OH (defosforilasi)

Penambahan Alkalin Fosfatase pada Larutan

Vektor

Ligasi

untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu agar DNA tidak terdegradasi

digunakan buffer yang mengandung ATP

Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar 0,25-1 mM

Penambahan Buffer

Penambahan Air (Pelarut)

ddH2O (double-distilled water)

untuk pemurnian dan proses

vakum

keuntungan: tidak

mengandung EDTA

Kekurangan: peluang

untuk berubahnya

pH

enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick

DNA Ligase enzim ligase yang

dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4

T4 DNA

Ligase

Penambahan DNA Ligase

Mekanisme T4 DNA Ligase

hidrolisis kofaktor

menghasilkan kompleks

enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen

dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat

inorganik (PPi)

sebagian AMP akan berpindah dari sisi

aktif lysin ke ujung bebas

5’-fosfat

ikatan fosfodiester

akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-

fosfat & melepaskan

AMP dan enzim

adenylate

suhu 4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit - beberapa jam hingga terjadi

transformasi

Inkubasi Campuran Larutan

STRATEGI PEMASUKAN

GEN APOPTIN REKOMBINAN

KE DALAM E.coli BL12(DE3)

Laju pertumbuhan yang

cenderung cepat

Dapat dikultivasi pada

medium kultur biasa

Mengekspresikan dengan

baik berbagai gen asing

yang mengkode protein

target

Pemilihan bakteri Escherichia Coli sebagai Sel Inang dalam Proses Kloning Gen Apoptin

I n c l u s i o n b o d yAkumulasi protein rekombinan, yang

membentuk agregat kompak bersifat inaktif tidak larut

Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell

Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell

Strain Escherichia coli

Tingkat efisiensi transformasi yang cenderung

lebih tinggi

Memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase

Memiliki mutasi Ion dan OmpT protease yang

meminimalisir degradasi protein rekombinan

E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik

kloning Gen Apoptin

E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik

kloning Gen Apoptin

Pembuatan bakteri

kompeten

Tahap transforma

si

Identifikasi klon yang diinginkan

Strategi Pemasukan Gen Apoptin Rekombinan ke dalam

E.coli BL21(DE3)

CaCl2

Memperlemah dinding sel

Membantu mengubah sifat permeabilitas sel

MgCl2

Mengganggu kestabilan membran E.coli BL21

Pembuatan E.coli BL21(DE3) kompeten

Tahapan Transformasi

Pembengkakan sel-sel E.coli BL21(DE3)

sehingga dinding menjadi bocor (lisis)

Gen Apoptin membentuk kompleks

resisten Dnase dengan ion-ion Ca2+

yang terikat pada permukaan sel

Pemberian kejutan panas (heat shock)

Recovery E.coli BL21(DE3) melalui

proses pendinginan dan penumbuhan

pada medium kaya nutrien.

Tahapan Transformasi

Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan

transformasi)

Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan

transformasi)

host tidak dimasuki

DNA apapun

host dimasuki

vektor religasi

host dimasuki

rekombinan dengan /tanpa

fragmen target

Identifikasi Klon Apoptin yang diingingkan

Bagaimana memastikan transformasi berhasil??

Diperlukan cara untuk menseleksi/menapis agar sel

inang yang mengandung DNA yang dituju dapat

diperoleh di antara sel-sel inang lain yang tidak

mengandung DNA yang dituju

Seleksi menggunakan kondisi yang memungkinkan

pertumbuhan sel/faga yang membawa vektor yang

mengandung DNA yang dituju

Screening

Proses yang melibatkan penelusuran sel rekombinan

atau fag yang diperoleh dari transformasi atau

transduksi untuk menemukan klon yang diinginkan

𝑁=ln (1−𝑃)

𝑙𝑛(1− 1𝑛 )

Persamaan matematis untuk menentukan jumlah rekombinan yang perlu di-screening

Screening

Kelompok kami melakukan proses kloning gen apoptin

yang diisolasi dari chicken anemia virus, menggunakan

plasmid sebagai vektornya. Ukuran genom apoptin adalah

1,4 x 103 kb dan ukuran rata-rata fragmen perpustkaan

adalah 2,32 kb. Perpustakaan genomik dibuat dalam

vektor-vektor yang ditransformasi ke dalam sel-sel bakteri

E. coli BL21(DE3). Dengan propabilitas 95%, berapa

banyak koloni bakteri rekombinan yang harus discreening

untuk menemukan fragmen gen apoptin tersebut?

Screening

Langkah 1 : Hitung nilai n (rasio ukuran organisme relatif terhadap fragmen rata-rata dalam perpustakaan gen)

𝑛=1,4×103𝑘𝑏

2,32𝑘𝑏=6,034×102

Langkah 2 : Hitung nilai N (jumlah sel rekombinan yang discreening)

𝑁=ln (1−0,95 )

ln(1− 1

6,034×102 )=1806

Screening

lacZ

Enzim berfungsi

X-gal produk

lacZ insert

enzim tak berfungsi

X-gal produk

Penggunaan metode blue-white screening dalam proses identifikasi klon gen apoptin

dalam E.coli BL21(DE3)

Jika memiliki DNA probe

Suatu bagian dari gen

yang dituju

Gen sejenis dari spesies

lain (orthologue)

Oligonukleotida sintetik

yang disintesis

berdasarkan sekuen

DNA dari gen di atas

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam

E.coli BL21(DE3)

cont’d

Master Plate

Ditumbuhkan pada membran

nitroselulosa yang diletakkan di atas

media pertumbuhan

membran nitroselulosa dilepaskan

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Sel bakteri dilisiskan menggunakan NaOHpH dinetralkanProteinaseDicuci

Total DNA [chromosom, plasmid

(vektor + ‘klon’)] menempel pada

membran nitroselulosa

cont’dPenggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Film fotografi diproses,Titik gelap menandakan

adanya P radioisotop

Koloni bakteri yang memiliki DNA yang

dituju

Lembar film fotografi dipaparkan kepada

membran nitroselulosa (Autoradiography)

cont’dPenggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning

Sentrifugasi hasil blue-white screening

Pemurnian Apoptin dengan teknik IMAC

His-Tag ini memfafilitasi proses pemurnian protein

berdasarkan afinitas selektif protein dengan

polihistinin tersebut terhadap adsorben yang

dilengkapi pengkelat metal seperti Ni2+ atau Co2+.

Terjadi interaksi antara residu histidin dengan ion

logam dan elusi protein dengan imidazole

Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning

Kelebihan dan Kekurangan

1. Metode Isolasi (metode Phenol – Chloroform):

Metode Kelebihan Kekurangan

Phenol – Chloroform

DNA yang didapatkan lebih murni

Waktu yang dibutuhkan lebih lama

Kolom Adsorpsi Waktu yang dibutuhkan lebih cepat

Memiliki kemungkinan hasil isolasi DNA masih terkontaminasi (polisakarida, protein)

2. Metode Sekuensing DNA (metode Sanger) :

Metode Kelebihan Kekurangan

Metode Sanger Mudah dilakukan Hanya efektif diterapkan pada DNA rantai tunggal

Tidak menggunakan bahan yang mudah merusak sampel

Metode Maxim – Gilbert

Dapat diterapkan pada DNA rantai tunggal maupun rantai ganda

Menggunakan reagen kimia dalam menentukan pembelahan spesifik DNA

3. Metode Isolasi Plasmid (metode denaturasi alkali) :

Dengan menggunakan metode denaturasi alkali, bakteri akan melisis sehingga dapat diambil plasmidnya, dan tidak diperlukannya pemurnian lanjutan.

4. Transformasi Unit (metode heat – shock) :

Dengan melakukan teknik ‘heat-shock‘ — mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembali– bakteri, maka DNA dapat masuk ke dalam sel. Melakukan metode dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42°C selama 45 detik akan membuat membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Dengan metode ini, kesterilan kerja dan kontaminasi sel akan terminimalisir.

5. Seleksi Klon Rekombinan (metode Blue – white screening) :

– Kelebihan yang ditawarkan oleh teknik ini adalah metodenya mudah dilakukan dan cepat.

– digunakan metode blue – white screening karena plasmid pUC 19 yang memiliki gen lacZ.