Keahlian dalam teknik molekular secara umum meliputi:

1. Ekstraksi DNA2. PCR3. RFLP4. RAPD5. DOT BLOT6. Kloning7. PAGE8. dll

ASEP AWALUDIN PRIHANTO

FPIK

UB

Pengantar

Elektroforesis

Apakah Elektroforesis?

Metode pemisahan molekul (DNA, RNA,

protein) melalui medium tertentu berdasarkan

ukuran dan muatan listriknya

Struktur dan Penyusun Protein

PROTEIN – asam amino polimer

STRUCTURE of Amino Acids

Asam amino mempunyai (-COOH) & amina group (-NH2 ) serta rantai samping

04_05_Hydrophobic.jpg

04_29_Disulfide bonds.jpg

GEL PADA ELEKTROFORESIS

• Agarose Gel (DNA dan RNA)

• Polyacrylamide Gel (Protein)

SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis)

Memisahkan protein berdasarkan ukuran

Sample harus dipanaskan selama 5 menit ‘sample buffer‘ yang berisi: SDS (CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+), Glukosa atau Glycerol

Ionizable tracking dye (i.e., bromophenol blue)

SDS-PAGE Muatan listrik protein

akan dirubah menjadi muatan negatif dengan bantuan SDS

SDS digunakan untuk merubahkonformasi protein

Polyacrylamide

liquid

solid

% acrylamide (w/v) Kisaran efektif

Dengan BIS 1:20 pemisahan - bp

3.5 1 000 - 2 000

5.0 80 - 500

8.0 60 - 400

12.0 40 - 200

15.0 25 - 150

20.0 6 - 100

Acrylamide Gel Elektroforesis

% Polyacrylamide

gel

Bromophenol

blue

Xylene cyanol

(41)

5 35 130

6 26 106

8 19 76

10 12 55

12 8 28

Migrasi Dye pada % Polyacrylamide Gel

yang berbeda

Kisaran ukuran (Kd) % Acrylamide

36-205 5%24-205 7.5%14-205 10%14-66* 12.5%14-45* 15%

SDS Gel

Stacking Gel

Resolving Gel

4 % acrylamide

12% acrylamide

Gradien Gel

5%

25%

Protein Gel

Lanes:

1Molecular Weight Markers

2Supernatant

3Pellet

4Resin

5Fraction 2

6Fraction 1

216 kDa

132 kDa

78 kDa

45.7 kDa

32.5 kDa

18.4 kDa

Protein diukur dalam kiloDalton

1 amu = 1 Dalton

1,000 unit massa atom= 1 kiloDalton (kDa)

Resolving

gel only

Protein Standard

Calculating Protein Size

3 216 kDa

6 132 kDa

9 78 kDa

18 45.7 kDa

22 32.5 kDa

30 18.4 kDa

Calculating Protein Size

3 216 kDa

6 132 kDa

9 78 kDa

18 45.7 kDa

22 32.5 kDa

30 18.4 kDa

10 20 30

mm from top of gel

Pro

tein

siz

e2

0

4

0

6

0

8

0

10

0

12

0

Penggunaan kurfa standar untuk

penentuan berat molekul protein

Bekerja dalam Lab

1. Tempatkan gel pada peralatan

chamber

2. Masukkan sampel dalam

well/sumuran.

3. Run gel

Prinsip dasar pengerjaan

Detail Pengerjaan

Menimbang agarose.

Campur agarose 50- 100 ml aquades.

Panaskan agarose

Pasang gel dan juga sisir nya

Tuangkan gel pada chamber

Masukkan DNA/Protetin kedalam setiap sumuran .

Agarose Gel Elektroforesis

Perlahan tambahkan buffer. Pastikan semua gel terendam dalam buffer.

Sebagai alternatif bisa memasukkan sampel setelah buffer dimasukkan (jangan lupa basic dye)

Sambungkan kedalam listrik dengan voltase rendah

Agarose Gel Elektroforesis

Pasang dalam chamber dan nyalakan saklar listriknya

Agarose Gel Electrophoresis

umumnya akan selesai dengan waktu satu jam.

Setelah selesai keluarkan gel dan amati pada lampu UV jangan lupa untuk membuat stainingnya

dari EtBr.

Sebelum

Sesudah

FMBIO® II Fluorescence Imaging System

Sumur 1, 3, 5, 7 adalah marker

Sumur 2, 4, 6 and 8 adalah sample

Agarose vs SDS-PAGE

• Untuk asam nukleatseperti DNA dan RNA.

• Memisahkan berdasarkanmuatan listrik, ukurandan bentuk

• Gel dibuat dari agar yang berasal dari rumput laut

• Untuk protein dengan ukuran yang berbeda SIZE.

• Memisahkan berdasarkan ukuran

• Gel dibuat dari bubuk

Polyacrylamide

Semoga bermanfaat