Struktura a funkce biomakromolekulKBC/BPOL

5. Metody určování struktury proteinů

Ivo Frébort

3D struktury

Pochopení funkce proteinů, mechanismu enzymových reakcí, design nových léčiv, atd.

Experimentální vyřešení struktury je velmi obtížné.

PDB ~80.000 proteinových strukturGenebank ~10.000.000 proteinových sekvencí

Z 80.000 struktur, 8.000 tvoří proteiny s méně než 30% identity sekvence a jen 1.100 je unikátních, reprezentuje proteiny, které jsou výrazně strukturně odlišné

Smysl určování 3D struktur

PDB

Protein Data Bank (PDB) - založena 1971 http://www.rcsb.org/pdb/

3D strukturní data makromolekul Data pocházejí z rentgenostrukturní

krystalografie nebo NMR Celkový počet struktur 116.258 (25/02/2016)

Vývoj obsahu PDB

Nárůst nových typů struktur v PDB

Informační portál PDB

http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html

Struktury membránových proteinů

25.2. 2016Unique proteins in database = 595

Number of coordinate files in database = 1882

Strukturní databáze virů v PDB

Cytokinin dehydrogenasa + substrát iP/iP9G

Možnost stanovení struktury komplexu ES/EI

IMUNOGLOBULIN-G

Určení funkčních domén proteinu

STRUKTURY MYOGLOBINU A HEMOGLOBINU

Určení struktury neproteinových složek

Je nutný extrémně čistý proteinový vzorek Protein musí tvořit relativně velké a kvalitní

krystaly. Obvykle největší problém Řadu proteinů není možno zkrystalovat vůbec

(např. membránové proteiny)

Rentgenová krystalografie proteinů

Krystaly enzymů vykazují katalytickou aktivitu

Proteinové krystaly obsahují velký podíl vody, ~50%

Výsledky získané chemickou modifikací a

proteinovým inženýrstvím většinou potvrzují

krystalové struktury

Metody pracující s proteiny v roztoku, zejména

NMR potvrzují krystalové struktury

Odpovídá krystalová struktura skutečnosti?

Krystaly lidského insulinu Rentgenokrystalografický experiment

Krystalografie proteinů

MAX FERDINAND PERUTZ(1914-2002)

1962 Nobelova cena za chemii

„za studium struktury globulárních proteinů“

2d.sin = n.

Fourierova transformace: řešení matematického vztahu mezi elektronovou hustotou a difrakcí rentgenova záření

F(h) odraz na krystalové mřížce v bodě h, f(x) rozptylová funkce elektronové hustoty v bodě x. F(h) je komplexní číslo (vektor) skládající se z amplitudy a fáze odrazu.Integrace je možná pouze na úrovni celé krystalové jednotky. Každý atom tedy přispívá k amplitudě a fázi každého individuálního odrazu, ale různým způsobem (závisí na počtu elektronů atomového obalu). Tedy i částečná data dávají informaci o kompletní proteinové struktuře.

Elektronová hustota ρ(x) v bodě x je dána sumou všech odrazů v krystalové jednotce. Ke získání kvalitní mapy elektronové hustoty (s dobrým rozlišením) je třeba kompletní data.

Braggův zákon

Difrakční záznam proteinového krystalu

Princip řešení fáze pomocí metody isomorfní výměnyJe možné změřit pouze amplitudu !!!

Kapalný dusík se používá ke zmražení a stabilizaci krystalu.

Detektor

Zařízení pro rentgenovou difrakci

Krystalizační kity a metodiky

Hanging drop Sitting drop Microdialysis

Činidla kitu „Crystal screen“ – Hampton Research

Molecular Dimensions – Mosquito Robot

http://www.moleculardimensions.com

Zdroj záření - synchotron

Synchrotronové záření je vyzářeno elektronem letícím téměř rychlostí světla, když je jeho dráha ohýbána magnetickým polem (obj. 1947)

Nejvýznamnější synchotrony

www.spring8.or.jp

SPring-8

109 x silnější RTG záření než konvenční zdroje

Linac akcelerátor urychluje elektrony generované elektronovým dělem na energii 1 GeV pomocí vysokofrekvenčního elektrického pole.

Synchrotron je kruhový akcelerátor, který dále urychluje elektrony na energii 8 GeV přenáší je do zásobního okruhu.

Zásobní okruh – elektrony s energií 8 GeV cyklují a jsou používány k produkci synchotronníhozáření, které je vyvedeno do jednotlivých výzkumných pracovišť.

1 km světelná dráha – slouží ke studiu koherentní optiky rentgenova záření, např. vliv gravitace na světlo.

SPring-8

Linac

Synchotron

Storage ring

Experimental station

Řešení proteinové struktury

Purifikace

Krystalizace Synchotron

Záznam dat

Zpracování dat

Isomorfní výměna

Řešení fázeMolekulární výměna

Mapa elektronové hustoty

Modelování

Optimalizace

Validace

Porovnání s PDB

Publikace

Struktura

Mapa elektronové hustoty a tvorba modelu

Validace struktury - Ramachandránův diagram

3: CORE (dark green), 2: ALLOWED (light green), 1: GENEROUS (yellow), 0: OUTSIDE (red)

Morris A L, MacArthur M W, Hutchinson E G & Thornton J M (1992). Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins, 12, 345-364.

Nukleární magnetická resonance

NMR lze použít pro řešení struktury malých proteinů (do 20 kDa)

Určení proteinové struktury pomocí NMR

Triple resonance experiments

NMR model Proteinový krystal

NMR vs. krystalové struktury

Struktura vyřešená pomocí NMR – priony PrP and PrP*

R Riek, S Hornemann, G Wider, M Billeter, R Glockshuber & K Wuethrich: NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature 382, 180-182 (1996).

Sekvence obsahuje všechny informace o struktuře

Existuje nepřeberné množství možných konfigurací peptidového řetězce

„Ab initio“ modelování – zatím neuskutečnitelné

„Homologní modelování“ na základě podobnosti aminokyselinové sekvence (nad 25% identity)

Teoretické předpovědi proteinové struktury

Literatura

Garett, R. and Grisham, C.: Biochemistry 2nd ed., Harcourt Brace & Company, Orlando, FL, USA 1999.

Jones, C., Mulloy, B., and Sanderson, M. R.: Crystallographic methods and protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 56, Humana Press, Totowa, NJ, USA 1996.

Spring-8 web page (www.spring8.or.jp) and other Internet resources