katarzyna szołtysek
DESCRIPTION
Funkcjonalne współzależności szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych TP53 i NF k B. Katarzyna Szołtysek. Mechanizm regulacji NF k B, współzależności z TP53. TP53 jako czynnik transkrypcyjny. www.brc.riken.jp /.../201p53_network.html. Regulacja aktywacji TP53. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Funkcjonalne współzależności szlaków sygnałowych zależnych od czynników transkrypcyjnych
TP53 i NFkB.
Katarzyna Szołtysek
Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z TP53
www.brc.riken.jp/.../201p53_network.html
TP53 jako czynnik transkrypcyjny
http://p53.free.fr/index.html
Regulacja aktywacji TP53
MDM2 negatywny regulator p53:• wiąże się z domeną TA p53• eksport p53 z jądra komórkowego• funkcja ligazy ubikwityny
PTEN pozytywny regulator p53:• defosforyluje PIP3 (Pi3-4-5P)• blokada aktywacji Akt/PKB
Cel pracy
zidentyfikowanie i scharakteryzowanie funkcjonalnych współzależności pomiędzy szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i TP53
analiza wpływu aktywacji szlaku zależnego od NFkB na przeżycie komórek nowotworowych eksponowanych na czynniki genotoksyczne (promieniowanie
UV i promieniowanie jonizujące)
analiza profilu ekspresji wybranych genów regulowanych przez czynniki transkrypcyjne NFkB i TP53, w warunkach kontrolnych i w komórkach eksponowanych na czynniki stresu komórkowego
identyfikacja genów, na których aktywność mają wpływ oba czynniki transkrypcyjne
i opracowanie modelu funkcjonalnych współzależności obu szlaków sygnałowych
HCT116 (rak jelita grubego) p53+/+ (wt) p53-/- (bi-allelic knock-out)
STATUS p53:
A – RT-PCR B – Western blot
A B
HCT116
Model doświadczalny
Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza (WB, qRT-PCR):
regulacja p53
blokada cyklu komórkowego
indukcja apoptozy
Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych
Analiza aktywacji badanych ścieżek sygnałowych
Indukcja białka p53:
A – Western blot
Indukcja ścieżki NFkB:
B – Western blot
C – RT-PCR
A
B C
Analiza poziomu ekspresji genów TP53 zależnych
Schemat ścieżki sygnałowej TP53
HCT116 HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – MDM2
Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – PTEN
HCT116 HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – p21
HCT116 HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – Noxa
HCT116 HCT116 p53-/-
Wnioski:
stymulacja komórek TNFa wpływa na aktywację genów zależnych od p53, wywołaną promieniowaniem UV
poziom ekspresji MDM2 i PTEN ulega podwyższeniu w obu stosowanych schematach
poziom ekspresji p21/WAF1 i Noxa ulega początkowemu obniżeniu, a następnie podwyższeniu w obu stosowanych schematach aktywacji analizowanych ścieżek sygnałowych
Analiza poziomu ekspresji genów NFkB zależnych
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: qRT-PCR
PCR Array (SABioscience -NFkB dependent genes)
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: cDNA 1h
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: cDNA 1h
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Analiza qRT-PCR: BCL3, NFKBIA, REL,
IL1A, IL8,
TNF, TNFAIP3