Katarzyna Lorenc- Kukuła

Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej

Uniwersytet Wrocławski

Efekty plejotropowe spowodowane Efekty plejotropowe spowodowane wzrostem zawartości związków wzrostem zawartości związków

fenolowych w roślinach lnu fenolowych w roślinach lnu transgenicznegotransgenicznego

Cel projektu

• uzyskanie lnu o zwiekszonych wlaściwościach antyoksydacyjnych spowolnienie/ zahamowanie procesu jełczenia tłuszczy

• ustalenie znaczenia flawonoidów oraz kontrolowana manipulacja ich syntezą w celu podwyższenia odporności roślin na stres środowiskowy, choroby oraz szkodniki

Flawonoidy

• wtórne metabolity roślinne

• wiążą toksyczne pierwiastki (miedź i ołów)

• hamują peroksydację lipidów

• ochrona przed patogenami, promieniowaniem UV

• właściwości antyalergiczne, antywirusowe i przeciwzapalne

• cenny element w diecie człowieka

1

2

36

1’7

8

6’

O

A

B

2’

45

3’

4’

5’

Konstrukcja roślin W92

• w celu zwiększenia właściwości antyoksydacyjnych lnu skonstruowano rośliny transgeniczne, do genomu których, przy użyciu wektora BinAR wprowadzono cDNA z Petuni hybrida kodujący enzymy:

• syntazy chalkonu (CHS) • izomerazy chalkonu (CHI) • dehydrogenazy dihydroflawonu (DFR)

4- kumarynian

4- kumarylo CoA4- kumarylo CoA

cynamonian

PhePhe

malonylo CoAmalonylo CoA

lignany

+

PALC4H

4CL

flawanonflawanon

3- OH- antocyjanidyny

chalkonchalkon

flawan- 3,4- dioleflawan- 3,4- diole

antocyjany

3-OH- flawanon

CHSCHS

CHICHI

F3H

DFRDFR

AS

5GT

taniny

Konstrukcja wektora użytego do przygotowania roślin W92

C P 86 68 83 72 70 17 21 28 39 40 13

0,5 kb

C 86 68 83 72 70 17 21 28 39 40

1,3 kb

0,8 kb

1,4 kb

23 S

C 86 68 83 72 70 17 21 28 39 40

Preselekcja lnu transgenicznego

0,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

C 28 40 70 72 86

ug/m

l

Właściwości antyoksydacyjne lnu- części zielone

5x- 91x40707286

mRNA / IC50: -0.77

Właściwości antyoksydacyjne lnu- nasiona F1

2003/2004

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

C 28 40 70 72 86

ug/m

l

2004/2005

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

C 28 40 70 72 86

ug/m

l

1,5x- 6x

1,3x- 16,6x

Właściwości antyoksydacyjne lnu- nasiona F2

2004/2005

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

C 28 40 70 72 86

ug/m

l

1,9x- 6,6x

Kwasy fenolowe – części zielone

Kwas protokatecholowy

Kwas kawowy + chlorogenowy

Kwas ferulowy

Kwas p- kumarowy

0

200

400

600

800

1000

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

0

20

40

60

80

100

120

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

0

5

10

15

20

25

30

35

40

C 28 40 70 72 86m

g/10

0g

0

50

100

150

200

250

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

(13%- 27%)

Kwasy fenolowe (2003,2004) –nasiona F1

caffeic acid

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

C 28 40 70 72 86

mg/1

00 g

ferulic acid

0

5

10

15

20

25

30

35

40

C 28 40 70 72 86

mg/1

00 g

p- coumaric acid

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

C 28 40 70 72 86

mg/1

00 g

Kwas kawowy Kwas ferulowy Kwas p- kumarowy

(7 %- 25 %)

Kwas kawowy

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

Kwas p- kumarowy

0

5

10

15

20

25

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

Kwas ferulowy

0

5

10

15

20

25

30

35

40

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

20032004

(29 %- 42 %)

Kwasy fenolowe (2004) –nasiona F2

Kwas kawowy

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

Kwas p- kumarowy

0

5

10

15

20

25

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

Kwas ferulowy

0

5

10

15

20

25

30

35

C 28 40 70 72 86

mg/

100g

23 %- 39 %

IC 50 SADZONKI IC 50 NASIONA

F1 F2

KWASY FENOLOWE2003

- 0,82 - 0,70 -

KWASY FENOLOWE 2004

- - 0,9 - 0,88

02468

1012

C 28 40 70 72 86

mg

/g

Analiza (HPLC) SDG w nasionach lnu

40- 12%

72- 14%

SDG/ IC 50 w nasionach0,7

Podstawowe składniki pokarmowe

Podstawowe składniki pokarmowe (%) C 40 72

Sucha masa 92,98 93,02 93,09

Białko ogólne (Nx 6,26) 24,3 23,8 24,4

Popiół surowy (mineralne) 3,6 3,9 5,7

Włókno surowe 7,7 6,3 6,7

BAW- związki bezazotowe wyciągowe 19,1 21,8 20,4

Frakcje włókna Van Soesta

  NDF 11,46 15,83 14,51

  ADF 9,38 7,24 9,63

  ADL (lignina) 3,55 1,37 3,61

C 40 72

100 100,04 100,12

100 97,98 100,66

100 110,36 159,94

100 81,51 87,24

100 113,97 106,54

100 138,13 126,61

100 77,19 102,67

100 38,59 101,69

Składniki mineralne

Linia Ca[mg/kg]

Mg[mg/kg]

Cu[mg/kg]

Zn[mg/kg]

Mn[mg/kg]

Fe[mg/kg]

K[%]

Na[mg/kg]

P[%]

C 1666 3710 9,42 72,3 32,4 62,6 1,10 457 0,553

40 1354 3868 7,40 72,4 41,4 83,2 1,05 420 0,461

72 1230 3776 7,21 76,0 48,0 82,7 1,04 439 0,611

Linia Pb[µg/kg]

Cd[µg/kg ]

Cr[µg/kg ]

Ni[mg/kg]

Cl-

[mg/kg]NO2

-

[mg/kg]

NO3-

[mg/kg]

SO42-

[mg/kg]

HPO42-

[mg/kg]

C <gr oznacz. 389 86,6

<gr oznacz.

250

<0,10

28,6 224 3967

40 48,4 562 231 127 17,7 93,4 3751

72 112 420 145 307 44,0 110 5849

Składniki mineralne

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C 40 72

%

- 10 %

+ 41 %

Zawartość tłuszczu ogólnego

38

39

40

41

42

43

44

45

C 28 40 70 72 86

od 2 do 7 %

Liczba nadtlenkowa

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

C 28 40 70 72 86

r = 0.86

Liczba jodowa

118

120

122

124

126

128

130

132

C 28 40 70 72 86

Liczba anizydynowa tłuszczu z F1 i F2 nie utlenianego promieniami

UV

F1

0

30

60

90

120

150

C 28 40 70 72 86

F2

0

30

60

90

120

150

180

210

C 28 40 70 72 86

Liczba anizydynowa tłuszczu z F1 i F2 utlenianego promieniami

UV

r = 0,94 F1

r= 0,71 F2

F1

0102030405060708090

100110

C 28 40 70 72 86

F2

0102030405060708090

100110

C 28 40 70 72 86

Analiza (GC- FID) kwasów tłuszczowych w nasionach lnu

PUFA

64,066,068,070,072,074,076,078,080,082,0

C 28 40 70 72 86

mo

l %

MUFA

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

C 28 40 70 72 86

mol

%

32%

7.5%

MUFA – 72 wzrost o 54%

PUFA- od 1% do 12%

MUFA (PUFA)/ IC500,91!!

Analiza fenotypowa

Linia

FW nasion na

roślinę (g)

FW nasion na

torebkę (mg)

Liczba nasion

na torebkę

FW pojedynczego

nasiona (mg)

Kontrola

W92.28

W92.40

W92.70

W92.72

W92.86

4.28 ± 0.22

3.25 ± 0.18

5.03 ± 0.29

6.43 ± 0.11

4.91 ± 0.32

6.94 ± 0.19

42,95 ± 1.17

52,51 ± 1.29

49,23 ± 1.03

47,78 ± 1.11

51,28 ± 1.00

47,33 ± 1.43

8,34 ± 1.0

8,66 ± 1.1

8,71 ± 0.6

8,59 ± 1.2

8,95 ± 0.4

8,88 ± 0.7

5,15 ± 0.44

6,06 ± 0.23

5,65 ± 0.31

5,56 ± 0.20

5,73 ± 0.37

5,33 ± 0.25

> 36% (15-62%)

> 30% dla F2

> 16% (10-22%) 5% (3-7%) 10% (3-18%)

7% (4- 9%)

Fenotyp roślin W92

W92/40

26.05.2003

kontrola

26.05.2003

W92/86

26.05.2003

Kwitnienie

W92/70 W92/40

17.06.2003

kontrola

17.06.2003

F.culmorum

0

20

40

60

80

100

120

C 28 40 70 72 86

%

F.oxysporum

0

20

40

60

80

100

120

C 28 40 70 72 86

%

F. culmorum i F. oxysporum

Kwasy fenolowe/ IC50 a odporność (0,9)

Fusarium.c /SDG 0,7

Fusarium/MUFA 0,9 ?