jatropha curcas L transformation trial

Download jatropha curcas L transformation trial

Post on 08-Feb-2016

38 views

Category:

Documents

0 download

TRANSCRIPT

Respon Eksplant Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakuan Transformasi Gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens

Digunakan untuk melengkapi Skripsi Tahun Ajaran 2012/2013

Oleh :Fika Ayu SafitriNIM. 081510501027

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS JEMBER2012

BAB 1. PENDAHULUAN1.1. Latar BelakangTanaman Jarak pagar dengan nama ilmiah Jatropha curcas L. dapat dikategorikan sebagai salah satu sumber energi alternatif pengganti solar. Hal ini dikarenakan minyak Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) dapat menghasilkan minyak biodiesel sebagai pengganti Bahan Bakar Minyak (Sudradjat, 2006) yang mendekati karakteristik diesel. Biodiesel merupakan bahan bakar alternatif yang terbuat dari minyak nabati atau hewani, minyak tersebut dapat diubah menjadi bahan bakar mesin diesel melalui proses transesterifikasi agar sifat-sifatnya menyerupai minyak solar (Hidayat dan Sumangat, 2008), sehingga biodiesel bisa digunakan sebagai bahan bakar campuran solar. Keunggulan penggunaan minyak jarakya itu tidak bersaing dengan kebutuhan pangan, ditambah lagi penanaman jarak pagar yang dapat dilakukan di lahan lahan marginal. Namun, kendala yang dihadapi dalam pengembangan tanaman jarak pagar sebagai bahan bakar pengganti yaitu keterbatasan bahan baku untuk industri biodiesel (Syakir, 2010) karena tingkat rendemen minyak yang masih rendah sekitar 30 35 % (Raden, et. A.,. 2009).Akhir akhir ini, banyak metode rekayasa genetik yang digunakan untuk perbaikan sifat tanaman, seperti halnya untuk menaikkan rendemen. Salah satu metode yang digunakan yaitu teknik transformasi gen pada tanaman agar tanaman yang kita inginkan memiliki sifat sifat yang diharapkan. Pada tanaman jarak pagar, minyak terdiri dari dua komponen penyusun, yaitu gliserol dan asam lemak. Dalam sintesis asam lemak terdapat faktor yang mempengaruhinya, yaitu adanya protein ACP (Acyl Carrier Protein) yang dikode oleh gen Acl. Branen, et al. (2001) menyatakan bahwa Acyl Carrier Protein (ACP) adalah protein yang bersifat asam memiliki ukuran kecil (9 kD), dimana protein ini merupakan kofaktor penting dalam biosintesis asam lemak pada tanaman. Menurut Guerra (1986), protein ACP dibutuhkan dalam jumlah yang banyak pada sintesis asam lemak dan terjadi di plastida tanaman. ACP sering dianggap sebagai suatu bentuk protein koenzim A (Therisod dan Kennedy, 1987), sehingga semakin banyak gen Acl yang terkandung pada suatu siklus biosintesis, maka jumlah asam lemak yang dihasilkan oleh tanaman meningkat, sehingga rendemen minyak pada tanaman jarak pagar juga dapat meningkat. Gen Acl yang telah diketahui tersebut diligasi pada plasmid pBI 121 untuk dilakukan transformasi pada tanaman jarak pagar. Pada penelitian ini digunakan Agrobacterium tumefaciens sebagai media transformasi ke kromosom tanaman. Media transformasi ini dipilih karena lebih sederhana dan ekonomis. Disamping itu, Agrobacterium Tumefaciens memiliki efisiensi tinggi untuk mentransfer dengan baik gen yang diinginkan kedalam kromosom tanaman (Sheeba, 2010) serta jumlah kopi gen yang di masukkan kedalam kromosom tanaman relatif besar (Wunn, 1997). Transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens lebih disenangi daripada menggunakan penembak biolistik karena penggunaan Agrobacterium menghasilkan proporsi yang lebih besar transgen terekspresi dengan jumlah lokus yang lebih rendah (Ishida et al., 1996; Zhao et al., 1998 dalam Utomo, D.S., 2004). Teknik transformasi gen menggunakan Agrobacterium Tumefaciens digunakan sebagai pendekatan molekuler yang ditujukan untuk peningkatan rendemen minyak pada tanaman jarak dengan memanfaatkan agrobacterium tumefaciens. Oleh karena itu, diperlukan penelitian ini untuk mendapatkan metode yang tepat pada transformasi gen Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.1.2. Rumusan MasalahPeningkatan rendemen minyak tanaman jarak dapat dilakukan dengan transformasi gen Acl ke dalam genom tanaman dengan harapan gen tersebut dapat terekspresi sehingga rendemen minyak tanaman jarak dapat meningkat. Metode transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens ini memiliki perbedaan antara satu spesies tanaman ke spesies tanaman lainnya, serta antara kultivar satu dengan kultivar lainnya. Menurut Hiei et al. (1997) bahwa keberhasilan Agrobacterium dalam menginfeksi tanaman ditentukan oleh banyak faktor diantaranya adalah jenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi serta galur Agrobacterium yang digunakan. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian mengenai respon eksplan tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakukan transformasi gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.1.3. Tujuan dan Manfaat1.3.1. TujuanPenelitian ini bertujuan untuk mengetahui respon eksplant tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) pada perlakukan transformasi gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.1.3.2. ManfaatManfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang metode transformasi gen Acl menggunakan Agrobacterium Tumefaciens.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA2.1. Jarak PagarTanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.) merupakan tanaman perdu yang termasuk dalam family Euphorbiaceae dan terdiri dari 170 spesies yang telah dikenal seperti karet dan singkong (Wudrack, 2008 dalam Carles, 2009). Menurut Hambali (2006) klasifikasi tanaman jarak pagar sebagai berikut :Divisi : SpermatophytaSubdivisi : AngiospermaeKelas : DicotyledonaeOrdo : EuphorboialesFamili : EuphorbiaceaeGenus : JatrophaSpesies : Jatropha curcas L.Tanaman jarak adalah salah satu tanaman penghasil bahan bakar alami dalam bentuk minyak diesel dan merupakan salah satu tanaman non-edible oil. Tanaman penghasil minyak, Bahan Bakar Nabati, terkadang menimbulkan masalah baru seperti persaingan dengan kebutuhan pangan yang penting bagi kehidupan manusia. Namun, tanaman jarak pagar ini merupakan tanaman non-edible oil dimana tanaman ini tidak akan bersaing dengan kebutuhan pangan. Hal ini disebabkan biji jarak mengandung racun sehingga tidak mungkin dikonsumsi oleh manusia. Selain itu, Jatropha curcas L. merupakan tanaman yang dapat tumbuh dilahan marginal sehingga dalam perawatannya tidak banyak membutuhkan banyak air dan pupuk (Siang, 2009).Indonesia dapat dikatakan sebagai salah satu daerah penyebaran tanaman jarak pagar selain India. Dengan kemampuan tanaman jarak pagar yang dapat tumbuh di lahan marginal, tanaman ini dapat dimanfaatkan untuk usaha konservasi lahan marginal sehingga dapat memberi manfaat dengan produksi minyak sebagai energi terbarukan. Menurut Siswadi (2006) Lahan kritis di Indonesia lebih dari 20 juta ha, sebagian besar berada di luar kawasan hutan dengan pemanfaatan yang belum optimal. Mengingat permintaan energi dan pangan yang naik pada tiap tahunnya, pemanfaatan lahan kritis dapat memenuhi kebutuhan energi tanpa bersaing dengan tanaman pangan, air dan sumber alam lainnya tidak terjadi jika pemanfaatan jarak pagar dilakukan secara optimal.

Gambar 1. Perkiraan penyebaran tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L.) (sumber : King, et al., 2009).2.2. Kultur JaringanSecara konvensional, perbanyakan tanaman jarak dilakukan dengan menggunakan benih dan stek. Namun, perbanyakan secara konvensional menimbulkan masalah seperti rendahnya viabilitas benih, perkecambahan yang rendah, terlambatnya pertumbuhan akar dan jumlah akar yang sedikit (Heller, 1996; Openshaw, 2000 dalam Shah, et. al., 2010). Pada umumnya tanaman jarak memulai berbuah pada tahun ke 2 3. Namun, sebagian kecil tanaman jarak dapat dilakukan pemanenanpada tahun pertama (setelah tanaman berumur 6 8 bulan) dengan produktivitas yang rendah sekitar 35-45 % (Arif dan Ahmed, 2009) 0,5 1,0 ton biji kering per hektar per tahun. Selain itu, rata - rata viabilitas dan tingkat perkecambahan tanaman jarak rendah (Kaewpoo dan Te-chato, 2009). Oleh karena itu, diperlukan pendekatan baru yang dapat digunakan sebagai cara perbanyakan tanaman jarak untuk meminimalisir menyelesaikan masalah pada tanaman jarak.Dalam perbanyakan tanaman jarak pagar juga dibutuhkan teknik yang dapat memudahkan dalam penyediaan bibit seperti kultur jaringan. Secara khusus, kultur jaringan dapat diartikan sebagai ilmu pengetahuan yang digunakan untuk menumbuhkan sel, jaringan atau organ tanaman yang telah dipisahkan dari tanaman induk pada media buatan (George, et al. 2008).Perbanyakan tanaman jarak menggunakan teknik kultur jaringan sudah sering dilakukan penelitian, akan tetapi perlu adanya perbaikan lebih lanjut mengingat tanaman jarak memiliki varietas yang berbeda sehingga dalam penggunaan teknik kultur jaringan diperlukan metode yang sesuai seperti penggunaan media, hormon serta bagian yang akan digunakan sebagai eksplan. Menurut Chaudhary, et al (1994) menyebutkan bahwa syarat yang optimum untuk pembentukan kalus atau pembentukan organ pada teknik kultur jaringan sangat beragam tidak hanya berasal dari perbedaan spesies namun juga perbedaan eksplan yang diambil pada tanaman yang sama akan menimbulkan hasil yang berbeda pula. 2.3. Tranformasi Gen dan Agrobacterium TumefaciensTransformasi merupakan upaya memanipulasi sifat gentik dan mentransfer gen- gen asing yang diisolasi dari tanaman, virus, bakteri atau hewan kedalam suatu latar belakang genetik baru. Pada metode transforamsi yang dilakukan pada penelitian ini digunakan bakteri pathogen tanah yang dapat menyebabkan crown-gall pada tanaman dikotil atau yang biasa disebut Agrobacterium Tumefaciens.Agrobacterium Tumefaciensmerupakan bakteri aerob obligat gram negatif (Mulyaningsih, 2009) dan merupakan bakteri pathogen tanah (Riva, et. al., 1998), dimana pada awalnya bakteri ini dapat merugikan bagi tanaman inang.Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor) (Tzfira, et. al., 2004; Riva, et. al., 1998). Crown gall tumor ini merupakan hasil dari transfer dan ekspresi gen yang terdapat pada agrobacterium kedalam sel tanaman yang menyebabkan proliferasi sel yang tidak terkendali dan sintesis senyawa yang dapat dimetabolisme secara khusus oleh agrobacterium (Escobar, dan Dandekar, 2003).Dasar transformasi genetik sel tanaman oleh Agrobacterium Tumefaciens adalah pemindahan Ti-Plasmid dari bakteri yang menginduksi terbentuknya tumor karena Ti-Plasmid tersebut dapat berintegarsi dengan genom tanaman inang.Sel agrobacterium memiliki 2 macam DNA, yaitu:DNA Kromosom bakteri dan DNA Plasmid (Gambar 3). Kemampuan membentuk tumor ditentukan oleh plasmid Ti (Tumor Induksi) yang berada pada A. tumefaciens. Ti-Plasmid tidak dapat digunakan untuk cloning secara langsung karena ukuran Ti-Plasmid terlalu besar (200 kb), sehingga Ti-Plasmid perlu diperkecil ukurannya agar dapat ditransfer ke tanaman.

Gambar 2. Bagian alami agrobacterium Tumefaciens. (Sumber : Pighin, 2003)Pada rekayasa genetik plasmid digunakan untuk menyisipkan/menyimpan gen yang diinginkan. Pada plasmid terdapat beberapa susunan gen mulai dari gen ketahanan pada antibiotic tertentu hingga gen yang dapat disalin menggunakan gen tertentu. Pada kromosom bakteri terdapat gen ketahanan terhadap antibiotic tertentu yang alamiah dibawa oleh bakteri tersebut. Ti-Plasmid mengandung suatu fragmen DNA yang disebut T-DNA (Transfer Deoxiribose Acid) (berukuran 15-30 kb) yang dapat diintegrasikan ke dalam DNA inti sel tanaman. Pada T-DNA terdapat gen untuk sintesis hormone akusin dan sitokinin. Keberadaan kedua hormone ini dapat merangsang tumbuhnya kanker pada tanaman. Kedua hormone ini menyebabkan pembelahan sel tanaman yang tidak terkendali yang dapat menyebabkan tumor pada tanaman. Oleh karena itu, gen yang menyebabkan produksi auksin dan sitokinin dihilangkan agar dapat digunakan dalam transformasi gen pada tanaman.Keberadaan T-DNA dalam agrobacterium mengakibatkan bakteri ini lebih banyak dipilih dalam transfer gen karena kemampuannya yang dapat membawa gen lain serta mentransfernya kedalam tanaman inang sehingga tanaman inang dapat mengekspresikan gen tersebut.Gen yan mengkode produksi auksin dan sitokinin dapat dihilangkan dengan menggunakan enzim retriksi yang kemudian diganti dengan gen yang diinginkan.Proses transfer T-DNA bakteri ke dalam sel tanaman dijalankan oleh produk dari daerah virulen (vir. region) yang berada di Ti-plasmid sehingga dapat mentransfer gen yang terdapat pada tanaman. Berikut merupakan beberapa tahapan transfer T-DNA dari Agrobacterium kedalam tanaman (gambar 4), antara lain : 1) Induksi terbentuknya ekspresi gen virulensi oleh komplek protein Vir A dan Vir G, dimana Vir A mendeteksi adanya senyawa fenolik yang dihasilkan tanaman akibat pelukaan, setelah itu, Vir A memfosforilisasi Vir G untuk melakukan transkripsi gen virulence. 2) Produksi T-Strand (sebuah ss salinan dari T-DNA) oleh komplek protein Vir D1/Vir D2. 3) Terbentuknya T-Komplek yang merupakan kesatuan T-Strand dan komplek protein Vir E. 4) T-komplek keluar dari sel bakteri. 5) T-komplek masuk ke dalam sel tanaman. 6) T-komplek menembus dindinh inti sel yang kemudian 7) berintegerasi dengan kromosom tanaman.

Gambar 3. Proses transfer T-DNA dari Agrobacterium Tumefaciens ke sel tanaman. (Sumber : Zupan, J.P dan Zambryski, P., 1995)Penggunaan agrobacterium sebagai media transformasi gen dinilai sebagai cara yang relatif murah dan lebih alami dibandingkan dengan menggunakan metode transformasi yang lain. Selain itu gen yang ditransformasi dengan A.tumefaciens terintegrasi lebih stabil di dalam genom tanaman target. (B. Santosa dan Sofiari, 2005) dan lebih mudah dalam memberikan perlakuan pada tanaman. Namun, keberhasilan proses transformasi juga dipengaruhi oleh kombinasi dari kekuatan bakteri (strain Agrobacterium) dan genotipe tanaman. (Sheeba, et. al., 2010). Agrobacterium ini berbahaya bagi tanaman, tetapi sangat berguna bagi peneliti karena: Agrobacterium dapat mentransformasikan kedalam genom tanaman,mudah ditemukan didalam tanah, serta sangat berguna untuk alat menstranfer DNA yang diinginkan peneliti untuk memodifikasi genetik tanaman (Winstead, 2001). Penggunaan agrobacterium sebagai media tranformasi sering dilakukan tidak hanya pada tanaman jarak pagar tetapi juga pada tanaman jagung (Utomo, 2004), Tomat (B. Santosa dan Sofiari., E, 2005), serta tanaman lainnya, sehingga penggunaan Agrobacterium sebagai media transformasi sangat umum digunakan.Secara konvensional, proses transformasi A. Tumefaciens diawali dari tahapan co-culture yaitu tahapan transfer T-DNA ke sel tanaman dalam jaringan eksplan yang diikuti oleh adanya seleksi yang selanjutnya regenerasi dari yang ditransformasi menjadi tanaman utuh (Chabaud, et al., 2011).2.4. Polymerase Chain Reaction (PCR)PCR (polymerase chain reaction) adalah salah suatu teknik perbanyakan DNA yang dilakukan secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Menurut lestari, P (2011) menyatakan bahwa kelebihan metode untuk mengidentifikasi atau membedakan varietas dominan dengan metode PCR ini adalah tidak butuh waktu yang lama, mudah dalam pelaksanaannya da...

Recommended

View more >