BAHAN DAN METODE

Secara garis besar penelitian ini dapat digambarkan pada skema seperti tertera

pada Gambar 1 .

PENGAMBILAN CONTOH TANAH 1 . Contoh Tanah 2. Contoh Aka.

ISOLASI DAN KOLEKSI 1 . Medium Ca,(PO,), 2. Medium AlPO,

SELEKSI JASAD RENIK 1 . Tahap 1 2. Tahap 2

JASAD RENIK TERPILIH 1 TELAAH JASAD RENIK

1 . Identifdcasi 2. Pembakuan populasi 3. Asam organik 4. Penumbuhan

Gambar 1 . Skema penelitian

I - -

I --

I I

UJI IN VITRO 1 . Perc. 1 2. Perc. 2

- UJI RUMAH KACA I . Perc. 3 2. Pen. 4

-

r

UJI LAPANG Perc.5 ,

- UJI EKOLOGI 1. Perc. 6 2. Perc. 7

Kegiatan penelitian terdiri atas pengambilan contoh tanah dan akar, analisis

awal contoh tanah, persiapan contoh tanah, isolasi dan koleksi jasad re& pelarut

fosfat, seleksi jasad renik, identifikasi jasad renik dan analisis asam organik, serta

pengujian jasad renik terpilih pada percobaan in vitro, rumah kaca dan lapang, serta

telaah ekologi beberapa jasad renik unggul.

Tempat dan Waktu

Contoh tanah dan akar tebu diambil dari beberapa lokasi, diantaranya dari

Lampung dan Sumatera Selatan yang dikategorikan bertanah masam, Sragen (Jawa

Tengah) yang bersifat basa, dan Madura yang bersifat netral.

Analisis kimia contoh tanah dan tanaman, isolasi jasad renik, seleksi jasad

renik, uji in vitro, dan telaah ekologi dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah,

Faperta IPB. Percobaan Rumah Kaca (RK) dilakukan di dua tempat, yang pertarna

di RK Jurusan Tanah, Faperta IPB dan RK Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi (PAIR)

BATAN Pasar Jumat Jakarta. Percobaan Lapang dilakukan di areal Perkebunan

Pabrik Gula Bungamaywg, Lampung Utara. Penetapan asam organik serta

identifikasi jasad renik dilakukan di Laboratorium Ekofisiologi Pusat Penelitian

Tanaman Pangan, Bogor, dan Laboratorium Bakteriologi & Mikologi FMIPA IPB,

serta Laboratorium Diagnostik dan Bakteriologi FKH,IPB.

Percobaan berlangsung selama 26 bulan, yang dimulai pada akhir Oktober

1991 dan berakhir pada Desember 1993.

Pengambilan Contoh Tanah dan Akar

Contoh tanah diambil secara komposit dari kedalaman 0-20 cm, selanjutnya

dibebaskan dari sisa-sisa tanaman, batu, kerikil, dan diaduk sampai rata. Contoh

tanah dikering-udarakan di atas hamparan plastik di bawah naungan untuk

menghindari sinar matahari langsung. Untuk memperoleh ukuran butir yang

seragam, tanah diayak dengan saringan 2 mrn, selanjutnya dianalisis beberapa sifat

kimianya.

Contoh akar tebu diambil dari tanaman yang berumur antara 4-6 bulan, dari

akar-akar muda yang aktif melakukan penyerapan hara dan air. Akar diambil dengan

membongkar rumpun tebu, dan contoh akar dikumpulkan bersama batang tebu bagian

bawah yang masih utuh terbungkus tanah.

Isolasi Jasad Renik Pelarut Fosfat

Metode Cawan Tuang ,

Contoh tanah. Sepuluh gram tanah yang akan diisolasi jasad reniknya

dilarutkan dalam 90 ml larutan fisiologis (larutan NaCl 0.85 persen), selanjutnya

diencerkan secara serial sampai tingkat pengenceran 1@ kali. Satu ml suspensi ini

dibiakkan pada agar cawan yang mengandung medium Pikovskaya (komposisinya

disajikan pada Tabel Lampiran 20) dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 hari.

Medium ini berwarna putih keruh karena Ca,(PO,),. Koloni yang dikelilingi zona

berwarna terang jernih menunjukkan adanya pelarutan Ca,(PO,)?. Koloni-koloni yang

diinginkan selanjutnya dimurnikan.

Contoh akar. Sejumlah akar tanaman tebu segar dibersihkan dari sisa-sisa

tanah yang menempel dan dicuci. Sepuluh gram akar yang sudah bersih direndam

dalam 90 ml larutan fisiologis steril, dikocok dengan kecepatan 100-150 rpm selama

20 menit, selanjutnya diencerkan secara serial sampai 104 kali. Satu mililiter suspensi

tersebut dibiakkan pada agar cawan yang mengandung medium Pikovskaya d m

diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 hari.

Metode Penyuburan

Isolasi dengan metode penyuburan dimaksudkan untuk memperoleh jasad renik

yang mampu melarutkan AIPO, sebagai satu-satunya sumber fosfat dalam medium

Pikovskaya yang dimodifikasi dengan penggantian Ca,(PO,), oleh AlPO, dan

(NH,),SO, oleh urea (komposisinya disajikan pada Tabel Lampiran 20). Medium

tersebut tidak berwarna dan mempunyai pH 4.1 sehingga agar dalam medium tersebut

tidak dapat memadat. Oleh karena itu medium tersebut tidak dibubuhi agar dan

metode pencawanan tidak dapat dilakukan.

Metode ini memerlukan kontrol, yaitu sederetan medium AIP04 dengan

tingkat pengenceran lo-' sampai 10' yang tidak mengandung suspensi tanah atau

akar. Deretan yang lain adalah medium AIPO, dengan tingkat pengenceran yang

36

sarna, yakni lo-' sampai lo4 yang dibubuhi dengan satu mililiter suspensi akar

(tingkat pengenceran lo-') atau tanah (tingkat pengencerean lo4) dan disiapkan lebi

dari satu deret. Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu kamar selama 5 sampai 6

hari.

Pada akhir inkubasi, deretan kontrol diuji dengan warna biru molibdat.

Caranya sebagai berikut : dua mililiter kultur yang akan diuji dipipet ke dalam

tabung reaksi, lalu dibubuhi dua mililiter larutan PB dan satu tetes larutan PC

(komposisi larutan PB dan PC disajikan pada Tabel Lampiran 21). Jika larutan

berwarna biru, berarti mengandung P larut yang telah membentuk senyawa

fosfomolibdat tereduksi. Intensitas warna biru terlemah pada kontrol mempakan

tingkat pengenceran yang dipilih untuk menguji kultur sampel.

Jika pada tingkat pengenceran yang sama intensitas warm biru pada h l t u r

sampel lebih tinggi dibanding kontrol, maka ha1 tersebut menunjukkan bahwa pada

kultur sampel telah terjadi pelarutan AlPO, oleh jasad renik pelarut fosfat.

Selanjutnya kultur samp J dibiakkan ke dalam cawan bermedium Pikovskaya padat,

dan koloni yang muncul dimurnikan untuk dikoleksi.

Koleksi Jasad Renik

Isolat-isolat yang diperoleh dikoleksi dalam agar miring pada dua macam

medium (Pikovskaya dan agar nutrien), disimpan pada suhu 4"C, serta diremajakan

setiap dua bulan.

37

Isolat yang dikoleksi diberi nama yang terdiri dari 4 digit. Digit pertama

menunjukkan jenis jasad renik (1 = bakteri, 2 = cendawan). Digit kedua

menunjukkan asal contoh (M = Madura; S = Sragen; L = Lampung; P = Sumatera

Selatan). Digit ketiga menunjukkan keterangan sampel (T = tanah; A = akar).

Digit keempat menunjukkan keterangan medium untuk isolasi (Ca = Pikovskaya

Ca,(PO,),; A1 = Pikovskaya AlPO,).

Sebagai contoh, isolat lMITICa adalah bakteri pertama yang diperoleh dari

contoh tanah pertama, asal Madura, medium Pikovskaya Ca,(PO,),. Sedangkan

2L,A2Al adalah cendawan ketiga yang diperoleh dari contoh akar tebu kedua, asal

Lampung , medium Pikovskaya AlP04.

Seleksi Jasad Renik

Jasad renik yang berhasil dikoleksi selanjutnya diseleksi dalam dua tahap.

Pada tahap pertama, jasad renik diuji untuk melarutkan senyawa P sukar larut (batuan /

fosfat dan AlPO,). Pada seleksi tahap kedua, jasad renik yang 1010s seleksi tahap

pertama diuji untuk meningkatkan P terekstrak dari tanah masam dan basa.

Seleksi Tahap 1 : Seleksi kemampuan pelarutan batuan fosfat dan AlPO,

Tahap ini bertujuan menyeleksi kemampuan jasad renik untuk melarutkan

batuan fosfat dan AlPO, dalam medium buatan.

38

Sebanyak 50 ml medium Pikovskaya cair ditempatkan dalam labu erlenmeyer

200 ml, disterilkan pada suhu 120°C selama 20 menit, menggunakan autoklaf. Satu

miliiiter suspensi jasad renik diinokulasikan pada medium tersebut dan diinkubasikan

pada suhu kamar selama 14 hari. Untuk bakteri, inkubasi dilakukan dengan

pengocokan berkecepatan 100 rpm secara periodik dan cendawan diinkubasikan dalam

keadaan diam.

Pada akhir inkubasi, kultur disentrifugasi dengan kecepatan 7500 rpm pada

suhu 25 "C selama 20 menit. Filtrat jernih yang diperoleh ditentukan pH dan P-

larutnya dengan metode kolorimetri. Jika belum diperoleh filtrat jernih, maka filtrat

dibubuhi dengan arang aktif dan disaring kembali.

Seleksi dilakukan dengan dua kali ulangan dan jasad renik dipilih (diseleksi)

atas dasar kemampuan yang menonjol dalam meningkatkan P-larut pada medium.

Seleksi Tahap 2 : Seleksi kemampuan meningkatkan P-terekstrak dari tanah masam dan basa

Tahap ini bertujuan menguji jasad renik yang 1010s dari seleksi tahap pertama

untuk melihat kemampuamya dalam ha1 meningkatkan P-tersedia di tanah masam dan

basa. Sebanyak 25 g tanah steril ditempatkan dalam tabung erlenmeyer 250 ml, lalu

diinokulasi dengan satu mili liter suspensi jasad renik dan diinkubasi pa& suhu kamar

selama 14 hari. Pada akhir inkubasi, dilakukan pengukuran pH H,O (10: 1). P larut

air dan P ekstraksi Bray I untuk tanah masam dan Olsen untuk tanah yang bersifat

39

basa. Sterilisasi tanah dilakukan dengan radiasi sinar y @Co berdosis 30 kilo Gray

selama 20 jam.

Seleksi tahap kedua ini diulang dua kali, dan kemampuan isolat &lam

meningkatkan P tersedia dijadikan dasar untuk pemilihan jasad renik yang unggul.

Telaah Jasad Renik

Identifikasi Jasad Renik

Bakteri yang terpilih diidentifikasi dengan berpedoman pada Bergey 's Manual

of Systematic Bacteriology Volume I tahun 1984 (Krieg dan Holt 1984), sedangkan

identifikasi cendawan mengikuti petunjuk Burnett dan Hunter (1972), Raper, Fennel,

dan Austwick (1965), serta Domsch, Gams, dan Anderson (1980).

Pernbakuan Populasi /

Kurva baku populasi jasad renik terpilih ditentukan untuk memudahkan teknik

inokulasi pada percobaan-percobaan selanjutnya. Kurva ini menyatakan hubungan

antara nilai rapat optis (Optical Density) suspensi jasad renik dengan Satuan

Pembentuk Koloni (Colony Forming Unit) yang ditentukan dengan met& cawan

hitung. Dengan demikian, maka inokulasi pada percobaan-percobaan yang akan

dilakukan dapat menggunakan populasi jasad renik yang seragam.

40

Suspensi jasad renik di dalam medium kaldu nutrien diencerkan berurut 2,

3, 4, 8, dan 10 kali dan diukur nilai rapat optis (Optical Density) nya dengan

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 rim. Selanjutnya untuk

masing-masing tingkat pengenceran, populasi jasad renik ditentukan dengan metode

hitungan cawan. Populasi jasad renik dan nilai rapat optisnya dihubungkan dengan

persamaan regresi linier, yang digunakan sebagai kurva baku populasi jasad

renik di dalam medium tersebut.

Penetapan Asam Organik

Sejumlah 1.0 x 10'' sel jasad renik diinokulasikan pada 100 ml medium

Pikovskaya batuan fosfat, diinkubasikan pada suhu kamar selama 3 hari dengan

goyangan 100 rpm untuk bakteri dan inkubasi diam selama 5 hari untuk cendawan.

Pada akhir inkubasi kultur disentrifugasi 7500 rpm, pada suhu 25 "C selama 20

menit. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar asam-asam organik

berikut : asam sitrat, dsalat, format, suksinat, butirat, asetat, dan propionat.

Penetapan ini dilakukan dengan HPLC (High Performance Liquid

Chromatography).

Pertumbuhan Jasad Renik

Pertumbuhan jasad renik terpilih ditelaah dengan tujuan untuk mengetahui laju

tumbuhnya dalam medium kaldu nutrien. Informasi yang diperoleh diperlukan dalam

pelaksanaan percobaan selanjutnya. Sejumlah 1.0 x 10'' sel jasad renik diinokulasi-

4 1

kan pada 50 ml medium kaldu nutrien dan biakan diinkubasikan pada suhu kamar.

Untuk bakteri, inkubasi dilakukan selama 48 jam di atas mesin pengocok

berkecepatan 100 rpm, dan setiap 6 jam ditentukan populasinya dengan cara

mengukur rapat optisnya. Di pihak lain, biakan cendawan diinkubasi selama 144 jam

dalam keadaan diam, dan setiap 24 jam dibuat suspensi sporanya serta diukur rapat

optisnya pada panjang gelombang 620 nm.

Waktu generasi (generation time) atau waktu penggandaan (doubling time)

jasad renik dihitung pada fase log, dengan menggunakan mmus :

a = populasi sel awal b = populasi sel setelah n generasi n = jumlah generasi

g = waktu generasi t = waktu yang diperlukan untuk pertumbuhan

sel dari populasi a sampai b

0.301 x t g -

log b - log a

g = waktu generasi t = waktu inkubasi a = populasi awal jasad renik b = populasi akhir jasad renik

Percobaan 1. Pengaruh Jasad Renik dan Bahan Organik

Terhadap Ketersediaan P Tanah Basa

Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan kantung-kantung plastik yang

masing-masing diisi 250 g tanah BKM (Berat Kering Mutlak), dengan sumber bahan

organik sisa tanaman tebu yang diberikan pada dosis 0 dan 10 ton ha".

Bahan organik bemkuran halus (40 mesh) dicampur merata dalam 250 g tanah

BKM, didiamkan selama 6 hari, lalu diinokulasi dengan 11 jenis jasad renik terpilih,

yang terdiri atas 9 bakteri, dan 2 cendawan. Sebagai kontrol, disiapkan kantung-

kantung berisi campuran yang sarna tanpa inokulasi. Jumlah sel yang diinokulasikan

adalah 2.5 x 10" CFU per kantung plastik (1.0 x lo9 CFU g-' BKM tanah), dan inku-

basi dilakukan selama 14 hari. Selama inkubasi, kadar air dipertahankan pada 70

persen kapasitas lapang.

43

Pada akhir inkubasi, dilakukan pengamatan terhadap pH air (10: 1). P larut air,

dan P tersedia yang diekstraksi dengan NaHCO, (Olsen).

Percobaan dilakukan pada tanah bersifat basa (Inceptis01 Sragen), yang

disterilisasi dengan radiasi sinar y, tanpa tanaman, dan disusun dalam rancangan acak

kelompok, 3 ulangan. Beda nilai tengah pengamatan diperbandingkan dengan uji

jarak beganda Duncan.

Percobaan 2. Pengaruh Jasad Renik, Bahan Organik dan Kapur

Terhadap Ketersediaan P tanah Masam

Percobaan dilakukan dengan menggunakan kantung-kantung plastik, yang

berisi 250 g BKM tanah Ultisol Lampung.

Bahan organik yang digunakan adalah sisa tanaman tebu dengan takaran 0 dan

10 ton ha-'. Kapur yang digunakan adalah CaCO, dengan dosis 0 dan satu kali Al,,,

(2.8 ton ha-').

Bahan organik dan kapur dicampur merata dengan 250 g tanah BKM dan

didiamkan selama 6 hari. Inokulasi dan inkubasi dilakukan dengan jasad renik-jasad

renik yang sama dan cara yang sama seperti yang disebutkan pada Percobaan 1.

Pada akhir inkubasi, pengamatan dilakukan terhadap pH air (10:1), P larut air, dan

P Bray.

44

Percobaan dilakukan pada tanah masam (Ultisol Lampung) yang disterilisasi

dengan sinar 7 60Co berdosis 30 kilo Gray selama 30 jam, tanpa tanaman, clan

disusun dalam rancangan acak kelompok, tiga ulangan. Beda nilai tengah diperban-

dingkan dengan uji Duncan.

Fraksionasi P-anorganik

Untuk mengetahui kemampuan jasad renik dalam melarutkan bentuk-bentuk

P anorganik tanah masam, rnaka dilakukan pengamatan terpisah dengan cara

menginoku-lasikan jasad renik yang bersangkutan sebanyak 1.0 x lo9 CFU gram-'

tanah pada 100 g BKM tanah Ultisol, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 14 hari

pada kadar air 75 persen kapasitas lapang. Percobaan dilakukan dalam labu-labu

erlenrneyer 300 rnl, yang diulang tiga kali.

Pada akhir inkubasi, fraksi-fraksi P anorganik ditentukan dengan metode

Chang dan Jackson yang dimodifikasi (Hesse, 1972). Metode fraksionasi disajikan

pada Tabel Lampiran 22.

Data yang diperoleh dianalisis dalarn rancangan acak lengkap, dan nilai

rataannya diperbandingkan dengan uji jarak berganda Duncan.

Percobaan 3. Pengaruh Jasad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap

Efisiensi Serapan P-Pupuk Dengan Teknik Pengenceran Isotop UP

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jasad renik terhadap

efisiensi pemupukan fosfat pada tanaman tebu, yang dilakukan dengan menggunakan

pot dalam rumah plastik.

Varietas tebu yang digunakan adalah PS 80-1424 dan bibit dipilih dari

tanaman sehat berumur enam bulan. Mata nomor 9 sampai 15 diambil dan disiapkan

sebagai bagal mata satu (budset) dan dikecambahkan pada medium pasir tanpa pupuk

selama 10 hari. Bibit yang seragam dipilih dan dipindahkan ke dalam pot percobaan

sebanyak satu tunas pot-'.

Perlakuan yang diberikan terdiri atas tiga faktor, yaitu jasad renik (5 jenis + 1 kontrol); pupuk P sebanyak lima taraf dengan dosis per ha sebanyak 0 kg P205,

45 kg P20S TSP, 90 kg P20S TSP, 90 kg P20, batuan fosfat (RP), dan 150 kg P,Os

RP; dan kapur (CaCO,) dua taraf dengan dosis 0 dan 1 kali Al,,, (2.8 ton CaCO, ha'

I ) . P radioaktif C2P) yang digunakan berada dalam bentuk senyawa TS32P dengan

aktivitas jenis 0.15 mCi gram-' P.

Sebanyak 4 kg BKM tanah dicampur terlebih dahulu dengan kapur, diinkubasi

selama 14 hari, selanjutnya diberi pupuk dasar (90 kg N ha-' dan 60 kg K ha"),

perlakuan pupuk fosfat dan sel jasad renik sejumlah 5 x 1012 CFU. Tahap berikutnya

adalah penanaman bibit tebu.

46

Percobaan disusun secara split-split plot (petak terbagi ganda) dalam

rancangan acak kelompok dengan dua ulangan. Sebagai petak utarna adalah

pengapuran, sedangkan anak petak dan anak-anak petak berturut-turut adalah dosis

pemupukan P dan jenis jasad renik. Penempatan anak petak dan anak-anak petak

dilakukan secara acak.

Tanaman di dalam pot dipertahankan sampai umur enam minggu, dan pada

umur tersebut tanaman dipanen, diukur bobot keringnya, kadar P-total dan P-pupuk,

efisiensi serapan pupuk P, dan nilai ekivalensi P tersedia dari batuan fosfat (RP)

terhadap P tersedia TSP.

Teknik perunutan P dari sumber RP dan efisiensi pupuk RP dihitung dengan

pendekatan Nilai-A (IAEA, 1976; Zapata, 1990; Sisworo dan Sisworo, 1986),

sebagai berikut :

Aflanah + RP) = Jumlah P dalam tanah yang tersedia bagi tanaman, yang berasal dari P-tanah dan P-RP.

Acr-10 = Jumlah P dalam tanah yang tersedia bagi tanarnan.

P-pupuk diserap tanaman Efsiensi Pupuk P = - x 1 0 0 %

P- pupuk yang diberikan

Percobaan 4. Pengaruh Jasad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap

Beberapa Sifat Agronomi Tanaman Tebu (Percobaan Rumah Kaca)

Percobaan ke 4 ini terdiri dari deretan percobaan yang sama dengan Percobaan

3, dengan pola rancangan dan perlakuan yang sama, kecuali dalam ha1 taraf

perlakuan pupuk fosfat (TSP). Fosfat yang digunakan untuk percobaan bukan

radioaktif, dan hanya diberikan dalam empat taraf, yaitu : 0, 90 (TSP), 90 (RP), dan

150 (RP) kg PzO, ha-'.

Secara teknis percobaan ini dilaksanakan tepat sama dengan Percobaan 3.

Tanaman tebu dipertahankan sampai umur tiga bulan (16 minggu), kemudian diamati

tinggi, bobot kering, dan kandungan N, P, serta K nya.

Percobaan 5. Pengaruh Jwad Renik, Pupuk P dan Kapur Terhadap

Beberapa Sifat Agronomi Tanaman Tebu (Percobaan Lapang)

Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jasad renik terhadap

pertumbuhan, serapan hara, dan produksi tebu di lapang. Percobaan ini dilakukan

pada pada tanah Ultisol di areal perkebunan Pabrik Gula Bungamayang, Lampung

Utara.

48

Jasad renik terlebih dahulu ditumbuhkan pada kaldu nutrien, kemudian

dicampur dengan gambut steril (sterilisasi dengan radiasi) sebagai bahan pembawa,

dan diinkubasi pada suhu kamar selama 14 hari. Pada akhir inkubasi ditetapkan

populasi sel jasad renik pada setiap gram bahan pembawa.

Varietas tebu yang digunakan adalah PS 80-1424. Bibit dipilih dari tanaman

sehat berumur 6 bulan, diambil mata nomor 9 sampai 15, dan disiapkan sebagai bagal

mata dua.

Perlakuan percobaan terdiri atas tiga faktor, yaitu jasad renik (5 jenis + 1

kontrol); pemupukan P sebanyak empat taraf dengan dosis 0,90 (TSP), 90 (RP), 150

(RP) kg P20, ha-'; dan kapur dengan dosis 0 dan 1 kali Al,. Dosis isolat yang

diberikan adalah 7.5 x 10" CFU plot-', dengan dua kali ulangan.

Percobaan disusun secara split-split plot dalam pola rancangan acak kelompok

dengan 2 ulangan. Sebagai petak utama, anak petak, dan anak-anak petak berturut-

turut adalah perlakuan kapur (K), fosfat (P), dan Isolat (I). Luas plot yang digunakan

adalah (6 x 7.5) m2, dengan jumlah bibit 15 mata m-'. Jasad renik diberikan sebagai

alas bibit.

Pada umur empat bulan, pengamatan dilakukan terhadap tinggi, jumlah tunas,

bobot kering pada sampel (2x3) m2, serta kadar N, P, dan K jaringan tebu. Di

pihak lain tanaman tebu di luar petak sampel pada setiap plotnya dipertahankan

sampai umur 11 bulan dan diamati kadar sukrosa serta bobot tebunya.

49

Data yang diperoleh dianalisis secara faktorial, dan nilai rataannya

diperbandingkan dengan uji jarak berganda Duncan.

Karakter Jasad Renik Terhadap Antibiotik

Untuk mengetahui nasib jasad renik yang diinokulasikan ke dalam tanah, maka

dua jasad renik diberi tanda (marker) terlebih dahulu sebelum diinokulasikan ke

dalam tanah. Marker tersebut adalah sifat resisten jasad renik terhadap campuran dua

macam antibiotik pada dosis yang tinggi.

Karakter isolat terhadap antibiotik yang perlu diketahui adalah sifat

resistensinya terhadap antibiotik tertentu, yang dilanjutkan dengan melipatgandakan

sifat resiten tersebut.

Uji Kepekaan Terhadap Antibiotik

Kegiatan ini dilakukan untuk menguji kepekaan jasad renik terhadap lima

macam antibiotik, yaitu eritromisin, penisilin, khloramfenikol, teramisin, dan

streptomisin.

Satu mililiter suspensi jasad renik masing-masing ditumbuhkan dalam medium

kaldu nutrien yang mengandung antibiotik 10, 20, 40, 60, 80, 90, dan 100 ug ml-',

dengan ulangan dua kali. Suspensi ini diinkubasikan pada suhu kamar selama tiga

50

hari dan diamati kekeruhannya. Dua jenis antibiotik dipilih berdasarkan resistensi

jasad renik terhadap antibiotik tersebut.

Arnplifikasi Sifat Resisten terhadap Antibiotik

Sifat resisten terhadap dua macam antibiotik yang dimiliki oleh ke dua bakteri

tersebut diadaptasikan ke dalam medium yang mengandung campuran antibiotik

terpilih.

Lima mililiter suspensi jasad renik masing-masing ditumbuhkan dalam medium

yang mengandung campuran dua macam antibiotik (1 : 1) pada konsentrasi 50 ug ml-'

(disebut suspensi I), digoyang dengan kecepatan 100 rpm selama tiga hari dan

ditentukan populasinya dengan metode cawan hitung pada medium agar nutrien.

Dengan cara yang sama, lima mililiter suspensi I ini ditumbuhkan juga dalam medium

yang mengandung 100 ug mi-' campuran antibiotik , digoyang 100 rpm selama 5 hari

dan ditentukan populasinya. Peningkatan adaptasi tersebut dilakukan secara bertahap,

dengan konsentrasi campuran antibiotik 50, LOO, 250, 400, 550, 700, 850, dan 1000

Jasad renik yang mampu beradaptasi dengan campuran dua macam antibiotik

dosis tertinggi selanjutnya disebut sebagai mutan, yang digunakan sebagai jasad renik

uji pada Percobaan 6 dan 7.

Penelitian ini menguji dua macam jasad renik, dengan menggunakan dua kali

ulangan untuk setiap tahapan kerja.

Percobaan 6. Uji Stabilitas Mutan Pada Medium

Tanpa Antibiotik

Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk menguji stabilitas resistensi jasad

renik yang ditumbuhkan pada medium yang tidak mengandung antibiotik.

Percobaan dilakukan dalam erlenmeyer 250 mi yang berisi 50 ml medium

kaldu nutrien tanpa antibiotik. Ke dalam medium tersebut, diinokulasikan satu

mililiter ml suspensi jasad renik mutan, yang selanjutnya digoyang dengan kecepatan

100 rpm. Pada hari ke 5, 10, 15, 20, 25, dan 30, populasi jasad renik ditentukan

dengan metode cawan hitung pada dua macam medium, yaitu agar nutrien

berantibiotik dan agar nutrien tanpa antibiotik.

Sebagai kontrol dilakukan deretan percobaan yang sama, tetapi menggunakan

medium kaldu nutrien berantibiotik dengan kandungan campuran antibiotik 500 ug

1 . Percobaan ini menggunakan dua jasad renik mutan dengan dua ulangan.

Percobaan 7. Uji Ekologi jasad Renik di Dalam Tanah

Percobaan ini disusun untuk menelaah nasib jasad renik yang diinokulaikan

ke dalam tanah, yaitu untuk mengetahui kemampuan jasad renik bertahan hidup dan

berkembang biak bersama-sama dengan jasad renik lain di dalam tanah.

52

Percobaan dilakukan pada 100 g tanah Ultisol Lampung di dalam labu

erlenrneyer 300 ml. Satu mililiter suspensi jasad renik mutan, diinolukasikan dalam

tanah tersebut dan disimpan di ruang gelap.

Pemantauan jasad renik dilakukan pada hari ke 5, 10, 15, 20, 25, dan 30

dengan menggunakan metode cawan hitung pada dua macam medium, yaitu agar

nutrien tanpa antibiotik dan agar nutrien yang mengandung campuran dua macam

antibiotik terpilih (1: 1) dengan tingkat konsentrasi 500 ug ml-'.

Percobaan menggunakan dua macam jasad renik, dengan dua ulangan. Data

yang diperoleh diperbandingkan terhadap kontrolnya.